Informe actividad Prontosan® frente a bacterias multiresistentes nosocomiales

Informe actividad Prontosan® frente a bacterias
multiresistentes nosocomiales.
Servicio de Microbiología. Hospital Virgen de Macarena. Sevilla
Departamento de Microbiologia. Facultad de Medicina. Sevilla
Dr. Álvaro Pascual
Director de la Unidad de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología del Hospital Universitario Virgen Macarena
de Sevilla.
Presidente de la SEIMC

ÍNDICE
1. OBJETIVOS
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 Cepas Bacterianas
2.2 Test Sensibilidad
2.3 Actividad bactericida de Prontosan®
2.4 Cepas con sensibilidad reducida in vitro a Prontosan®
3. RESULTADOS
3.1 Microdilución en caldo
3.2 Difusión en disco (placa)
3.3 Curvas de tiempo-muerte bacteriana
3.4. Curvas de crecimiento bacteriano
3.5 Test de Dilución-Neutralización
3.6. Cepas con sensibilidad in vitro
4. CONCLUSIONES
5. BIBLIOGRAFÍA

1. OBJETIVOS
1º Determinar la actividad in vitro de Prontosan® frente a los clones más representativos de
bacterias nosocomiales multiresistentes.
2º Estudiar la aparición de aislados con sensibilidad disminuida tras la exposición continua a
Prontosan® en cepas bacterianas multirresistentes y, en estos casos, valorar el coste biológico
(fitness bacteriano).
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 Cepas Bacterianas
Se incluyen cepas estándares de la colección ATCC y cepas nosocomiales resistentes de
Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae y Enterococcus
faecalis:
Nº Cepa Clon Característica
1 Enterococcus faecium ATCC 35667
2 Staphylococcus aureus ATCC 25923
3 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
4 Escherichia coli ATCC 25922
5 Acinetobacter baumannii ATCC 19606
6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
7 Enterobacter cloacae ATCC 13047
8 Enterococcus faecalis ATCC 29212
9 Pseudomonas aeruginosa ST-175 XDR
10 Pseudomonas aeruginosa ST-111 VIM-2
11 Pseudomonas aeruginosa ST-235 GES-5
12 Acinetobacter baumannii Clon Internacional I MDR
13 Acinetobacter baumannii Clon Internacional II MDR
14 Staphylococcus aureus Complejo Clonal 5 Resistente a meticilina
15 Staphylococcus aureus Complejo Clonal 8 Resistente a meticilina
16 Escherichia coli ST-131 CTX-M
17 Klebsiella pneumoniae SHV-12
18 Klebsiella pneumoniae ST-512 KPC-3

19 Klebsiella pneumoniae OXA-48 y CTX-M-15
20 Klebsiella pneumoniae TEM-4
21 Enterococcus faecalis Complejo Clonal 2
22 Enterococcus faecalis Complejo Clonal 9
23 Enterobacter cloacae SHV-12 y CTX-M-9
24 Enterobacter cloacae CTX-M-15
25 Enterobacter cloacae CTX-M-9
26 Enterococcus faecium VanB2
27 Enterococcus faecium VanA
28 Enterococcus faecium VanA
29 Enterococcus faecium VanB
2.2 Tests de sensibilidad
Con el fin de determinar la sensibilidad de las cepas bacterianas a Prontosan®, se utilizaron dos
métodos: microdilución en caldo y difusión con discos. Ambos se llevaron a cabo siguiendo
las recomendaciones del CLSI 1 para antimicrobianos. Para cada cepa se determinaron: i)
concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB)
(microdilución en caldo) y ii) diámetro del halo de inhibición (difusión con disco).
2.3 Actividad bactericida de Prontosan®
Para el resto de los experimentos, se seleccionaron las 8 cepas ATCC y las 8 cepas clínicas que
presentaron mayor CMI dentro de cada especie.
Para el estudio de la actividad bactericida de Prontosan®, se utilizaron curvas de tiempo-muerte
bacteriana, siguiendo la metodología descrita en la normativa de los Estándares Europeos
EN1040 2 y PrEN12054 3 (EN 1040,1997. PrEN 12054, 1995) y Kawamura-Sato et al. 4
Previamente a realizar las curvas de tiempo-muerte, se comprobó que la solución de
neutralización (8% v/v Tween 80, 6% w/V saponina, 0.8% w/v lecitina, 2% w/v docedil sulfato
sódico, PBS) no inhibía el crecimiento bacteriano a las concentraciones utilizadas en el ensayo,
y que una dilución 1:10 de la solución de neutralización era capaz de neutralizar la actividad
bactericida de Prontosan®. Para las curvas de tiempo-muerte, con un inoculo inicial de 5x10 5
UFC/mL, se utilizaron concentraciones de Prontosan® equivalentes a 0.25, 1, 4 y 8xCMI.

Se tomaron alícuotas a diferentes tiempos (0, 5´, 10´, 15´, 30´, 1h, 2h, 4h, 8h y 24h), que fueron
neutralizadas e inoculadas en placas Mueller-Hinton agar para el recuento bacteriano. Se
consideró que Prontosan® tenia actividad bactericida cuando a la concentración ensayada, se
conseguía una reducción 3 log UFC/mL.
Con el fin de complementar estos estudios, se realizaron curvas de crecimiento bacteriano
monitorizando la turbidez (DO a 595 nm) del medio con un lector automático de microplacas
(Infinite F200PRO, TECAN). Los experimentos se realizaron en ausencia y presencia de diferentes
concentraciones de Prontosan® (0,25, 1, 2, 4 y 8 x CMI) utilizando un inoculo bacteriano de
5x10 5 UFC/mL.
Adicionalmente, la actividad bactericida de Prontosan® se determinó mediante el test de
dilución-neutralización siguiendo el Estándar Europeo PrEN 12054 3 . Brevemente, un inóculo
bacteriano inicial de 10 6 UFC/mL fue incubado durante 1 minuto con el producto sin diluir, y
seguido de un proceso de neutralización, se contaron las UFC mediante diluciones seriadas en
placas de Mueller-Hinton agar.
2.4 Selección de Cepas con sensibilidad reducida in vitro a Prontosan®
La selección de cepas con sensibilidad reducida a Prontosan® se llevó a cabo por dos métodos
distintos: 1) difusión en agar utilizando discos impregnados con diferentes concentraciones de
Prontosan®;; y 2) Pases seriados en placas con concentraciones crecientes de Prontosan®, desde
0.5xCMI de cada cepa y crecientes en Log 2 .
Todos estos experimentos se realizaron por triplicado en 3 días distintos.

3. RESULTADOS
3.1 Microdilución en caldo
Como se muestra en la tabla 1, los valores de CMI y CMB obtenidos con la colección de cepas
ATCC fueron variables (0.5-4 mg/L). Las cepas más sensibles a Prontosan® fueron S. aureus, K
pneuumoniae y E. cloacae. Los valores de CMB fueron iguales a los de CMI para todas las cepas
testadas, con excepción de E. cloacae, la cual fue una dilución superior (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de CMI/CMB de Prontosan® frente a cepas estándar.
CEPA CMI (mg/L) CMB (mg/L)
1 Enterococcus faecium ATCC 35667 2 2
2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5 0,5
3 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0,5 0,5
4 Escherichia coli ATCC 25922 1 1
5 Acinetobacter baumannii ATCC 19606 4 4
6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4 4
7 Enterobacter cloacae ATCC 13047 0,5 1
8 Enterococcus faecalis ATCC 29212 1 1

En la tabla 2 están representados los valores de CMI y CMB obtenidos con las cepas clínicas
(0.5 -8 mg/L). Para cada especie, se seleccionó la cepa con mayor CMI para experimentos
posteriores (marcadas en negrita y asterisco).
Tabla 2. Valores de CMI/CMB de Prontosan® frente a cepas clínicas.
CEPA CMI (mg/L) CMB (mg/L)
9* Pseudomonas aeruginosa ST-175 XDR 8 8
10 Pseudomonas aeruginosa ST-111 VIM-2 8 8
11 Pseudomonas aeruginosa ST-235 GES-5 8 8
12* Acinetobacter baumannii CI I MDR 4 4
13 Acinetobacter baumannii CI II MDR 4 4
14* Staphylococcus aureus CC5 Meticillin-resistant 1 1
15 Staphylococcus aureus CC8 Meticillin-resistant 1 1
16* Escherichia coli ST-131 BLEE Type CTX-M 2 2
17 Klebsiella pneumonia BLEE Type SHV-12 1 1
18* Klebsiella pneumoniae ST-512 KPC-3 2 4
19 Klebsiella pneumoniae OXA-48 y CTX-M-15 2 2
20 Klebsiella pneumoniae BLEE type TEM-4 2 2
21* Enterococcus faecalis CC2 C2620 2 2
22 Enterococcus faecalis CC9 C2288 2 2
23 Enterobacter cloacae SHV-12 y CTX-M-9 1 1
24* Enterobacter cloacae CTX-M-15 2 2
25 Enterobacter cloacae CTX-M-9 2 2
26* Enterococcus faecium VanB2 2 2
27 Enterococcus faecium VanA 1 1
28 Enterococcus faecium VanA 0,5 1
29 Enterococcus faecium VanB 0,5 1

3.2 Difusión en disco
Tras 24 horas de incubación en presencia de discos blancos impregnados con 15 µL de
Prontosan®, no se observaron zonas de inhibición alrededor del disco, probablemente debido a
la escasa difusión de Prontosan® en el agar.
3.3 Curvas de tiempo-muerte bacteriana
Como se indica en los ensayos de muerte bacteriana (figuras 1A a 1P), Prontosan® muestra una
actividad bactericida dosis-dependiente frente a las cepas estudiadas. En todas las cepas se
observa recrecimiento bacteriano tras 24 horas de incubación a ciertas concentraciones, sin
embargo la erradicación total del inóculo bacteriano (sin crecimiento bacteriano posterior) se
observó a concentraciones variables de Prontosan® (cepas ATCC: 1xCMI para E. faecium, 4xCMI
para E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa y E. faecalis y 8xCMI para S. aureus, K. pneumoniae y E.
cloacae;; cepas clínicas: 4xCMI para todas las cepas excepto para S. aureus que fue de 8xCMI).
Estas concentraciones (16mg/L o inferior) son muy inferiores a las concentraciones comerciales
utilizadas (1000 mg/L).

Log CFU/mL
Enterococcus faecium ATCC 35667
Time (h)
Log CFU/mL
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Time (h)

Log CFU/mL
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Time (h)
Log CFU/mL
Escherichia coli ATCC 25922
Time (h)

Log CFU/mL
Acinetobacter baumannii ATCC 19606
Time (h)
Log CFU/mL
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Time (h)

Log CFU/mL
Enterobacter cloacae ATCC 13047
Time (h)
Log CFU/mL
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Time (h)

Log CFU/mL
Enterococcus faecium VanB2
Time (h)
Log CFU/mL
Staphylococcus aureus MR CC5
Time (h)

Log CFU/mL
Klebsiella pneumoniae KPC-­‐3
Time (h)
Log CFU/mL
Escherichia coli CTX-­‐M
Time (h)

Log CFU/mL
Acinetobacter baumannii MDR CI1
Time (h)
Log CFU/mL
Pseudomonas aeruginosa ST-­‐175 XDR
Time (h)

Log CFU/mL
Enterobacter cloacae CTX-­‐M-­‐15
Time (h)
Log CFU/mL
Enterococcus faecalis CC2
Time (h)

Una vez finalizadas las curvas de tiempo-muerte bacteriana, en las cepas en las que se observó
actividad bactericida de Prontosan® a diferentes concentraciones y un posterior crecimiento
bacteriano a las 24h, se determinó la CMI de las colonias recuperadas tras la exposición a
Prontosan®. Las CMIs de todas las cepas estudiadas tras 24 horas de incubación con Prontosan®
fueron similares a las CMIs pre-exposición. Por consiguiente, no fueron detectadas colonias
resistentes a Prontosan®
3.4 Curvas de crecimiento bacteriano
En las figuras 2A a 2P, se representan las curvas de crecimiento bacteriano de las cepas
expuestas a diferentes concentraciones de Prontosan® (0,25, 1, 4 y 8xCMI). La inhibición del
crecimiento bacteriano se produce a 4xCMI en todas las cepas estudiadas, excepto para las
cepas ATCC de S. aureus y E. cloacae, que se produjo a 8xCMI. La máxima concentración testada
fue 16 mg/L, significativamente inferior a las concentraciones comercialmente utilizadas.

Enterococcus faecium ATCC 35667
OD 595nm
Tiime (h)
Staphylococcus aureus ATCC 25923
OD 595nm
Time (h)

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
OD 595nm
Time (h)
OD 595nm
Escherichia coli ATCC 25922
Time (h)

Acinetobacter baumannii ATCC 19606
OD 595nm
Time (h)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
OD 595nm
Time(h)

Enterobacter cloacae ATCC 13047
OD 595nm
Time (h)
Enterococcus faecalis ATCC 29212
OD 595nm
Time (h)

Enterococcus faecium VanB2
OD 595nm
Time (h)
Staphylococcus aureus MR CC5
OD 595nm
Time (h)

Klebsiella pneumoniae KPC-­‐3
OD 595nm
Time (h)
Escherichia coli CTX-­‐M
OD 595nm
Time (h)

Acinetobacter baumannii MDR CI1
OD 595nm
Time (h)
Pseudomonas aeruginosa ST-­‐175 XDR
OD 595nm
Time (h)

OD 595nm
Enterobacter cloacae CTX-­‐M-­‐15
Time (h)
Enterococcus faecalis CC2
OD 595nm
Time (h)

3.5 Test de dilución-neutralización
Previamente a la realización del experimento, se validó el test de dilución-neutralización
siguiendo los Estándares Europeos (PrEN 12054) 3 señalando que no se encontró actividad
bactericida destacable debido a la neutralización. Adicionalmente, se demostró que la
neutralización inhibía la actividad bactericida de Prontosan®.
Los resultados de los test muestran como Prontosan® presenta actividad bactericida bajo las
condiciones descritas en el Estándar Europeo prEN12054, mostrando actividad bactericida en
un 1 minuto de contacto con cada microorganismo ensayado (tabla 3):
- Temperatura del test: 20ºC±1ºC
- Concentración de producto testado: Sin diluir
- Tiempo de contacto: 1 minuto
- Procedimiento de recuento: siembra en placas
- Temperatura de incubación: 37ºC±1ºC

Tabla 3. Test de diluciónneutralización de Prontosan® frente cepas estándares y
clínicas.
Log UFC/mL
CEPA Grupo 1ª Rep 2º Rep 3ª Rep Media DE
Enterococcus faecium
ATCC 35667
Staphylococcus aureus
ATCC25923
Klebsiella pneumonia
ATCC 13883
Escherichia coli
ATCC 25922
Acinetobacter baumannii
ATCC 19606
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Enterobacter cloacae
ATCC 13047
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Enterococcus faecium
Van B2
Staphylococcus aureus
MR CC5
Klebsiella pneumoniae
ST-512 KPC-3
Escherichia coli
CTX-M
Acinetobacter baumannii
MDR CI1
Pseudomonas aeruginosa
ST-175 XDR
Enterobacter cloacae
CTX-M-15
Enterococcus faecalis
CC2
Control 5,98 6,09 6,15 6,07 0,09
Prontosan®

3.6. Selección de cepas con sensibilidad reducida in vitro a Prontosan®
En el experimento con difusión en agar utilizando discos de papel impregnados con diferentes
concentraciones de Prontosan®, no fue posible identificar mutantes resistentes ya que no se
obtuvo zona de inhibición, posiblemente debido a la pobre difusión de Prontosan® en el agar.
En el experimento con pases seriados en placas con concentraciones crecientes de Prontosan®,
observamos que las cepas crecieron en las placas con concentraciones superiores a su CMI
(tabla 4), aunque las CMI de las cepas que se recuperaban a esas concentraciones eran iguales a
las obtenidas previamente a la exposición al biocida. Los resultados sugieren una tolerancia
temporal a bajas concentraciones de Prontosan®, no observada a las concentraciones
comerciales del producto.

Tabla 4. Crecimiento en placa con concentraciones crecientes de Prontosan®
CEPA
CMI (mg/L)
Prontosan®
Concentración máxima con
crecimiento en placa (mg/L)
CMI de Prontosan®
tras exposición
Enterococcus faecium
ATCC 35667
Staphylococcus aureus
ATCC25923
Klebsiella pneumonia
ATCC 13883
Escherichia coli
ATCC 25922
Acinetobacter baumannii
ATCC 19606
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Enterobacter cloacae
ATCC 13047
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Enterococcus faecium
Van B2
Staphylococcus aureus
MR CC5
Klebsiella pneumoniae
ST-512 KPC-3
Escherichia coli
CTX-M
Acinetobacter baumannii
MDR CI1
Pseudomonas aeruginosa
ST-175 XDR
Enterobacter cloacae
CTX-M-15
Enterococcus faecalis
CC2
2 8 1
0,5 8 0,5
0,5 8 0,5
1 8 1
4 64 2
4 256 4
0,5 64 0,5
1 16 1
2 8 2
1 8 2
2 32 2
2 8 1
4 64 2
8 256 4
2 32 1
2 32 2

4. CONCLUSIONES
1. Prontosan® muestra una elevada actividad bactericida frente a los patógenos
multiresistentes nosocomiales más comunes a concentraciones significativamente
inferiores que las utilizadas comercialmente.
2. Prontosan® presenta una rápida actividad bactericida (1 minuto), tiempo muy inferior al
recomendado por el fabricante (15 minutos).
3. La selección de mutantes con sensibilidad reducida a Prontosan® no debe representar
un problema in vivo tal como sugieren los resultados in vitro.

1) Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007. Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing; 17th Informational supplement. CLSI document
M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
2) EN 1040: 1997 E. Chemical disinfectants and antiseptics. Basic bactericidal activity.
Test method and requirements (phase 1). European Committee for Standardization
(CEN).
3) PrEN 12054: 1995 E. Chemical disinfectants and antiseptics. Products for hygienic
and surgical handrub and handwash. Bactericidal activity. Test method and
requirements (phase 2, step 1). European Committee for Standardization (CEN).
4) Kumiko Kawamura-Sato, Jun-ichi Wachino, Takaaki Kondo, Hideo Ito and
Yoshichika Arakawa. Reduction of disinfectant bactericidal activities in clinically
isolated Acinetobacter species in the presence of organic material. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy (2008) 61; 568!576.