Naturhistorica 152

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16 Torben Stemme, Gerd Bicker, Steffen Harzsch, Stefan Koenemann Proteinen im Gewebe gesorgt. Das Gewebe wird konserviert und gehärtet, wodurch alle makromolekularen Strukturen an Ort und Stelle bleiben. Dabei werden Proteine mehr oder weniger stark denaturiert und über Quervernetzung verbunden. Dies ist ein kritischer Schritt, da auch das zu untersuchende Molekül nicht vor Denaturierung geschützt ist. Somit kann es vorkommen, dass das AG durch das Fixativ in einem Grad denaturiert wird, woraufhin der AK das Epitop nicht mehr zu erkennen vermag. Als Fixativ zur Immundetektion von Serotonin hat sich 4 %iges PFA bewährt (Abb. 7). Nach entsprechender Inkubationszeit wird das Gewebe mindestens 2 h bei mehrmaligem Lösungswechsel mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, um überschüssiges Fixativ aus dem Gewebe zu entfernen. Einbetten und Schneiden Die Einbettung der Individuen erfolgt in 4 % Agarose in destilliertem Wasser. Vor dem Einbetten in der noch etwa 50 °C Tab. 2 Protokoll der Immunhistochemie zur Detektion von Serotonin und Synapsin, sowie zur Fluoreszenzmarkierung der Zellkerne (modifiziert nach Stern et al. 2007). Erläuterungen: Aqua dest.: Destilliertes Wasser; Cy3: Carbocyanin 3; DABCO: Triethylendiamin; DAPI: 4',6-Diamidino-2-phenylindol; DSHB: Developmental Studies Hybridoma Bank; JIRL: Jackson Immuno Research Laboratories; min: Minute; MP: Molecular Probes; NHS: Nomalserum vom Pferd; PBS: Phosphat gepufferte Salzlösung; PFA: Paraformaldehyd; RT: Raumtemperatur; T: Temperatur; TX: Triton X-100; ü. N.: über Nacht. Schritt Chemikalien T Dauer Fixierung 4 % PFA 4 °C ü. N. Waschen 4-maliger Wechsel, PBS RT je 30 min Einbetten + Schneiden (Vibratom) Poly-L-Lysin; 4 % Agarose in Aqua dest. Permeabilisierung 0,3 % Saponin in PBS-TX 0,2 % RT 45 min Waschen 4-maliger Wechsel, PBS-TX 0,2 % RT je 30 min Blocken 5 % NHS in PBS-TX 0,2 % RT 180 min Primär-AK Rabbit-Anti-Serotonin (Sigma) 1:5000 + Mouse-Anti-Synapsin SYNORF1 (E. Buchner, Würzburg, DSHB)1:30 in Block-Lösung 4 °C 2 Tage Waschen 4-maliger Wechsel, PBS-TX 0,2 % RT je 30 min Sekundär-AK Goat-Anti-Rabbit Cy3-konjugiert ( JIRL) 1:250 + Goat-Anti-Mouse (MP) Alexa Fluor 488-konjugiert 1:250 + 1 µg/ml DAPI in Block-Lösung 4 °C ü. N. Waschen 4-maliger Wechsel, PBS-TX 0,2 % letzter Wechsel PBS RT je 30 min Eindecken Mowiol + 25 mg/ml DABCO Naturhistorica Berichte der Naturhistorischen Gesellschaft Hannover 152 · 2010
Die rätselhaften Grottenkrebse der Blue Holes 17 warmen Agarose wird das Gewebe mit Poly-L-Lysin inkubiert. Diese Behandlung stabilisiert die Verbindung von Gewebe und Einbettmedium aufgrund der guten adhäsiven Eigenschaften des Poly-L-Lysin. Nach einigen min wird überschüssiges Poly-L-Lysin entfernt, sodass nur ein kleiner Film das Präparat umgibt, und die Einbettung durchgeführt. Dabei werden die Präparate auf dem Boden eines Wägeschälchens ausgerichtet und mit der flüssigen Agarose überschichtet. Nach Aushärten wird der Agarose-Block mit eingeschlossener Probe mit einer herkömmlichen Rasierklinge getrimmt, in ein Vibratom eingespannt und umgeben von PBS geschnitten. Die Technik des Vibratomschneidens gilt als eine einfache und schnelle Methode, um Gewebeschnitte herzustellen. Hierbei wird eine Rasierklinge in wässrigem Medium (PBS) durch das Präparat geführt. Dabei vibriert die Klinge, wodurch sich eine saubere Schnittfläche ergibt, außerdem werden Scherkräfte durch geringe Stauchung des Präparates minimiert. Permeabilisierung Im folgenden Schritt werden die fertigen Schnitte mit 0,3 % Saponin in Phosphat gepufferter Salzlösung mit Triton X-100 (PBS-TX) 0,2 % für mindestens 45 min inkubiert. Saponin ist ein von verschiedenen Pflanzenfamilien bekanntes Detergenz. Das hier verwendete Saponin wurde aus der Rinde des Seifenrinden-Baumes (Quillaja saponaria) gewonnen. Diese pflanzlichen Glykoside bilden in Wasser seifenartige Lösungen. Durch eine Reaktion der Saponine mit dem Cholesterol der Zellmembranen eukaryotischer Zellen kommt es zur Perforation der Membran. Dadurch wird dem AK das Eindringen in die Zelle erleichtert. Abb. 7 Ergebnisse von verschiedenen Fixierungen zur Serotonin- (rot) und Synapsin-Immundetektion (grün) (blau: Zellkernfärbung mit DAPI). Eine Fixierung mit AAF (85 % Eisessig, 10 % Formalin, 5 % Ethanol) (A) sowie eine Vorfixierung mit 4 % PFA und Nachfixierung mit AAF (B) zeigen keine beziehungsweise schwache Färbungen. Das beste Ergebnis wird bei einer Fixierung mit 4 % PFA erzielt (C). Maßstab: 200 µm. Naturhistorica Berichte der Naturhistorischen Gesellschaft Hannover 152 · 2010
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