Naturhistorica 152

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18 Torben Stemme, Gerd Bicker, Steffen Harzsch, Stefan Koenemann Blockierung unspezifischer Antikörper-Bindungen Nach mehreren Wasch-Schritten mit PBS-TX 0,2 % für insgesamt mindestens 2 h folgt die Überführung in 5 % NHS (Normalserum vom Pferd) in PBS-TX 0,2 % über Nacht zur Blockierung unspezifischer AK-Bindungen. Durch den Vorgang des Blockierens soll die unspezifische Hintergrundfärbung so gering wie möglich gehalten werden. Auch wenn AK spezifisch an das AG binden, kommt es dennoch immer wieder zu unspezifischen Bindungen, welche zu einer falsch positiven Färbung führen. Häufigste Ursache hierfür ist die Tendenz von Proteinen, hydrophobe und auch elektrostatische Bindungen auszubilden. Um dem entgegenzuwirken, bietet man in der Blocklösung konkurrierende Proteine an. Hydrophobe Bindungen zwischen den Proteinen treten in wässriger Lösung insbesondere dann auf, wenn deren Grenzflächenspannung niedriger ist, als die des umgebenden Wassers. Triton X-100 als nichtionisches Detergenz verringert die Oberflächenspannung und reduziert so die Ausbildung von hydrophoben Bindungen (Luttmann et al. 2009). Primär-Antikörper-Bindung Direkt im Anschluss nach Abnahme der Blocklösung werden die primären AK auf die Gewebeschnitte gegeben. Dieser bindet an das entsprechende AG (hier Serotonin beziehungsweise Synapsin). Hierbei ist zu beachten, dass eine ausgewogene Balance zwischen der Konzentration des AK und der Inkubationszeit beibehalten wird. Eine zu hohe Konzentration und/ oder zu lange Inkubationszeit kann die Wahrscheinlichkeit von unspezifischer Abb. 8 Aufnahme eines Horizontalschnittes (60 μm) von den Ganglien des fünften bis siebten Thorakalsegmentes (T5-7) von Nebalia bipes. Pro Ganglion sind zwei zentral gelegene serotonerge Zellkörper zu beobachten (Sternchen) (Rot: Serotonin; Grün: Synapsin; Blau: Zellkernfärbung). Anterior ist links. Maßstab: 50 μm. Naturhistorica Berichte der Naturhistorischen Gesellschaft Hannover 152 · 2010
Die rätselhaften Grottenkrebse der Blue Holes 19 Hintergrundreaktion erhöhen, umgekehrt aber kann eine zu geringe Konzentration und/oder zu kurze Inkubation das spezifische Signal verringern. Sekundär-Antikörper-Bindung Nach erneuten Wasch-Schritten mit PBS-TX 0,2 % über mindestens 2 h werden die Proben mit sekundären AK über Nacht inkubiert. Wie oben erläutert sind die sekundären AK mit Fluorochromen gekoppelt und binden an den primären AK. Es ist Gleiches zu beachten wie bei der Primär-AK-Bindung. In dieser Lösung ist auch 1 μg/ml des Fluoreszenz-Farbstoffes DAPI enthalten. Um die Präparate vor dem Prozess des Ausbleichens zu schützen, werden die Schnitte während der Inkubation dunkel gelagert. Zum Abschluss erfolgt eine weitere Serie von Wasch-Schritten, ebenfalls über mindestens 2 h mit PBS-TX 0,2 %. Der letzte Wasch-Schritt wird mit PBS durchgeführt. Eindecken Zum Schluss werden die Gewebeschnitte auf herkömmlichen Objekträgern in Mowiol eingedeckt. Mowiol eignet sich gut zum Eindecken, da es bei Raumtemperatur komplett aushärtet. Danach sind die Präparate theoretisch unbegrenzt haltbar. Ein Ausbleichen der Präparate – also eine irreversible Zerstörung der Fluorochrome, vor allem durch starken Lichteinfluss – ist nicht auszuschließen. Verringert wird das Ausbleichen durch Zugabe von Triethylendiamin (DABCO), welches dem Mowiol in einer Konzentration von 25 mg/ ml hinzugegeben wird. Nach Aushärten des Mowiols (über Nacht, staubgeschützt bei Raumtemperatur) können die fertigen Präparate staubgeschützt, dunkel und trocken bei 4 °C nahezu unbegrenzt gelagert werden. In Abbildung 8 ist eine gut gelungene Beispielfärbung des Bauchmarks von Nebalia bipes (Malacostraca) abgebildet. Ergebnisse und Diskussion Das serotonerge System im Bauchmark der Pancrustacea In Bezug auf die Phylogenie der Arthropoda wurden mit Hilfe der oben erläuterten Methode der Immunhistochemie in verschiedenen Studien für das serotonerge System im Bauchmark Grundmuster für höhere Taxa postuliert (Harzsch & Waloszek 2000; Harzsch 2003, 2004). Innerhalb der Pancrustacea liegen Grundmuster des serotonergen Systems für Entomostraca, Malacostraca, Zygentoma und Pterygota vor (Harzsch & Waloszek 2000; Harzsch 2002, 2003). Generell bestehen diese Muster aus zwei Gruppen von maximal zwei Neuronen im anterioren und posterioren Teil der Hemiganglia (Abb. 9). Die Neurone dieser Zellpaare lassen sich individuell aufgrund ihrer Lage und Morphologie identifizieren und homologisieren. Die Grundmuster von Entomostraca, Malacostraca und Zygentoma zeigen eine gleiche Anzahl von Neuronen, nämlich zwei anteriore und zwei posteriore serotonerge Zellpaare (ASZ beziehungsweise PSZ). Unterschieden werden sie nur aufgrund ihrer Neuritenmorphologie. Jedes serotonerge Neuron der Entomostraca besitzt einen ipsilateralen und einen kontralateralen Neuriten, es handelt sich somit um bipolare Neurone. Bei Malacostraca zeigen die anterioren Zellkörper einen kontralateral wandernden Neuriten, Naturhistorica Berichte der Naturhistorischen Gesellschaft Hannover 152 · 2010
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