HYDRAGEL 6 IF Penta HYDRAGEL 12 IF Penta

HYDRAGEL 6 IF Penta
Ref. 4341
HYDRAGEL 12 IF Penta
Ref. 4342
Ref. 4384*
Masque dynamique / Dynamic mask
2005/03

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
UTILISATION
Les kits HYDRAGEL 6 IF Penta et HYDRAGEL 12 IF Penta permettent la détection de toute protéine monoclonale dans le sérum humain, par
immunofixation sur gel d’agarose dans le système semi-automatique HYDRASYS. Le système HYDRASYS permet de réaliser toutes les séquences
jusqu’à l’obtention du gel prêt pour l’interprétation. Les protéines sont séparées en tampon alcalin (pH 9,1) puis immunoprécipitées par un antisérum
Pentavalent anti-chaînes lourdes gamma (Ig G), alpha (Ig A), mu (Ig M), et anti-chaînes légères kappa et lambda (libres et liées). Après immunofixation,
les protéines précipitées sont colorées par une solution d’amidoschwarz. L’excès de colorant est éliminé en milieu acide.
Chaque gel d’agarose est prévu pour l’analyse de 6 échantillons pour le kit HYDRAGEL 6 IF Penta et pour l’analyse de 12 échantillons pour le kit
HYDRAGEL 12 IF Penta.
À usage in vitro exclusivement.
PRINCIPE DU TEST
L’électrophorèse et l’immunofixation des protéines permettent de détecter les immunoglobulines mono- et oligoclonales, marqueurs des
gammapathies. Celles-ci peuvent apparaître sous forme de bandes anormales de mobilité généralement gamma ou bêta, mais également alpha,
éventuellement masquées en électrophorèse par les protéines habituelles de ces zones.
L’immunofixation s’effectue grâce à un antisérum Pentavalent.
Elle se réalise en quatre étapes :
1. Séparation électrophorétique des protéines en gel d’agarose.
2. Fixation et immunoprécipitation des protéines séparées par électrophorèse : application du fixateur et de l’antisérum sur le gel, au niveau des
pistes de migration. Le fixateur et l’antisérum diffusent dans le gel. Le fixateur précipite toutes les protéines et les anticorps précipitent les
antigènes correspondants.
3. Élimination des protéines non précipitées par pompage et lavage. Les protéines précipitées restent piégées dans le gel.
4. Coloration des protéines et comparaison de la position des bandes immunoprécipitées avec celle des bandes anormales observées après
électrophorèse des protéines.
Pour détecter de façon précise la présence d’une bande monoclonale, l’échantillon est testé sur deux pistes. Après électrophorèse, la piste ELP sert
de référence grâce à la précipitation par le fixateur de toutes les protéines présentes ; la piste immunologique Penta permet de détecter la bande
monoclonale grâce à l’antisérum Pentavalent.
Cette technique simple et rapide donne une image claire et très facilement interprétable.
RÉACTIFS FOURNIS DANS LES KITS HYDRAGEL 6 IF Penta ET HYDRAGEL 12 IF Penta
COMPOSANTS RÉF. N° 4341 RÉF. N° 4342 RÉF. N° 4384* Gels d’agarose (prêts à l’emploi) 10 gels 10 gels 80 gels Mèches tamponnées (prêtes à l’emploi) 10 sachets de 2 10 sachets de 2 80 sachets de 2 Diluant colorant (solution concentrée) 1 fl. de 60 ml 1 fl. de 60 ml 8 fl. de 60 ml Colorant amidoschwarz (solution concentrée) 1 fl. de 20 ml 1 fl. de 20 ml 8 fl. de 20 ml Fixateur (prêt à l’emploi) 2 fl. de 2,9 ml Immunoglobulines totales de mammifère anti-Ig humaines (gamma-alpha-mu-kappa-lambda) = Pentavalent (prêtes à l’emploi)
2 fl. de 2,9 ml Applicateurs (prêts à l’emploi) 1 boîte de 10 2 boîtes de 10 16 boîtes de 10 Barrettes antisérums (prêtes à l’emploi) 1 boîte de 10 1 boîte de 10 8 boîtes de 10 Papiers-filtres fins 1 sachet de 10 1 sachet de 10 8 sachets de 10
| Papiers-filtres épais | 1 sachet de 10 | 1 sachet de 10 | 8 sachets de 10 |
* HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTE : Le fixateur et l’antisérum Pentavalent sont commercialisés séparément sauf pour le MAXI-KIT (voir RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS).
POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS
Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice.
LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION.
1. GELS D’AGAROSE
Préparation
Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/l ; tampon tris-barbital, pH 9,1 ± 0,1 ; composants sans danger aux
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Les gels contiennent 0,31 % de barbital et 0,34 % de barbital sodé. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter
immédiatement un médecin !
Utilisation
Support pour l’électrophorèse et l’immunofixation des protéines.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les gels peuvent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date
d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur
le devant du kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation
brutale de température.
NE PAS CONGELER.
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NOTICE D"UTILISATION SEBIA - Français

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Éliminer le gel dans les cas suivants :
(I) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ;
(II) apparition de bactéries ou de moisissures ;
(III) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation).
2. MÈCHES TAMPONNÉES
Préparation
Les mèches en éponge tamponnées sont prêtes à l’emploi. Chaque mèche tamponnée contient : tampon tris-barbital, pH 9,1 ± 0,3 ; azoture de
sodium ; composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Les mèches tamponnées contiennent 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sodé et 0,30 % d’azoture de sodium. Ne pas avaler !
En cas d’ingestion, consulter immédiatement un médecin ! L’azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas
de contact avec des acides, du plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des mèches, éviter tout contact avec ces produits.
Utilisation
Les mèches en éponge tamponnées jouent un rôle de réservoir de tampon pour l’électrophorèse et assurent le contact entre le gel et les électrodes.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les mèches tamponnées peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur.
Elles doivent être conservées horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur le devant du kit doit être pointée vers le haut).
Elles sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet des mèches tamponnées. NE PAS CONGELER.
Éliminer les mèches tamponnées si le sachet est ouvert ou si les mèches sont sèches.
3. DILUANT COLORANT
Préparation
Le diluant colorant concentré doit être utilisé comme décrit dans le paragrahe " COLORANT AMIDOSCHWARZ ". Il contient une solution acide.
Utilisation
Pour la préparation du colorant amidoschwarz.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le
kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant. NE PAS CONGELER.
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.
4. COLORANT AMIDOSCHWARZ
Préparation
Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la
solution finale et son pouvoir de coloration.
Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant :
1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré.
2. Refermer soigneusement le flacon.
3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes.
4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration.
5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire.
6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration.
7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes.
Le colorant est prêt à l’emploi.
REMARQUE : Une reprise incomplète du colorant peut entraîner une mauvaise coloration de la fraction albumine (baisse du pourcentage ou trou
blanc dans la fraction).
Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion.
Utilisation
Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique des protéines.
IMPORTANT : Le colorant est uniquement destiné à la coloration de 10 gels. Renouveler le colorant après 10 utilisations.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter
l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant.
La solution diluée est stable pendant 1 mois.
Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur.
5. COFFRET D’ANTISÉRUM ET DE FIXATEUR (Réf. N° 4384)
5.1. ANTISÉRUM PENTAVALENT
Préparation
L’antisérum Pentavalent est prêt à l’emploi. Il contient des immunoglobulines totales de mammifère anti-Ig humaines. Il a une couleur jaune-orangée
pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon.
Lorsque l’antisérum présente un léger trouble ou précipité, il suffit généralement de mettre le flacon à température ambiante environ 10 minutes avant
son utilisation. Si le trouble persiste, il ne perturbe en rien la réaction immunologique. Dans le cas de précipité insoluble, il est recommandé de
centrifuger l’antisérum pendant 5 minutes à 3000 rpm.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Utilisation
Pour l’immunofixation des protéines séparées par électrophorèse.
Les antisérums peuvent être d’origines animales différentes. Il est donc impératif de ne pas mélanger deux flacons différents d’antisérums, y compris
de la même spécificité, et de TOUJOURS changer l’embout de la pipette lors d’un changement de flacon.
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant
après toute utilisation.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
L’antisérum Pentavalent doit être conservé au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette
du flacon d’antisérum.
NOTE : Durant le transport, l’antisérum peut rester à température ambiante (entre 15 et 30 °C) pendant 15 jours sans que cela n’affecte la qualité du
test.
5.2. FIXATEUR
Préparation
Le fixateur est prêt à l’emploi. Il contient : une solution acide et des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des
performances optimales.
Il a une couleur spécifique pour éviter toute erreur lors de l’utilisation.
Utilisation
Pour la fixation des protéines séparées par électrophorèse sur la piste référence (ELP).
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant
après toute utilisation.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le fixateur peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette
du flacon de fixateur.
Il ne doit pas y avoir de précipité.
6. APPLICATEURS
Utilisation
Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons.
Conservation
Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
7. BARRETTES ANTISÉRUMS
Utilisation
Barrettes colorées, à usage unique, pour le dépôt du fixateur et de l’antisérum Pentavalent pour l’immunofixation.
ATTENTION : Manipuler avec précaution les barrettes contenant des antisérums.
8. PAPIERS-FILTRES FINS
Utilisation
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons.
Conservation
Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
9. PAPIERS-FILTRES ÉPAIS
Utilisation
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption des protéines non précipitées du gel après l’étape d’immunofixation.
Conservation
Les papiers-filtres épais doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS
1. COFFRET D’ANTISÉRUM ET DE FIXATEUR IF Penta (pour les kits 4341 et 4342)
Le coffret Antisérum et Fixateur pour immunofixation IF Penta (SEBIA, référence N° 4345) contient un flacon d’antisérum Pentavalent et un flacon de
fixateur de 2,9 mL chacun, spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec le masque dynamique.
1.1. ANTISÉRUM PENTAVALENT
Voir paragraphe précédent 5.1.
1.2. FIXATEUR
Voir paragraphe précédent 5.2.
2. DÉCOLORANT
Préparation
Chaque flacon de décolorant concentré (SEBIA, référence N° 4540, 10 flacons de 100 ml chacun) doit être dilué au 1/1 000 avec de l’eau distillée ou
déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution décolorante.
Prélever par quantité de 5 ml et compléter à 5 litres avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/l.
Utilisation
Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant après coloration du gel.
Pour le rinçage de la cuve de coloration après lavage.
Pour neutraliser l’acidité du décolorant, mettre dans le flacon de vidange vide, 15 ml de soude à 50 % (solution du commerce).
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Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou
sur l’étiquette du flacon de décolorant.
Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon fermé.
Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.
En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µl/l de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération microbienne.
Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée
sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant.
3. SOLUTION DE LAVAGE HYDRASYS
Préparation
Chaque flacon de solution de lavage HYDRASYS concentrée (SEBIA, référence N° 4541, 10 flacons de 80 ml chacun) doit être complété à 5 litres
avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution, la solution de lavage contient : tampon alcalin, pH 8,8 ± 0,3 ; azoture de sodium.
ATTENTION : La solution de lavage concentrée contient 0,625 % d'azoture de sodium. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter
immédiatement un médecin ! L'azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de contact avec des acides, du
plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité d’eau.
Utilisations
Pour le lavage du gel après immunofixation afin d’éliminer les protéines résiduelles non précipitées.
Pour le lavage périodique de la cuve de coloration de l’HYDRASYS : par exemple, pour une utilisation journalière, effectuer un lavage hebdomadaire
de la cuve de coloration.
Voir la notice de la solution de lavage pour les instructions d’utilisation.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les solutions de lavage concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés. Elles sont stables
jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de solution de lavage.
Éliminer la solution de lavage diluée s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.
4. FLUIDIL
Préparation
Le Fluidil (SEBIA, référence N° 4587, 1 flacon de 5 ml) est prêt à l’emploi.
Utilisation
Pour la dilution des échantillons visqueux ou troubles (turbidité induite par la présence d’une cryoglobuline ou d’un cryogel).
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le Fluidil peut être conservé à température ambiante. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette du flacon de Fluidil.
Il ne doit pas y avoir de précipité.
ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES
1. Système HYDRASYS SEBIA, référence N° 1210 ou N° 1211.
2. Micropipetteur, manuel ou automatique, tel que HYDRAplus SEBIA, référence N° 1215, pour le chargement des applicateurs ou des barrettes
antisérums.
3. Chambre humide, référence N° 1270, fournie avec le système HYDRASYS.
4. Bidons plastiques fournis avec le système HYDRASYS.
5 Barre métallique du masque SEBIA, fournie avec le système HYDRASYS.
6. Masque dynamique, SEBIA, référence N° 1255.
7. Pipettes de 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µL, 100 µl et 200 µl.
ÉCHANTILLONS À ANALYSER
Prélèvement et conservation des échantillons
L’analyse se fait sur sérums frais. Les sérums doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques.
Les sérums peuvent être conservés une semaine au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C).
Pour des conservations prolongées, congeler les échantillons ; les échantillons congelés sont stables au minimum 1 mois. Les échantillons
décongelés peuvent donner au point de dépôt, une trace due à la dénaturation de protéines ou de lipoprotéines.
La conservation des sérums congelés est améliorée par addition à l’échantillon d’azoture de sodium 0,2 g/l.
Préparation des échantillons
Utiliser directement les échantillons de sérum non dilués.
Après conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C) ou congélation, certains sérums (en particulier ceux qui contiennent une cryoglobuline ou un
cryogel) deviennent visqueux ou troubles. Ces sérums présentent des difficultés de manipulation lors du dépôt avec l’applicateur HYDRASYS, car ils
ne diffusent que très difficilement sur les dents de l’applicateur. Prétraiter ces sérums avec le Fluidil : ajouter 25 µl de Fluidil à 75 µl de sérum, agiter
15 secondes au vortex, puis suivre la technique.
Certaines paraprotéines sont polymérisées, le sérum présente alors une bande d'allure "monoclonale" au niveau du point de dépôt sur les deux pistes.
Préparer une solution réductrice en ajoutant 1 % de ß-mercaptoéthanol (BME) dans le Fluidil (cette solution se conserve une semaine à température
ambiante en microtube hermétiquement fermé). Prétraiter ces sérums par cette solution : ajouter 25 µl de solution réductrice à 75 µl de sérum pur,
agiter au vortex et laisser en contact 15 minutes minimum (30 minutes maximum), puis suivre la technique.
Échantillon à éviter
Ne pas utiliser de plasma. Le fibrinogène donne une bande proche du point de dépôt. Cette bande peut fausser l’interprétation du test (confusion avec
une gammapathie).
Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
TECHNIQUE
Le système HYDRASYS est un instrument multiparamétrique semi-automatique qui assure le traitement des HYDRAGEL selon les étapes suivantes :
application des échantillons, migration électrophorétique, incubation avec les réactifs, séchage, lavage, coloration, décoloration et séchage final.
Les étapes manuelles sont les suivantes : préparation des échantillons et des gels, dépôt des réactifs et lancement des séquences automatiques.
LIRE ATTENTIVEMENT LE MANUEL D’INSTRUCTIONS D’HYDRASYS.
I. PRÉPARATION DE LA MIGRATION
1. Mettre HYDRASYS sous tension.
2. Poser un applicateur pour l’analyse de 6 échantillons sur HYDRAGEL IF Penta 6/12 ou deux applicateurs pour l’analyse de 12 échantillons,
à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 1).
- Déposer 10 µl d’échantillon pur dans chaque puits. Le chargement de chaque applicateur ne doit pas excéder 2 minutes.
| PUITS DE DÉPÔT |
ÉCHANTILLONS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
IMPORTANT : Ne pas utiliser les puits de l’applicateur numérotés 1, 8 et 15 ; il est recommandé de les identifier au préalable à l’aide d’un
marqueur pour éviter d’y déposer l’échantillon par erreur.
- Placer l’(es) applicateur(s) dans la chambre humide, dents vers le haut (en manipulant l’(es) applicateur(s) par la protection en plastique).
Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation.
- Laisser diffuser 5 minutes après le dépôt du dernier échantillon.
Pour une conservation prolongée (8 heures maximum), placer la chambre humide au réfrigérateur.
3. Ouvrir le capot du module de migration et relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.
ATTENTION : Ne pas fermer le capot de l’appareil si les chariots sont relevés !
4. Sélectionner le programme de migration "6/12 PENTA MS/MD" dans le menu.
5. Sortir les mèches tamponnées de leur emballage en les manipulant par les languettes plastiques.
Fixer les mèches sur le chariot porte-électrodes à l'aide des languettes perforées. La face de la mèche fixée sur la languette vient en contact
avec l'électrode (Fig. 2).
6. Sortir le gel de son emballage.
- Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin.
ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation.
- Déposer 200 µl d'eau distillée ou déminéralisée sur le plateau de migration dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.
- Placer le gel (face gel orientée vers le haut) sur le plateau contre la barrette, à l'intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 3).
- Donner une forme concave au gel (Fig. 3) et le dérouler sur le plateau jusqu'au contact de la goutte d'eau qui doit se répartir sur toute la
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d'air éventuellement piégées puis dérouler totalement le gel au contact du
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.
7. Abaisser l'ensemble des chariots jusqu'en butée. Dans cette position, les mèches tamponnées ne touchent pas le gel. NE PAS FORCER LA
DESCENTE DES CHARIOTS.
8. Sortir l’(es) applicateur(s) de la chambre humide en le(s) manipulant par la protection plastique.
- Éliminer la protection des dents.
- Pour l’analyse de 6 échantillons sur HYDRAGEL IF Penta 6/12, placer l'applicateur en position N° 6 sur le porte-applicateurs.
- Pour l’analyse de 12 échantillons, placer les applicateurs en positions N° 3 et N° 9.
IMPORTANT : Les numérotations de l'applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4).
9. Fermer le capot du module de migration.
10. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur "START" (flèche verte à gauche du clavier).
IMPORTANT : Ne rien placer à proximité immédiate de la grille de ventilation (à droite de l’appareil).
MIGRATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES
• Descente des chariots porte-électrodes et porte-applicateurs pour amener les mèches tamponnées et l’(es) applicateur(s) au contact du gel.
• Remontée du chariot porte-applicateurs.
• Migration à 20 W constants, à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, jusqu’à 42 Vh accumulés (pendant environ 9 minutes).
• Déconnexion des électrodes par remontée du chariot porte-électrodes.
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque.
A l’écran, s’affiche le message : " AS".
NOTE : Pendant toutes les séquences de migration, le capot du module de migration reste verrouillé.
II. PRÉPARATION DE L’IMMUNOFIXATION
Les différents éléments du masque dynamique (repère couleurs, barrette antisérums, support barrette, guide et réducteur de course) sont présentés
sur la figure 5.
Pendant la migration, préparer le masque dynamique en procédant comme suit :
1. Poser le guide du masque dynamique à plat sur la paillasse.
IMPORTANT : L’analyse de six échantillons à l’aide du masque dynamique nécessite l’utilisation du réducteur de course qui doit être placé
sur le guide du masque dynamique.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
2. Positionner une barrette antisérums sur le support barrette (Fig. 6) :
- Placer les bossages de la barrette, inclinée à 45°, contre les ressorts du support barrette.
- En prenant appui contre ces ressorts, faire pivoter la barrette pour la fixer dans les encoches du support barrette.
ATTENTION : Vérifier que la barrette soit fixée correctement sur le support barrette : les ergots situés aux extrémités de la barrette
doivent être bien enclenchés dans les deux encoches du support barrette.
3. Placer l’ensemble barrette – support barrette sur le guide du masque dynamique (Fig. 7) (équipé d’un réducteur de course pour l’analyse de
6 échantillons) puis placer le repère couleurs qui indique les emplacements de dépôt des réactifs, correspondant à la technique, sur le support
barrette devant les puits de la barrette antisérums (Fig. 8).
4. Déposer les réactifs, dont la couleur est rappelée dans le tableau ci-dessous, sur la barrette antisérums :
- 8 µl par puits pour l’analyse de 6 échantillons et,
- 12 µl par puits pour l’analyse de 12 échantillons.
| PISTE | DÉSIGNATION | COULEUR |
| ELP | solution de fixation | jaune |
| Penta | antisérum Pentavalent | jaune-orangé |
NOTE : Pour éviter les inversions, les réactifs sont colorés et la couleur de la piste à remplir est rappelée sur le repère couleurs de dépôt des réactifs.
IMPORTANT : Ne pas utiliser les puits de la barrette antisérums en positions 1, 8 et 15.
Lors du prélèvement des réactifs, ne pas piéger de bulles d'air dans l'embout de la pipette.
Pour déposer les réactifs (Fig. 9) :
- tenir la pipette inclinée,
- en appliquant légèrement l’embout sur le bord de l’orifice, déposer la goutte de réactif dans le puits.
5. Retirer le repère couleurs.
III. IMMUNOFIXATION
1. Ouvrir le capot du module de migration.
2. Retirer l’(es) applicateur(s) et le(s) jeter.
3. Relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes, retirer les mèches par les languettes et les jeter.
- Retirer les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.
- Nettoyer les électrodes avec un papier ouaté humide.
- Laisser le gel en place dans le module de migration.
4. Mettre en place le masque dynamique de dépôt des réactifs en procédant comme suit (Fig. 10) :
- fixer la tige destinée à l'accrochage du masque dynamique, à l'aide des plots de fixation. (Une fois mise en place, cette tige peut être laissée
sur l'HYDRASYS) ;
- placer les encoches du masque dans les repères de la tige en tenant le masque par la poignée ;
- faire pivoter le masque pour l'appliquer sur le plateau de l’HYDRASYS.
IMPORTANT : Régler au préalable la position du masque pour obtenir une parfaite correspondance entre les profils électrophorétiques du gel
et les pistes de révélation du masque.
5. Caler le support-barrette sur le guide au plus bas, dirigé vers l’opérateur. Tout en maintenant l’ensemble du support-barrette par la poignée
située à droite, exercer une pression sur le point d’appui central, pour amener la barrette en contact avec le gel. Relacher cette pression, les
réactifs s’étalent alors sous chacune des pistes (Fig. 11).
6. Immédiatement, à l’aide de la poignée située à droite, répartir les réactifs en effectuant un aller-retour du masque dynamique au-dessus du
gel d’un mouvement lent et régulier (environ 5 secondes) (Fig. 12).
ATTENTION : Pendant cette opération, le masque ne doit être tenu que par la poignée sans toucher au guide. Ne jamais appuyer
une seconde fois : les réactifs risquent de se mélanger.
7. Retirer l’ensemble guide – masque dynamique :
- tenir le guide par la poignée ;
- faire pivoter le guide autour de la tige et le décrocher ;
- décrocher la barrette du support barrette et la jeter.
ATTENTION : Manipuler avec précaution les barrettes contenant des antisérums.
- Un léger excès de réactifs subsiste sur le gel sous la forme d’une goutte au niveau des orifices des puits quand le masque est retiré, sans
aucun effet sur les résultats.
8. Fermer le capot du module de migration.
9. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur "START" (flèche verte à gauche du clavier).
À l'écran, s'affiche le message : "[INCUBATION]".
IMMUNOFIXATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES
• Incubation à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 5 minutes.
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque.
À l'écran, s'affiche le message : " PAP.".
NOTE : Pendant la séquence d'incubation, le capot du module de migration reste verrouillé.
IV. POMPAGE DU GEL
1. Ouvrir le capot du module de migration.
2. Appliquer une feuille de papier-filtre épais sur le gel :
- incliner la feuille de papier-filtre épais d'environ 45° et aligner le bord inférieur de la feuille de papier-filtre sur la barrette de positionnement
du gel ;
- faire pivoter la feuille de papier-filtre et l'appliquer sur le gel.
IMPORTANT : Bien appuyer sur toute la surface de la feuille de papier-filtre pour assurer un contact parfait entre le gel et le papier.
3. Fermer le capot du module de migration.
4. Démarrer la séquence en appuyant sur "START" (flèche verte à gauche du clavier).
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
POMPAGE DU GEL - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES
• Pompage à 40 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 3 minutes.
À l'écran, s'affiche le message : "[POMPAGE]".
• Un signal sonore (bip) retentit.
À l'écran, s'affiche le message : "❊ PAP.".
V. SÉCHAGE DU GEL
1. Ouvrir le capot du module de migration.
2. Retirer le papier-filtre en laissant le film en place.
3. Fermer le capot du module de migration.
4. Démarrer la séquence en appuyant sur "START" (flèche verte à gauche du clavier).
SÉCHAGE - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES
• Séchage à 50 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 6 minutes.
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque. Le plateau reste à 50 °C jusqu'à l'ouverture du capot.
NOTE : Pendant toute la séquence de séchage, le capot du module de migration reste verrouillé.
VI. PRÉPARATION DES SÉQUENCES DE LAVAGE, COLORATION ET DÉCOLORATION DU GEL
1. Ouvrir le capot du module de migration.
2. Récupérer le film pour les séquences suivantes.
3. Placer le film sur le porte-film, face gel vers l'opérateur, en procédant comme suit (Fig. 13) :
- ouvrir le porte-film ;
- le poser à plat sur la paillasse ;
- positionner le gel dans les gorges des colonnettes ;
- refermer le porte-film ;
- s'assurer que le film soit bien enfoncé dans les gorges des deux colonnettes.
4. Introduire le porte-film dans le module de traitement / coloration du gel.
IMPORTANT : Avant de lancer un cycle de coloration, s'assurer que :
- le flacon de solution de lavage contienne 400 ml de solution de lavage ;
- le flacon de colorant contienne 300 ml de colorant ;
- le flacon de décolorant contienne 1 litre de décolorant minimum ;
- le flacon de vidange soit vide.
Pour le branchement des canaux réactifs : se référer aux instructions affichées sur l’écran de l’appareil (sélectionner la touche : VISU
CANAUX).
IMPORTANT : Ne pas oublier d’obturer les canaux non utilisés.
5. Sélectionner le programme de coloration "IF AMIDO" dans le menu.
- Démarrer la séquence en appuyant sur "START" (flèche verte à droite du clavier).
Pendant toutes les séquences de coloration, décoloration et séchage, le système reste verrouillé.
Après refroidissement de la cuve, un signal sonore (bip) retentit et le système se débloque (la ventilation se maintient jusqu’à la récupération
du porte-film).
NOTES :
- La température du plateau continue à descendre et atteint 20 °C en 5 minutes environ. À 20 °C, une nouvelle séquence de migration peut être
lancée.
- Remettre les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.
- Nettoyer le plateau avec un papier ouaté humide.
VII.FIN DU TRAITEMENT DU GEL
1. Sortir le porte-film du compartiment ; ouvrir le porte-film et retirer le gel sec.
2. Si nécessaire, nettoyer le dos du gel (support plastique) avec un papier ouaté humide.
NOTE : Pour les gels à rangées multiples (2 ou 3), les longueurs de migration peuvent être sensiblement différentes, sans aucune conséquence
sur les résultats.
RÉSULTATS
L’antisérum Pentavalent permet la détection des :
• immunoglobulines : Ig A (K ou L), Ig G (K ou L), Ig M (K ou L) ;
• chaînes légères libres kappa ou lambda ;
• immunoglobulines : Ig D (K ou L), Ig E (K ou L), qui sont détectées par leurs chaînes légères kappa ou lambda.
Interprétation
Un échantillon normal présente une zone diffuse peu colorée, sans bande focalisée, correspondant aux immunoglobulines polyclonales G, A, M, K et L.
Une hypergammaglobulinémie entraîne une zone diffuse beaucoup plus colorée mais sans fraction monoclonale.
La présence d’une gammapathie est caractérisée par une ou plusieurs bandes monoclonales révélées par l’antisérum Pentavalent.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Cas particuliers
• Une discrète gammapathie monoclonale (par exemple, une dysglobuline de mobilité bêta) peut être cachée dans un profil électrophorétique normal.
Cette fraction peut être détectée par l’antisérum Pentavalent.
• Une hypogammaglobulinémie peut être associée à une chaîne légère libre monoclonale à la limite de détection qui, vu son faible poids moléculaire,
est éliminée dans les urines sous forme de protéine de Bence Jones. La quantité résiduelle dans le sérum est très faible, mais l’antisérum
Pentavalent, par sa réaction d’amplification, permet sa détection.
• Une bande d’allure monoclonale observée à l’électrophorèse mais non retrouvée sur la piste immunoprécipitée peut indiquer la présence de
fibrinogène.
• Une précipitation sur les deux pistes, au niveau du point de dépôt, peut indiquer la présence d’une Ig M polymérisée ou d’une cryoglobuline qu’il
conviendra d’identifier après traitement réducteur (voir " Échantillons à analyser ").
Toute bande monoclonale détectée par l’antisérum Pentavalent nécessite obligatoirement une identification à l’aide des kits immunofixation :
• HYDRAGEL 1 IF (SEBIA, réf. N° 4301), HYDRAGEL 2 IF (SEBIA, réf. N° 4302), HYDRAGEL 4 IF (SEBIA, réf. N° 4304 ou 4308) ou HYDRAGEL
9 IF (SEBIA, réf. N° 4309),
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES (SEBIA, réf. N° 4321), HYDRAGEL 2 BENCE JONES (SEBIA, réf. N° 4322) ou HYDRAGEL 4 BENCE JONES
(SEBIA, réf. N° 4324).
Interférences et limites
L’utilisation d’antisérums autres que ceux spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec le masque dynamique peut affecter la qualité des
résultats.
Compte tenu des principes analytiques des techniques actuelles (principes de l’électrophorèse de zone, résolution et sensibilité), aucune garantie ne
peut être donnée quant à la détection totale de toutes les composantes monoclonales.
Assistance technique
Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux.
Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès
du Service Technique SEBIA.
PERFORMANCES
Reproductibilité intra-essai
Migration de trois (3) échantillons de sérums pathologiques : Deux sérums à forte gammapathie monoclonale et un sérum présentant une faible
paraprotéine.
La migration et l’immunofixation de chaque échantillon ont été réalisées sur 2 lots différents de gels HYDRAGEL IF Penta 6/12 à raison de 12 analyses
par gel, suivies d’une coloration à l’amidoschwarz.
Tous les échantillons analysés donnent les mêmes résultats pour les 2 lots de gels testés. Les profils obtenus sont identiques et caractéristiques pour
chacun des échantillons testés.
En effet, l’immunofixation ne détecte qu’une bande monoclonale pour chacun des trois échantillons pathologiques.
Reproductibilité inter-essais
Migration de douze (12) échantillons de sérums pathologiques présentant une ou plusieurs paraprotéines.
La migration et l’immunofixation de chaque échantillon ont été réalisées sur 10 gels HYDRAGEL IF Penta 6/12 de 3 lots différents, suivies d’une
coloration à l’amidoschwarz.
Tous les échantillons analysés donnent les mêmes résultats pour les 3 lots de gels testés. Les profils obtenus sont identiques et caractéristiques des
échantillons analysés et l’immunofixation met en évidence les bandes monoclonales attendues pour tous les échantillons.
Exactitude
Quatre vingt cinq (85) échantillons différents de sérums pathologiques et onze (11) sérums normaux ont été testés en parallèle dans la technique
HYDRAGEL 12 IF Penta et sur un autre système en gel d’agarose disponible dans le commerce.
Pour les deux techniques, les résultats obtenus montrent une parfaite corrélation entre les deux systèmes d’analyse et les mêmes bandes anormales
ont été mises en évidence pour tous les échantillons pathologiques analysés, avec une sensibilité de 100 % et une spécificité de 100 % par rapport
à cette dernière technique, calculées selon la méthode recommandée (Wendling, 1986).
Sensibilité
Trois sérums à gammapathie ont été dilués en série et analysés sur gel HYDRAGEL IF Penta 6/12 avec coloration à l’amidoschwarz.
Les résultats sont résumés ci-dessous.
BANDE MONOCLONALE LIMITE DE DÉTECTION (g/l) ÉCHANTILLON N° TYPE CONC. (g/l) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 10,9 0,12 2 alpha, lambda 5,8 0,25
| 3 | mu, kappa | 3,4 | 0,12 |
Selon la position de la bande monoclonale et le fond polyclonal de la zone des gammaglobulines, le seuil de détection d’une paraprotéine peut varier
de 0,12 à 0,25 g/L.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
BIBLIOGRAPHIE
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir :
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
INTENDED USE
The HYDRAGEL 6 IF Penta and HYDRAGEL 12 IF Penta kits are designed for the detection of monoclonal proteins in human serum by immunofixation
electrophoresis on alkaline buffered (pH 9.1) agarose gels. They are used in conjunction with the semi-automated HYDRASYS system to perform all
the steps needed to obtain gels ready for interpretation. Serum proteins are electrophoresed and immunofixed by a Pentavalent antiserum anti-gamma
(Ig G), alpha (Ig A) and mu (Ig M) heavy chains, and anti-kappa and lambda (free and bound) light chains. After immunofixation, the precipitated
proteins are stained with amidoblack. The excess of stain is removed with an acidic solution.
Each agarose gel in the HYDRAGEL 6 IF Penta and HYDRAGEL 12 IF Penta kits is intended to run six or twelve samples, respectively.
For In Vitro Diagnostic Use.
PRINCIPLE OF THE TEST
Abnormal bands in the electrophoretic pattern of serum proteins, generally with a gamma-mobility, but also alpha- and beta-mobility (these might be
hidden by regular proteins of the corresponding zones), are always suspect of being monoclonal proteins and therefore an indication of gammopathies.
To identify these abnormal bands, the technique of immunofixation is applied.
Immunofixation electrophoresis is a simple technique that allows a protein to be anchored in situ after electrophoresis, by forming an insoluble complex
with its antibody. It is performed in four stages:
1. Separation of proteins by electrophoresis on agarose gel.
2. Fixation and immunoprecipitation of the electrophoresed proteins: fixative solution and antiserum are overlaid directly onto the gel surface over
the appropriate electrophoretic migration tracks. The fixative solution and antiserum diffuse into the gel, precipitating all the proteins and the
corresponding antigens, respectively.
3. The unprecipitated, soluble proteins are removed from the gel by blotting and washing. Precipitin of the antigen-antibody complex is trapped within
the gel matrix.
4. The precipitated proteins are visualized by staining. The immunoprecipitated bands are then compared with the corresponding abnormal bands
seen in the electrophoretic pattern of serum sample.
To detect the suspect monoclonal component(s), the samples are simultaneously electrophoresed in two tracks. After electrophoresis, the ELP track
serves as a reference showing electrophoretic pattern of the sample’s proteins. The immunofixation (Penta) track reveals monoclonal components that
reacted with the Pentavalent antiserum.
This simple and fast technique gives a clear and easily interpretable picture.
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE HYDRAGEL 6 IF Penta AND HYDRAGEL 12 IF Penta KITS
ITEMS PN 4341 PN 4342 PN 4384* Agarose Gels (ready to use) 10 gels 10 gels 80 gels Buffered Strips (ready to use) 10 packs of 2 each 10 packs of 2 each 80 packs of 2 each Staining solution diluent (stock solution) 1 vial, 60 mL 1 vial, 60 mL 8 vials, 60 mL each Amidoblack Stain (stock solution) 1 vial, 20 mL 1 vial, 20 mL 8 vials, 20 mL each Fixative Solution (ready to use) 2 vials, 2.9 mL each Mammalian anti-Ig human immunoglobulins (gamma - alpha - mu - kappa - lambda) : Pentavalent antiserum (ready to use)
2 vials, 2.9 mL each Applicators (ready to use) 1 pack of 10 2 packs of 10 each 16 packs of 10 each Antisera segments (ready to use) 1 pack of 10 1 pack of 10 8 packs of 10 each Filter Papers-Thin 1 pack of 10 1 pack of 10 8 packs of 10 each
| Filter Papers-Thick | 1 pack of 10 | 1 pack of 10 | 8 packs of 10 each |
*HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTE : The fixative solution and the Pentavalent antiserum are supplied separately from the kits except for MAXI-KIT (See REAGENTS REQUIRED
BUT NOT SUPPLIED).
FOR OPTIMAL RESULTS
All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions.
PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY.
1. AGAROSE GELS
Preparation
Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations
used, necessary for optimum performance.
WARNING: Agarose gels contain 0.31 % barbital and 0.34 % sodium barbital. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately !
Use
Support medium for protein electrophoresis and immunofixation.
Storage, stability and signs of deterioration
Store gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). They are stable until the
expiration date indicated on the kit package and the gel package labels. (The arrow on the front of the kit box must be pointing upwards). Avoid storage
close to a window or to a heat source. Avoid important variation of temperature during storage.
DO NOT FREEZE.
Discard when:
(i) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel),
(ii) bacterial or mold growth is indicated,
(iii) abnormal liquid quantity is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions).
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SEBIA INSTRUCTIONS - English

2. BUFFERED STRIPS
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Preparation
Buffered sponge strips are ready to use. Each contains: tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.3 ; sodium azide ; additives, nonhazardous at concentrations
used, necessary for optimum performance.
WARNING: The buffer in the strips contains 0.92 % barbital, 1.03 % sodium barbital and 0.30 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested
consult physician immediately ! When disposing, prevent contact with acids, lead or copper, as these are known to form explosive or toxic
compounds with sodium azide.
Use
Buffered sponge strips function as electrophoresis buffer reservoir and ensure contact between the gel and electrodes.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the buffered strips horizontally in the original protective packaging at room temperature or refrigerated. (The arrow on the front of the kit box
must be pointing upwards).
They are stable until the expiration date indicated on the kit package or buffered strips package label.
DO NOT FREEZE.
Discard buffered strips if the package is opened and the strips dry out.
3. STAINING SOLUTION DILUENT
Preparation
The stock staining solution diluent must be used as described in paragraph " AMIDOBLACK STAIN ".
It contains an acidic solution.
Use
For the preparation of the amidoblack staining solution.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining
solution diluent vial labels. DO NOT FREEZE.
Do not add any sodium azide.
4. AMIDOBLACK STAIN
Preparation
The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in
viscosity or solidification.
In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure:
1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial.
2. Close carefully the vial.
3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds.
4. Pour this solution in the container for staining solution processing.
5. Repeat this step twice, three times if necessary.
6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water.
7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes.
The staining solution is ready to use.
NOTE : An incomplete reconstitution of the stain will lead to an under-evaluation of albumin fraction (low percentage or white hole inside the fraction).
After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at
concentrations used, necessary for optimum performance.
WARNING: Harmful if swallowed.
Use
For staining gels with electrophoretic protein separations.
IMPORTANT : The staining solution is designed to stain only 10 gels. Change the solution after 10 staining steps.
Storage, stability and signs of deterioration
Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution
is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels.
Working staining solution is stable for 1 month.
Do not store the working staining solution close to a heat source.
5. ANTISERA AND FIXATIVE PACK (with PN 4384)
5.1. PENTAVALENT ANTISERUM
Preparation
Pentavalent antiserum is ready to use. Pentavalent antiserum is a mixture of mammalian total anti-Ig human immunoglobulins.
For easy identification and as an aid in monitoring its application, the antiserum is colored with a nonhazardous yellow-orange dye that matches the
color of the vial label.
When antiserum exhibits a slight turbidity, leave the antiserum vial at room temperature for a minimum of 10 minutes. This should be sufficient to clear
the solution ; however, if turbidity remains, this should not affect in any way the immunological reaction. In case of insoluble precipitates, it is
recommended to centrifuge antiserum for 5 minutes at 3000 rpm.
Use
For immunofixation of the electrophoresed proteins.
Antisera may originate from different animal species. Don’t mix two different antisera vials, even with the same specificity, and ALWAYS change the
tip of the pipette when changing antiserum vials.
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Storage, stability and signs of deterioration
Store the Pentavalent antiserum refrigerated (2 to 8 °C). It is stable until the expiration date indicated on the kit package or antiserum vial labels.
NOTE: During transportation, the antiserum can be kept without refrigeration (15 to 30 °C) for 15 days without any adverse effects on performance.
5.2. FIXATIVE SOLUTION
Preparation
Fixative solution is ready to use. It contains: acidic solution ; additives, nonhazardous at concentrations used, necessary for optimum performance.
For an easy identification and as an aid in monitoring its application, the fixative is colored with a nonhazardous dye.
Use
To fix electrophoretically separated proteins in the reference track (ELP).
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.
Storage, stability and signs of deterioration
Store fixative solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or fixative solution vial
labels.
Fixative solution must be free of precipitate.
6. APPLICATORS
Use
Precut, single use applicators for sample application.
Storage
Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated.
7. ANTISERA SEGMENTS
Use
Single use, colored segments for fixative solution and antiserum application onto the gel for immunofixation.
WARNING : Segments with antisera have to be handled with care.
8. FILTER PAPERS - THIN
Use
Single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application.
Storage
Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.
9. FILTER PAPERS - THICK
Use
Single use, thick absorbent paper pads for blotting unprecipitated proteins off the gel after immunofixation step.
Storage
Store the thick filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
1. ANTISERUM AND FIXATIVE SOLUTION PACK (for 4341 and 4342 kits)
The antiserum and fixative solution pack for IF Penta immunofixation, SEBIA, PN 4345, contains 1 Pentavalent antiserum vial and 1 fixative solution
vial (2.9 mL each). They are specific for the immunofixation procedure with the dynamic mask.
1.1. ANTISERUM
See previous paragraph 5.1.
1.2. FIXATIVE SOLUTION
See previous paragraph 5.2.
2. DESTAINING SOLUTION
Preparation
Each vial of stock Destaining Solution (SEBIA, PN 4540, 10 vials, 100 mL each) to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is
convenient to dilute only 5 mL of the stock solution to 5 liters, the volume of the destaining solution container. After dilution, the working destaining
solution contains: citric acid, 0.05 g/dL.
Use
For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels.
For rinsing of the staining compartment after wash step.
To neutralize the acidity of the destaining solution, pour 15 mL of a 50% solution of sodium hydroxide into the empty waste container.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining
solution vial labels. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. Do not add any sodium azide.
Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.
To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µL/dL of ProClin 300.
Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on the
kit package or destaining solution vial labels.
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3. HYDRASYS WASH SOLUTION
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Preparation
Each vial of the stock HYDRASYS Wash Solution (SEBIA, PN 4541, 10 vials, 80 mL each) to be diluted up to 5 liters with distilled or deionized water.
After dilution, the working wash solution contains: alkaline buffer pH 8.8 ± 0.3 ; sodium azide.
WARNING: The stock wash solution contains 0.625 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately ! Sodium
azide may lead to formation of explosive or toxic compounds when in contact with acids, lead or copper. Always flush with a large quantity
of water when disposing.
Use
The HYDRASYS wash solution is designed to wash unprecipitated proteins from gels. It also serves for cleaning of the HYDRASYS Staining
Compartment. Use periodically, e.g., if the instrument is used daily, wash the staining compartment weekly.
See the package insert for directions to use.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the stock and working wash solutions in closed containers at room temperature or refrigerated. They are stable until the expiration date indicated
on the wash solution vial label.
Discard working wash solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.
4. FLUIDIL
Preparation
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 mL) is ready to use.
Use
To dilute viscous or turbid samples, e.g., sera containing cryoglobulin or cryogel.
Storage, stability and signs of deterioration
Store at room temperature. It is stable until the expiration date indicated on the Fluidil vial label.
Fluidil must be free of precipitate.
EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 or PN 1211.
2. Micropipettor, either manual or automated, such as HYDRAplus SEBIA, PN 1215, for an alternative way of loading the sample applicators or
antisera segments.
3. Wet Storage Chamber, PN 1270, supplied with HYDRASYS.
4. Container Kit supplied with HYDRASYS.
5 Template guide Bar SEBIA, supplied with HYDRASYS.
6. Dynamic mask, SEBIA, PN 1255.
7. Pipettes: 8 µL, 10 µL, 12 µL, 20 µL, 100 µL and 200 µL.
SAMPLES FOR ANALYSIS
Sample collection and storage
Fresh serum samples are recommended for analysis. Sera must be collected according to established procedures used in clinical laboratory testing.
If needed, store sera at 2 to 8 °C for up to one week.
For longer storage periods, freeze the samples. Frozen samples are stable for at least one month.
Thawed samples may give slight application marks due to protein or lipoprotein denaturation.
Frozen serum samples with sodium azide, 0,02 g/dL improves the storage stability.
Sample preparation
Use undiluted serum samples.
After storage at 2 to 8 °C or freezing, some sera (particularly those containing a cryoglobulin or cryogel) may become viscous or develop turbidity.
Such sera might present application problems due to hindered diffusion through the sample applicator teeth. In such case add 25 µL Fluidil to 75 µL
of serum and vortex for 15 seconds. Then follow the standard procedure.
Some monoclonal proteins can polymerize resulting in a "monoclonal fraction" appearing on all immunofixed tracks. In this case (i) prepare 1 % betamercaptoethanol
(BME, or 2-mercaptoethanol, 2ME) in Fluidil, (ii) add 25 µL of this reducing solution to 75 µL neat serum, (iii) vortex and wait at least
15 minutes minimum (maximum 30 minutes) and then follow the standard procedure.
Sample to avoid
Avoid plasma samples: fibrinogen gives a band in the reference track close to the application point that might be taken for a monoclonal
immunoglobulin.
Avoid hemolyzed samples.
PROCEDURE
The HYDRASYS system is a semi-automated multi-parameter instrument. The automated steps include processing of HYDRAGEL agarose gels in
the following sequence: sample application, electrophoretic migration, incubation with fixative solution and antiserum, drying, staining, destaining and
final drying. The manual steps include handling samples and gels, application of fixative and antiserum and setting up the instrument for operation.
READ CAREFULLY HYDRASYS INSTRUCTION MANUAL.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
I. MIGRATION SET UP
1. Switch on HYDRASYS instrument.
2. Place one applicator for 6 samples analysis on HYDRAGEL IF Penta 6/12 or two applicators for 12 samples analysis, on a flat surface with
the well numbers in the right-side-up position (Fig. 1).
- Apply 10 µL neat sample in each well. Load each applicator within 2 minutes.
| WELLS |
SAMPLES ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
NOTE: The wells no. 1, 8 and 15 are not used in this test ; they may be marked with a felt tip pen to avoid filling them with samples by mistake.
- Place each applicator into the wet storage chamber with the teeth up [handle it by the plastic tooth protection frame].
See wet chamber package insert for further details.
- Let the samples diffuse into the teeth for 5 minutes after the last sample application. For later use (up to 8 hours), keep the entire chamber
under refrigeration.
3. Open the lid of the Migration Module and raise the electrode and applicator carriers.
WARNING: Never close the lid while the carriers are raised !
4. Select "6/12 PENTA SM/DM" migration program from the instrument menu (left side of the keyboard).
5. Remove buffered strips from the package ; handle them by the plastic ends. Engage the punched ends of the strip's plastic backing to the pins
on the electrode carrier ; the strip's plastic backing must face the carrier (Fig. 2).
6. Unpack the HYDRAGEL plate.
- Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately.
WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration.
- Pool 200 µL of distilled or deionized water on the lower third of the frame printed on the Temperature Control Plate of the migration module.
- Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 3).
- Bend the gel and ease it down onto the water pool (Fig. 3). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire
gel plate and the gel is lined up with the printed frame.
7. Lower both carriers down. In this position the buffered strips do not touch the gel. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY DOWN.
8. Remove each applicator from the wet chamber. Handle it by the protection frame.
- Snap off the applicator teeth's protection frame.
- For 6 samples analysis on HYDRAGEL IF Penta 6/12, place the applicator into position No 6 on the carrier.
- For 12 samples analysis, place the two applicators each into position No 3 and 9.
IMPORTANT: The numbers printed on the applicator must face the operator (Fig. 4).
9. Close the lid of the migration module.
10. Start the procedure immediately by pressing the green arrow "START" key on the left side of the keyboard.
IMPORTANT: Make sure that the ventilation air inlet on the right side of the instrument is not blocked.
MIGRATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS
• The two carriers are lowered so that buffered strips and applicator(s) contact the gel surface.
• Sample applicator carrier rises up.
• Migration is carried out under 20 W constant at 20 °C controlled by Peltier effect, until 42 Vh accumulated (for about 9 minutes).
• The electrode carrier rises to disconnect the electrodes.
• An audible beep signals that the migration module lid unlocks. The following message is displayed on the screen: " AS".
NOTE: The migration module lid remains locked during all migration steps.
II. IMMUNOFIXATION SET UP
The dynamic mask contains a colored reference guide for reagent application, an antisera segment, a segment holder, a dynamic mask guide and a
length-reducing device (Fig. 5).
During the migration, assemble the dynamic mask as follows :
1. Place the dynamic mask guide on a flat surface.
IMPORTANT : For six samples analysis on HYDRAGEL IF Penta 6/12, it is necessary to position a length-reducing device on the dynamic
mask guide.
2. Set up an antisera segment on the segment holder (Fig. 6) :
- Tilt the antisera segment at a 45° angle and position it against the plastic springs of the segment holder.
- Pull apart the two elements and pivot the segment to fix it into the notches of the segment holder.
WARNING : Be sure the segment is correctly positioned on the holder : the pins at ends of the segment must be blocked into the
notches of the holder.
3. Set up the holder with the segment on the dynamic mask guide (Fig. 7). Then, put the colored reference guide for reagent application,
corresponding to the assay being run, on the segment holder in front of the segment wells (Fig. 8).
- 14 -

4. Apply reagents as follows:
- 8 µL per well for 6 samples analysis and,
- 12 µL per well for 12 samples analysis.
| TROUGH | REAGENT | COLOR |
| ELP | fixative solution | yellow |
| Penta | Pentavalent antiserum | yellow - orange |
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
NOTE: Reagents are colored and the colors are shown on the colored reference guide to facilitate correct antisera pipetting.
IMPORTANT: Do not use wells of antisera segment in position 1, 8 and 15.
- Aspirate reagents avoiding any air bubbles in the pipette tip.
- Apply the reagents (Fig. 9) :
- Hold pipette at an angle and rest its tip lightly at the side of the well, without touching the bottom of the well.
- Inject the drop of reagent into the well.
5. Remove the colored reference guide.
III. IMMUNOFIXATION
1. Open the migration module lid.
2. Remove the sample applicator(s) and discard.
3. Raise both carriers, remove the buffered strips by their plastic ends and discard.
- Remove both carriers.
- Wipe electrodes with soft wet tissue.
- Leave the gel in place in the migration module.
4. Set up the dynamic mask for reagent application as follows (Fig. 10):
- Position the mask guide on the anchoring clip (the guide may stay in the migration module all the time).
- Hold the dynamic mask by the tab and position it into the guide with the notches aligned with the marks.
- Lower the dynamic mask onto the plate of HYDRASYS.
IMPORTANT : Adjust the dynamic mask position for perfect alignment between electrophoretic profiles and wells of the mask.
5. Place the segment holder at the lowest point on the mask guide, facing the operator.
Hold the segment holder by the handle situated on its right and press on the central pressure point such that the antisera segment contacts
the gel.
Release the pressure ; then, reagents will spread under each track (Fig. 11).
6. Immediately, using the segment holder handle, move the segment slowly but steadily up and down the entire length of the gel to apply the
reagents. Application should take approximately 5 seconds (Fig. 12).
WARNING : During this step, hold the mask only by the segment holder handle. Avoid touching the guide. Don’t re-press on the
pressure point as this may result in cross contamination of reagents.
7. Remove the guide and the dynamic mask.
- Remove the segment holder using its handle.
- Remove the antisera segment from the holder and discard.
WARNING : Segments with antisera have to be handled with care.
- Residual reagent may remain in the wells after application. This should have no effect on test results.
8. Close the lid of the migration module.
9. Start the procedure immediately by pressing the green arrow "START" key on the left side of the keyboard. A message "[INCUBATION]"
appears on the screen.
IMMUNOFIXATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS
• Incubation at 20 °C for 5 minutes (controlled by Peltier effect).
• An audible beep signals that the migration module lid unlocks. The following message is displayed on the screen: " PAP.".
NOTE: The migration module lid remains locked during incubation.
IV. BLOTTING OF THE GEL
1. Open the migration module lid.
2. Apply a thick filter paper on the gel:
- line up the filter paper edge with the gel edge (incline it at a 45° angle) and ease it down onto the gel.
IMPORTANT: Press firmly on the whole surface of the filter paper to ensure perfect adherence on the gel.
3. Close the lid of the migration module.
4. Start the procedure by pressing the "START" key (green arrow on the left side of the keyboard).
BLOTTING - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS
• Blotting at 40 °C controlled by Peltier effect, for 3 minutes. The following message is displayed on the screen: "[BLOTTING]".
• An audible signal (beep) rings. The following message is displayed on the screen: "❊ PAP.".
V. DRYING OF THE GEL
1. Open the migration module lid.
2. Remove the filter paper and leave the gel in place.
3. Close the lid.
4. Start the procedure by pressing the "START" key (green arrow on the left side of the keyboard).
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
DRYING - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS
• Drying at 50 °C controlled by Peltier effect, for 6 minutes.
• A beep signals that the cover unlocks. The plate temperature remains at 50 °C until the lid is opened. “Migration temp maintained” is displayed on
the screen.
NOTE: The migration module lid remains locked during the drying step.
VI. GEL PROCESSING SET UP
1. Open the lid.
2. Remove the dried gel for further processing.
3. Open the gel holder. Lay it flat and position the dried gel (with gel side facing up) into the grooves of the two rods and close the holder. Make
sure that the film is correctly positioned inside the holder (Fig. 13).
4. Place the gel holder into the Gel Processing / Staining Module.
IMPORTANT: Before starting the gel processing / staining program, check the following:
- the wash solution container contains at least 400 mL of wash solution ;
- the staining container is filled with 300 mL of staining solution ;
- the destaining container contains at least 1 liter of destaining solution ;
- the waste container is empty ;
For reagent line connection: refer to the information displayed on the screen of the instrument (select key: REAGENT LINES).
IMPORTANT: Do not forget to block up the unused lines.
5. Select "IF AMIDO" staining program from the instrument menu and start the run by pressing the "START" key (green arrow on the right side
of the keyboard).
During staining, destaining and drying steps, the compartment remains locked.
After cooling step, an audible beep signals that the compartment unlocks (the ventilation is maintained until the gel holder is removed).
NOTES:
- Temperature of the migration plate keeps decreasing since the lid has been opened until it reaches 20 °C (in less than 5 minutes). Then a new
migration run may start.
- Return the sample applicator and electrode carriers back in place.
- Wipe the temperature control plate with a soft wet tissue.
VII.GEL PROCESSING COMPLETION
1. Remove the gel holder from the compartment, open it and remove the dried gel.
2. If needed, clean the back side (the plastic support side) of the dry film with a damp soft paper.
NOTE : The lengths of electrophoretic migrations may be slightly different with gels containing 2 or 3 analysis rows, without any adverse effects
on performance.
RESULTS
The Pentavalent antiserum detects:
• G, A, M immunoglobulins, kappa and lambda chains,
• free kappa and lambda light chains,
• kappa and lambda light chains bound to epsilon or delta heavy chains.
Interpretation
A normal serum shows a slightly stained zone, corresponding to the polyclonal immunoglobulins (G, A, M, kappa and lambda), without any sharp
band.
A hypergammaglobulinemia is characterized by a heavily stained, diffused zone, without any restricted bands.
A gammopathy is characterized by one or more focused band(s).
Special cases
A slight monoclonal gammopathy can be hidden in a normal electrophoretic profile (e.g., beta-mobility dysglobulin). This band will be detected with the
Pentavalent antiserum.
• A hypogammaglobulinemia might be associated with a monoclonal free light chain. This protein, due to its low molecular weight, is eliminated
through the kidney into urine (Bence Jones Protein). The remaining quantity in the serum is usually very low, but it can be detected by
immunofixation with Pentavalent antiserum.
• When a monoclonal type band is observed on serum electrophoresis (ELP track) but fails to be confirmed by immunofixation, fibrinogen (plasma
sample) should be the prime suspect.
• When a monoclonal type band is observed on all immunofixation tracks, cryoglobulin or polymerized Ig M should be suspected. Depolymerize with
a reducing agent and repeat the procedure (see "Samples for analysis").
Any monoclonal-like fraction has to be identified by further investigation on:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, PN 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, PN 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, PN 4304 or 4308, or HYDRAGEL 9 IF SEBIA,
PN 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4322 or HYDRAGEL 4 BENCE JONES SEBIA,
PN 4324.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Limitations
The use of antisera other than those specific for the immunofixation procedure with the dynamic mask may affect the results.
Due to the resolution and sensitivity limits of zone electrophoresis, it is possible that some monoclonal components may not be detected with this
method.
Troubleshooting
Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the
procedure were carefully followed.
Kit reagent Safety Data Sheets and information on waste product elimination are also available from the Technical Service of the supplier.
PERFORMANCE DATA
Reproducibility and specificity
Reproducibility within gel was demonstrated on three different pathological samples : two samples with one high level monoclonal component and one
sample with low level of monoclonal component.
Each sample was run 12 times on 2 lots of HYDRAGEL IF Penta 6/12 gels using the amidoblack staining procedure.
All repeats gave identical results within lot and lot-to-lot and as expected for the type of samples tested. Immunofixation showed only one monoclonal
component for the three pathological samples.
Reproducibility between gels and specificity
Reproducibility between gels was demonstrated on twelve different pathological samples with one or many monoclonal components.
These samples were run on 10 HYDRAGEL IF Penta 6/12 gels from 3 different lots, using the amidoblack staining procedure.
All repeats gave identical results gel to gel and as expected for the type of samples tested.
Accuracy
Eighty five (85) different pathological serum samples and eleven (11) normal sera were run using the HYDRAGEL 12 IF Penta kit, and another
commercially available agarose gel immunofixation system.
In all cases, the results obtained by the SEBIA test and the comparable commercially available procedure were identical.
Sensitivity
Serial dilutions were prepared with 3 pathological serum samples all exhibiting monoclonal components and analyzed on HYDRAGEL IF Penta 6/12
gels.
The results are summarized below.
MONOCLONAL COMPONENT DETECTION LIMIT (mg/dL) SAMPLE No TYPE CONC. (g/dL) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 1.09 12 2 alpha, lambda 0.58 25
| 3 | mu, kappa | 0.34 | 12 |
Depending on the migration position of the monoclonal component and the level of polyclonal background in the gamma zone, the detection limit may
vary from 12 to 25 mg/dL.
BIBLIOGRAPHY
For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ANWENDUNGSBEREICH
Die kits HYDRAGEL 6 IF Penta und HYDRAGEL 12 IF Penta dienen zum Nachweis monoklonaler Proteine in Humanserum durch
Immunfixationselektrophorese auf Agarosegelen in alkalischem Puffer (pH-Wert 9,1). Sie wurden für das halbautomatische Elektrophoresegerät
HYDRASYS entwickelt, das die Bearbeitung der Gele übernimmt, bis diese für die Auswertung vorliegen. Die Serumproteine werden zunächst
elektrophoretisch getrennt und dann mit Pentavalentem Antiserum gegen Ig G-, Ig A- und Ig M-Schwerketten sowie gegen die freien und gebundenen
Kappa- und Lambda-Leichtketten immunfixiert. Nach der Immunfixation werden die ausgefällten Proteine mit Amidoschwarz gefärbt. Überschüssige
Farbe wird durch eine saure Lösung entfernt.
Mit einem Agarosegel des HYDRAGEL 6 IF Penta Kits können 6 Proben und mit einem Agarosegel des HYDRAGEL 12 IF Penta Kits 12 Proben
analysiert werden.
In-vitro-Diagnostikum.
TESTPRINZIP
Bei atypischen Banden im elektrophoretischen Muster von Serumproteinen, die vor allem durch eine anomale Mobilität der Gammaglobuline, aber
auch der Alpha- und Betaglobuline hervorgerufen werden (jedoch durch die üblicherweise dort vorgefundenen Proteine der entsprechenden
Fraktionen verborgen sein können), besteht immer der Verdacht, daß es sich um monoklonale Proteine und damit um ein Anzeichen für
Gammopathien handeln könnte. Zur Identifikation dieser atypischen Banden wird die Methode der Immunfixation angewandt.
Die Immunfixationselektrophorese ist eine einfache Methode zur Bindung eines Proteins in situ nach der Elektrophorese, indem es einen unlöslichen
Komplex mit seinem Antikörper bildet. Das Verfahren teilt sich in vier Schritte:
1. Trennung der Proteine durch Elektrophorese auf Agarosegel.
2. Fixierung und Immunpräzipitation der Proteine nach der Elektrophorese: Fixierlösung und Antiserum werden direkt auf die Geloberfläche und
damit auf die entsprechenden elektrophoretischen Migrationsspuren aufgebracht. Die Fixierlösung und das Antiserum diffundieren in das Gel,
wobei alle Proteine bzw. die entsprechenden Antigene ausgefällt werden.
3. Die ungebundenen, löslichen Proteine werden vom Gel durch Abblotten und Waschen entfernt. Das Präzipitat des Antigen-Antikörper-Komplexes
ist in der Gelmatrix eingeschlossen.
4. Die ausgefällten Proteine werden durch Färbung sichtbar gemacht. Die Immunpräzipitationsbanden werden anschließend mit den entsprechenden
atypischen Banden im elektrophoretischen Muster der Serumprobe verglichen.
Zum Nachweis der vermuteten monoklonalen Komponente(n) erfolgt die gleichzeitige Elektrophorese der Proben in zwei Spuren. Nach der
Elektrophorese dient die ELP-Spur, die das elektrophoretische Muster der in der Probe enthaltenen Proteine aufweist, als Referenz. Die
Immunfixations- (Penta-) Spur gestattet die Identifikation der monoklonalen Komponenten, die mit dem Pentavalenten Antiserum reagierten.
Mit dieser einfachen und schnellen Technik werden eindeutige und leicht interpretierbare Ergebnisse erzielt.
IM HYDRAGEL 6 IF Penta UND HYDRAGEL 12 IF Penta-KIT ENTHALTENE REAGENZIEN UND MATERIALIEN
BEZEICHNUNG BESTELL-NR. 4341 BESTELL-NR. 4342 BESTELL-NR. 4384* Agarosegele (gebrauchsfertig) 10 Gele 10 Gele 80 Gele Pufferstreifen (gebrauchsfertig) 10 Pack zu 2 Stück 10 Pack zu 2 Stück 80 Pack zu 2 Stück Verdünnungslösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 60 ml 1 Fläschchen, 60 ml 8 Fläschchen, 60 ml Amidoschwarz-Färbelösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 20 ml 1 Fläschchen, 20 ml 8 Fläschchen, 20 ml Fixierlösung (gebrauchsfertig) 2 Fläschchen, 2,9 ml Säugetier-Anti-Ig-Human- (Gamma-, Alpha-, My-, Kappa-, Lambda-) Immunglobuline: pentavalentes Antiserum (gebrauchsfertig)
2 Fläschchen, 2,9 ml Applikatoren (gebrauchsfertig) 1 Pack zu 10 2 Pack zu 10 16 Pack zu 10 Antiseren Segmente (gebrauchsfertig) 1 Pack zu 10 1 Pack zu 10 8 Pack zu 10 Filterpapier, dünn 1 Pack zu 10 1 Pack zu 10 8 Pack zu 10
| Filterpapier, dick | 1 Pack zu 10 | 1 Pack zu 10 | 8 Pack zu 10 |
*HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
HINWEIS : Die Fixierlösung und das pentavalente Antiserum werden getrennt vom Kit geliefert, mit Ausnahme beim MAXI-KIT (Siehe erforderliche,
aber nicht mitgelieferte Reagenzien).
FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE
Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden.
BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN.
1. AGAROSEGELE
Vorbereitung
Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 8 g/l ; Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,1 ± 0,1 ; Additiva zur Optimierung der Leistung,
in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.
WARNHINWEIS: Die Agarosegele enthalten 0,31 % Barbital und 0,34 % Natriumbarbital. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen
Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen!
Gebrauch
Hilfsmedium für die Proteinelektrophorese und Immunfixation.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Gele waagerecht in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 bis 30 °C) oder im Kühlschrank (2 bis 8 °C) aufbewahren. Sie bleiben bis zum
Verfalldatum stabil, das auf dem Etikett der Kit- oder Gelverpackung angegeben ist. (Der Pfeil auf der Vorderseite der Kit-Schachtel muß nach oben
zeigen.) Eine Lagerung in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle ist zu vermeiden. Starke Temperaturschwankungen sind zu vermeiden.
NICHT EINFRIEREN.
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SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Das Gel ist zu verwerfen bei:
(i) Kristallen oder Niederschlag auf der Geloberfläche oder sehr weicher Gelstruktur (was darauf hindeutet, daß das Gel gefroren war) ;
(ii) Bakterien- oder Schimmelpilzbildung ;
(iii) einer ungewöhnlich stark ausgeprägten Flüssigkeitsansammlung in der Gel-Box (was auf einen Austritt von Puffer aus dem Gel aufgrund
unsachgemäßer Lagerung hindeutet).
2. PUFFERSTREIFEN
Vorbereitung
Die als Streifen vorliegenden Pufferschwämme sind gebrauchsfertig. Jeder Pufferstreifen enthält: Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,1 ± 0,3 ; Natriumazid ;
Additiva zur Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.
WARNHINWEIS: Der im Streifen enthaltene Puffer enthält 0,92 % Barbital, 1,03 % Natriumbarbital und 0,30 % Natriumazid. Nicht einnehmen!
Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen! Darf bei der Entsorgung nicht mit Säuren, Blei oder Kupfer in Kontakt
kommen, da sich sonst explosive bzw. toxische Natriumazidverbindungen bilden können.
Gebrauch
Die Pufferstreifen fungieren als Elektrophoresepufferreservoir und gewährleisten den Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Bewahren Sie die Pufferstreifen waagerecht liegend in der Original-Schutzverpackung bei Zimmertemperatur oder gekühlt auf. (Der Pfeil auf der
Verpackungsschachtel muss nach oben zeigen.) Die Pufferstreifen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Schachtel oder auf dem Etikett
der Streifen stabil.
NICHT EINFRIEREN!
Verwerfen Sie die Pufferstreifen, wenn die Verpackung geöffnet ist und die Streifen ausgetrocknet sind.
3. VERDÜNNUNGSLÖSUNG
Vorbereitung
Die Amidoschwarz-Verdünnungslösung ist wie im Abschnitt “Amidoschwarz-Färbelösung” beschrieben zu verwenden.
Die Lösung enthält Zitronensäure.
Gebrauch
Zum Herstellen der Amidoschwarz-Färbelösung.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Konzentrierte Verdünnungslösung im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahren. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem
Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN!
Geben Sie kein Natriumazid zu.
4. AMIDOSCHWARZ FÄRBELÖSUNG
Vorbereitung
Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des
Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt.
Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung :
1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben.
2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen.
3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln.
4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer des HYDRASYS überführen.
5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen.
6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen
auffüllen.
7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen.
Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig.
ACHTUNG: Eine unvollständige Lösung des Amidoschwarz Konzentrats kann zu einer Unterbestimmung der Albuminfraktion und/oder zu
Auslöscheffekten der Albuminfraktion führen.
Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2 ; 0,4 g/dl Amidoschwarz ; 6,7% Ethylenglycol ; zusätzliche Additive zur
Optimierung (ungiftig in den verwendeten Konzentrationen).
WARNUNG: Nicht verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen!
Gebrauch
Zum Färben der Agarose Gele nach elektrophoretischer Trennung.
WICHTIG: Die Färbelösung ist für maximal 10 Färbungen konzipiert. Wechseln Sie deshalb die Färbelösung nach 10 Färbungen aus.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Amidoschwarz- Konzentrat und verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank verschlossen aufbewahren um Flüssigkeitsverlust
durch Verdunstung zu vermeiden. Das Amidoschwarz-Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett)
haltbar.
Verdünnte Färbelösung ist einen Monat haltbar.
Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren.
5. ANTISEREN UND FIXIERLÖSUNGSPACK (mit Art.-Nr. 4384)
5.1. PENTAVALENTES ANTISERUM
Vorbereitung
Das Pentavalente Antiserum ist gebrauchsfertig. Das Pentavalente Antiserum ist ein Gemisch von Säugetier- Anti-Ig-Human-Gesamtimmunglobulinen.
Damit das Antiserum schnell und sicher angewendet werden kann, ist es mit einem gesundheitlich unbedenklichen gelborangefarbenen Farbstoff
markiert. Das Fläschchenetikett weist dieselbe Farbe auf.
Sollte das Antiserum eine leichte Trübung aufweisen, kann es für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Dies sollte für die
Klärung der Lösung ausreichen. Eine eventuell noch vorhandene leichte Trübung sollte die Immunologische Reaktion in keiner Weise beeinflussen.
Im Falle von unlöslichen Ausfällungen, wird eine fünfminütige Zentrifugation bei 3000 U/min empfohlen.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Gebrauch
Zur Immunfixation von Proteinen nach der Elektrophorese.
Die Antiseren können von unterschiedlichen Tierspezies stammen. Nicht den Inhalt von 2 unterschiedlichen Antiserenfläschchen mischen, auch nicht
bei gleicher Spezifität und IMMER eine neue Pipettenspitze benutzen, wenn das Antiserumfläschchen gewechselt wird.
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Pentavalentes Antiserum im Kühlschrank (bei 2 bis 8 °C) aufbewahren. Es ist bis zum Verfallsdatum (auf der Kit-Verpackung oder auf dem Etikett)
stabil.
HINWEIS: Während des Transports kann das Antiserum ungekühlt (15 bis 30 °C) bis zu 15 Tage ohne nachteilige Effekte für die Durchführung
aufbewahrt werden.
5.2. FIXIERLÖSUNG
Vorbereitung
Die Fixierlösung ist gebrauchsfertig. Sie enthält: saure Lösung ; Additiva zur Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen
ungefährlich. Damit die Fixierlösung schnell und sicher angewendet werden kann ist sie mit einem gesundheitlich unbedenklichen Farbstoff markiert.
Gebrauch
Zur Fixierung der elektrophoretisch getrennten Proteine in der Referenzspur (ELP).
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Fixierlösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfallsdatum (auf der Kitpackung oder auf dem
Fläschchenetikett der Fixierlösung) stabil.
Fixierlösung darf kein Präzipitat aufweisen.
6. APPLIKATOREN
Gebrauch
Einmalapplikatoren für den Probenauftrag.
Lagerung
Applikatoren vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
7. ANTISERA-SEGMENTE
Gebrauch
Farbige Antisera-Segmente, zum Auftragen der Fixierlösung und der Antiseren auf das Gel.
WARNUNG: Mit Antiserum befüllte Antiseren-Segmente vorsichtig behandeln.
8. FILTERPAPIER, DÜNN
Gebrauch
Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten überschüssiger Flüssigkeit von der Geloberfläche vor dem Probenauftrag.
Lagerung
Dünnes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
9. FILTERPAPIER, DICK
Gebrauch
Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten nicht ausgefällter Proteine nach der Immunfixation.
Lagerung
Das dicke Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN (NICHT IM KIT ENTHALTEN)
1. ANTISEREN- UND FIXIERLÖSUNGSPACKUNG (für Art.-Nr. 4341 und Art.-Nr. 4342 Kits)
Die Antiseren- und Fixierlösungspackung für IF Penta Immunfixation, SEBIA, Art.-Nr. 4345, enthält 1 Pentavalent-Antiserumfläschchen und
1 Fixierlösungsfläschchen mit (jeweils 2,9 ml). Sie sind speziell auf die Immunfixationspozedur mit der dynamischen Maske abgestimmt.
1.1 ANTISERUM
Siehe vorheriger Abschnitt 5.1.
1.2 FIXIERLÖSUNG
Siehe vorheriger Abschnitt 5.2.
2. ENTFÄRBELÖSUNG
Vorbereitung
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte Entfärbelösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4540, 10 Fläschchen zu je 100 ml) mit destilliertem oder entionisiertem
Wasser auf 100 Liter auffüllen. Es empfiehlt sich, nur 5 ml konzentrierte Lösung auf 5 Liter, dem Fassungsvermögen des Behälters für die
Entfärbelösung, aufzufüllen. Verdünnte Entfärbelösung enthält: Zitronensäure, 0,5 g/l.
Gebrauch
Zum Entfärben, d.h. Auswaschen von überschüssiger Farbe und zur Entfernung der Gelhintergrundfärbung, sowie zum Spülen der Färbekammer nach
dem Waschen.
Zur Neutralisation der sauren Entfärbelösung können 15 ml einer 50 % Natronlauge (NaOH) in den leeren Abfallbehälter gefüllt werden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Konzentrierte Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit-
Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett der Entfärbelösung angegeben ist. Verdünnte Entfärbelösung bleibt bei Raumtemperatur in einem
verschlossenen Behälter eine Woche stabil. Kein Natriumazid zugeben.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.
Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung zu verhindern, wenn sie länger als 1 Woche aufgehoben wird, sollten 50 µl/l ProClin 300
zugesetzt werden.
Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum Verfallsdatum
stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.
3. HYDRASYS WASCHLÖSUNG
Vorbereitung
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte HYDRASYS Waschlösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4541, 10 Fläschchen zu je 80 ml) mit destilliertem oder
entionisiertem Wasser auf 5 Liter auffüllen. Verdünnte Waschlösung enthält: alkalischen Puffer, pH-Wert 8,8 ± 0,3 ; Natriumazid.
WARNHINWEIS: Konzentrierte Waschlösung enthält 0,625 % Natriumazid. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort
den Arzt aufsuchen! Natriumazid kann bei Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer zu explosiven bzw. toxischen Verbindungen reagieren. Bei
der Entsorgung stets mit reichlich Wasser nachspülen.
Gebrauch
HYDRASYS Waschlösung dient zum Auswaschen der nicht ausgefällten Proteine aus den Gelen. Es wird ebenfalls zum Reinigen des HYDRASYS
Färbemoduls eingesetzt. Die Reinigung in regelmäßigen Abständen durchführen: Wird das Gerät zum Beispiel täglich genutzt, sollte das Färbemodul
einmal pro Woche gereinigt werden.
Hinweise zum Gebrauch finden Sie auf der Packungsbeilage.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Konzentrierte und verdünnte Waschlösung in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum
Verfalldatum stabil, das auf dem Fläschchenetikett der Waschlösung angegeben ist.
Verdünnte Waschlösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.
4. FLUIDIL
Vorbereitung
Fluidil (SEBIA, Bestell-Nr. 4587, 1 Fläschchen, 5 ml) ist gebrauchsfertig.
Gebrauch
Zum Verdünnen zähflüssiger oder trüber Proben, z.B. von Kryoglobulin- oder Kryogel-haltigen Seren.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Fluidil bei Raumtemperatur aufbewahren. Es bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf Kit-Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett angegeben ist.
Fluidil darf kein Präzipitat aufweisen.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE AUSSTATTUNG (NICHT IM KIT ENTHALTEN)
1. HYDRASYS System, SEBIA, Bestell-Nr. 1210 oder Nr. 1211.
2. Für das Beladen der Applikatoren oder Antisera-Segment kann alternativ eine manuelle Mikropipette oder der Pipettierautomat HYDRAplus
SEBIA, Bestell-Nr. 1215, verwendet werden.
3. Feuchte Kammer, Bestell-Nr. 1270, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.
4. Behälter-Kit, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.
5 Schablonen-Führungsstab SEBIA, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.
6. Dynamische Maske, SEBIA, Art.-Nr. 1255.
7. Pipetten: 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µl, 100 µl und 200 µl.
PROBEN FÜR DIE ANALYSE
Probensammlung und -lagerung
Für die Analyse werden frische Proben empfohlen. Die Gewinnung von Serum- und Urinproben nach einem gebräuchlichen Verfahren für klinische
Labortests durchführen. Die Proben sollten umgehend bei 2 - 8 °C gekühlt und können bis zu einer Woche gelagert werden. Bei längerer Lagerung
die Proben einfrieren (mindestens 1 Monat stabil).
Nach dem Auftauen können diese Proben aufgrund der Protein bzw. Lipoprotein-Denaturierung leichte Trennspuren an der Auftragsstelle hinterlassen.
Eingefrorene Serumproben, versetzt mit Natriumazid 0,02 g/dl bleiben bei Lagerung länger stabil.
Probenvorbereitung
Unverdünnte Serumproben verwenden.
Nach der Lagerung im Kühl- oder Gefrierschrank können manche Serumproben (insbesondere Kryoglobulin oder Kryoprotein haltige Proben)
zähflüssig oder trüb werden. Derartige Proben lassen sich mitunter schwer auftragen, da sie kaum durch die Zähne des Probenapplikators
diffundieren. In solchen Fällen zu 75 µl Serum 25 µl Fluidil zugeben und 15 Sekunden im Rotationsmischer mischen. Anschließend mit dem
Standardverfahren fortfahren.
Einige monoklonale Proteine können in polymerisierter Form vorliegen als läge auf allen immunfixierten Spuren eine monoklonale Fraktion vor. In
diesem Fall (i) eine Fluidil-Lösung herstellen, die 1% Beta-Mercaptoethanol (BME, oder 2-Mercaptoethanol, 2 ME) enthält, (ii) zu 75 µl unverdünntem
Serum 25 µl Reduktionslösung geben, (iii) im Rotationsmischer mischen und mindestens 15 Minuten (maximal 30 Minuten) einwirken lassen.
Anschließend mit dem Standardverfahren fortfahren.
Folgende Proben nicht verwenden
Plasmaproben vermeiden: Das Fibrinogen ergibt eine Bande in der Nähe der Auftragsstelle, die mit monoklonalem Protein verwechselt werden könnte.
Keine hämolysierten Proben verwenden.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
DURCHFÜHRUNG
Das HYDRASYS System ist ein halbautomatisches Multiparameter-Gerät, das eine automatische Bearbeitung der HYDRAGEL Agarosegele in der
nachstehenden Reihenfolge durchführt: Probenapplikation, elektrophoretische Migration, Inkubation mit Fixierlösung und Antiserum, Trocknen,
Färben, Entfärben und Endtrocknen. Zu den manuellen Schritten gehört die Handhabung der Proben und Gele, der Auftrag der Fixierlösung und des
Antiserums sowie die Bedienung des Geräts.
DIE BEDIENUNGSANLEITUNG ZUM HYDRASYS SYSTEM AUFMERKSAM DURCHLESEN.
I. VORBEREITUNG DER MIGRATION
1. HYDRASYS einschalten.
2. Bei Verwendung von HYDRAGEL 6 IF Penta für 6 Proben einen Applikator, bei Verwendung von HYDRAGEL 12 IF Penta für 12 Proben zwei
Applikatoren auf eine ebene Unterlage legen, so dass die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (Abb. 1).
- In jede Vertiefung 10 µl unverdünnte Probenflüssigkeit auftragen. Das Füllen eines Applikators darf höchstens 2 Minuten dauern.
| VERTIEFUNG |
PROBE ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
HINWEIS: Die Nummern der Vertiefungen 1, 8 und 15 werden bei diesem Test nicht verwendet ; sie sollten mit einem Filzschreiber markiert
werden, um ein irrtümliches Befüllen zu vermeiden
- Die Applikatoren mit den Zähnen nach oben in die feuchte Kammer legen (nur am Schutzrahmen für die Zähne anfassen).
Hinweise hierzu finden Sie in der Packungsbeilage zur feuchten Kammer.
- Die Proben nach dem Auftragen der letzten Probe 5 Minuten lang in die Zähne einziehen lassen. Erfolgt die Anwendung erst (bis zu
8 Stunden) später, die komplette Kammer in den Kühlschrank stellen.
3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen, und die Elektroden-/Applikatoren-Halter nach oben klappen.
WARNHINWEIS: Die Abdeckung bei hochgestelltem Elektroden-/Applikatoren-Halter nicht schliessen!
4. Im Gerätemenü das Programm "6/12 PENTA SM/DM" wählen (an der Tastatur links).
5. Die Pufferstreifen an den Kunststoffenden aus der Packung nehmen. Die Perforation des Plastikfilms in die Stifte des Elektroden-Halters
einführen. Die Plastikfolie muß dabei zum Applikator-Halter zeigen (siehe Abb. 2).
6. Das Gel aus der Verpackung nehmen.
- Ein dünnes Filterpapier vorsichtig und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier
sofort wieder entfernen.
WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange auf dem Gel lassen, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
- 200 µl destilliertes oder entionisiertes Wasser in das untere Drittel des Rahmens geben, der auf der Peltier-Platte des Migrationsmoduls
aufgedruckt ist.
- Das Gel (mit der Gelseite nach oben) an die untere Kante des aufgedruckten Rahmens anlegen (siehe Abb. 3).
- Das Gel biegen und auf dem Wasser abrollen (siehe Abb. 3). Darauf achten, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden, das Wasser
unter der gesamten Gelplatte verteilt ist und das Gel am aufgedruckten Rahmen anliegt.
7. Beide Halter nach unten klappen. In dieser Position dürfen die Pufferstreifen keinen Kontakt mit dem Gel haben. DIE HALTER NICHT MIT
GEWALT BIS GANZ NACH UNTEN DRÜCKEN.
8. Die Applikatoren aus der feuchten Kammer nehmen. Dabei nur am Schutzrahmen anfassen.
- Den Schutzrahmen für die Zähne entfernen.
- Bei Verwendung von HYDRAGEL IF Penta 6/12 (6 proben), einen Applikator an Position 6 auf dem Halter einsetzen.
- Bei Verwendung von HYDRAGEL IF Penta 6/12 (12 proben), je einen Applikator an Position 3 und 9 einsetzen.
WICHTIG: Die auf dem Applikator aufgedruckten Ziffern müssen immer zum Bediener zeigen (siehe Abb. 4).
9. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.
10. Die Migration sofort starten. Dazu die grüne Pfeiltaste "START" auf der linken Seite der Tastatur drücken.
WICHTIG: Darauf achten, daß die Lüftungsschlitze an der rechten Geräteseite nicht verdeckt sind.
MIGRATION - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE
• Die beiden Halter werden soweit gesenkt, daß die Pufferstreifen und der/die Applikator(en) in Kontakt mit der Geloberfläche kommen.
• Der Probenapplikator-Halter wird angehoben.
• Die Migration erfolgt unter Anlegen eines Gleichstroms von 20 W und bei einer Temperatur von 20 °C, die durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten
wird, bis 42 Vh erreicht sind (nach etwa 9 Minuten).
• Der Elektroden-Halter wird angehoben und unterbricht dabei den Kontakt der Elektroden.
• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Am Bildschirm wird folgende Meldung angezeigt: " AS".
HINWEIS: Während der Migration bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.
II. VORBEREITUNG DER IMMUNFIXATION
Die dynamische Maske enthält eine Farbcodierung für den Reagenzienauftrag, ein Antisera-Segment, einen Segmenthalter, eine Führung und ein
Reduzierelement (Abb. 5).
Während der Migration die dynamische Maske wie folgt zusammensetzen:
1. Die Führung auf eine ebene Oberfläche legen.
WICHTIG: Bei Verwendung von HYDRAGEL IF PENTA 6/12 ist es nötig das Reduzierelement in der Führung zu positionieren.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
2. Ein Antisera-Segment auf dem Segmenthalter anbringen (Abb. 6):
- Das Antiserensegment im Winkel von 45° neigen und gegen die Plastikfedern des Segmenthalters positionieren.
- Die beiden Elemente auseinanderziehen und das Segment einschwenken, um es in den beiden Nuten des Halters zu befestigen.
WARNUNG: Sicherstellen dass das Segment korrekt im Segmenthalter positioniert ist. Die Haltestifte am Ende des Segments
müssen in den Nuten des Halters festsitzen.
3. Den Segmenthalter mit dem Antisera-Segment auf der Führung anbringen (Abb. 7). Anschließend die Farbcodierung für den
Reagenzienauftrag auf den Segmenthalter legen (Abb. 8).
4. Die Reagenzien wie folgt auftragen:
- Bei der Analyse mit 6 Proben : 8 µl / Vertiefung und,
- bei der Analyse mit 12 Proben : 12 µl / Vertiefung.
| SPUR | REAGENZ | FARBE |
| ELP | Fixierlösung | gelb |
| Penta | Pentavalentes Antiserum | gelborange |
HINWEIS: Reagenzien sind farbig und entsperechen der beigefügten Farbcodierung, um ein korrektes Pipettieren der Antiseren zu erleichtern.
WICHTIG: Nicht die Vertiefungen in Positionen 1, 8 und 15 auf dem Antiserensegment verwenden.
Die Reagenzien ohne Luftblasen in die Pipettenspitze aufziehen.
Die Reagenzien auftragen (siehe Abb. 9):
- Die Pipette schräg im Winkel und ihre Spitze leicht gegen die Wandung der Vertiefungen halten, ohne den Boden der Vertiefung zu
berühren.
- Den Reagenztropfen in die Vertiefung spritzen.
5. Die Farbcodierung entfernen.
III. IMMUNFIXATION
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.
2. Den/die Probenapplikator(en) entfernen und verwerfen.
3. Beide Elektroden-/Applikator-Halter aufrichten, und die Pufferstreifen an den Plastikenden entfernen und verwerfen.
- Den Applikatorrahmen entfernen.
- Die Elektroden mit einem feuchten Tuch vorsichtig abwischen.
- Das Gel im Migrationsmodul belassen.
4. Die dynamische Maske zum Reagenzienauftrag wie folgt einsetzen (Abb. 10) ;
- Die Metallstange auf die beiden unteren Haltestifte stecken (danach kann die Führung im Migrationsmodul verbleiben).
- Die dynamische Maske auf die Metallstange schieben (rechte Klemme in die Nut der Stange).
- Die dynamische Maske auf das Gel absenken.
WICHTIG: Richten Sie die dynamische Maske mit eingelegtem Antisera-Segment zwischen den Markierungen für die Gelposition aus.
5. Das Antisera-Segment auf der platzieren, sodass er zum Bediener zeigt. Das Segment am Griff auf der rechten Seite halten und auf kurz auf
die Mitte des Segment-Halters drücken, sodass das Antisera-Segment mit dem Gel in Kontakt kommt. Beim Lösen des Drucks kommen die
Reagenzien mit dem Gel in Kontakt (Abb. 11).
6. Sofort den Segmenthalter am rechten Griff langsam und stetig auf dem Gel einmal auf und ab bewegen um die Reagenzien aufzutragen. Die
Auftragung sollte etwa 5 Sekunden betragen (Abb. 12).
WARNUNG: Während dieses Schrittes die Schablone nur am Griff des Segmenthalters halten. Ein Berühren der Führung vermeiden.
Nicht wiederholt auf den Druckpunk drücken, weil das zu Kreuzkontaminationen der Reagenzien führen kann.
7. Die dynamische Maske aus dem HYDRASYS entfernen, den Segmenthalter entnehmen.
Das benutzte Antisera-Segment verwerfen. Evtl. verbleibende Reagentienreste im Antisera-Segment beeinträchtigen das Testergebnis nicht.
WARNUNG: Mit Antiserum befüllte Antiseren-Segmente vorsichtig behandeln.
8. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.
9. Die Inkubation sofort durch drücken der Starttaste mit dem grünen Pfeil auf der linken Seite der Tastatur starten. Auf dem Bildschirm wird
folgende Meldung angezeigt: "[INKUBATION]".
IMMUNFIXATION – BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN SCHRITTE
• Inkubation bei 20 °C für 5 Minuten, kontrolliert durch den Peltier-Element.
• Ein akustisches Signal ertönt und die Abdeckung wird entriegelt. Folgende Meldung blinkt auf dem Bildschirm: " PAP.".
HINWEIS: Während des Inkubationsschritts bleibt die Abdeckung verriegelt.
IV. ABBLOTTEN DES GELS
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.
2. Ein dickes Filterpapier auf das Gel legen:
- Den unteren Rand des Filterpapiers am Rand des Gels ausrichten, (es im Winkel von 45° neigen) und es auf das Gel herunterlassen.
WICHTIG: Die gesamte Oberfläche des Filterpapiers andrücken, sodass ein perfektes Anliegen sichergestellt ist.
3. Die Abdeckung des Migrationsmodul schließen.
4. Das Abblotten durch drücken der Starttaste mit den grünen Pfeilen auf der linken Seite der Tastatur starten.
ABBLOTTEN – BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN SCHRITTE
• Abblotten bei 40 °C für 3 Minuten, kontrolliert durch den Peltier-Element.
Folgende Meldung erscheint auf dem Bildschirm: "[BLOTTEN]".
• Ein akustisches Signal ertönt.
Folgende Meldung erscheint auf dem Bildschirm: "❊ PAP.".
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V. TROCKNEN DES GELS
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.
2. Das Filterpapier herausnehmen. Das Gel im Migrationsmodul belassen.
3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.
4. Das Verfahren starten. Dazu die "START"-Taste (grüne Pfeiltaste auf der linken Seite der Tastatur) drücken.
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
TROCKNEN - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE
• Das Trocknen erfolgt 6 Minuten lang bei 50 °C (durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten).
• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Bis zum Öffnen der Abdeckung wird die Temperatur auf
50 °C gehalten. “MIGRATION TEMP MAINTAINED” wird auf dem Bildschirm angezeigt.
HINWEIS: Während des Trocknens bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.
VI. VORBEREITUNG DER GELBEARBEITUNG
1. Die Abdeckung öffnen.
2. Das getrocknete Gel zur weiteren Bearbeitung herausnehmen.
3. Den Gel-Halter öffnen und flach hinlegen. Das Gel (mit der Gelseite nach oben) in die Ausfräsung des Gel-Halters einsetzen, und den Gel-
Halter schließen. Darauf achten, daß das Gel im Halter korrekt positioniert ist (siehe Abb. 13).
4. Den Gel-Halter in das Gelbearbeitungs-/Färbemodul einsetzen.
WICHTIG: Vor dem Start des Gelbearbeitungs-/Färbeprogramms überprüfen, daß:
- der Waschlösungsbehälter mindestens 400 ml Waschlösung enthält,
- der Färbelösungsbehälter 300 ml Färbelösung enthält,
- der Entfärbelösungsbehälter mindestens 1 Liter Entfärbelösung enthält,
- der Abfallbehälter leer ist,
- die nicht benötigten Kanäle blockiert sind.
Hinweise zum Anschluß an die Reagenzkanäle werden am Monitor des Gerätes angezeigt (drücken Sie dazu die Taste KANAELE).
WICHTIG: Nicht vergessen, die nicht benötigten Kanäle zu blockieren.
5. Im Gerätemenü das Färbeprogramm "IF AMIDO" wählen, und den Vorgang durch Drücken der "START"-Taste (grüner Pfeil auf der rechten
Seite der Tastatur) starten.
Während der Färbe-, Entfärbe- und Trocknungsschritte bleibt das Färbemodul verriegelt.
Nach einer Abkühlphase des Moduls ertönt ein akustisches Signal, und das Färbemodul entriegelt sich (die Luftkühlung erfolgt solange, bis
der Gel-Halter entnommen wird).
HINWEIS:
- Die Temperatur der Peltier-Platte sinkt nach dem Öffnen (innerhalb von 5 Minuten) auf 20 °C. Danach kann die nächste Migration durchgeführt
werden.
- Den Probenapplikator-/Elektroden-Halter wieder einsetzen.
- Die Peltier-Platte mit einem weichen, feuchten Papiertuch abwischen.
VII.ABSCHLUSS DER GELBEARBEITUNG
1. Den Gel-Halter aus dem Färbemodul nehmen, die Bügel nach oben klappen und das getrocknete Gel entnehmen.
2. Bei Bedarf die Rückseite (den Plastikfilm) der trockenen Folie mit einem weichen, feuchten Papiertuch reinigen.
HINWEIS: Die Migrationslänge kann bei Gelen mit 2 oder 3 Analysereihen unterschiedlich sein, ohne jegliche Beeinträchtigung der Leistung.
ERGEBNISSE
Pentavalentes Antiserum dient zum Nachweis von:
• Immunglobuline Ig G, Ig A, Ig M, jeweils Kappa- und Lambda-Ketten,
• freie Kappa- und Lambda- Leichtketten,
• an Epsilon- oder Delta-Schwerketten gebundene Kappa- und Lambda- Leichtketten.
Interpretation
Eine normale Serumprobe weist eine leicht gefärbte Fraktion ohne scharf abgegrenzte Banden auf, die den polyklonalen Immunglobulinen (G-, A-,
M-, Kappa und Lambda) entspricht.
Eine Hypergammaglobulinämie ist durch eine stark gefärbte, diffuse Fraktion und das Fehlen jeglicher scharf abgegrenzter Banden gekennzeichnet.
Eine Gammopathie ist durch eine oder mehrere scharf abgegrenzte Banden gekennzeichnet.
Sonderfälle
• Eine leichte monoklonale Gammopathie (wie bei atypischen Globulinen mit Betamobilität) ist in einem normalen elektrophoretischen Profil nicht
sichtbar. Eine solche Bande läßt sich mit Pentavalentem Antiserum nachweisen.
• Eine Hypogammaglobulinämie kann mit einer monoklonalen freien Leichtkette assoziiert sein. Dieses Protein wird aufgrund seiner geringen
Molmasse von den Nieren über den Urin ausgeschieden (Bence-Jones-Protein). Die im Serum verbleibende Menge ist zwar in der Regel sehr
gering, läßt sich aber durch Immunfixation mit Pentavalentem Antiserum nachweisen.
• Wird bei der Serum Elektrophorese (ELP Spur) eine monoklonale Fraktion gefunden, die durch Immunfixation nicht bestätigt werden kann, sollte
Fibrinogen (Plasmaprobe) als wahrscheinlichste Ursache angenommen werden.
• Wird eine monoklonale Bande auf allen Immunfixationsspuren gefunden, sollte als Ursache Kryoglobulin oder polymerisiertes Ig M angenommen
werden. Die Probe mit einem reduzierenden Agenz depolymerisieren und das Verfahren wiederholen (siehe "Proben für die Analyse").
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Werden monoklonale Fraktionen durch pentavalentes Antiserum gefunden, sind zu Ihrer Identifikation weitere Untersuchungen erforderlich. Dazu
eignen sich folgende Immunfixations Kits:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, Art.-Nr. 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, Art.-Nr. 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, Art.-Nr. 4304 oder 4308, oder HYDRAGEL
9 IF SEBIA, Art.-Nr. 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, Art.-Nr. 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, Art.-Nr. 4322 oder HYDRAGEL 4 BENCE JONES
SEBIA, Art.-Nr. 4324.
Interferenzen und Einschränkungen
Die Verwendung von anderen Antiseren statt der spezifischen Antiseren für das Immunfixations-verfahren mit der verstellbaren Auftragsschablone
kann die Ergebnisse beeinträchtigen
Es wird darauf hingewiesen, dass aufgrund der derzeitigen Kenntnis des zugrundeliegenden Analysenprinzips (Theorie der Zonenelektrophorese,
Auflösungsvermögen und Sensitivität) keine Garantie für ein 100 % Erkennen aller monoklonalen Komponenten gewährt werden kann.
Fehlersuche
Kommt es trotz sachgerechter Lagerung und Vorbereitung der Materialien und Beachtung der Verfahrensbeschreibung zum Versagen des Tests,
wenden Sie sich bitte an den SEBIA Kundendienst.
Sicherheitsdatenblätter zu den Kit-Reagenzien sowie Informationen zur Abfallbeseitigung sind bei SEBIA GmbH, Fulda erhältlich.
LEISTUNGSSPEZIFIKATIONEN
Reproduzierbarkeit innerhalb eines Laufs und Spezifität
Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Gels wurde mit 3 verschiedenen pathologischen Proben ermittelt: zwei Proben mit hohem Gehalt je einer
monoklonalen Komponente, sowie einer Probe mit niedrigem Gehalt von zwei monoklonalen Komponenten.
Jede Probe wurde 12fach mit zwei Chargen von HYDRAGEL IF Penta 6/12 Gelen mit dem Amidoschwarz-Färbeverfahren untersucht.
Alle Wiederholungen ergaben innerhalb einer Charge und innerhalb verschiedener Chargen identische Ergebnisse und entsprachen dem jeweils
erwarteten Probentyp. Die Immunfixation zeigte nur eine monoklonale Komponente für die drei pathologischen Proben.
Reproduzierbarkeit von Lauf zu Lauf und Spezifität
Die Reproduzierbarkeit von Lauf zu Lauf wurde mit zwölf verschiedenen pathologischen Proben mit einer oder mehreren monoklonalen Komponenten
getestet.
Diese Proben wurden auf 10 HYDRAGEL IF Penta 6/12 Gelen von 3 verschiedenen Chargen mit dem Amidoschwarz-Färbeverfahren untersucht.
Alle Wiederholungen von Lauf zu Lauf ergaben identische Resultate und entsprachen dem jeweils erwarteten Probentyp.
Richtigkeit
Fünfundachtzig (85) verschiedene pathologische Serumproben und 11 normale Serumproben wurden mit HYDRAGEL 12 IF Penta Kits und einem
anderen handelsüblichen Agarosegel Immunfixationssystem analysiert.
In allen Fällen waren die Ergebnisse, die mit SEBIA Tests und dem Testverfahren erhalten wurden identisch.
Empfindlichkeit
Von 3 pathologischen Serumproben, die alle monoklonale Komponenten aufwiesen wurden serielle Verdünnungen hergestellt und mit HYDRAGEL IF
Penta 6/12 Gelen analysiert.
Die Ergebnisse sind unten zusammengefasst.
MONOKLONALE KOMPONENTE NACHWEISGRENZE (mg/dl) PROBEN-Nr. TYPE KONZ. (g/dl) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 1,09 12 2 alpha, lambda 0,58 25
| 3 | my, kappa | 0,34 | 12 |
Die Nachweisgrenze kann in Abhängigkeit von der Migrationsposition der monoklonalen Komponenten und dem Spiegel des polyklonalen
Hintergrunds in der Gamma-Fraktion zwischen 12 bis 25 mg/dl variieren.
LITERATUR
Zur Interpretation von Immunfixationsmustern siehe auch:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
GEBRUIKSAANWIJZING
De HYDRAGEL 6 IF Penta en HYDRAGEL 12 IF Penta kits zijn bedoeld voor het opsporen van monoclonale proteïnen in menselijk serum door middel
van immunofixatie-elektroforese op alkalisch gebufferde (pH 9,1) agarose-gels. De kits worden samen met het HYDRASYS systeem toegepast om zo
alle fasen uit te voeren die nodig zijn om gels te verkrijgen die gereed zijn voor interpretatie. De serumproteïnen ondergaan elektroforese en
immunofixatie door een Pentavalent antiserum anti-gamma (Ig G), alfa (Ig A) en mu (Ig M) zware ketens en anti-kappa en lambda (vrije en gebonden)
lichte ketens. Na immunofixatie worden de geprecipiteerde proteïnen met amidozwart gekleurd. De overtollige kleurstof wordt met een zure oplossing
verwijderd.
Iedere gel in de HYDRAGEL 6 IF Penta en HYDRAGEL 12 IF Penta kits is bedoeld voor de analyse van respectievelijk 6 en 12 monsters.
Voor gebruik bij in vitro diagnostiek.
PRINCIPE VAN DE TEST
Abnormale banden in het elektroforetisch patroon van serumproteïnen, en dan vooral met een gammamobiliteit, maar ook met alfa- en bètamobiliteit
(deze kunnen verborgen zijn door de normale proteïnen van de corresponderende zones), kunnen altijd monoclonaal zijn en zodoende een indicatie
leveren voor gammopathieën. Om deze abnormale banden te kunnen identificeren wordt de techniek van de immunofixatie toegepast.
Immunofixatie-elektroforese is een eenvoudige techniek waarbij een proteïne na elektroforese in situ wordt gebonden door de vorming van een
onoplosbaar complex met zijn anti-lichaam.
Het wordt in vier fasen uitgevoerd:
1. Separatie van proteïnen door elektroforese op agarose-gel.
2. Fixatie en immunoprecipitatie van de proteïnen na elektroforese: de fixeeroplossing en het antiserum worden direct op het geloppervlak
aangebracht op de juiste elektroforetische-migratiesporen. De fixeeroplossing en het antiserum trekken in de gel terwijl zij respectievelijk al de
proteïnen en de corresponderende antigenen precipiteren.
3. De niet-geprecipiteerde, oplosbare proteïnen worden door middel van deppen en spoelen van de gel verwijderd. De geprecipiteerde proteïnen
blijven vastzitten in de gel.
4. De geprecipiteerde proteïnen worden door middel van kleuring zichtbaar gemaakt. De immuno-geprecipiteerde banden worden vervolgens
vergeleken met de corresponderende abnormale banden die werden waargenomen in het elektroforetisch patroon van het serummonster.
Om detectie en identificatie van de verdachte monoclonale component(en) mogelijk te maken ondergaan de monsters simultaan in twee sporen
elektroforese. Na de elektroforese dient één spoor (ELP) als referentie, en deze geeft het elektroforetisch patroon van de monsterproteïnen te zien.
Het immunofixatie-spoor (Penta) toont de monoclonale componenten uit hun reactie met het Pentavalente antiserum.
Deze eenvoudige en snelle techniek levert een duidelijk en gemakkelijk te interpreteren beeld op.
REAGENTIA EN MATERIALEN BIJGELEVERD BIJ DE HYDRAGEL 6 IF Penta EN HYDRAGEL 12 IF Penta KITS
ARTIKELEN PROD. NR. 4341 PROD. NR. 4342 PROD. NR. 4384* Agarose-gels (klaar voor gebruik) 10 gels 10 gels 80 gels Gebufferde strips (klaar voor gebruik) 10 pakjes van 2 stuks 10 pakjes van 2 stuks 80 pakjes van 2 stuks Verdunner voor de kleuroplossing (geconcentreerde oplossing) 1 flesje van 60 ml 1 flesje van 60 ml 8 flesjes van 60 ml Amidozwart kleurstof (voorraadoplossing) 1 flesje van 20 ml 1 flesje van 20 ml 8 flesjes van 20 ml Fixeeroplossing (klaar voor gebruik) 2 flesjes van 2,9 ml Van zoogdieren afkomstige anti-Ig menselijke immuunglobulinen (gamma - alfa - mu - kappa - lambda): Pentavalent (vijfwaardig) antiserum (klaar voor gebruik)
2 flesjes van 2,9 ml Applicators (klaar voor gebruik) 1 pakje van 10 stuks 2 pakjes van 10 stuks 16 pakjes van 10 stuks Antisera-segmenten (klaar voor gebruik) 1 pakje van 10 stuks 1 pakje van 10 stuks 8 pakjes van 10 stuks Filterpapierstrips - dun -
| 1 pakje van 10 velletjes 1 pakje van 10 velletjes 8 pakjes van 10 velletjes Filterpapierstrips - dik - | 1 pakje van 10 velletjes | 1 pakje van 10 velletjes | 8 pakjes van 10 velletjes |
* HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
OPMERKING: De fixeeroplossing en het Pentavalent (vijfwaardig) antiserum worden los van de kits geleverd, behalve bij de MAXI-KIT (zie
BENODIGDE MAAR NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA).
VOOR OPTIMALE RESULTATEN
Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter.
LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR.
1. AGAROSE-GELS
Voorbereiding
De agarose-gels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; tris-barbital buffer, pH 9,1 ± 0,1 ; in de gebruikte concentraties niet schadelijke
toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.
WAARSCHUWING: De agarose-gels bevatten 0,31 % barbital en 0,34 % natriumbarbital. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden!
Gebruik
Draagmedium voor elektroforese en immunofixatie van proteïnen.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking en gekoeld (bij 2 tot 8 °C) of bij kamertemperatuur
(15 tot 30 °C) bewaard worden. De gels zijn stabiel tot de houdbaarheidsdatum die op de kit, of op het verpakkingslabel van de gel, staat aangegeven.
(De pijl op de voorzijde van de verpakking moet naar boven wijzen.) Vermijd opslag dicht bij een raam of een warmtebron. Vermijd belangrijke
temperatuurwisselingen tijdens de opslag. NIET INVRIEZEN.
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SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands

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Verwijder de gel wanneer er :
(I) zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft
aan dat de gel bevroren is geweest) ;
(II) bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ;
(III) een abnormale hoeveelheid vloeistof in de geldoos aanwezig is (wijst erop dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens
onjuiste opslagomstandigheden).
2. GEBUFFERDE STRIPS
Voorbereiding
Gebufferde sponsstrips zijn gereed voor gebruik. Elke strip bevat: tris-barbital buffer, pH 9,1 ± 0,3 ; natriumazide ; in de gebruikte concentraties niet
schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.
WAARSCHUWING: De gebufferde strips bevatten 0,92 % barbital, 1,03 % natriumbarbital en 0,30 % natriumazide. Niet voor inwendig
gebruik! Bij abusievelijke inname dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Bij verwijdering contact met zuren, lood of koper
vermijden aangezien deze explosieve of toxische verbindingen aangaan met natriumazide.
Gebruik
Gebufferde sponsstrips fungeren als bufferreservoir bij elektroforese en zorgen voor contact tussen de gel en de elektroden.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bewaar de gebufferde strips horizontaal in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur of in de koeling. (De pijl aan de voorkant van
de kitdoos dient omhoog te wijzen.)
De strips blijven stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of de etiketten van de verpakking van
de gebufferde strips.
NIET INVRIEZEN.
Gooi de gebufferde strips weg als de verpakking geopend is en de strips uitdrogen.
3. VERDUNNER VOOR DE KLEUROPLOSSING
Bereiding
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing moet toegepast worden volgens de beschrijving in de paragraaf "AMIDOZWART KLEUROPLOSSING".
Het bevat een zure oplossing.
Toepassing
Bij de preparatie van de amidozwart kleuroplossing.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum
zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET
INVRIEZEN!
Geen natriumazide toevoegen.
4. AMIDOZWART KLEUROPLOSSING
Bereiding
De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed
door de toename van de viscositeit of de hardwording.
In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden:
1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe.
2. Sluit het flesje zorgvuldig.
3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden.
4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt.
5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal.
6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water.
7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten.
De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik.
OPMERKING : Een onvolledige oplossing van de kleurstof zal een onvolledige kleuring van de albuminefractie opleveren (een laag percentage of een
wit gat in de fractie).
Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven,
ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking.
WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname.
Toepassing
Bij het kleuren van gels tijdens elektroforetische proteïneseparatie.
BELANGRIJK : De kleuroplossing is ontwikkeld voor het kleuren van een maximum van 10 gels. Na het kleuren van 10 gels dient u de oplossing te
vervangen.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping
te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het
label van de flesjes met kleuroplossing.
De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel.
De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren.
5. ANTISERA- EN FIXEERPAKKET (bij productnummer 4384)
5.1. PENTAVALENT ANTISERUM
Voorbereiding
Pentavalent antiserum is klaar voor gebruik. Pentavalent antiserum is een mengsel van van zoogdieren afkomstige totale anti-Ig menselijke
immuunglobulinen.
Voor eenvoudige identificatie van antisera en als hulpmiddel bij het toezien op de applicatie ervan worden de antisera gekleurd met een nietschadelijke
geel-oranje kleurstof die overeenkomt met de kleur van het etiket op het flesje.
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Wanneer antiserum een lichte vertroebeling vertoont, kunt u het flesje antiserum gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur laten staan.
Dit zou voldoende moeten zijn om de oplossing weer helder te krijgen. Blijft de vertroebeling evenwel bestaan, dan zal dit desondanks geen enkel
effect hebben op de immunologische reactie. In het geval van onoplosbare precipitaten geldt de aanbeveling de antisera gedurende 5 minuten te
centrifugeren bij 3000 toeren per minuut.
Gebruik
Voor immunofixatie van de elektroforetisch behandelde proteïnen.
Antisera kunnen afkomstig zijn van verschillende diersoorten. De inhoud van twee flesjes antisera mag dan ook NOOIT vermengd worden, zelfs niet
wanneer ze dezelfde specificiteit hebben, en bij het verwisselen van flesjes antiserum dient ALTIJD het pipetpuntje vervangen te worden.
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke
flacon zetten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bewaar het Pentavalent antiserum in de koeling (bij een temperatuur van 2 tot 8 °C). Het blijft stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die
vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes antiserum.
OPMERKING: Tijdens transport kan het antiserum gedurende 15 dagen ongekoeld bewaard worden (bij een temperatuur van 15 tot 30 °C) zonder
nadelige effecten op de prestaties.
5.2. FIXEEROPLOSSING
Voorbereiding
De fixeeroplossing is klaar voor gebruik. Het bevat: een zure oplossing ; toevoegingen, niet schadelijk in de gebruikte concentraties maar noodzakelijk
voor optimale prestaties. Voor eenvoudige identificatie en als hulpmiddel bij het toezien op de applicatie is de fixeer gekleurd met een niet-schadelijke
kleurstof.
Gebruik
Voor het fixeren van elektroforetisch gescheiden proteïnen in het referentiespoor (ELP).
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke
flacon zetten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bewaar de fixeeroplossing bij kamertemperatuur of in de koeling. Het blijft stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de
verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes fixeeroplossing.
Fixeeroplossing dient vrij te zijn van precipitaat.
6. APPLICATORS
Gebruik
Voorgesneden applicators, voor eenmalig gebruik, voor het aanbrengen van de monsters.
Opslag
Bewaar de applicators op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.
7. ANTISERA-SEGMENTEN
Gebruik
Gekleurde segmenten voor eenmalig gebruik voor het aanbrengen van fixeeroplossing en antiserum op de gel voor immunofixatie.
WAARSCHUWING: Segmenten met antisera dienen met uiterste zorgvuldigheid behandeld te worden.
8. FILTERPAPIER - DUN
Gebruik
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het absorberen van overtollige vloeistof van het oppervlak van de gel vóór het aanbrengen van de
monsters.
Opslag
Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.
9. FILTERPAPIER - DIK
Gebruik
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het opdeppen van niet-geprecipiteerde proteïnen na de immunofixatiefase.
Opslag
Bewaar de dikke velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.
BENODIGDE, NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA
1. PAKKET MET ANTISERUM EN FIXEEROPLOSSING (voor de kits 4341 en 4342)
Het pakket met antiserum en fixeeroplossing voor IF Penta-immunofixatie, SEBIA, productnummer 4345, bevat 1 flesje Pentavalent antiserum en
1 flesje fixeeroplossing (elk met een inhoud van 2,9 ml). Deze zijn specifiek bedoeld voor de immunofixatieprocedure met het dynamisch masker.
1.1 ANTISERUM
Zie de voorgaande paragraaf 5.1.
1.2 FIXEEROPLOSSING
Zie de voorgaande paragraaf 5.2.
2. ONTKLEURINGSOPLOSSING
Voorbereiding
Elk flesje ontkleuringsoplossing (SEBIA, prod. nr. 4540, 10 flesjes, 100 ml elk) wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water.
Het is praktisch om een verdunning van een klein deel van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 5 ml concentraat te verdunnen tot 5 liter, de
inhoud van de container voor de ontkleuringsoplossing. Na verdunning bevat de ontkleuringsoplossing: citroenzuur, 0,5 g/l.
Gebruik
Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleurstof van de gels.
Voor het spoelen van het kleurcompartiment na de spoelstap.
Giet om de zuurgraad van de vlekkenoplosser te neutraliseren 15 mL van een 50% Sodium Hydroxyde-oplossing in de lege afvalbak.
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Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De concentraat-ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de labels
op de flesjes met ontkleuringsoplossing. De verdunde ontkleuringsoplossing is, in een afgesloten fles en bij kamertemperatuur, gedurende 1 week
stabiel. Geen natriumazide toevoegen.
Verwijder de verdunde ontkleuringsoplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting
met microben.
Om te voorkomen dat micro-organismen zich kunnen verspreiden in de verdunde ontkleuringsoplossing wanneer deze langer dan een week bewaard
moet worden, kunt u er 5 µL/dL ProClin 300 aan toevoegen.
De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot
aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing.
3. HYDRASYS WASOPLOSSING
Voorbereiding
Ieder flesje geconcentreerde HYDRASYS Spoeloplossing (SEBIA, prod. nr. 4541, 10 flesjes, 80 ml elk) wordt verdund tot 5 liter met gedestilleerd of
gedeïoniseerd water.
Na verdunning bevat de spoeloplossing: alkalische buffer, pH 8,8 ± 0,3 ; natriumazide.
WAARSCHUWING: De geconcentreerde spoeloplossing bevat 0,625 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Natriumazide kan EXPLOSIEVE OF TOXISCHE VERBINDINGEN AANGAAN met zuren,
lood en koper. Na gebruik spoelen met grote hoeveelheden water.
Gebruik
De HYDRASYS spoeloplossing is ontwikkeld voor het afspoelen van niet-geprecipiteerde proteïnen, en dient tevens voor het spoelen van het
HYDRASYS Kleuringscompartiment. Gebruik periodiek, d.w.z. als het instrument dagelijks wordt gebruikt, spoelt u het kleuringscompartiment
wekelijks.
Voor verdere instructies met betrekking tot het gebruik wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De geconcentreerde oplossing en de verdunde oplossing in gesloten containers bewaren bij kamertemperatuur of gekoeld. De oplossingen blijven
stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de labels op de flesjes met spoeloplossing. Ruim de verdunde spoeloplossing op
zodra hij van uiterlÿk verandert, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben.
4. FLUIDIL
Voorbereiding
Fluidil (SEBIA, prod. nr. 4587, 1 flesje, 5 ml) is gereed voor gebruik.
Gebruik
Voor de verdunning van viskeuze of troebele monsters, bijvoorbeeld sera die cryoglobuline of cryogel bevatten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bewaren bij kamertemperatuur. Blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de labels op de flesjes met Fluidil.
Het Fluidil moet vrij van neerslag zijn.
BENODIGDE UITRUSTING EN ACCESSOIRES
1. HYDRASYS Systeem SEBIA, prod. nr. 1210 of nr. 1211.
2. Micro-pipet, voor handmatig dan wel automatisch gebruik, zoals bijvoorbeeld de HYDRAplus SEBIA, prod. nr. 1215, als extra keuzemogelijkheid
voor het vullen van de monsterapplicators of antisera-segmenten.
3. Vochtige kamer, prod. nr. 1270, geleverd met HYDRASYS.
4. Container Kit, geleverd met HYDRASYS.
5 Malgeleidestaaf SEBIA, geleverd met HYDRASYS.
6. Dynamisch masker, SEBIA, productnummer 1255.
7. Pipetten: 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µl, 100 µl en 200 µl.
MONSTERS VOOR ANALYSE
Verzameling en opslag van monsters
Voor de analyse wordt het gebruik van verse serummonsters aanbevolen. De sera dienen te worden verzameld overeenkomstig de vastgestelde
procedures zoals die worden gehanteerd bij klinische laboratoriumproeven.
Indien nodig kunnen de sera tot maximaal één week worden bewaard bij een temperatuur van 2 tot 8 °C.
Voor langduriger opslagperiodes kunnen de monsters worden ingevroren. Ingevroren monsters blijven ten minste één maand stabiel.
Ontdooide monsters kunnen lichte applicatiesporen vertonen als gevolg van proteïne- of lipoproteïnedenaturatie.
Wanneer aan ingevroren serummonsters natriumazide wordt toegevoegd, 0,02 g/dl, zorgt dit voor een verbeterde opslagstabiliteit.
Voorbereiding van de monsters
Gebruik onverdunde serummonsters.
Na een periode van opslag bij een temperatuur van 2 tot 8 °C of na invriezing kunnen sommige sera (met name die sera die cryoglobuline of cryogel
bevatten) stroperig worden of kan er vertroebeling in ontstaan. Dergelijke sera zouden applicatieproblemen kunnen geven vanwege een bemoeilijkte
diffusie door de tandjes van de monsterapplicator. In zo’n geval kunt u 25 µl Fluidil toevoegen aan 75 µl serum en dit gedurende 15 seconden mixen
in de vortexmixer. Volg daarna de standaardprocedure.
Sommige monoklonale proteïnen kunnen polymeriseren, waardoor er een "monoklonale fractie" verschijnt op alle geïmmunofixeerde sporen. In dit
geval kunt u als volgt te werk gaan: (I) prepareer 1% bèta-mercapto-ethanol (BME, of 2-mercapto-ethanol, 2 ME) in Fluidil, (II) voeg 25 µl van deze
reductie-oplossing toe aan 75 µl puur serum, (III) mix dit in de vortexmixer en wacht ten minste 15 minuten (15 minuten minimum, 30 minuten
maximum), en volg daarna de standaardprocedure.
Monsters die vermeden dienen te worden
Vermijd plasmamonsters: fibrinogeen geeft een band te zien in het referentiespoor, vlak bij het applicatiepunt, die zou kunnen worden aangezien voor
een monoklonale immuunglobuline.
Vermijd gehemolyseerde monsters.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
PROCEDURE
Het HYDRASYS systeem is een multiparameter-instrument. Tot de geautomatiseerde fasen behoort bewerking van HYDRAGEL agarose-gels in de
volgende volgorde: applicatie van de monsters, elektroforetische migratie, incubatie met de reagentia, drogen, spoelen, kleuren, ontkleuren en een
laatste droogfase. Tot de handmatige stappen behoren de voorbereiding van de monsters en de gel, het aanbrengen van de reagentia en het in
werking stellen van de automatische fasen.
LEES HET HYDRASYS-INSTRUCTIEHANDBOEK NAUWKEURIG.
I. VOORBEREIDING VAN DE MIGRATIE
1. Schakel het HYDRASYS instrument in.
2. Plaats één applicator voor de analyse van 6 monsters op HYDRAGEL IF Penta 6/12, of twee applicators voor de analyse van 12 monsters,
op een vlakke ondergrond met de holtenummers met de goede kant naar boven (Fig. 1).
- Breng 10 µl zuiver monster aan in elke holte. Vul elke applicator binnen 2 min.
| PUTTEN |
MONSTERS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
BELANGRIJK: De holtes nr. 1, 8 en 15 worden bij deze test niet gebruikt ; ze kunnen met een viltstift gemarkeerd worden om te voorkomen
dat ze per ongeluk toch gevuld worden met monsterstof.
- Plaats iedere applicator in de vochtige kamer, met de strips omhoog. Manipuleer deze aan het plastic beschermframe van de strips.
Voor verdere informatie wordt u naar de bijsluiter van de vochtige kamer verwezen.
- Laat de monsters gedurende 5 minuten, na de applicatie van het laatste monster, in de strips trekken. Voor later gebruik (tot maximaal 8 uur
later) houdt u de gehele kamer gekoeld.
3. Open het deksel van de Migratiemodule en til de dragers van de elektroden en de applicators op.
WAARSCHUWING: Sluit het deksel niet als de dragers nog omhoog staan.
4. Selecteer het "6/12 PENTA SM/DM" migratieprogramma uit het menu op het instrument (linkerzijde van het bedieningspaneel).
5. Neem de gebufferde strips uit de verpakking ; manipuleer ze aan de plastic uiteinden. Druk de geperforeerde einden van de plastic achterzijde
van de strips over de pinnen op de elektrodedrager ; de plastic achterzijden van de strips moeten tegen de drager liggen (Fig. 2).
6. Pak de HYDRAGEL agarose-gel uit.
- Rol een dun filter voorzichtig en gelijkmatig over het oppervlak om zo het teveel aan vloeistof te absorberen. Verwijder het filterpapier direct.
WAARSCHUWING : Laat het filtreerpapier niet te lang in contact met de gel om dehydratatie van de gel te vermijden.
- Giet 200 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het migratieframe dat afgedrukt is op de temperatuurcontroleplaat van de migratiemodule.
- Plaats de gelplaat (de gelzijde omhoog) met de rand tegen de begrenzer aan de onderzijde van het afgedrukte frame (Fig. 3).
- Buig de gel en breng deze naar beneden op het water (Fig. 3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingesloten en dat het water zich
onder de gehele gelplaat verspreidt (Fig. 3), en tevens dat de gel parallel met het afgedrukte frame ligt.
7. Breng beide dragers omlaag. In deze positie raken de gebufferde strips de gel niet. FORCEER DE DRAGERS NIET HELEMAAL NAAR
BENEDEN.
8. Haal de applicator(s) uit de vochtige kamer. Manipuleer ze aan het plastic beschermframe.
- Breek het beschermframe los van de tanden van de applicators.
- Voor de analyse van 6 monsters op HYDRAGEL IF Penta 6/12 plaatst u de applicator in positie nr. 6 op de drager.
- Voor de analyse van 12 monsters plaatst u de twee applicators in de posities nr. 3 en 9.
BELANGRIJK: De nummers die op de applicators zijn geprint moeten door de bediener gelezen kunnen worden (Fig. 4).
9. Sluit het deksel van de migratiemodule.
10. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de "START"-knop met de groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.
BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de ventilatieopening aan de rechterzijde van het instrument niet geblokkeerd is.
MIGRATIE - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN
• De beide dragers worden omlaag gebracht zodat de gebufferde strips en applicators in contact komen met de gel.
• De drager van de monsterapplicator komt omhoog.
• De migratie wordt uitgevoerd bij 20 W continustroom bij 20 °C, geregeld door het Peltier-effect tot 42 Vh (gedurende ongeveer 9 minuten).
• De elektrodedrager komt omhoog zodat de elektroden uitgeschakeld worden.
• Een hoorbaar piepsignaal geeft aan dat het deksel van de module ontsloten wordt. Het volgende bericht verschijnt op het scherm: " AS".
OPMERKING: Gedurende alle migratiestappen blijft het deksel van de migratiemodule vergrendeld.
II. SET-UP VAN DE IMMUNOFIXATIE
Het dynamisch masker bevat een referentiewijzer in kleur voor het aanbrengen van reagentia, een antiserasegment, een segmenthouder, een geleider
voor het dynamisch masker en een apparaat om de lengte in te korten (Fig. 5).
Tijdens de migratie zet u het dynamisch masker als volgt in elkaar:
1. Plaats de geleider voor het dynamisch masker op een vlakke ondergrond.
BELANGRIJK: Voor de analyse van zes monsters op HYDRAGEL IF Penta 6/12 is het noodzakelijk om een apparaat voor het inkorten van
de lengte op de geleider voor het dynamisch masker te positioneren.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
2. Stel een antiserasegment op op de segmenthouder (Fig. 6):
- Houd het antiserasegment schuin onder een hoek van 45° en positioneer het tegen de plastic veren van de segmenthouder.
- Trek de twee elementen uit elkaar en draai het segment om zijn as om het te bevestigen in de inkepingen van de segmenthouder.
WAARSCHUWING: Wees er zeker van dat het segment correct gepositioneerd is op de houder: de pinnetjes aan de uiteinden van
het segment dienen in de inkepingen van de houder vast te zitten.
3. Stel de houder met het segment op op de geleider van het dynamisch masker (Fig. 7). Zet daarna de gekleurde referentiewijzer voor het
aanbrengen van reagentia, corresponderend met de te analyseren test, op de segmenthouder vóór de segmentholtes (Fig. 8).
4. Breng de reagentia als volgt aan:
- 8 µl per holte voor de analyse van 6 monsters en,
- 12 µl per holte voor de analyse van 12 monsters.
| GOOT | REAGENS | KLEUR |
| ELP | fixeeroplossing | geel |
| Penta | Pentavalent antiserum | geel-oranje |
OPMERKING: De reagentia zijn gekleurd en de kleuren zijn terug te vinden op de gekleurde referentiewijzer om u behulpzaam te zijn bij het
pipetteren van de correcte antisera.
BELANGRIJK: Gebruik geen antiserasegmentholtes in positie 1, 8 en 15.
Zuig de reagentia op en vermijd daarbij zorgvuldig dat er luchtbelletjes in het puntje van de pipet komen.
Breng de reagentia aan (Fig. 9):
- Houd de pipet schuin en laat het puntje lichtjes rusten op de zijkant van de holte, zonder dat het de bodem van de holte raakt.
- Injecteer het druppeltje reagens in de holte.
5. Haal de gekleurde referentiewijzer weer weg.
III. IMMUNOFIXATIE
1. Open het deksel van de migratiemodule.
2. Verwijder de monsterapplicator(s) en gooi deze weg.
3. Til beide dragers omhoog, verwijder de gebufferde strips aan hun plastic uiteinden en gooi ze weg.
- Verwijder beide dragers.
- Veeg de elektroden af met een zachte, vochtige tissue.
- Laat de gel op zijn plaats staan in de migratiemodule.
4. Het dynamisch masker dient nu als volgt te worden opgesteld voor het aanbrengen van de reagentia (Fig. 10):
- Positioneer de maskergeleider op de ankerklem (de geleider mag de hele tijd in de migratiemodule blijven).
- Houd het dynamisch masker vast aan het lipje en positioneer het in de geleider, waarbij de inkepingen aan dienen te sluiten bij de
markeringen.
- Laat het dynamisch masker zakken op de HYDRASYS-plaat.
BELANGRIJK: Stel de positie van het dynamisch masker zo bij dat er een perfecte aansluiting ontstaat tussen de elektroforetische profielen
en de holtes van het masker.
5. Plaats de segmenthouder op het laagste punt op de maskergeleider, met de voorzijde naar de bediener. Houd de segmenthouder vast aan
de handgreep die zich aan de rechterzijde ervan bevindt, en druk op het centrale drukpunt zodat het antiserasegment contact maakt met de
gel. Laat het drukpunt los ; de reagentia zullen zich nu onder alle sporen verspreiden (Fig. 11).
6. Beweeg nu meteen, met behulp van de handgreep van de segmenthouder, het segment langzaam en gelijkmatig op en neer over de hele
lengte van de gel om de reagentia aan te brengen. De applicatie zal zo ongeveer 5 seconden in beslag nemen (Fig. 12).
WAARSCHUWING: Tijdens deze fase houdt u het masker slechts vast aan de handgreep van de segmenthouder. Vermijd het
aanraken van de geleider. Druk niet opnieuw op het drukpunt, aangezien dit zou kunnen leiden tot een in elkaar overlopen van
reagentia.
7. Verwijder de geleider en het dynamisch masker.
- Verwijder de segmenthouder aan zijn handgreep.
- Verwijder het antiserasegment uit de houder en gooi het weg.
WAARSCHUWING: Segmenten met antisera dienen met uiterste zorgvuldigheid behandeld te worden.
- Achterblijvende reagentia kunnen na de applicatie in de holtes blijven. Dit heeft geen effect op de testresultaten.
8. Sluit het deksel van de migratiemodule.
9. Start de procedure onmiddellijk door op de groene pijl te drukken, de "START"-knop aan de linkerzijde van het toetsenpaneel. Op het scherm
verschijnt het bericht "[INCUBATION]".
IMMUNOFIXATIE - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE STAPPEN
• Incubatie bij 20 °C gedurende 5 minuten (gecontroleerd door het Peltier-effect).
• Een hoorbaar piepsignaal geeft aan dat het deksel van de migratiemodule ontgrendeld wordt. Het volgende bericht verschijnt op het scherm:
" PAP.".
OPMERKING: Tijdens de incubatie blijft het deksel van de migratiemodule vergrendeld.
IV. AFDEPPEN VAN DE GEL
1. Open het deksel van de migratiemodule.
2. Breng een dik velletje filterpapier aan op de gel:
- zorg ervoor dat de rand van het filterpapier gelijk ligt met de rand van de gel (buig het om in een hoek van 45°) en laat het voorzichtig op
de gel zakken.
BELANGRIJK: Druk stevig op het hele oppervlak van het filterpapier om ervoor te zorgen dat het zich overal goed aan de gel hecht.
3. Sluit het deksel van de migratiemodule.
4. Start de procedure door op de "START"-knop te drukken (groene pijl aan de linkerzijde van het toetsenpaneel).
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
AFDEPPEN - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE STAPPEN
• Afdeppen bij 40 °C gecontroleerd door het Peltier-effect, gedurende 3 minuten.
Het volgende bericht verschijnt op het scherm: "[BLOTTING]".
• Er klinkt een hoorbaar piepsignaal.
Het volgende bericht verschijnt op het scherm: "❊ PAP.".
V. DROGEN VAN DE GEL
1. Open het deksel van de migratiemodule.
2. Verwijder het filterpapier en laat de gel op zijn plaats.
3. Sluit het deksel van de migratiemodule.
4. Start de procedure door het indrukken van de "START"-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.
HET DROGEN VAN DE GEL - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN
• Bij 50 °C gedurende 6 minuten drogen (temperatuur gecontroleerd door het Peltier-effect).
• Er klinkt een signaaltoon, en de veiligheidsvergrendeling van het deksel van de migratiemodule wordt ontsloten. De temperatuur van de plaat blijft
50 °C totdat het deksel wordt geopend. Op het scherm ziet u staan: "MIGRATIETEMP. BLIJFT GEHANDHAAFD".
OPMERKING: Het deksel van de migratiemodule blijft gedurende de gehele droogfase vergrendeld.
VI. VOORBEREIDING VAN DE GELVERWERKINGSFASEN: SPOELEN, KLEUREN EN ONTKLEUREN
1. Open het deksel van de migratiemodule.
2. Neem de gedroogde gelfilm eruit voor verdere bewerking.
3. Open de gelhouder. Leg deze vlak op het rooster, en plaats de gedroogde gel (met de gelkant naar boven gericht) in de spleten van de beide
stangen. Sluit de houder. Zorg ervoor dat de film op de juiste wijze in de houder geplaatst is (Fig. 13).
4. Plaats de gelhouder in de gelverwerkings-/ kleuringsmodule.
BELANGRIJK: Voordat begonnen kan worden met het gelverwerkings-/ kleuringsprogramma, moet het volgende gecontroleerd worden:
- de spoelcontainer is gevuld met 400 ml spoeloplossing ;
- de kleuringscontainer is gevuld met 300 ml kleuringsoplossing ;
- de ontkleuringscontainer bevat ten minste 1 liter ontkleuringsoplossing ;
- de afvalcontainer is leeg ;
- de ongebruikte kanalen zijn geblokkeerd.
Voor de verbinding van de reagenslijnen: zie de informatie op het scherm van het apparaat (keuzetoets: REAGENT LINES).
BELANGRIJK: Vergeet niet de niet-gebruikte lijnen te blokkeren.
5. Selecteer het "IF AMIDO" kleuringsprogramma uit het menu op het instrument. Start de procedure door het indrukken van de "START"-knop
(groene pijl op de rechterzijde van het bedieningspaneel).
Gedurende de kleur-, onkleur- en droogstappen blijft het compartiment gesloten.
Na de koelstap geeft een audiosignaal aan dat het compartiment ontsloten wordt (de ventilatie wordt doorgezet totdat de gelhouder
verwijderd is).
OPMERKINGEN:
- De temperatuur van de migratieplaat blijft dalen nadat het deksel geopend werd, tot een temperatuur van 20 °C is bereikt (in ongeveer 5 minuten).
Dan kan met een nieuwe migratiecyclus begonnen worden.
- Veeg de temperatuurcontroleplaat schoon met een vochtig doekje.
- Breng de monsterapplicator- en elektrodedragers terug in positie.
VII. AFRONDING VAN DE GELVERWERKING
• Haal de gelhouder uit het compartiment ; open de gelhouder en haal de droge gel eruit.
• Indien nodig kunt u de achterzijde van de gel (plastic steun) met een vochtig doekje schoonmaken.
NOOT: Voor de gels met verschilende rijen (2 of 3) kunnen de migratielengtes aanzienlijk verschillen, zonder de resultaten te beïnvloeden.
RESULTATEN
Het Pentavalent antiserum detecteert:
• G, A, M immuunglobulinen, kappa en lambda ketens,
• vrije kappa en lambda lichte ketens,
• kappa en lambda lichte ketens gebonden aan epsilon of delta zware ketens.
Interpretatie
Een normaal serum geeft een lichtelijk gekleurde, gediffundeerde zone te zien, zonder scherpe begrenzing, die overeenkomt met de polyclonale
immnunoglobulinen (G, A, M, kappa en lambda).
Een hypergammaglobulinemie wordt gekarakteriseerd door een veel sterker gekleurde gediffundeerde zone, maar zonder monoclonale fractie.
Een gammopathie wordt gekarakteriseerd door één of meer monoclonale banden, aangetoond met behulp van het Pentavalent antiserum.
Speciale gevallen
• Een lichte monoclonale gammopathie kan in een normaal elektroforetisch profiel verborgen blijven (bijvoorbeeld bèta-mobiliteit dysglobuline). Deze
band kan met het Pentavalent antiserum worden ontdekt.
• Een hypogammaglobulinemie kan met een monoclonale vrije lichte keten geassocieerd worden. Dit proteïne wordt, vanwege zijn lage moleculaire
gewicht, door de nier geëlimineerd en via de urine afgevoerd (Bence Jones Proteïne). De resterende hoeveelheid in het serum is gewoonlijk erg
gering, maar het kan aangetoond worden door middel van immunofixatie met Pentavalent antiserum.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
• Wanneer een monoklonaal type band wordt waargenomen op serum-elektroforese (ELP-spoor) maar dit niet wordt bevestigd door immunofixatie,
dient u primair verdacht te zijn op fibrinogeen (plasmamonster).
• Wanneer een monoklonaal type band wordt waargenomen op alle immunofixatiesporen, dient de verdenking uit te gaan naar cryoglobuline of
gepolymeriseerd Ig M. Depolymeriseer met een reductiemiddel en herhaal de procedure (zie "Monsters ter analyse").
Iedere monoklonaalachtige fractie dient te worden geïdentificeerd door nader onderzoek op:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, productnummer 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, productnummer 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, productnummer 4304 of
4308, of HYDRAGEL 9 IF SEBIA, productnummer 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, productnummer 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, productnummer 4322 of HYDRAGEL
4 BENCE JONES SEBIA, productnummer 4324.
Interferentie en begrenzingen
Het gebruik van andere antisera dan die welke specifiek bedoeld zijn voor de immunofixatieprocedure met het dynamisch masker, kan de resultaten
nadelig beïnvloeden.
Met het oog op de resolutie- en gevoeligheidsbeperkingen van zone-elektroforese is het mogelijk dat niet alle monoclonale componenten met deze
methode volledig worden gedetecteerd.
Troubleshooting
Bel de technische dienst van de leverancier als de test mislukt terwijl u de instructies voor voorbereiding en opslag van materialen, en voor de
procedure, nauwkeurig hebt gevolgd.
Veiligheidsdatalijsten voor Kit-reagentia en informatie over de verwijdering van afvalproducten zijn tevens verkrijgbaar bij de technische dienst van de
leverancier.
PRESTATIEGEGEVENS
Reproduceerbaarheid binnen een gel en specificiteit
De reproduceerbaarheid binnen een gel werd aangetoond op drie verschillende pathologische monsters: twee monsters met één hoog niveau aan
monoklonale component en één monster met een laag niveau aan monoklonale component.
Ieder monster werd 12 maal getest op 2 partijen HYDRAGEL IF Penta 6/12-gels met behulp van de amidozwart kleuringsprocedure.
Alle herhalingen gaven identieke resultaten te zien binnen een partij en tussen verschillende partijen, en overeenkomstig de verwachtingen voor het
type geanalyseerde monsters.
Immunofixatie toonde slechts één monoklonale component voor de drie pathologische monsters.
Reproduceerbaarheid tussen gels en specificiteit
De reproduceerbaarheid tussen gels werd aangetoond op twaalf verschillende pathologische monsters met één of vele monoklonale componenten.
Deze monsters werden getest op 10 HYDRAGEL IF Penta 6/12-gels uit 3 verschillende partijen, met behulp van de amidozwart kleuringsprocedure.
Alle herhalingen gaven identieke resultaten te zien van gel tot gel en overeenkomstig de verwachtingen voor het type geanalyseerde monsters.
Nauwkeurigheid
Vijfentachtig (85) verschillende pathologische serummonsters en elf (11) normale sera werden getest met behulp van de HYDRAGEL 12 IF Penta-kit
en een ander commercieel verkrijgbaar agarosegel-immunofixatiesysteem.
In alle gevallen waren de resultaten verkregen met de SEBIA-tests identiek aan de resultaten verkregen met de vergelijkbare commercieel verkrijgbare
procedure.
Gevoeligheid
Seriële verdunningen werden geprepareerd met 3 pathologische serummonsters die alledrie monoklonale componenten vertoonden, en deze werden
geanalyseerd op HYDRAGEL IF Penta 6/12-gels.
De resultaten worden onderstaand weergegeven.
MONOCLONALE COMPONENT DETECTIELIMIET (mg/dl) MONSTER Nr. TYPE CONC. (g/dl) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 1,09 12 2 alfa, lambda 0,58 25
| 3 | mu, kappa | 0,34 | 12 |
Afhankelijk van de migratiepositie van de monoklonale component en het niveau van polyklonale achtergrond in de gammazone, kan de detectielimiet
variëren van 12 tot 25 mg/dl.
BIBLIOGRAFIE
Voor aanvullende informatie met betrekking tot de interpretatie van immunofixatiepatronen wordt verwezen naar:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
UTILIZZO
II kits HYDRAGEL 6 IF Penta e HYDRAGEL 12 IF Penta sono stati progettati per l’identificazione di proteine monoclonali nel siero umano mediante
elettroforesi ed immunofissazione su gel di agarosio tamponato in mezzo alcalino (pH 9.1). I kits sono usati in combinazione con il sistema semiautomatico
HYDRASYS per eseguire tutte le fasi necessarie all’ottenimento di gels pronti per l’interpretazione. Le sieroproteine sono fatte migrare ed
immunofissate mediante un antisiero Pentavalente anti catene pesanti gamma (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M) ed anti catene leggere kappa e lambda
(libere e legate). Dopo l’immunofissazione, le proteine precipitate sono colorate con amidoschwarz. L’eccesso di colorante è rimosso con una
soluzione acida.
Ogni gel dei kits HYDRAGEL 6 IF Penta e HYDRAGEL 12 IF Penta permette di processare rispettivamente 6 e 12 campioni.
Per uso diagnostico in vitro.
PRINCIPIO DEL METODO
Bande anomale nel quadro elettroforetico sieroproteico, generalmente con mobilità in zona gamma, ma anche in zona alfa e beta (queste possono
essere nascoste dalle normali proteine delle zone corrispondenti), sono presunte essere proteine monoclonali e pertanto un indice di gammapatie.
Per identificare tali bande anomale si utilizza la tecnica dell’immunofissazione.
L’immunofissazione elettroforetica è una semplice tecnica che permette di fissare una proteina in situ formando un complesso insolubile con anticorpi
specifici.
Tale tecnica consta di quattro fasi:
1. Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel di agarosio.
2. Fissazione ed immunoprecipitazione delle proteine migrate: soluzione fissativa ed antisiero sono stratificati direttamente sulla superficie del gel
nelle appropriate corsie di migrazione. Soluzione fissativa ed antisiero diffondono nel gel precipitando, rispettivamente, le proteine ed i
corrispondenti antigeni.
3. Le proteine non precipitate e quindi solubili sono rimosse dal gel mediante asciugatura e lavaggio. Il complesso antigene-anticorpo precipitato è
intrappolato all’interno della matrice del gel.
4. Le proteine precipitate sono evidenziate con la colorazione. Le bande immunoprecipitate sono poi comparate con le corrispondenti bande anomale
visibili nel quadro elettroforetico sieroproteico di riferimento.
Per evidenziare ed identificare le presunte componenti monoclonali i campioni sono fatti migrare contemporaneamente in due corsie. Dopo
l’elettroforesi la corsia ELP serve da riferimento, mostrando il quadro elettroforetico delle proteine del campione. La corsia immunologica (Penta), rivela
le componenti monoclonali che hanno reagito con l’antisiero Pentavalente.
Questa semplice e rapida tecnica fornisce un quadro chiaro e facilmente interpretabile.
REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEI KITS HYDRAGEL 6 IF Penta E HYDRAGEL 12 IF Penta
COMPONENTI PN 4341 PN 4342 PN 4384* Gels di Agarosio (pronti all’uso) 10 gels 10 gels 80 gels Strisce tamponate (pronte all’uso) 10 confezioni da 2 10 confezioni da 2 80 confezioni da 2 Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 flacone, 60 ml 1 flacone, 60 ml 8 flaconi da 60 ml Colorante Amidoschwarz (soluzione concentrata) 1 flacone, 20 ml 1 flacone, 20 ml 8 flaconi da 20 ml Soluzione Fissativa (pronta all’uso) 2 flaconi da 2.9 ml Immunoglobuline di mammifero anti-Ig umane (gamma, 2 flaconi da 2.9 ml alfa, mu, kappa e lambda): antisiero Pentavalente (pronto all’uso) Applicatori (pronti all’uso) 1 confezione da 10 2 confezioni da 10 16 confezioni da 10 Barrette Antisieri (pronte all’uso) 1 confezione da 10 1 confezione da 10 8 confezioni da 10 Cartine da filtro sottili 1 confezione da 10 1 confezioni da 10 8 confezioni da 10
| Cartine da filtro spesse | 1 confezione da 10 | 1 confezione da 10 | 8 confezioni da 10 |
* HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTA: La soluzione fissativa e l’antisiero Pentavalente sono forniti separatamente dal kit ad esclusione del MAXI-KIT (Vedi REAGENTI RICHIESTI
MA NON FORNITI).
PER RISULTATI OTTIMALI
I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit.
LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO.
1. GELS DI AGAROSIO
Preparazione
I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 8 g/l ; tampone tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.
AVVERTENZA: I gels di agarosio contengono 0.31 % di barbital e 0.34 % di barbital sodico. Non ingerire! Se ingerito consultare
immediatamente un medico!
Utilizzo
Mezzo di supporto per elettroforesi ed immunofissazioni proteiche.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare i gels orizzontalmente nella confezione originale protettiva a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono stabili
fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). Evitare
la conservazione nelle seguenti condizioni: in prossimità di fenestre ; in prossimità di sorgenti di calore ; in presenza di brusche e/o significative
variazioni di temperatura. NON CONGELARE.
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FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Non utilizzare il gel quando:
(i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del
congelamento del gel),
(ii) è presente muffa o flora batterica,
(iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni
di conservazione improprie).
2. STRISCE TAMPONATE
Preparazione
Le strisce tamponate sono pronte all’uso. Ogni striscia contiene: tampone tris-barbital pH 9.1 ± 0.3 ; sodio azide ; additivi, non rischiosi alle
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.
AVVERTENZA: Il tampone nelle strisce contiene 0.92 % di barbital, 1.03% di barbital sodico e 0.30 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerite
consultare immediatamente un medico! Quando smaltite, evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono originare composti
esplosivi o tossici con la sodio azide.
Utilizzo
Le strisce di spugna tamponate funzionano da riserva di tampone per l’elettroforesi ed assicurano il contatto tra il gel e gli elettrodi.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare le strisce tamponate orizzontalmente nella loro confezione protettiva, a temperatura ambiente o in frigorifero. (La freccia sulla scatola del
kit deve essere rivolta verso l’alto).
Le strisce sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta della confezione delle strisce.
NON CONGELARE.
Non utilizzare le strisce se la confezione è aperta e le strisce sono asciutte.
3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE
Preparazione
Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ".
Contiene una soluzione acida.
Utilizzo
Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola
del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE.
Non aggiungere sodio azide.
4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ
Preparazione
l colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del suo
potere colorante siano minimamente alterati.
Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo.
1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato.
2. Chiudere accuratamente il flacone.
3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi.
4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.
5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario.
6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.
7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata.
8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti.
Il colorante è pronto all’uso.
NOTA : Una risospensione incompleta del colorante può causare una cattiva colorazione della frazione albumina (percentaule bassa di albumina o
svuotamento al centro della frazione).
Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi
alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali.
AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione.
Utilizzo
Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine.
IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire
l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante.
Il colorante diluito è stabile 1 mese.
Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore.
5. CONFEZIONE ANTISIERI E FISSATIVO (con PN 4384)
5.1. ANTISIERO PENTAVALENTE
Preparazione
Pronto all’uso. L’antisiero Pentavalente è una miscela di anti immunoglobuline totali umane. Per una facile identificazione dell’antisiero e per un aiuto
nel controllo della corretta applicazione, l’antisiero è colorato con un colorante atossico arancione. Tale colore è riportato sull’etichetta del flacone.
Quando l’antisiero mostra una lieve torbidità, lasciarne il flacone a temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti. Questa azione dovrebbe essere
sufficiente a chiarificare la soluzione ; tuttavia, se la torbidità rimane, questa non dovrebbe avere alcun effetto sulla reazione immunologica. In caso
di precipitati insolubili, si raccomanda di centrifugare l’antisiero per 5 minuti a 3000 rpm.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Utilizzo
Per immunofissare le proteine separate elettroforeticamente.
Gli antisieri possono avere origine da specie animali differenti. Non miscelare due diversi flaconi di antisiero, anche con la stessa specificità, e
sostituire SEMPRE il puntale della pipetta quando si cambia il flacone di antisiero.
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni
utilizzo.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare l’antisiero Pentavalente in frigorifero (2 - 8 °C). L’antisiero è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o
sull’etichette del flacone.
NOTA: Durante il trasporto, l’antisiero può essere mantenuto a temperatura non refrigerata (15 - 30 °C) per 15 giorni senza effetti negativi sulle
prestazioni.
5.2. SOLUZIONE FISSATIVA
Preparazione
La soluzione fissativa è pronta all’uso. Contiene: soluzione acida ; additivi, non rischiosi alle concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.
Per una facile identificazione e come aiuto nel controllo della sua corretta applicazione, il fissativo è colorato con un colorante atossico.
Utilizzo
Per fissare le proteine separate mediante l’elettroforesi nella pista di riferimento (ELP).
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni
utilizzo.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare la soluzione fissativa a temperatura ambiente o in frigorifero. Il fissativo è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del
kit o sull’etichetta del flacone.
La soluzione fissativa deve essere priva di precipitato.
6. APPLICATORI
Utilizzo
Applicatori monouso, pretagliati, per l’applicazione dei campioni.
Conservazione
Conservare gli applicatori in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.
7. BARRETTE ANTISIERI
Utilizzo
Barrette colorate monouso, per la stratificazione sul gel da immunofissazione della soluzione fissativa e degli antisieri.
AVVERTENZA : Le barrette con gli antisieri devono essere manipolate con precauzione.
8. CARTINE DA FILTRO - SOTTILI
Utilizzo
Cartine assorbenti sottili, pretagliate, monouso per l’eliminazione dell’eccesso di liquido dalla superficie del gel prima dell’applicazione dei campioni.
Conservazione
Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.
9. CARTINE DA FILTRO - SPESSE
Utilizzo
Cartine assorbenti spesse, pretagliate, monouso per l’eliminazione dal gel delle proteine non precipitate dopo la fase di immunofissazione.
Conservazione
Conservare le cartine da filtro spesse in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.
REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. CONFEZIONE ANTISIERO E SOLUZIONE FISSATIVA (per kits 4341, 4342)
La confezione antisiero e soluzione fissativa per immunofissazione IF Penta, SEBIA, PN 4345, contiene 1 flacone di antisiero Pentavalente e 1 flacone
di soluzione fissativa da 2.9 mL ciascuno. Gli antisieri sono specifici per la metodica immunofissativa con maschera dinamica.
1.1 ANTISIERI
Vedi precedente paragrafo 5.1.
1.2 SOLUZIONE FISSATIVA
Vedi precedente paragrafo 5.2.
2. SOLUZIONE DECOLORANTE
Preparazione
Ogni flacone di Soluzione Decolorante concentrata (SEBIA, PN 4540, 10 flaconi da 100 ml ciascuno) deve essere diluito a 100 litri con acqua
deionizzata o distillata. Per convenienza diluire solo 5 ml di soluzione concentrata a 5 litri, ossia al volume della tanica della soluzione decolorante.
Dopo la diluizione la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.5 g/l.
Utilizzo
Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel.
Per il risciacquo del compartimento di colorazione dopo la fase di lavaggio.
Per neutralizzare l’acidità della soluzione decolorante versare, nella tanica vuota dei liquidi reflui, 15 mL di una soluzione al 50 % di Idrossido di Sodio.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino all data di scadenza
indicata sulla scatola del kit o sulla etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente
in flacone chiuso. Non aggiungere sodio azide.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.
Per prevenire le proliferazioni microbiche nella soluzione decolorante diluita, da conservare oltre una settimana, aggiungere 5 µL/dL di ProClin 300.
La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data
di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante.
3. SOLUZIONE DI LAVAGGIO HYDRASYS
Preparazione
Ogni flacone di Soluzione di Lavaggio concentrata HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 flaconi da 80 ml ciascuno) deve essere diluito a 5 litri con acqua
distillata o deionizzata. Dopo la diluizione la soluzione di lavaggio contiene: tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; sodio azide.
AVVERTENZA: La soluzione di lavaggio concentrata contiene 0.625 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerita consultare immediatamente
un medico! La sodio azide può portare alla formazione di composti tossici o esplosivi se posta a contatto con acidi, piombo o rame. Quando
smaltita, fare scorrere un’abbondante quantità di acqua.
Utilizzo
La soluzione di lavaggio HYDRASYS ha la funzione di rimuovere le proteine non precipitate dai gels. Serve inoltre per lavare il compartimento di
colorazione di HYDRASYS. Usare periodicamente ; per esempio, se lo strumento è usato giornalmente lavare il compartimento di colorazione
settimanalmente.
Consultare l’inserto nella confezione per la procedura di utilizzo.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare sia la soluzione di lavaggio concentrata che quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero in contenitore chiuso. Entrambe le
soluzioni sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone della soluzione di lavaggio.
Eliminare la soluzione di lavaggio diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.
4. FLUIDIL
Preparazione
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 flacone da 5 ml) è pronto all’uso.
Utilizzo
Per diluire campioni viscosi o torbidi, per esempio, sieri contenenti criogloguline o criogel.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento.
Conservare a temperatura ambiente. Fluidil è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone.
Fluidil deve essere privo di precipitato.
APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN 1210 o PN 1211.
2. Dispensatore manuale o in alternativa, per il caricamento degli applicatori dei campioni o delle barrette antisieri, campionatore automatico
HYDRAplus SEBIA, PN 1215.
3. Camera umida, PN 1270, fornita con HYDRASYS.
4. Kit di taniche fornito con HYDRASYS.
5. Barra per il fissagio della maschera SEBIA fornita con HYDRASYS.
6. Maschera dinamica, SEBIA, PN 1255.
7. Pipette: 8 µL, 10 µL, 12 µL, 20 µL, 100 µL e 200 µL.
CAMPIONI PER L’ANALISI
Raccolta e conservazione dei campioni
Per l’analisi sono raccomandati campioni freschi. I sieri e le urine devono essere prelevati seguendo le procedure convenzionali per i tests clinici di
laboratorio.
Refrigerare i campioni (2 - 8 °C) subito dopo il prelievo e conservare al massimo una settimana.
Per periodi di conservazioni più lunghi, congelare i campioni. I campioni congelati sono stabili fino ad 1 mese.
I campioni scongelati possono dar luogo a leggeri segni nel punto di applicazione causati dalla denaturazione delle proteine o delle lipoproteine.
I sieri congelati con aggiunta di sodio azide, 0.2 g/L, migliorano la stabilità di conservazione.
Preparazione dei campioni
Utilizzare campioni di siero non diluiti.
Dopo refrigerazione o congelamento, alcuni sieri (particolarmente quelli contenenti crioglobuline o criogel) possono essere viscosi o sviluppare
torbidità. Tali sieri possono presentare problemi di deposizione dovuti alla ostacolata diffusione nei dentini di applicazione. In tali casi, aggiungere
25 µL di Fluidil a 75 µL di campione ed agitare per 15 secondi. Seguire quindi la procedura.
Alcune proteine monoclonali possono polimerizzare dando luogo ad una "frazione monoclonale" che si presenta in tutte le piste di immunofissazione.
In questo caso (i) preparare una soluzione all’1 % di beta-mercaptoetanolo (BME, o 2-mercaptoethanol, 2ME) in Fluidil, (ii) aggiungere 25 µL di
soluzione riducente a 75 µL di siero non diluito, (iii) agitare ed attendere per almeno 15 minuti (massimo 30 minuti) e quindi eseguire la procedura.
Campioni da evitare
Evitare campioni di plasma. Il fibrinogeno dà luogo ad una banda nella pista di riferimento, vicino al punto di applicazione in zona beta, che può essere
scambiata per una proteina monoclonale.
Non utilizzare campioni emolizzati.
PROCEDURA
Il sistema HYDRASYS è uno strumento multiparametrico semi-automatico. Le fasi automatiche includono il trattamento dei gels di agarosio
HYDRAGEL nella seguente sequenza: applicazione del campione, migrazione elettroforetica, incubazione con la soluzione fissativa e con l’antisiero,
essiccazione, colorazione, decolorazione ed essiccazione finale. Le fasi manuali includono la manipolazione dei campioni, dei gels, l’applicazione del
fissativo e dell’antisiero e la preparazione dello strumento per l’uso.
LEGGERE ATTENTAMENTE IL MANUALE DI ISTRUZIONE HYDRASYS.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
I. MIGRAZIONE
1. Accendere lo strumento HYDRASYS.
2. Posizionare un applicatore per l’analisi di 6 campioni su HYDRAGEL IF Penta 6/12 o due applicatori per l’analisi di 12 campioni, su una
superficie piana con i numeri dei pozzetti rivolti verso l’alto (Fig. 1).
- Applicare 10 µl di campione in ogni pozzetto. Caricare ciascun applicatore entro 2 minuti.
| POZZETTI |
CAMPIONI ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
NOTA: I pozzetti no. 1, 8 e 15 non sono utilizzati ; possono essere marcati con un pennarello per evitarne il riempimento erroneo con il
campione.
- Inserire ciascun applicatore nella camera umida di conservazione, con i dentini rivolti verso l’alto (maneggiare i depositori mediante la cornice
protettiva in plastica).
Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli.
- Lasciare che i campioni diffondano nei dentini per 5 minuti dall’applicazione dell’ultimo campione. Mantenere la camera, così preparata, in
frigorifero se si intende usare gli applicatori più tardi (fino ad 8 ore).
3. Aprire lo sportello del modulo di migrazione ed alzare le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori
AVVERTENZA: Non chiudere mai lo sportello se le cornici mobili sono alzate.
4. Selezionare il programma di migrazione "6/12 PENTA MS/MD" dal menù dello strumento (lato sinistro della tastiera).
5. Estrarre le strisce tamponate dalla confezione ; maneggiarle mediante le estremità in plastica. Agganciare le estremità in plastica forate agli
spinotti della cornice porta elettrodi ; le estremità in plastica della striscia devono essere rivolte verso la cornice mobile (Fig. 2).
6. Estrarre il gel dalla confezione.
- Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido dalla superficie del gel, facendo aderire sul gel una cartina da filtro sottile.
AVVERTENZA: Non lasciare assolutamente la cartine da filtro in contatto prolungato con il gel in modo da evitare la sua disidratazione.
- Dispensare 200 µl di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sulla piastra di controllo temperatura del modulo
di migrazione.
- Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 3)
- Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia di acqua. Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere
uniformemente stratificata al di sotto della lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato.
7. Abbassare entrambe le cornici mobili. In questa posizione le strisce tamponate non toccano il gel. NON FORZARE LE CORNICI MOBILI AD
ABBASSARSI ULTERIORMENTE.
8. Estrarre ciascun applicatore dalla camera di umidificazione. Maneggiare gli applicatori mediante la cornice di protezione.
- Staccare la cornice di protezione dei dentini dell’applicatore.
- Per l’analisi di 6 campioni con HYDRAGEL IF 6/12 Penta, inserire l’applicatore sulla cornice mobile in posizione No 6.
- Per l’analisi di 12 campioni, inserire i due applicatori in posizione No 3 e 9.
IMPORTANTE: I numeri stampati sugli applicatori devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4).
9. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.
10. Avviare la procedura immediatamente premendo la freccia verde "START" sul lato sinistro della tastiera.
IMPORTANTE: Assicurarsi che la griglia di ventilazione sul lato destro dello strumento non sia ostruita.
MIGRAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE
• Le due cornici mobili vengono abbassate in modo che le strisce tamponate e gli applicatori entrino in contatto con il gel.
• La cornice mobile porta applicatori si alza.
• Ha luogo la migrazione in condizioni di potenza costante, 20 W a 20 °C controllati mediante effetto Peltier, fino ad accumulare 42 Vh (per circa 9 minuti).
• La cornice mobile porta elettrodi si alza interrompendo il contatto.
• Un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione è stato sbloccato. Sullo schermo compare il messaggio: " AS".
NOTA: Lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato durante tutte le fasi della migrazione.
II. IMMUNOFISSAZIONE - PREPARAZIONE
La maschera dinamica è composta da una guida colorata con i colori di riferimento per l’applicazione dei reagenti, da una barretta antisieri, da un
supporto barretta, da una guida per la maschera dinamica e da un riduttore di corsa (Fig. 5).
Durante la migrazione, assemblare la maschera dinamica come segue:
1. Posizionare la guida per la maschera dinamica su una superficie piana.
IMPORTANTE : Per l’analisi di 6 campioni con HYDRAGEL IF Penta 6/12, è necessario posizionare il riduttore di corsa sulla guida per la
maschera dinamica.
2. Posizionare una barretta antisieri sul supporto barretta (Fig. 6) :
- Inclinare la barretta antisieri con un angolo di 45° e appoggiarla contro le molle plastiche del supporto barretta.
- Allontanare i due elementi e ruotare la barretta per fissarla nelle fessure del supporto barretta.
AVVERTENZA : Assicurarsi che la barretta sia correttamente inserita nel supporto : gli spinotti all’estremità della barretta devono
essere bloccati nelle fessure del supporto barretta.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
3. Alloggiare il supporto con il segmento sulla guida della maschera dinamica (Fig. 7). Quindi, posizionare la guida colorata con i colori di
riferimento per l’applicazione dei reagenti, corrispondente agli esami da eseguire, sul supporto barretta davanti ai pozzetti della barretta
(Fig. 8).
4. Applicare i reagenti come segue:
- 8 µL per pozzetto per l’analisi di 6 campioni,
- 12 µL per pozzetto per l’analisi di 12 campioni.
| PISTA | REAGENTE | COLORE |
| ELP | soluzione fissativa | giallo |
| Penta | antisiero Pentavalente | arancione |
NOTA: Per facilitare il corretto pipettamento, i reagenti sono colorati e i colori sono riportati sulla guida colorata con i colori di riferimento.
IMPORTANTE: Non usare i pozzetti 1, 8 e 15 della barretta antisieri.
Aspirare i reagenti evitando di intrappolare bolle d’aria nel puntale della pipetta.
Applicare i reagenti (Fig. 9) :
- Mantenere la pipetta inclinata accostando il puntale su una parete del pozzetto, senza toccare il fondo del pozzetto.
- Iniettare la goccia di reagente nel pozzetto.
5. Rimuovere la guida colorata con i colori di riferimento.
III. IMMUNOFISSAZIONE
1. Aprire lo sportello del modulo di migrazione.
2. Rimuovere l’applicatore(i) e smaltirlo(i).
3. Alzare entrambe le cornici mobili, rimuovere le strisce tamponate mediante le estremità in plastica e smaltirle.
- Estrarre il carrello porta applicatori ed elettrodi.
- Pulire gli elettrodi con carta soffice inumidita.
- Lasciare il gel in posizione nel modulo di migrazione.
4. Posizionare la maschera dinamica per l’applicazione dei reagenti come segue (Fig. 10):
- Posizionare la barra metallica di fissaggio per la maschera sui due spinotti di ancoraggio inferiori (la barra può essere sempre lasciata nel
modulo di migrazione).
- Tenere la maschera dinamica tramite l’aletta superiore ed inserirla nella barra con l’incavo allineato ai segni.
- Abbassare la maschera dinamica sulla piastra di HYDRASYS.
IMPORTANTE : Regolare la posizione della maschera dinamica per il perfetto allineamento tra i profili elettroforetici e i pozzetti della
maschera.
5. Posizionare il porta barretta nel punto inferiore della maschera dinamica, verso l’operatore. Tenere il porta barretta con la maniglia esistente
alla destra e premere sul punto di pressione centrale in modo che la barretta antisieri tocchi il gel. Rilasciare la pressione ; quindi, i reagenti
diffonderanno sotto ciascuna pista (Fig. 11).
6. Immediatamente, usando la maniglia del porta barretta, muovere la barretta lentamente e con movimento continuo, in avanti ed indietro
sull’intera lunghezza del gel per applicare i reagenti. L’Applicazione dovrebbe richiedere circa 5 secondi (Fig. 12).
AVVERTENZA : Durante questa fase, tenere la maschera solo con la maniglia del porta barretta. Evitare di toccare la guida. Non
premere nuovamente il punto di pressione per non provocare una contaminazione tra reagenti.
7. Rimuovere la guida e la maschera dinamica.
- Rimuovere il porta barretta utilizzando la sua maniglia.
- Rimuovere la barretta antisieri dal porta barretta e smaltirla.
AVVERTENZA : Le barrette con gli antisieri devono essere manipolate con precauzione.
- Dopo l’applicazione, nei pozzetti possono rimanere residui di reagenti. Questa evenienza non dovrebbe avere effetti sui risultati del test.
8. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.
9. Fare partire immediatamente la procedura premendo la freccia verde "START" sul lato sinistro della tastiera. Sullo schermo compare il
messaggio "[INCUBAZIONE]".
IMMUNOFISSAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE
• Incubazione a 20 °C per 5 minuti (temperatura controllata mediante effetto Peltier).
• Un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione si è sbloccato. Sullo schermo compare il messaggio: " CARTA".
NOTA: Durante l’incubazione lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato.
IV. ASCIUGATURA DEL GEL
1. Aprire lo sportello del modulo di migrazione.
2. Applicare sul gel una carta da filtro spessa:
- allineare il margine della cartina da filtro al margine del gel (inclinandola di 45°) e abbassarla sul gel.
IMPORTANTE: Premere decisamente sull’intera superficie della carta da filtro per assicurare una perfetta aderenza sul gel.
3. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.
4. Avviare la procedura premendo il tasto "START" (freccia verde sul lato sinistro della tastiera).
ASCIUGATURA - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE
• Asciugatura a 40 °C controllati mediante effetto Peltier, per 3 minuti. Sullo schermo è mostrato il messaggio "[POMPAGGIO]".
• Viene emesso un segnale acustico. Sullo schermo compare il seguente messaggio: "❊ CARTA".
V. ESSICCAZIONE DEL GEL
1. Aprire lo sportello del modulo di migrazione.
2. Rimuovere la cartina da filtro lasciando il gel in posizione.
3. Chiudere lo sportello.
4. Avviare la procedura premendo il tasto "START" (freccia verde sul lato sinistro della tastiera).
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ESSICCAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE
• Essiccazione a 50 °C controllati mediante effetto Peltier per 6 minuti.
• Un segnale acustico avverte che lo sportello è sbloccato. La temperatura della piastra rimane a 50 °C finchè lo sportello non viene aperto. Sullo
schermo compare il messaggio "MANTENIMENTO TEMPERATURA".
NOTA: Il modulo di migrazione rimane bloccato durante la fase di essiccazione.
VI. TRATTAMENTO DEL GEL
1. Aprire lo sportello.
2. Estrarre il gel essiccato pronto per i trattamenti successivi.
3. Aprire il telaio porta gel. Metterlo in posizione piana ed inserire la lastrina (con il gel rivolto verso l’operatore) nelle scanalature delle due guide,
quindi chiudere il telaio. Assicurarsi che il gel sia correttamente posizionato all’interno del telaio (Fig. 13).
4. Inserire il telaio porta gel nel Modulo di trattamento/colorazione del gel.
IMPORTANTE: Prima di avviare il programma di trattamento/colorazione del gel controllare che:
- la tanica della soluzione di lavaggio contenga almeno 400 ml di soluzione di lavaggio.
- la tanica del colorante sia riempita con 300 ml di soluzione colorante.
- la tanica del decolorante contenga almeno 1 litro di soluzione decolorante.
- la tanica dei liquidi reflui sia vuota.
Per la connessione dei reagenti: riferirsi alle informazioni mostrate sul visore dello strumento (premere il tasto: VISUAL CANALI).
IMPORTANTE: Non dimenticare di chiudere gli ingressi dei reagenti non utilizzati.
5. Selezionare il programma di colorazione "IF AMIDO" dal menù dello strumento ed avviare la procedura premendo il tasto "START" (freccia
verde sul lato destro dello strumento).
Durante i cicli di colorazione, decolorazione e asciugatura, il compartimento rimane bloccato.
Dopo il ciclo di raffreddamento, un segnale acustico indica che il compartimento è sbloccato (la ventilazione è mantenuta fino a quando il
supporto del gel viene rimosso)
NOTE:
- La temperatura della piastra di migrazione decresce a partire dall’apertura del coperchio finchè non raggiunge 20 °C (in meno di 5 minuti). A questo
punto può essere avviata una nuova migrazione.
- Rimettere in posizione le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori.
- Pulire la piastra di migrazione con della carta soffice inumidita.
VII.COMPLETAMENTO DEL TRATTAMENTO DEL GEL
1. Rimuovere il telaio porta gel dal compartimento ; aprirlo e rimuovere il gel essiccato.
2. Se necessario pulire il retro della lastrina di gel (la faccia con la plastica di supporto) con una carta soffice inumidita.
NOTA : Le lunghezze di migrazione dei gels con 2 o 3 righe analitiche possono essere sensibilmente differenti, senza alcuna conseguenza sui
risultati.
RISULTATI
L’antisiero Pentavalente rileva:
• Immunoglobuline G, A, M, catene kappa e lambda,
• Catene leggere libere kappa e lambda,
• Catene leggere kappa e lambda legate a catene pesanti epsilon o delta.
Interpretazione
Un siero normale mostra una leggera colorazione diffusa, senza nessuna frazione netta, corrispondente alle immunoglobuline policlonali (G, A, M,
kappa e lambda).
L’ipergammaglobulinemia è caratterizzata dalla presenza di una zona diffusa marcatamente colorata e dall’assenza di bande nette.
La gammapatia è caratterizzata dalla presenza di una o più bande ben delimitate e nette.
Casi particolari
• Una modesta componente monoclonale può essere nascosta in un protidogramma normale (disglobuline con mobilità beta). Tale banda sarà messa
in evidenza grazie all’antisiero Pentavalente.
• La ipogammaglobulinemia può essere associata ad una catena monoclonale libera leggera. Questa proteina, a causa del basso peso molecolare,
è eliminata attraverso il rene nelle urine (proteina di Bence Jones). La quantità residua nel siero è generalmente molto bassa, ma grazie alla
amplificazione della reazione con l’antisiero Pentavalente, tale frazione è facilmente messa in evidenza.
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile sull’elettroforesi del siero (pista ELP) ma non viene confermata dall’immunofissazione, il primo
sospetto deve essere per la presenza di fibrinogeno (campione di plasma).
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile su tutte le piste di immunofissazione, deve essere sospettata la presenza di crioglobuline o
Ig M polimerizzate. Depolimerizzare con un agente riducente e ripetere la procedura (vedi "Campioni per l’analisi").
Ogni banda di tipo monoclonale deve essere identificata con un’ulteriore investigazione utilizzando:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, PN 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, PN 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, PN 4304 o 4308, o HYDRAGEL 9 IF SEBIA,
PN 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4322 o HYDRAGEL 4 BENCE JONES SEBIA,
PN 4324.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Interferenze e limitazioni
L’uso di un antisiero diverso da quello specifico per l’immunofissazione con maschera dinamica, può avere effetti sui risultati.
Per i limiti di risoluzione e sensibilità dell’elettroforesi zonale, è possibile che alcune componenti monoclonali possano non essere rilevate con questo
metodo.
Eliminazione errori
Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e
conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche.
La scheda di sicurezza del kit reagenti e le informazioni sullo smaltimento dei rifiuti sono disponibili anche presso il fornitore del servizio di Assistenza
Tecnica.
DATI SULLE PRESTAZIONI
Riproducibilità nella serie e specificità
La riproducibilità nel gel è stata dimostrata su tre diversi campioni patologici : due campioni con una componente monoclonale di livello alto e un
campione con una componente monoclonale di livello basso. Ciascun campione è stato processato 12 volte su gels di 2 lotti di HYDRAGEL IF Penta
6/12, utilizzando la procedura di colorazione con amidoschwarz.
Tutte le ripetizioni nel lotto e fra lotti, hanno fornito risultati identici e attesi per il tipo di campione analizzato. L’immunofissazione ha mostrato una sola
componente monoclonale per ciascuno dei tre campioni patologici.
Riproducibilità tra serie e specificità
La riproducibilità tra gels è stata dimostrata su dodici diversi campioni patologici con una o più componenti monoclonali.
I campioni sono stati processati su 10 gels HYDRAGEL IF Penta 6/12 di 3 diversi lotti, utilizzando la procedura di colorazione con amidoschwarz.
Tutte le ripetizioni tra gels, hanno fornito risultati identici e attesi per il tipo di campione analizzato.
Accuratezza
Ottantacinque (85) diversi campioni di siero patologici e undici (11) sieri normali sono stati processati utilizzando i gels HYDRAGEL IF Penta 6/12 ed
un diverso sistema per immunofissazione su gel di agarosio reperibile in commercio.
In tutti i casi, i risultati ottenuti dai tests SEBIA e dalla metodica di comparazione disponibile in commercio, sono stati identici.
Sensibilità
Sono state preparate diluizioni scalari di 3 campioni di siero patologici tutti con componenti monoclonali, analizzate con la metodica HYDRAGEL 12 IF
Penta.
I risultati sono riassunti di seguito.
COMPONENTE MONOCLONALE LIMITE RILEVAMENTO (mg/dL) CAMPIONE N° TIPO CONC. (g/dL) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 1.09 12 2 alfa, lambda 0.58 25
| 3 | mu, kappa | 0.34 | 12 |
In relazione alla posizione di migrazione della componente monoclonale ed al livello del fondo policlonale della zona gamma, il limite di rilevamento
può variare tra 12 e 25 mg/dL.
BIBLIOGRAFIA
Per ulteriori informazioni sulla interpretazione dei quadri immunofissativi consultare:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ESPECIFICACIONES DE USO
Los kits HYDRAGEL 6 IF Penta e HYDRAGEL 12 IF Penta permiten la detección de cualquier proteína monoclonal en el suero humano, mediante
inmunofijación en gel de agarosa en el sistema semiautomático HYDRASYS. El sistema HYDRASYS permite realizar todas las etapas hasta la
obtención del gel listo para la interpretación. Las proteínas son separadas en tampón alcalino (pH 9,1) y luego son inmunoprecipitadas con un antisuero
pentavalente anti-cadenas pesadas gamma (Ig G), alfa (Ig A), mu (Ig M), y anti-cadenas ligeras kappa y lambda (libres y ligadas). Después de la
inmunofijación, las proteínas precipitadas son coloreadas con una solución de negro amido. El exceso de colorante es eliminado en medio ácido.
Cada gel de los kits HYDRAGEL 6 IF Penta y HYDRAGEL 12 IF Penta está preparado para la realización de 6 ó 12 muestras respectivamente.
Para Uso Diagnóstico In Vitro.
PRINCIPIO DEL TEST
La presencia de bandas anormales en una electroforesis de proteínas séricas, mayoritariamente en la zona gamma, pero también en las zonas alfa
y beta (éstas pueden estar ocultas por las proteínas normales de las zonas correspondientes), es un indicio de la presencia de proteínas
monoclonales y por tanto es indicativo de gammapatías. La inmunofijación está indicada para la identificación de estas bandas anormales. La
inmunofijación es una técnica simple, que permite la fijación de una proteína, después de realizar una electroforesis, mediante la formación de un
compuesto insoluble con su anticuerpo correspondiente. Se realiza en cuatro etapas.
1. Separación electroforética de proteínas en gel de agarosa.
2. Fijación e inmunoprecipitación de las proteínas ya separadas. Una solución fijadora y antisuero son dispensados en las pistas electroforéticas
correspondientes. La solución fijadora y los antisueros difunden en el gel, precipitando todas las proteínas y los correspondientes antígenos.
3. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. El precipitado del complejo antígeno - anticuerpo
queda fijado en la matriz del gel.
4. Las proteínas precipitadas se visualizarán mediante tinción. Las bandas inmunoprecipitadas serán comparadas con la presencia de bandas
anormales en el patrón electroforético.
Para detectar de forma precisa la presencia de una banda monoclonal, la muestra es analizada en dos carriles. Después de la electroforesis, el carril
ELP sirve de referencia gracias a la que la solución fijadora ha precipitado todas las proteínas presentes ; el carril inmunológico Penta permite detectar
la banda monoclonal gracias al antisuero Pentavalente.
Esta técnica, simple y rápida, permite la obtención de resultados claros y fáciles de interpretar.
REACTIVOS SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 6 IF Penta E HYDRAGEL 12 IF Penta
ARTÍCULO REF 4341 REF 4342 REF 4384* Geles de Agarosa (listos para usar) 10 geles 10 geles 80 geles Esponjas Tamponadas (listas para usar) 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 80 bolsas de 2 Diluyente del colorante (solución stock) 1 vial de 60 ml 1 vial de 60 ml 8 viales de 60 ml Colorante Negro Amido (solución stock) 1 vial de 20 ml 1 vial de 20 ml 8 viales de 20 ml Solución Fijadora (lista para usar) 2 viales de 2.9 ml Inmunoglobulinas de Mamífero anti-Ig humanas (gamma - alfa - mu - kappa - lambda) : antisuero Pentavalente (listo para usar)
2 viales de 2.9 ml Aplicadores (listos para usar) 1 caja de 10 2 cajas de 10 16 cajas de 10 Segmentos para antisueros (listos para usar) 1 caja de 10 1 caja de 10 8 cajas de 10 Papeles de Filtro - Finos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 8 paquetes de 10
| Papeles de Filtro - Gruesos | 1 paquete de 10 | 1 paquete de 10 | 8 paquetes de 10 |
(*) HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTA: La solución fijadora y el antisuero Pentavalente se comercializan por separado excepto en el MAXI-KIT (consulte REACTIVOS NECESARIOS
NO SUMINISTRADOS).
PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS
Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas.
LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES.
1. GELES DE AGAROSA
Preparación
Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 8 g/l ; tampón tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ATENCION: Los geles de agarosa contienen barbital 0.31 % y barbital sódico 0.34 % . ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere accidentalmente consultar
al médico inmediatamente !
Uso
Medio de soporte para la separación electroforética de proteínas e inmunofijación posterior.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacenar los geles en posición horizontal en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C).
Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores. (La flecha situada en la cara frontal del kit debe
apuntar hacia arriba). Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evitar variaciones importantes de temperatura durante
su almacenamiento. NO CONGELAR.
Desechar cuando:
(i) haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel),
(ii) se observe crecimiento bacteriano o fúngico,
(iii) se evidencie una cantidad excesiva de líquido en el recipiente del gel (consecuencia de la exudación del tampón debida a un almacenamiento
inadecuado).
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INSTRUCCIONES SEBIA - Español

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
2. ESPONJAS TAMPONADAS
Preparación
Las esponjas tamponadas están listas para su uso. Contienen: tampón tris-barbital pH 9.1 ± 0.3 ; azida sódica ; aditivos, inocuos a las
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ATENCION: El tampón de las esponjas contiene barbital 0.92 %, barbital sódico 1.03 % y azida sódica 0.30 %. ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere
accidentalmente consultar al médico inmediatamente! Al desechar, evitar el contacto con ácidos, plomo o cobre, ya que se conoce su
tendencia a formar compuestos explosivos o tóxicos con la azida sódica.
Uso
Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio del tampón de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera.
Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora (la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba).
Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora. NO LAS CONGELE.
Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa está abierta o si las esponjas están secas.
3. DILUYENTE DEL COLORANTE
Preparación
El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el párrafo "COLORANTE NEGRO AMIDO". Contiene una solución
ácida.
Uso
Para la preparación del colorante negro amido.
Conservación, estabilidad y señales de deterioro
El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada
en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente. NO LO CONGELE.
No le añada azida sódica.
4. COLORANTE NEGRO AMIDO
Preparación
El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución
final y su capacidad de coloración.
Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación :
1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado.
2. Cierre el vial con cuidado.
3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos.
4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración.
5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario.
6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración.
7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.
8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos.
El colorante está listo para usar.
NOTA : Una reconstitución incompleta del colorante puede implicar una mala coloración de la fracción albúmina (disminución de su porcentaje o
aparición de un agujero blanco en el centro de la fracción).
Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión.
Uso
Para la coloración de los geles después de la separación electroforética de las proteínas.
IMPORTANTE: El colorante está destinado para colorear sólo 10 geles. Cambie el colorante después de 10 usos.
Conservación, estabilidad y señales de deterioro
Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera, en contenedores cerrados para evitar
la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante.
La solución diluida es estable durante 1 mes.
No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor.
5. CAJA DE ANTISUERO Y SOLUCIÓN FIJADORA (Ref. N° 4384)
5.1 ANTISUERO PENTAVALENTE
Preparación
El antisuero Pentavalente está listo para su uso. Contiene inmunoglobulinas totales de mamífero anti-Ig humanas. Es de color anaranjado para evitar
errores al usarlo. El color es el mismo que el de la etiqueta del vial.
Cuando el antisuero presenta una ligera turbidez o precipitados, generalmente basta con poner el vial a temperatura ambiente unos 10 minutos antes
de su utilización. Si la turbidez persiste, no perturbará la reacción inmunológica. Si hay un precipitado insoluble, se recomienda centrifugar el antisuero
durante 5 minutos a 3000 r.p.m.
Utilización
Para la inmunoprecipitación de las proteínas separadas mediante electroforesis.
Los antisueros pueden ser de orígenes animales diferentes. Es por tanto imperativo no mezclar dos viales diferentes de antisueros, incluso si son de
la misma especificidad, y SIEMPRE hay que cambiar la punta de la pipeta al cambiar de vial.
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente
después de usarlo.
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Conservación, estabilidad y señales de deterioro
El antisuero Pentavalente debe ser conservado en la nevera (entre 2 y 8 °C). Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en
la etiqueta del vial de antisuero.
NOTA: Durante el transporte, los antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente (entre 15 y 30 °C) durante 15 días sin que esto afecte a la
calidad del test.
5.2 SOLUCIÓN FIJADORA
Preparación
La solución fijadora está lista para su uso. Contiene: una solución ácida y aditivos, inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un
funcionamiento óptimo.
Tiene un color específico para evitar errores al usarla.
Utilización
Para la fijación de las proteínas separadas mediante electroforesis en el carril de referencia (ELP).
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente
después de usarlo.
Conservación, estabilidad y señales de deterioro
La solución fijadora puede conservarse a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la
etiqueta del vial de solución fijadora.
Debe estar exenta de precipitados.
6. APLICADORES
Uso
Aplicadores precortados, de un solo uso, para la aplicación de la muestra.
Almacenamiento
Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados.
7. SEGMENTOS PARA ANTISUEROS
Utilización
Segmentos coloreados, de un solo uso, para la aplicación de la solución fijadora y del antisuero Pentavalente en la inmunofijación.
ATENCIÓN: Manipule con cuidado los segmentos que contengan antisueros.
8. PAPELES DE FILTRO - FINOS
Uso
Papeles de filtro finos, de un solo uso, para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de la muestra.
Conservación
Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.
9. PAPELES DE FILTRO - GRUESOS
Uso
Papeles de filtro gruesos, de un solo uso, para absorber las proteínas no precipitadas del gel después de la inmunofijación.
Conservación
Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. CAJA DE ANTISUERO Y SOLUCIÓN FIJADORA PARA IF Penta (para los kits 4341 y 4342)
La Caja de Antisuero y Solución Fijadora para inmunofijación IF Penta (SEBIA, referencia N° 4345) contiene un vial de antisuero Pentavalente y un
vial de solución fijadora de 2,9 mL cada uno, específicos de la técnica de inmunofijación realizada con la plantilla dinámica.
1.1 ANTISUERO PENTAVALENTE
Vea el párrafo precedente 5.1.
1.2 SOLUCIÓN FIJADORA
Vea el párrafo precedente 5.2.
2. DECOLORANTE
Preparación
Diluir cada vial de la Solución Decolorante stock (SEBIA, PN 4540, 10 viales de 100 ml) hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es
conveniente diluir sólo 5 ml de la solución stock hasta 5 litros, que es el volumen del contenedor de la solución decolorante. Después de la dilución,
la solución de trabajo contiene: ácido cítrico, 0.5 g/l.
Uso
Para decolorar: eliminar el exceso de colorante y coloración de fondo de los geles.
Para el lavado del compartimento de coloración.
Para neutralizar la acidez del decolorante, introduzca dentro del contenedor de desechos vacío 15 ml de sosa al 50 % (solución comercial).
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacenar la solución stock de decolorante a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit
o en las etiquetas del vial. La solución de trabajo del decolorante es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella cerrada.
No añadir azida sódica.
Desechar la solución de trabajo del decolorante si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.
Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µL/dL de
ProClin 300.
El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de
caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante.
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3. SOLUCIÓN DE LAVADO HYDRASYS
Preparación
Cada vial de la Solución de Lavado stock HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 viales de 80 ml) se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada.
Después de la dilución, la solución de lavado de trabajo contiene: tampón alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; azida sódica.
ATENCION: La solución de lavado stock contiene azida sódica 0.625 %. ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere accidentalmente consultar al médico
inmediatamente ! La azida sódica puede formar compuestos explosivos o tóxicos si entra en contacto con ácidos, plomo o cobre. Lavar
siempre con gran cantidad de agua al desechar.
Uso
La solución de lavado HYDRASYS está diseñada para lavar las proteínas no precipitadas de los geles. También sirve para lavar el Compartimento
de Tinción del HYDRASYS. Usarla periódicamente ; por ejemplo, si el aparato se usa diariamente, lavar el compartimento de tinción una vez por
semana.
Ver las instrucciones de su caja para conocer las directrices de uso.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacenar las soluciones de lavado stock y de trabajo en contenedores cerrados a temperatura ambiente o refrigeradas. Son estables hasta la fecha
de caducidad indicada en la etiqueta del vial.
Desechar la solución de lavado de trabajo si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.
4. FLUIDIL
Preparación
El Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 ml) está listo para su uso.
Uso
Para diluir muestras viscosas o turbias, por ejemplo, sueros que contengan crioglobulinas o criogeles.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacenar a temperatura ambiente. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial.
El Fluidil debe estar exento de precipitados.
EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, referencia N° 1210 o referencia N° 1211.
2. Pipeteador, manual o automático, como el HYDRAplus SEBIA, referencia N° 1215, para la carga de los aplicadores o de los segmentos para
antisueros.
3. Cámara húmeda, referencia N° 1270, suministrada con HYDRASYS.
4. Kit de Contenedores suministrado con HYDRASYS.
5 Barra de Guia de la Plantilla SEBIA, suministrada con HYDRASYS.
6. Plantilla dinámica, SEBIA, referencia N° 1255.
7. Pipetas: 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µl, 100 µl y 200 µl.
MUESTRAS PARA ANALISIS
Extracción y almacenamiento de las muestras
El análisis se hace con sueros frescos. Los sueros deben ser obtenidos de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio
clínico.
Los sueros pueden ser conservados una semana en la nevera (entre 2 y 8 °C).
Para conservaciones prolongadas, congele las muestras ; las muestras congeladas son estables 1 mes como mínimo. Las muestras descongeladas
pueden dejar una marca en el punto de aplicación, debida a la desnaturalización de proteínas o lipoproteínas.
La conservación de los sueros congelados mejora añadiendo a la muestra azida sódica 0.2 g/l.
Preparación de las muestras
Usar muestras de suero sin diluir.
Después del almacenaje entre 2 y 8 °C o de la congelación, algunos sueros (particularmente aquellos que contengan crioglobulina o criogel) pueden
volverse viscosos o desarrollar turbidez. Tales sueros pueden presentar problemas de aplicación a causa de que difunden mal por el peine del
aplicador de muestras. En ese caso añadir 25 µl de Fluidil a 75 µl de suero y agitar en el vórtex durante 15 segundos. Seguir entonces el
procedimiento habitual.
Algunas paraproteínas están polimerizadas, y el suero presenta entonces una banda de aspecto "monoclonal" a la altura del punto de aplicación en
los dos carriles. Prepare una solución reductora añadiendo un 1 % de ß-mercaptoetanol (BME) en Fluidil (esta solución se conserva una semana a
temperatura ambiente en un microtubo cerrado herméticamente). Trate estos sueros antes de aplicarlos con esta solución: añada 25 µl de solución
reductora a 75 µl de suero puro, agite en el vórtex y deje en reposo durante 15 minutos como mínimo (máximo 30 minutos), y luego siga con el
procedimiento habitual.
Muestras a descartar
No usar muestras de plasma : el fibrinógeno da lugar a una banda cerca del punto de aplicación que puede ser confundida con una inmunoglobulina
monoclonal y afectar a la cuantificación de la fracción correspondiente.
No use muestras hemolizadas.
PROCEDIMIENTO
El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautomático multiparamétrico. Las etapas automáticas incluyen el procesado de los geles de agarosa
HYDRAGEL en la siguiente secuencia: aplicación de la muestra, migración electroforética, incubación con solución fijadora y antisuero, secado,
tinción, decoloración y secado final. Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles, aplicación de la solución fijadora y antisuero,
y la puesta en marcha del instrumento para la operación.
LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS.
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I. PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACION
1. Encender el HYDRASYS.
2. Coloque un aplicador para el análisis de 6 muestras en el HYDRAGEL IF Penta 6/12 o dos aplicadores para el análisis de 12 muestras, en
una superficie plana, con los números de los pocillos hacia arriba (Fig. 1).
- Dispense 10 µl de suero en cada pocillo. La carga de cada aplicador debe hacerse en menos de 2 minutos.
| POCILLOS DE APLICACIÓN |
MUESTRAS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
IMPORTANTE: No utilice los pocillos del aplicador con los números 1, 8 y 15 ; se recomienda identificarlos previamente con un rotulador para
evitar aplicar muestra en ellos por error.
- Colocar cada aplicador en la cámara húmeda, con el peine hacia arriba.(asirlos por el plástico protector del peine).
Ver la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles.
- Dejar difundir las muestras durante 5 minutos después de la última aplicación. Para un uso posterior (hasta 8 horas después), mantener la
cámara húmeda en el refrigerador.
3. Abrir la puerta del Módulo de Migración y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador.
ATENCION: ¡Nunca cerrar la puerta cuando los soportes estan elevados!
4. Seleccionar el programa de migración "6/12 PENTA ME/MD" en el menú del instrumento (mitad izquierda del teclado).
5. Extraer la esponjas tamponadas de su envoltorio ; asirlas por los extremos de plástico. Engarzar los extremos de plástico agujereados con
las puntas metálicas del soporte de los electrodos ; los extremos de plástico deben quedar encarados al soporte (Fig. 2).
6. Abrir el contenedor del HYDRAGEL.
- Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel
inmediatamente.
ADVERTENCIA: No deje que el papel de filtro contacte demasiado rato con el gel para evitar que se deshidrate.
- Dispensar 200 µl de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Superficie de Control de Temperatura
del módulo de migración.
- Colocar el gel (la cara de agarosa hacia arriba) con su borde inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado (Fig. 3).
- Aplicar el gel en la superficie, haciéndolo contactar con el agua (Fig. 3). Asegurarse de que no queden burbujas, que el agua esté extendida
bajo toda la superficie del gel y que éste esté alineado con el marco serigrafiado.
7. Devolver ambos soportes a su posición original. Las esponjas tamponadas no deben tocar el gel. NO FORZAR LOS SOPORTES HACIA
ABAJO.
8. Extraer el(los) aplicador(es) de la cámara húmeda. Asirlo(s) po el plástico protector.
- Romper el plástico protector precortado del peine.
- Para el análisis de 6 muestras en el HYDRAGEL IF Penta 6/12, ponga el aplicador en la posición N° 6 del soporte de los aplicadores.
- Para el análisis de 12 muestras, ponga los aplicadores en las posiciones N° 3 y N° 9.
IMPORTANTE: Los números impresos en los aplicadores deben quedar de cara al usuario (Fig. 4).
9. Cerrar la puerta del módulo de migración.
10. Iniciar el procedimiento inmediatamente, presionando la tecla "START" (flecha verde) en el lado izquierdo del teclado.
IMPORTANTE: Asegurarse de que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no está bloqueada.
MIGRACION - DESCRIPCION DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS
• Los dos soportes descienden, con lo cual las esponjas tamponadas y y aplicador(es) entran en contacto con la superficie del gel.
• El soporte del aplicador se eleva.
• La migración se realiza a potencia constante de 20 W, a 20 °C controlados por efecto Peltier, hasta que se han acumulado 42 Vh (unos 9 minutos).
• El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos.
• Un pitido audible se produce al finalizar la migración. En pantalla aparece el siguiente mensaje: " AS".
NOTA: El módulo de migración permanece con la puerta cerrada durante los pasos de migración correspondientes.
II. PREPARACIÓN DE LA INMUNOFIJACIÓN
Los diferentes elementos de la plantilla dinámica (guía de referencia coloreada, segmento para antisueros, soporte del segmento, guía y reductor de
superficie) aparecen en la figura 5.
Durante la migración, prepare la plantilla dinámica de la forma siguiente:
1. Ponga la guía de la plantilla dinámica en una superficie plana.
IMPORTANTE: El análisis de seis muestras con la plantilla dinámica necesita la utilización del reductor de superficie, que debe colocarse en
la guía de la plantilla dinámica.
2. Ponga un segmento para antisueros en el soporte del segmento (Fig. 6):
- Incline el segmento 45° y colóquelo en las patillas del soporte del segmento.
- Apoyándose en estos resortes, gire el segmento para fijarlo en las muescas del soporte del segmento.
ATENCIÓN: Compruebe que el segmento esté fijado correctamente en el soporte del segmento: los salientes situados en los
extremos del segmento deben estar bien encajados en las dos muescas del soporte del segmento.
3. Coloque el conjunto segmento – soporte del segmento en la guía de la plantilla dinámica (Fig. 7) (equipada con un reductor de superficie para
el análisis de 6 muestras) y luego ponga la guía de referencia coloreada, que indica los lugares en los que aplicar los reactivos,
correspondiente a la técnica, sobre el soporte del segmento delante de los pocillos del segmento para antisueros (Fig. 8).
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4. Aplique los reactivos, cuyo color se indica en la tabla inferior, en el segmento para antisueros:
- 8 µl por pocillo para el análisis de 6 muestras y,
- 12 µl por pocillo para el análisis de 12 muestras.
| CARRIL | REACTIVO | COLOR |
| ELP | solución fijadora | amarillo |
| Penta | antisuero Pentavalente | anaranjado |
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
NOTA: Para evitar errores en la aplicación, los reactivos están coloreados y el color del carril a rellenar aparece en la guía de referencia
coloreada.
IMPORTANTE: No utilice los pocillos del segmento para antisueros que están en las posiciones 1, 8 y 15.
Aspire los reactivos sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta.
Para aplicar los reactivos (Fig. 9) :
- sostenga la pipeta inclinada,
- apoye ligeramente la punta de la pipeta en un lado del pocillo y dispense la gota de reactivo en el pocillo.
5. Retire la guía de referencia coloreada.
III. INMUNOFIJACION
1. Abra la tapa del módulo de migración.
2. Saque el/los aplicador/es y tírelo/s.
3. Eleve los soportes de los electrodos y los aplicadores y saque las esponjas tamponadas cogiéndolas por las lengüetas y tírelas.
- Saque los soportes de los electrodos y los aplicadores.
- Limpie los electrodos con un pañuelo de papel humedecido.
- Deje el gel en su lugar en el módulo de migración.
4. Ponga en su lugar la plantilla dinámica de aplicación de reactivos de la forma siguiente (Fig. 10) :
- coloque la barra metálica destinada al enganche de la plantilla dinámica con ayuda de los pernos de anclaje. (Una vez colocada, la barra
metálica puede permanecer en el HYDRASYS) ;
- coloque las muescas de la plantilla en las señales de la barra cogiendo la plantilla por la lengüeta ;
- gire la plantilla para colocarla en la placa del HYDRASYS.
IMPORTANTE: Ajuste previamente la posición de la plantilla para obtener una correspondencia perfecta entre los perfiles electroforéticos del
gel y los carriles de inmunofijación de la plantilla.
5. Ponga el soporte del segmento en el punto más bajo de la guía, dirigido hacia el operario. Sostenga el conjunto soporte-segmento por el asa
situada a la derecha y presione en el punto de apoyo central, de forma que el segmento contacte con el gel. Deje de presionar, y entonces
los reactivos se extenderán bajo cada carril (Fig. 11).
6. Inmediatamente, con ayuda del asa situada a la derecha, reparta los reactivos efectuando un movimiento lento y regular de ida y vuelta de
la plantilla dinámica por encima del gel (la aplicación debe durar unos 5 segundos) (Fig. 12).
ATENCIÓN: Durante esta operación, la plantilla sólo debe cogerse por el asa sin tocar la guía. No presione nunca por segunda vez:
los reactivos podrían mezclarse.
7. Saque la guía y la plantilla dinámica:
- Coja la guía por el asa ;
- Gire la guía alrededor de la barra metálica y sáquela ;
- Saque el segmento del soporte y tírelo.
ATENCIÓN: Manipule con cuidado los segmentos que contengan antisueros.
- Queda un ligero exceso de reactivos sobre el gel en forma de gota a la altura de los orificios de los pocillos al quitar la plantilla, sin ningún
efecto en los resultados.
8. Cierre la tapa del módulo de migración.
9. Inicie el procedimiento inmediatamente apretando la tecla "INICIO" (flecha verde del lado izquierdo del teclado).
En la pantalla aparece el mensaje: "[INCUBACIÓN]".
INMUNOFIJACIÓN - DESCRIPCIÓN DE LAS ETAPAS AUTOMÁTICAS
• Incubación a 20 °C, controlados por efecto Peltier, durante 5 minutos.
• Suena un pitido y la tapa del módulo de migración se desbloquea.
En la pantalla aparece el mensaje: "PAP.".
NOTA: Durante la incubación, la tapa del módulo de migración permanece bloqueada.
IV. ABSORCIÓN CON PAPEL
1. Abra la tapa del módulo de migración.
2. Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel:
- incline el papel de filtro grueso unos 45° y alinee el borde inferior del papel de filtro con el borde inferior del gel ;
- coloque el papel encima del gel.
IMPORTANTE: Presione sobre toda la superficie del papel de filtro para asegurar un contacto perfecto entre el gel y el papel.
3. Cierre la tapa del módulo de migración.
4. Inicie el procedimiento apretando la tecla "INICIO" (flecha verde del lado izquierdo del teclado).
ABSORCIÓN CON PAPEL – DESCRIPCIÓN DE LAS ETAPAS AUTOMÁTICAS
• Absorción a 40 °C, controlados por efecto Peltier, durante 3 minutos.
En la pantalla aparece el mensaje: "[ABSORCIÓN]".
• Suena un pitido.
En la pantalla aparece el mensaje: "❊ PAP.".
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V. SECADO DEL GEL
1. Abrir la tapa del módulo de migración.
2. Extraer el papel de filtro, dejando el gel en su posición actual.
3. Cerrar la tapa.
4. Apretar la tecla "START" (flecha verde situada a la izquierda del teclado).
SECADO - DESCRIPCION DE LOS PASOS AUTOMATIZADOS
• Secado a 50 °C controlado por efecto Peltier, durante 6 minutos.
• Un pitido nos indica que debemos levantar la tapa. El gel permanecerá a 50 °C mientras la tapa permanezca cerrada.
NOTA: El módulo de migración permanece cerrado mientras se produce el proceso de secado.
VI. PROCESADO DEL GEL
1. Abrir la tapa.
2. Extraer el gel (una vez seco) para su procesado posterior.
3. Abrir el soporte del gel. Colocar el gel seco (con la superficie mirando hacia arriba) en los orificios de los dos cilindros y cerrar el soporte.
Comprobar que el gel está colocado adecuadamente dentro del soporte (Fig. 13).
4. Colocar el soporte en el Módulo de Procesado/Tinción.
IMPORTANTE : Antes de comenzar con el procesado/coloración comprobar lo siguiente:
- el contenedor de Solución de Lavado contiene al menos 400 ml de solución de lavado ;
- el contenedor de Colorante contiene al menos 300 ml de colorante ;
- el contenedor de Decolorante contiene como mínimo 1 litro de decolorante ;
- el contenedor de Deshechos está vacío.
Para conocer en qué posiciones conectar los reactivos, consultar la información que aparece en la pantalla del instrumento (seleccionar la
tecla : VER CANALES).
IMPORTANTE : No olvidar bloquear los canales no utilizados.
5. Seleccionar el programa de coloración "IF AMIDO" e iniciar el proceso apretando la tecla "START" (flecha verde situada a la derecha en el teclado).
Durante todas las secuencias de coloración, decoloración y secado, el sistema permanece bloqueado.
Después del enfriamiento de la cubeta, una señal sonora (bip) suena y el sistema se desbloquea (la ventilación se mantiene hasta la
recuperación del porta-films).
NOTAS:
- La temperatura de la placa de migración desciende hasta 20 °C (en menos de 5 minutos). En este momento podremos iniciar una nueva migración.
- Volver a colocar el portaaplicadores en su ubicación original.
- Lavar la placa de migración con un trapo suave ligeramente humedecido.
VII.PROCESADO DEL GEL: FINALIZACION DEL PROCEDIMIENTO
1. Retirar el soporte del compartimento, abrirlo y extraer el gel ya seco.
2. Si procede, limpiar el reverso del gel (soporte plástico) con un trapo seco y suave.
NOTA: En los geles con varias filas de muestras (2 ó 3), las longitudes de migración pueden ser ligeramente diferentes, sin ninguna repercusión
en los resultados.
RESULTADOS
El antisuero Pentavalente permite la detección de:
• inmunoglobulinas: Ig A (K ó L), Ig G (K ó L), Ig M (K ó L) ;
• cadenas ligeras libres kappa o lambda ;
• inmunoglobulinas: Ig D (K ó L), Ig E (K ó L), que son detectadas por sus cadenas ligeras kappa o lambda.
Interpretación
Un suero normal muestra una zona ligeramente teñida, que corresponde a las inmunoglobulinas policlonales (G, A, M, kappa y lambda), sin ninguna
banda definida.
Una hipergammaglobulinemia se caracteriza por una tinción fuerte y difusa en la zona de las gamma, sin presentar bandas claramente definidas.
Una gammapatía se caracteriza por la presencia de una o más banda(s) focalizada(s).
Casos particulares
• Una gammapatía monoclonal leve puede quedar oculta en un perfil electroforético normal (por ej., componente monoclonal con movilidad en la
zona beta). Esta banda será detectada con el antisuero Pentavalente.
• Una hipogammaglobulinemia podría estar asociada con una cadena ligera libre monoclonal. Esta proteína, debido a su bajo peso molecular, es
eliminada por el riñón a través de la orina (Proteína de Bence Jones). La cantidad presente en el suero es normalmente muy baja, pero puede
detectarse realizando una inmunofijación con el antisuero Pentavalente.
• Una banda de aspecto monoclonal observada en la electroforesis pero que no aparece en el carril inmunoprecipitado puede indicar la presencia
de fibrinógeno.
• Una precipitación en los dos carriles, a la altura del punto de aplicación, puede indicar la presencia de una Ig M polimerizada o de una crioglobulina,
que habrá que identificar tras aplicar a la muestra un tratamiento reductor (vea " Muestras para el análisis ").
Toda banda monoclonal detectada con el antisuero Pentavalente necesita obligatoriamente ser identificada usando los kits de inmunofijación:
• HYDRAGEL 1 IF (SEBIA, ref. N° 4301), HYDRAGEL 2 IF (SEBIA, ref. N° 4302), HYDRAGEL 4 IF (SEBIA, ref. N° 4304 ó 4308) ó HYDRAGEL 9 IF
(SEBIA, ref. N° 4309),
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4321), HYDRAGEL 2 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4322) ó HYDRAGEL 4 BENCE JONES
(SEBIA, ref. N° 4324).
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Interferencias y limitaciones
La utilización de antisueros distintos a los específicos para la técnica de inmunofijación realizada con la plantilla dinámica puede afectar a la calidad
de los resultados.
Teniendo en cuenta los principios analíticos de las técnicas actuales (principios de la electroforesis de zona, resolución y sensibilidad), no puede darse
ninguna garantía respecto a la detección de la totalidad de todos los componente monoclonales.
Resolución de problemas
Avisar al Servicio de Atención Técnica del distribuidor cuando el test no funcione, pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la
preparación y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir.
Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles
en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor.
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS
Reproducibilidad intraserial
Migración de tres (3) muestras de suero patológicas: Dos sueros con una fuerte gammapatía monoclonal y un suero que presenta una paraproteína
débil.
La migración y la inmunofijación de cada muestra han sido realizadas con 2 lotes diferentes de geles HYDRAGEL IF Penta 6/12 a razón de 12 análisis
por gel, seguidos de una coloración con negro amido.
Todas las muestras analizadas proporcionan los mismos resultados para los 2 lotes de geles probados. Los perfiles obtenidos son idénticos y
característicos de cada una de las muestras analizadas.
En efecto, la inmunofijación sólo detecta una banda monoclonal en cada una de las tres muestras patológicas.
Reproducibilidad interserial
Migración de doce (12) muestras de suero patológicas que presentan una o varias paraproteínas.
La migración y la inmunofijación de cada muestra han sido realizadas en 10 geles HYDRAGEL IF Penta 6/12 de 3 lotes diferentes, seguidas de una
coloración con negro amido.
Todas las muestras analizadas proporcionan los mismos resultados para los 3 lotes de geles probados. Los perfiles obtenidos son idénticos y
característicos de las muestras analizadas y la inmunofijación pone en evidencia las bandas monoclonales esperadas en todas las muestras.
Exactitud
Ochenta y cinco (85) muestras diferentes de sueros patológicos y once (11) sueros normales han sido analizados en paralelo con la técnica
HYDRAGEL 12 IF Penta y con otro sistema comercial de geles de agarosa.
En las dos técnicas, los resultados obtenidos muestran una correlación perfecta entre los dos sistemas de análisis, y se han detectado las mismas
bandas anormales en todas las muestras patológicas analizadas, con una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 100 % respecto a esta última
técnica, calculadas según el método recomendado (Wendling, 1986).
Sensibilidad
Tres sueros con una gammapatía han sido diluidos serialmente y analizados en geles HYDRAGEL IF Penta 6/12 con coloración con negro amido.
Los resultados se resumen a continuación.
BANDA MONOCLONAL LÍMITE DE DETECCIÓN (g/L) MUESTRA No TIPO CONC. (g/L) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 10.9 0.12 2 alfa, lambda 5.8 0.25
| 3 | mu, kappa | 3.4 | 0.12 |
Según la posición de la banda monoclonal y el fondo policlonal de la fracción de las gammaglobulinas, el límite de detección de una paraproteína
puede variar de 0,12 a 0,25 g/L.
BIBLIOGRAFIA
Para información adicional o interpretación de resultados consultar:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
UTILIZAÇÃO
Os kits HYDRAGEL 6 IF Penta e HYDRAGEL 12 IF Penta destinam-se à detecção de proteínas monoclonais no soro humano, por imunofixação em
gel de agarose no sistema semi-automático HYDRASYS. O sistema HYDRASYS permite permite realizar todas as sequências, até à obtenção do
gel para interpretação. As proteínas do soro são separadas por electroforese em tampão alcalino (pH 9,1) e depois imunoprecipitadas com um
antisoro pentavalente anti-cadeias pesadas gama (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M), e anti-cadeias leves kapa e lambda (livres e ligadas). Após
imunofixação, as proteínas precipitadas são coradas com negro de amido. O excesso de corante é removido em meio ácido.
Cada cada gel de agarose poderá analisar 6 amostras no kit HYDRAGEL 6 IF Penta e 12 amostras no kit HYDRAGEL 12 IF Penta.
Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED.
PRINCÍPIO DO TESTE
A electroforese e imunofixação das proteínas permite detectar as imunoglobulinas mono e oligoclonais, que são marcadores das gamapatias. Estas
podem surgir sob a forma de bandas anómalas de mobilidade gama ou beta, geralmente, mas igualmente alfa, eventualmente mascaradas na
electroforese pelas proteínas habituais destas zonas.
A imunofixação efectua-se graças a um antisoro pentavalente.
A operação é feita em quatro fases:
1. Separação das proteínas por electroforese em gel de agarose.
2. Fixação e imunoprecipitação das proteínas sujeitas a electroforese: aplicação do fixador e do antisoro pentavalente directamente sobre o gel, ao
nível das pistas de migração. O fixador e o antisoro difundem-se no gel ; o fixador precipita todas as proteínas e os anticorpos precipitam os
antigénios correspondentes.
3. As proteínas solúveis, não precipitadas, são removidas do gel por lavagem e secagem com papel de filtro. As proteínas precipitadas ficam retidas
no interior da matriz do gel.
4. Coloração das proteínas e comparação da posição das bandas imunoprecipitadas com as bandas anómalas observadas no perfil electroforético
da amostra de soro.
Para identificar de forma precisa a natureza das bandas monoclonais, as amostras são testadas simultaneamente em duas pistas. Depois da
electroforese, a pista ELP serve como referência, mostrando o perfil electroforético das proteínas da amostra. A pista imunológica Penta permite a
caracterização dos componentes monoclonal(is) que reagiram com o antisoro pentavalente.
Esta técnica simples e rápida proporciona uma imagem clara e fácil de interpretar.
REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS NOS KITS HYDRAGEL 6 IF Penta E HYDRAGEL 12 IF Penta
ITEM REF. N° 4341 REF. N° 4342 REF. N° 4384* Geles de agarose (prontos a usar) 10 geles 10 geles 80 geles Tiras de tampão (prontas a usar) 10 pacotes de 2 10 pacotes de 2 80 pacotes de 2 Diluente da solução corante (solução concentrada) 1 frasco, 60 ml 1 frasco, 60 ml 8 frascos, 60 ml Corante negro de amido (solução concentrada) 1 frasco, 20 ml 1 frasco, 20 ml 8 frascos, 20 ml Fixador (pronto a usar) 2 frascos, 2,9 ml Imunoglobulinas totais de mamífero anti-Ig humanas (gama-alfa-mu-kapa-lambda) = antisoro pentavalente (pronto a usar) 2 frascos, 2,9 ml Aplicadores (prontos a usar) 1 caixa de 10 2 caixas de 10 16 caixas de 10 Segmentos antisoro 1 pacote de 10 1 pacote de 10 8 pacotes de 10 Papéis de filtro finos 1 pacote de 10 1 pacote de 10 16 pacotes de 10
| Papéis de filtro espessos | 1 pacote de 10 | 1 pacote de 10 | 8 pacotes de 10 |
* HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTA: O Fixador e os Antisoros Pentavalentes são fornecidos separadamente, excepto para o MAXI-KIT (ver REAGENTES NECESSÁRIOS MAS
NÃO FORNECIDOS).
PARA UMA OPTIMIZAÇÃO DE RESULTADOS:
Todos os reagentes do mesmo kit devem ser utilizados em conjunto e de acordo com as instruções de utilização.
Por favor, leia atentamente as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO.
1. GELES DE AGAROSE
Preparação
Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão tris-barbital pH 9,1 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: Os geles de agarose contêm 0,31 % de barbital e 0,34 % de barbital sódico. Não ingerir! Se ingerido, consultar imediatamente um
médico!
Utilização
Meio de suporte para electroforese e imunofixação das proteínas.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar os geles horizontalmente, na embalagem protectora de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 ºC) ou no frigorífico (2 - 8 ºC) (a seta
existente na parte da frente da caixa do kit deve ficar voltada para cima). Os geles são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit e nos
rótulos das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de uma
fonte de calor).
NÃO CONGELAR!
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INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Deitar fora o gel quando:
(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo for muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ;
(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ;
(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de
armazenamento inadequadas).
2. TIRAS DE TAMPÃO
Preparação
As tiras de esponja com tampão estão prontas a usar. Cada uma contém: tampão tris-barbital pH 9,1 ± 0,3 ; azida de sódio ; aditivos, não perigosos
nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: As tiras contêm 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sódico e 0,30 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingeridas, consultar
imediatamente um médico! Quando deitar fora as tiras evitar o seu contacto com ácidos, chumbo ou cobre, já que estes elementos formam
compostos explosivos ou tóxicos com a azida de sódio.
Utilização
As tiras de tampão funcionam como reservatório de tampão da electroforese e asseguram o contacto entre o gel e os eléctrodos.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
As tiras de tampão podem ser conservadas à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C).
As tiras de tampão devem ser conservadas horizontalmente dentro da embalagem protectora (a seta na parte da frente da caixa deve permanecer
apontada para cima).
As tiras são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou na embalagem protectora das tiras. NÃO CONGELAR.
3. DILUENTE DA SOLUÇÃO CORANTE
Preparação
O diluente da solução corante deverá ser utilizado como está descrito no parágrafo " SOLUÇÃO CORANTE NEGRO DE AMIDO ".
Contém uma solução ácida.
Utilização
Para a preparação das soluções de corante negro de amido.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. NÃO
CONGELAR.
Não adicionar azida de sódio.
4. CORANTE NEGRO DE AMIDO
Preparação
O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final
e o seu poder de coloração.
Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte:
1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado.
2. Fechar cuidadosamente o frasco.
3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos.
4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração.
5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes.
6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração.
7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada.
8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos.
A solução corante está pronta a utilizar.
NOTA : Uma reconstituição incompleta do corante pode provocar uma má coloração da fracção de albumina (baixa da percentagem ou lacuna dentro
da fracção).
Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/l ; etilenoglicol, 6,7% ; aditivos, não perigosos nas
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: Nocivo em caso de ingestão.
Utilização
Para corar geles depois da electroforese das proteínas.
IMPORTANTE : A solução corante é unicamente destinada à coloração de 10 geles. Recomenda-se a renovação da solução após as 10 utilizações.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a
evaporação.
A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos.
A solução diluída de corante é estável por um mês.
Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor.
5. KIT ANTISOROS E FIXADOR (ref. n° 4384)
5.1. ANTISORO PENTAVALENTE
Preparação
O Antisoro Pentavalente está pronto a usar. Todos os antisoros são imunoglobulinas totais de mamífero anti-Ig humanas. Cada um tem uma cor
específica para evitar todos os erros de utilização. Os rótulos dos frascos têm a mesma cor que as soluções.
Se o antisoro apresentar uma certa turvação, deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente durante, pelo menos, 10 minutos antes da sua
utilização. No entanto e caso a turvação persista, a reacção imunológica não será afectada. Em caso de formação de precipitado insolúvel, é
recomendada a centrifugação do antisoro durante 5 minutos à rotação de 3000 rpm.
Utilização
Para imunoprecipitação das proteínas previamente separadas por electroforese.
O antisoro pode ser originário de variadas espécies animais. Não misture o conteúdo de dois frascos diferentes de antisoros, mesmo que com a
mesma especificidade. Actualize SEMPRE a etiqueta da pipeta quando mudar de frasco.
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,
após utilização.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar os antisoros no frigorífico (2 - 8 °C). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos de antisoro.
NOTA: Durante o transporte, o antisoro pode ser mantido à temperatura ambiente (15 - 30 ºC) durante 15 dias sem que isso afecte a qualidade do
teste.
5.2. FIXADOR
Preparação
O fixador vem pronto a usar. Contém: solução ácida ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. Tem
uma cor específica para evitar todos os erros de utilização. A cor é igual à do rótulo do frasco.
Utilização
Para fixar as proteínas separadas por electroforese na pista de referência (ELP).
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,
após utilização.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar o fixador à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco.
O fixador deve estar livre de precipitados.
6. APLICADORES
Utilização
Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras.
Armazenamento
Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
7. SEGMENTO DE ANTISORO
Utilização
Segmentos coloridos, de utilização única, para a aplicação do fixador e dos antisoros na imunofixação.
ATENÇÃO: Manipular os suportes contendo antisoros com precaução.
8. PAPEIS DE FILTRO FINOS
Utilização
Pré-cortados, de utilização única, destinam-se a absorver o excesso de humidade da superfície do gel antes da aplicação da amostra.
Armanezamento
Armazenar os papéis de filtro finos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
9. PAPEIS DE FILTRO ESPESSOS
Utilização
De utilização única, destinam-se a absorver as proteínas não precipitadas da superfície do gel depois da fase da imunofixação.
Armazenamento
Armazenar os papéis de filtro espessos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. KIT COM ANTISOROS E FIXADOR IF Penta (para os kits com ref. 4341 e 4342)
O Kit de antisoros e fixador para imunofixação (SEBIA ref. nº 4345) contém 1 frascos de antisoros Pentavalente e um de solução fixadora, com 2,9 ml
cada, especificos para a realização do procedimento de imunofixação com a Máscara Dinâmica.
1.1. ANTISOROS
Ver secção 5.1.
1.2. FIXADOR
Ver secção 5.2.
2. SOLUÇÃO DESCORANTE
Preparação
Cada frasco de solução descorante concentrada (SEBIA, ref. nº 4540, 10 frascos de 100 ml cada) deve ser diluída a 1/1000 com água destilada ou
desmineralizada e permite obter 100 litros de solução total. É conveniente diluir apenas 5 ml da solução concentrada de cada vez, para o volume
final de 5 litros (a capacidade do recipiente onde se vai colocar a solução descorante). Após diluição, a solução descorante contém: ácido cítrico,
0,5 g/l.
Utilização
Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel. No enxaguamento da câmara de coloração, após lavagem.
Para neutralizar a acidez do descorante, colocar no frasco de despejo vazio, 15 ml de soda a 50% (solução disponível comercialmente).
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou
nos rótulos dos frascos da solução descorante. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente, quando conservada
em recipiente fechado. Não adicionar azida de sódio.
Em caso de conservação mais prolongada da solução diluída (superior a uma semana), adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar qualquer
proliferação microbiana.
A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao
fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
3. SOLUÇÃO DE LAVAGEM HYDRASYS
Preparação
Cada frasco de solução de lavagem concentrada HYDRASYS (SEBIA, ref. nº 4541, 10 frascos de 80 ml cada) deve ser diluído para a obtenção do
volume final de 5 litros com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução de lavagem contém: tampão alcalino pH 8,8 ± 0,3 ; azida de
sódio.
AVISO: A solução de lavagem contém 0,625 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerida, consultar imediatamente um médico! Quando em
contacto com ácidos, chumbo ou cobre, a azida de sódio pode levar à formação de compostos explosivos ou tóxicos. Quando deitar fora
lavar abundantemente com grande quantidade de água.
Utilização
Para a lavagem do gel após imunofixação de modo a eliminar as proteínas residuais não precipitadas.
Para a lavagem da câmara de coloração do HYDRASYS.
Utilizar periodicamente. Por exemplo, se o aparelho for utilizado diariamente, fazer a lavagem da câmara de coloração uma vez por semana.
Ver as instruções de utilização incluídas na embalagem.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução concentrada e a solução diluída em recipientes fechados à temperatura ambiente ou no frigorífico. As soluções são estáveis
até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco da solução de lavagem.
Deitar fora a solução de lavagem diluída se houver alterações no seu aspecto, por exemplo, se ficar turva devido a contaminação microbiana.
4. FLUIDIL
Preparação
O Fluidil (SEBIA, ref. nº 4587, 1 frasco de 5 ml) vem pronto a ser usado.
Utilização
Destina-se a diluir amostras viscosas ou turvas, por exemplo, soro contendo uma crioglobulina ou um criogel.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco de Fluidil.
O Fluidil não deve conter quaisquer precipitados.
EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS
1. Sistema SEBIA HYDRASYS, ref. n° 1210 ou ref. n° 1211.
2. HYDRAplus SEBIA, ref. n° 1215, micropipetador, manual ou automático, como alternativa na pipetagem das amostras para os aplicadores
respectivos ou dos segmentos de antisoro.
3. Câmara húmida fornecida com o sistema HYDRASYS, ref. n° 1270.
4. Frascos de plástico fornecidos com o HYDRASYS.
5. Barra metálica para a fixação da máscara SEBIA, fornecida com o sistema HYDRASYS.
6. Máscara Dinâmica, SEBIA, ref. n° 1225.
7. Pipetas: 8 µl, 10 µl, 12 µl, 20 µl, 100 µl e 200 µl.
AMOSTRAS
Colheita e conservação das amostras
É recomendada a utilização de amostras de soro frescas. Os soros devem ser colhidos de acordo com os métodos utilizados nos laboratórios de
análises clínicas. Se necessário, armazenar o soro entre 2 - 8 °C até uma semana. Para conservação prolongada, congelar as amostras. As amostras
congeladas são estáveis durante pelo menos um mês. As amostras descongeladas podem levar ao aparecimento de ligeiras bandas no ponto de
aplicação, devido à desnaturação das proteínas ou lipoproteínas.
A estabilidade do armazenamento do congelamento aumenta com a adição de azida de sódio a 0,2 g/l.
Preparação das amostras
Utilizar directamente amostras de soro puras. Após conservação a 2 - 8 °C ou congelamento, alguns soros (especialmente os que contêm uma
crioglobulina ou um criogel) podem tornar-se viscosos ou turvos. Estes soros podem apresentar problemas na aplicação porque difundem com muita
dificuldade pelos dentes do aplicador de amostras. Neste caso, adicionar 25 µl de Fluidil a 75 µl de soro e agitar no vortex durante 15 segundos.
Depois, seguir o método normal.
Certas paraproteínas são polimerizadas, o que resulta no aparecimento de uma "banda monoclonal" em todas as pistas. Neste caso preparar uma
solução de ß-mercaptoetanol (BME) a 1% em Fluidil (esta solução redutora é estável por uma semana num microtubo hermeticamente fechado e à
temperatura ambiente). Adicionar 25 µl de solução redutora a 75 µl de soro puro, agitar no vortex e aguardar pelo menos 15 minutos (máximo de
30 minutos) e depois seguir o método normal.
Amostras a evitar
Não utilizar amostras de plasma. O fibrinogénio leva ao aparecimento de uma banda perto do ponto de aplicação que pode ser confundida com uma
gamapatia monoclonal.
Não utilizar amostras hemolisadas.
TÉCNICA
O sistema HYDRASYS é um aparelho semi-automático multi-paramétrico. Os passos automáticos incluem o tratamento dos geles de agarose
HYDRAGEL segundo as etapas seguintes: aplicação das amostras, migração electroforética, incubação com os reagentes, secagem, lavagem,
coloração, descoloração e secagem final. Os passos manuais são os seguintes: preparação das amostras e dos geles, aplicação dos reagentes e
lançamento das sequências automáticas. LER ATENTAMENTE O MANUAL DE INSTRUÇÕES DO HYDRASYS.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
I. PREPARAÇÃO DA MIGRAÇÃO
1. Ligar o aparelho HYDRASYS.
2. Colocar 1 aplicador para a análise de 6 amostras pelo HYDRAGEL IF Penta 6/12 ou 2 aplicadores para analisar 12 amostras, numa superfície
plana, com os números dos poços voltados para cima (Fig. 1):
- Aplicar 10 µl de amostra pura em cada poço. A pipetagem das amostras em cada aplicador não deve ultrapassar o tempo de dois minutos.
| POÇOS |
AMOSTRAS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
NOTA: Os poços nº 1, 8 e 15 não são utilizadas neste ensaio ; pode-se marcar estas pistas com uma caneta, de modo a evitar a colocação
de amostras por enganos.
- Colocar os aplicadores na câmara húmida com os dentes voltados para cima (segure-os pela protecção de plástico).
- Deixar as amostras difundirem-se pelos dentes durante cinco minutos após a aplicação da última amostra. Para uma conservação
prolongada (8 horas no máximo), colocar a câmara húmida no frigorífico.
Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes.
3. Abrir a tampa da câmara de migração e levantar os suportes do aplicador e dos eléctrodos.
AVISO: Nunca fechar a tampa quando os suportes estão levantados!
4. Seleccionar o programa de migração "6/12 PENTA MP/MD" no menu apresentado pelo aparelho (lado esquerdo do teclado).
5. Retirar as tiras de tampão da embalagem ; colocar as tiras de tampão sobre os eléctrodos fixando as extremidades de plástico perfuradas
aos pinos do suporte dos eléctrodos. A face das tiras de tampão onde estão fixadas as partes de plástico fica em contacto com os eléctrodos.
(Fig. 2).
6. Desempacotar a placa HYDRAGEL.
- Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino.
ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto com o gel por tempo prolongado, para evitar a sua desidratação.
- Aplicar 200 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso na placa de migração.
- Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso na placa de migração (Fig. 3).
- Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 3) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura
do gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal.
7. Baixar os dois suportes. Nesta posição as tiras de tampão não tocam no gel.
NÃO FORÇAR A DESCIDA DOS SUPORTES MANUALMENTE.
8. Retirar os aplicadores da câmara húmida. Segurá-los pela estrutura de protecção plástica.
- Quebrar e retirar a protecção dos dentes.
- Para analisar 6 amostras com HYDRAGEL IF PENTA 6/12, colocar o aplicador na posição n° 6 do suporte dos aplicadores,
- Para analisar 12 amostras, colocar os aplicadores nas posições n° 3 e n° 9 do suporte dos aplicadores.
IMPORTANTE: Os números impressos nos aplicadores devem ficar virados para o operador (Fig. 4).
9. Fechar a tampa da câmara de migração.
10. Dar início imediatamente ao processo apoiando em "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).
IMPORTANTE: Assegure-se de que a grelha de ventilação não está bloqueada (à direita do aparelho).
MIGRAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS
• Descida dos suportes do aplicador e dos eléctrodos de forma a que as tiras de tampão e os aplicadores contactem com a superfície do gel.
• Subida do aplicador de amostras.
• A migração é feita à potência constante de 20 W, a 20 °C, controlada por efeito de Peltier, até que tenham sido atingidos 42 Vh, durante cerca de
9 minutos.
• Os eléctrodos são desligados com a subida do suporte.
• A audição de um sinal sonoro indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada. A seguinte mensagem aparece no ecrã: " AS".
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante todos os passos da migração.
II. PREPARAÇÃO DA IMUNOFIXAÇÃO
Os diferentes elementos que compõem a máscara dinâmica (sinalizador de cores para aplicação dos reagentes, segmento para colocação de
antisoros, suporte de segmentos, guia da máscara dinâmica e peça reductora) são apresentados na figura 5.
Durante a migração, prepare a máscara dinâmica da seguinte forma:
1. Coloque a máscara dinâmica numa superfície plana.
IMPORTANTE: Para a análise de 6 amostras, é necessário posicionar o reductor de comprimento na guia da máscara dinâmica.
2. Coloque um segmento de antisoros no suporte do mesmo (Fig. 6) :
- Incline o segmento dos antisoros num ângulo de 45º e posicione-o contra os encaixes de plástico do suporte.
- Fazendo pressão sobre os encaixes, faça girar o segmento por forma a fixá-lo na ranhura do suporte de segmento.
ATENÇÃO: Certifique-se que o segmento é correctamente posicionado no suporte: as extremidades do segmento deverão estar
bloqueadas na ranhura do suporte.
3. Posicione o segmento dos antisoros e respectivo suporte sobre a guia da máscara dinâmica (Fig. 7) (equipada de uma peça redutora para
as análises de 6 amostras). De seguida, coloque o sinalizador de cores para aplicação dos reagentes (correspondente ao ensaio que irá
decorrer), no suporte de segmentos em frente aos poços do segmento dos antisoros (Fig. 8).
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4. Disponha os reagentes da seguinte forma:
- 8 µl por poço para a análise de 6 amostras ;
- 12 µl por poço para análise de 12 amostras.
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
| PISTA | REAGENTE | COR |
| ELP | Fixador | Amarelo |
| Penta | Antisoro pentalente | Amarelo alaranjado |
NOTA: Para evitar enganos na pipetação dos antisoros, os reagentes são corados e as cores podem ser encontradas no sinalizador de cores
de referência.
IMPORTANTE: Não utilize os poços nas posições 1, 8 e 15.
Pipetar os reagentes, evitando introduzir bolhas de ar na ponta da pipeta.
Para aplicar os reagentes (Fig. 9):
- Segurar a pipeta inclinada,
- Pipetar os antisoros nos poços respectivos.
5. Retire o sinalizador de cores de referência.
III. IMUNOFIXAÇÃO
1. Abrir a tampa da câmara de migração.
2. Retirar o(s) aplicador(es) e deitá-lo(s) fora.
3. Levantar os dois suportes (dos aplicadores e dos eléctrodos), retirar as tiras de tampão pegando-lhes pelas suas extremidades de plástico e
deitá-las fora.
- Retirar os dois suportes.
- Limpar os eléctrodos com um pano macio e húmido.
- Deixar o gel no seu lugar na câmara de migração.
4. Colocar em posição a máscara de aplicação dos reagentes da seguinte forma (Fig. 10):
- Colocar a barra metálica, para ligação da máscara de incubação, nos pinos de fixação (a barra metálica pode permanecer
permanentemente no HYDRASYS).
- Segurar a máscara pela pega e colocá-la sobre a barra metálica (encaixando as extremidades nas reentrâncias da mesma).
- Baixar a máscara sobre o gel.
IMPORTANTE: Regular a posição da máscara, de modo a obter uma correspondência perfeita entre os perfis electroforéticos do gel e as
pistas de revelação da máscara.
5. Posicionar o segmento de suporte ao mais baixo nível na guia da máscara, dirigido para o operador. Segure o segmento de suporte pela
pega situada na sua direita e pressione no ponto central, de forma a que o segmento de antisoro contacte com a superficie do gel. Alivie a
pressão ; em seguida, os reagentes espelhar-se-ão debaixo de cada pista (Fig. 11).
6. Imediatamente após, empurrar lentamente o suporte, executando um movimento lento e regular de ida e volta, em toda a extensão do gel
para aplicar os reagentes. A duração da aplicação deverá ser de aproximadamente 5 segundos (Fig. 12).
AVISO: Durante este passo, segure a máscara apenas pela pega do segmento de suporte. Evite tocar na guia. Não volte a pressionar
no ponto de pressão, uma vez que poderá existir o risco de contaminação dos reagentes.
7. Remova a guia e a máscara dinâmica.
- Remova o segmento de suporte utilizando a pega.
- Remova o segmento de antisoro do suporte e deite fora.
ATENÇÃO: Manipular os suportes contendo antisoros com precaução.
- Um ligeiro excesso de reagente subsiste no gel sobre a forma de uma gota ao nível dos orifícios dos poços quando a máscara é retirada.
Este facto não afectará os resultados.
8. Fechar a tampa da câmara de migração.
9. Dar início imediatamente ao processo premindo a tecla "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).
Aparece a mensagem "[INCUBAÇÃO]" no ecrã.
IMUNOFIXAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS
• Incubação a 20 °C durante 5 minutos (controlada pelo efeito de Peltier).
• A audição de um sinal sonoro indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada.
A seguinte mensagem aparece no ecrã: " PAP.".
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante a incubação.
IV. ABSORÇÃO DO GEL
1. Abrir a tampa da câmara de migração.
2. Aplicar uma folha de papel de filtro espesso sobre o gel:
- Inclinar o papel de filtro a 45°, alinhar a sua margem com a margem do gel.
- Aplicá-lo sobre o gel.
IMPORTANTE: Exercer pressão uniforme, para assegurar um contacto perfeito com o gel.
3. Fechar a tampa da câmara de migração.
4. Dar início à absorção, premindo a tecla "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).
ABSORÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS
• Secagem por absorção a 40 °C, controlada pelo efeito de Peltier, durante 3 minutos. A mensagem "[BOMBAGEM]" aparecerá no ecrã.
• Ouve-se um sinal sonoro e a seguinte mensagem aparece no ecrã: "❊ PAP.".
V. SECAGEM DO GEL
1. Abrir a tampa da câmara de migração.
2. Retirar o papel de filtro e deixar o gel no seu lugar.
3. Fechar a tampa.
4. Dar início ao processo premindo a tecla “START” (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
SECAGEM DO GEL - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS
• Secagem a 50 ºC, controlada pelo efeito de Peltier, durante 6 minutos.
• Ouve-se um sinal sonoro e a tampa da câmara de migração é desbloqueada. A temperatura da placa permanece a 50 ºC até a tampa ser aberta.
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante a fase de secagem.
VI. PREPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE TRATAMENTO DO GEL
1. Abrir a tampa.
2. Retirar a película seca de gel para tratamento posterior.
3. Abrir o suporte do gel. Colocar o gel seco na horizontal (com o lado do gel virado para cima), nas ranhuras das duas barras e fechar o suporte.
Certifique-se de que o filme está correctamente posicionado no interior do suporte (Fig. 13).
4. Colocar o suporte do gel na câmara de coloração.
IMPORTANTE: Antes de dar início ao programa de coloração do gel, verificar o seguinte:
- se o frasco da solução de lavagem está cheio com pelo menos 400 ml de solução de lavagem ;
- se o frasco do corante está cheio com 300 ml de solução corante ;
- se o frasco de descorante contem pelo menos 1 litro de solução descorante ;
- se o frasco de despejo está vazio.
Para seleccionar os canais de entrada dos reagentes: consultar a informação indicada no ecrã do aparelho (premir a tecla: “VER CANAIS”).
IMPORTANTE: Não esquecer de tapar os canais não utilizados.
5. Seleccionar o programa de coloração "IF AMIDO" no menu do aparelho. Iniciar a operação premindo a tecla "START" (flecha verde no lado
direito do teclado).
Durante as etapas de coloração, descoloração e secagem o sistema permanece fechado. Após arrefecimento da câmara, ouve-se um sinal
sonoro e o sistema desbloqueia-se (a ventilação mantém-se até que se retire o gel).
NOTAS:
- A temperatura da placa de migração continua a decrescer quando a tampa está aberta até chegar aos 20 ºC (em menos de 5 minutos). Depois
pode-se dar início a um novo processo de migração.
- Repor o aplicador de amostras e os suportes do eléctrodo no seu lugar.
- Limpar a placa de controlo de temperatura com um pano macio e húmido.
VII.FINALIZAÇÃO DO TRATAMENTO DO GEL
1. Retirar o suporte do gel da câmara, abrir e retirar o gel seco.
2. Se necessário, limpar a parte de trás (suporte plástico) do gel com um papel macio e húmido.
NOTA : Para os geles com linhas de migração múltiplas (2 ou 3), as extensões da migração podem ser sensivelmente diferentes, sem qualquer
consequência negativa nos resultados.
RESULTADOS
O antisoro pentavalente permite a detecção das:
• Imunoglobulinas: Ig A (K ou L), Ig G (K ou L) e Ig M (K ou L) ;
• Cadeias leves livres kapa ou lambda ;
• Imunoglobulinas: Ig D (K ou L), Ig E (K ou L), que são detectadas pelas suas cadeias leves kapa ou lambda.
Interpretação
Uma amostra de soro normal apresenta uma zona pouco corada difusa de imunoglobulinas policlonais (G, A, M, kapa e lambda), sem nenhuma
banda focalizada.
Uma hipergamaglobulinémia é caracterizada por uma zona difusa fortemente corada, sem apresentar bandas monoclonais.
Uma gamapatia é caracterizada por uma ou mais bandas monoclonais bem demarcadas, detectadas pelo soro pentavalente.
Casos especiais
• Uma gamapatia monoclonal ligeira (ex. disglobulina de mobilidade beta) pode ser camuflada por um perfil electroforético normal. Esta fracção será
detectada pelo antisoro pentavalente.
• Uma hipogamaglobulinémia pode estar associada a uma cadeia leve livre monoclonal. Esta proteína, devido ao seu baixo peso molecular, é
eliminada pelos rins na urina (proteína Bence Jones). A quantidade remanescente no soro é normalmente muito baixa, mas pode ser detectada por
imunofixação com o antisoro pentavalente, através da sua reacção de amplificação.
• Quando uma banda do tipo monoclonal é observada por electroforese (pista ELP) mas falha na confirmação por imunofixação, a primeira suspeita
deverá ser a presença de fibrinogénio (numa amostra de plasma).
• Quando a mesma banda monoclonal é observada em todas as pistas de imunofixação, deverá suspeitar-se de crioglobulina ou Ig M polimerizada.
Despolimerizar com agente redutor e repetir a técnica (ver "AMOSTRAS").
Qualquer banda monoclonal detectada por antisoro Pentavalente necessita obrigatoriamente de ser identificada por outro dos seguintes métodos de
imunofixação:
• HYDRAGEL 1 IF (SEBIA, ref. n° 4301), HYDRAGEL 2 IF (SEBIA, ref. nº 4302), HYDRAGEL 4 IF (SEBIA, ref. n° 4304 ou 4308) ou HYDRAGEL
9 IF (SEBIA, ref. nº 4309).
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES (SEBIA, ref. n° 4321), HYDRAGEL 2 BENCE JONES (SEBIA, ref. n° 4322) ou HYDRAGEL 4 BENCE JONES
(SEBIA, ref. n° 4324).
Interferências e limitações
O uso de outros antisoros que não os específicos à técnica de imunofixação realizada com a máscara dinâmica pode afectar a qualidade dos
resultados.
Em virtude dos limites de resolução e sensibilidade inerentes da electroforese de zona, é possível que alguns componentes monoclonais não possam
ser detectados por este método.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Assistência técnica
Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor ainda que tenham sido seguidas, escrupulosamente, as instruções para
a preparação e armazenamento dos reagentes, assim como as instruções de utilização da técnica.
As folhas de informação de segurança do kit e informação sobre eliminação de desperdícios do produto poderão ser também disponibilizados pelos
serviços técnicos do fornecedor.
CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO
Reprodutibilidade intra-ensaio
A reprodutibilidade foi demonstrada com três amostras de soro patológico: duas amostras com alto nível de gamapatia monoclonal e uma amostra
de soro com uma paraproteína fraca. Cada amostra foi ensaiada em dois lotes de gel HYDRAGEL IF Penta 6/12, realizando-se 12 ensaios por gel,
utilizando o corande negro de amido.
Todos os soros ensaiados deram resultados idênticos para os 2 lotes mostrando perfis típicos para cada tipo de amostra testada. A imunofixação não
mostrou nenhuma banda monoclonal nas três amostras de soro patológico.
Reproductibilidade inter-ensaio
A reprodutibilidade inter ensaios foi demonstrada em doze (12) amostras patológicas diferentes com um ou mais paraproteínas.
As amostras foram ensaiadas em 10 geles de HYDRAGEL IF Penta 6/12 de 3 lotes diferentes, utilizando o corante negro de amido.
Todas as amostras analisadas deram os mesmos resultados para os 3 lotes testados. Os perfis obtidos foram os esperados das amostras testadas,
ou seja, a imunofixação detectou cada banda monoclonal para cada uma das amostras, de modo reproductível e sem falsos positivos.
Exactidão
Oitenta e cinco (85) amostras de soro patológico diferentes e onze (11) de soro normal foram testadas com o kit HYDRAGEL 12 IF Penta e com outro
sistema de imunofixação por geles de agarose disponível comercialmente.
Os resultados obtidos demonstraram uma perfeita correlação entre os dois sistemas de análise em todas as amostras patológicas analisadas, com
uma sensibilidade de 100 % e uma especificidade de 100 %.
Sensibilidade
Três soros com gamapatias foram diluídos em série e analisados pelo gel HYDRAGEL IF Penta 6/12 com o corante negro de amido. Os resultados
são indicados no quadro abaixo:
COMPONENTE MONOCLONAL LIMITE DE DETECÇÃO (g/L) AMOSTRA N° TIPO CONCENTRAÇÃO (g/L) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gama, kapa 10,9 0,12 2 alfa, lambda 5,8 0,25
| 3 | mu, kapa | 3,4 | 0,12 |
Dependendo da posição da migração das bandas monoclonais, do nível policlonal da zona gama assim os limites de detecção de uma paraproteína
podem variar entre 0,12 a 0,25 g/l.
BIBLIOGRAFIA
Para informação adicional sobre a interpretação dos padrões de imunofixação, consultar:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.
Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ANVÄNDNINGSOMRÅDE
HYDRAGEL 6 IF Penta och HYDRAGEL 12 IF Penta kit är designade för detektering av monoklonala proteiner i humant serum med immunofixering
elektrofores på alkaliskt buffrade (pH 9.1) agaros geler. De används tillsammans med det halvautomatiska HYDRASYS systemet för att utföra alla
nödvändiga steg klara för geltolkning. Serumproteinerna genomgår elektrofores och immunofixering med ett pentavalent antiserum anti-gamma (Ig G),
alfa (Ig A) och mu (Ig M) tunga kedjor, och anti-kappa och lambda (fria och bundna) lätta kedjor. Efter immunofixering, färgas de utfällda proteinerna
med amidosvart. Eventuell överflödig färg avlägsnas med en sur lösning.
Varje agaros gel i kiten HYDRAGEL 6 IF Penta och HYDRAGEL 12 IF Penta är avsedda för att köra sex eller tolv prov.
Endast för in vitro diagnostik.
TESTPRINCIPER
Abnormala band hos elektroforetiska mönster i serumproteiner, primärt dem med gammarörlighet, men även alfa- och betarörlighet (dessa kan vara
gömda av regelbundna proteiner i motsvarande zoner), misstänks alltid vara monoklonala proteiner och därmed en indikation på gammopatier. För
identifiering av dessa abnormala band används immunofixeringstekniken.
Immunofixerings-elektrofores är en enkel teknik som tillåter ett protein att bli förankrad in situ (på plats) efter elektrofores, genom bildning av ett olösligt
komplex med sin antikropp. Detta genomförs i fyra steg:
1. Proteinseparering med elektrofores på agaros gel.
2. Fixering och immunoprecipitering av elektroforiserade proteiner: Fixativ lösning och antiserum läggs direkt på gelytan, över passande
elektroforetiskt migreringsspår. Fixativ lösning och antiserum diffunderar in i gelen, alla proteiner och motsvarande antigener precipiterar därmed.
3. De oprecipiterade, lösliga proteinerna avlägsnas från gelen med blottning och tvättning. Fällning av antigen-antikropp komplex fångas i
gelmatrisen.
4. De fällda proteinerna visualiseras med färgning. De immunoprecipiterade banden jämförs sedan med motsvarande abnormala band som kan ses
i serumprovets elektroforetiska mönster.
För att detektera en misstänkt monoklonal komponent (komponenter), genomgår proven samtidig elektrofores i två spår. Efter elektrofores, används
ELP- spåret som referens, vilket visar elektroforetiska mönster hos provets proteiner. Immunofixeringsspåret (Penta) visar monoklonala komponenter
som har reagerat med pentavalent antiserum.
Denna enkla och snabba teknik, ger en klar och lätt tolkningsbar bild.
MEDFÖLJANDE REAGENSER OCH MATERIAL I KITEN : HYDRAGEL 6 IF Penta OCH HYDRAGEL 12 IF Penta
OBJEKT PN 4341 PN 4342 PN 4384* Agaros geler (färdiga att anv.) 10 geler 10 geler 80 geler Buffrade strips (färdiga att anv.) 10 förp. 2 i varje 10 förp. 2 i varje 80 förp. 2 i varje Färgspädningslösning (stamlösning) 1 flaska 60 mL 1 flaska 60 mL 8 flaskor 60 mL i varje Amidosvart färg (stamlösning) 1 flaska, 20 mL 1 flaska, 20 mL 8 flaskor 20 mL i varje Fixativ lösning (färdig att anv.) 2 flaskor, 2.9 mL i varje Anti-Ig human immunoglobuliner-däggdjurursprung (gamma - alfa - mu - kappa - lambda) : Pentavalent antiserum (färdig att anv.) 2 flaskor, 2.9 mL i varje Applikatorer (färdiga att anv) 1 förp. med 10 2 förp. med 10 i varje 16 förp. med 10 i varje Antiserasegment (färdiga att anv.) 1 förp. med 10 1 förp. med 10 8 förp. med 10 i varje Filterpapper-tunna 1 förp. med 10 1 förp. med 10 8 förp. med 10 i varje
| Filterpapper-tjocka | 1 förp. med 10 | 1 förp. med 10 | 8 förp. med 10 i varje |
*HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
NOTERA : Fixativ lösning och pentavalent antiserum levereras separat med undantag för MAXI-KIT (Se ERFORDERLIGA REAGENSER MEN EJ
MEDLEVERERADE).
FÖR OPTIMALA RESULTAT
Reagenser från samma kit måste alltid användas tillsammans och enligt de instruktioner som anges på förpackningens insticksblad.
LÄS NOGGRANNT FÖRPACKNINGENS INSTICKSBLAD
1. AGAROS GELER
Förberedelse
Agaros geler är färdiga att använda. Varje gel innehåller: agaros, 0.8 g/dL ; Tris-barbital buffert pH 9.1 ± 0.1 ; tillsatser, ofarliga vid använda
koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda.
VARNING: Agaros geler innehåller 0.31 % barbital och 0.34 % natrium barbital. Färtär inte ! Om så sker, kontakta läkare omedelbart.
Användning
Hjälpmedel för proteinelektrofores.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara gelerna upprätt, i originalförpackningen och vid rumstemperatur (15 till 30 °C) eller i kylskåp (2 till 8 °C). De är hållbara fram till angivet
utgångsdatum på kitförpackningen eller på gelförpackningens etiketter. (Pilen på förpackningens framsida måste peka uppåt). Undvik förvaring nära
fönster eller värmekälla. Undvik större temperaturvariationer under lagring.
FRYS INTE IN GELEN.
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SEBIA INSTRUKTIONER - Svenska

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Släng gelen om:
(i) kristaller eller fällning bildats på gelytan eller gelkonsistensen blivit väldigt mjuk (inträffar när gelen varit fryst),
(ii) bakteriell tillväxt eller mögeltillväxt påvisas,
(iii) onormal mängd vätska är närvarande i gelpåsen (som ett resultat av buffertutsöndring från gelen på grund av felaktiga lagringsförhållanden).
2. BUFFRADE STRIPS
Förberedelse
Buffrade strips är färdiga att använda. Varje innehåller: Tris-barbital buffert pH 9.1 ± 0.3 ; natriumazid ; tillsatser, ofarliga vid använda koncentrationer,
men nödvändiga för optimala prestanda.
VARNING: Bufferten i stripsen innehåller 0.92 % barbital, 1.03 % natrium barbital och 0.30 % natriumazid. Förtär inte ! Om så sker, kontakta
läkare omedelbart! Vid avyttring, undvik kontakt med syra, bly eller koppar, då dessa kan bilda explosiva eller giftiga föreningar med
natriumazid.
Användning
Buffrade strips fungerar som en elektroforetisk buffertreservoar och säkerställer kontakt mellan gel och elektroder.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara de buffrade stripsen horisontellt i den skyddande originalförpackningen vid rumstemperatur eller i kylskåp.(pilen på kitförpackningens framsida
måste peka uppåt). De är hållbara fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på de buffrade stripsens förpackningsetikett.
FRYS INTE IN STRIPSEN.
Kasta om förpackningen är öppen eller om stripsen är uttorkade.
3. FÄRGNINGSLÖSNING DILUENT
Förberedelse
Stamfärglösnings diluent måste användas enligt beskrivning i paragraf « AMIDOSVART FÄRG ».
Den innehåller en sur lösning.
Användning
För förberedelse av amidosvart färglösning.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Lagra stamfärglösnings diluent vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på kitförpackningen eller på diluentens
flasketiketter.
FRYS INTE IN.
Tillsätt inte natriumazid.
4. AMIDOSVART FÄRG
Förberedelse
Amidosvart koncentratet är visköst och kan bli trögflytande. Egenskaperna hos stamlösningen påverkas ej av ökad viskositet eller löslighet.
För att uppnå en perfekt rekonstituering av färgen, vänligen respektera nedansående procedur:
1. Tillsätt 15 ml färgdiluent till vialen amidosvartkoncentrat.
2. Stäng vialen omsorgsfullt.
3. Skaka vialen kraftigt i c:a 5 sekunder.
4. Häll lösningen i behållaren för färgprocessning.
5. Repetera dessa steg 2 eller 3 gånger om nödvändigt.
6. Överför återstående diluent till behållaren och fyll upp till 300 ml med destillerat eller avjoniserat vatten.
7. Blanda innehållet i behållaren noga 5 till 10 minuter. Färglösningen är nu redo att användas.
NOTERA: En icke komplett reconstituerad färglösning kan leda till en undervärdering av albuminfraktionen (lågt procenttal eller vita hål i fraktionen).
Efter spädning innehåller arbetsfärglösningen : sur lösning pH ≈ 2 ; amidosvart, 0.4 g/dL ; etylen-glykol, 6.7 % ; tillsatser, ofarliga vid använda
koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda.
VARNING: Farligt att svälja.
Användning
För färgning av geler vid elektroforetiska proteinsepareringar.
VIKTIGT : Färglösningen är avsedd för färgning av 10 geler. Byt lösning efter färgning av 10 geler.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Lagra både stam-och bruks-färglösningar vid rumstemperatur eller i kylskåp i stängda behållare för att förhindra avdunstning. Stamfärglösningen är
hållbar till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på färgflaskornas etiketter.
Brukslösningen är hållbar i en månad.
Förvara inte arbetsfärglösningen i närheten av en värmekälla.
5. ANTISERA OCH FIXATIV FÖRPACKNING (med PN 4384)
5.1. PENTAVALENT ANTISERUM
Förberedelse
Pentavalent antiserum är färdig att använda. Pentavalent antiserum är en blandning av totalt immunoglobulin av icke Ig humant däggdjursursprung.
Antiserum är färgat med en ofarlig gul-orange färg som matchar färgen på flaskans etikett, dels för lätt identifikation av antiserumet och dels som en
hjälp för att övervaka dess användning.
Om antiserumet visar en lätt grumlighet, lämna antiserumflaskan vid rumstemperatur i minst 10 minuter. Detta bör vara tillräckligt för att lösningen ska
klarna, men om grumligheten kvarstår skall detta inte på något sätt påverka den immunologiska reaktionen. Om olösliga precipitat kvarstår
rekommenderas att centrifugera antiserumet vid 3000 rpm i 5 minuter.
Användning
Används för immunofixering av proteiner efter elektrofores.
Antisera kan härröra från olika djurarter. Blanda inte två olika antiserumflaskor, även om de har samma specificitet, och byt ALLTID pipettspets mellan
antiserumflaskor.
VIKTIGT: För att undvika kontaminering mellan reagens, var noggrann med att sätta tillbaka skruvlocket på motsvarande flaska efter varje användning.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara Pentavalent antiserum i kylskåp (2 till 8 °C). Det är hållbart fram till angivet utgångsdatum på kitförpackningen eller på antiserumflaskans
etikett.
NOTERA: Under transport kan antiserum förvaras utan kylning (15 till 30 °C) i 15 dagar utan några negativa effekter på prestandan.
5.2. FIXATIV LÖSNING
Förberedelse
Fixativ lösning är färdig att använda. Den innehåller: sur lösning ; tillsatser som är ofarliga vid de använda koncentrationerna men nödvändiga för
optimala prestanda. Fixativet är färgat med en ofarlig färg för lätt identifikation och som en hjälp för att övervaka dess användning.
Användning
Används för fixering av elektroforetiskt separerade proteiner i referensspåret (ELP).
VIKTIGT: För att undvika kontaminering mellan reagens, var noggrann med att sätta tillbaka skruvlocket på motsvarande flaska efter varje användning.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara fixativ lösning vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på kitförpackningen eller på fixativlösningsflaskornas
etiketter.
Fixativ lösning måste vara fri från fällning.
6. APPLIKATORER
Användning
Tillskurna applikatorer för engångsbruk. För provappliceringar.
Förvaring
Förvara applikatorerna på en torr plats, vid rumstemperatur eller i kylskåp.
7. ANTISERASEGMENT
Användning
Engångsbruk, färgade segment för fixativ lösning och applicering av antisera på gelen för immunofixering.
VARNING: Segment med antisera måste behandlas försiktigt.
8. FILTERPAPPER - TUNNA
Användning
Tunnt tillskurna och absorberande pappersbitar för engångsbruk. Används för borttagning av fukt på gelytan innan provapplicering.
Förvaring
Förvara de tunna filterpappren på ett torrt ställe i rumstemperatur eller i kylskåp.
9. FILTERPAPPER-TJOCKA
Användning
Engångsbruk, tjocka absorberande pappersbitar för blottning av oprecipiterade proteiner från gelen efter immunofixeringssteget.
Förvaring
Förvara de tjocka filterpappren på en torr plats vid rumstemperatur eller i kylskåp.
ERFORDERLIGA REAGENSER MEN INTE MEDLEVERERADE
1. FÖRPACKNING MED ANTISERUM OCH FIXATIV LÖSNING (för kiten 4341 och 4342).
Förpackningen med antiserum och fixativ lösning för IF Penta immunofixation, SEBIA, PN 4345, innehåller 1 flaska Pentavalent antiserum och 1 flaska
fixativ lösning (2.9 mL i varje). De är specifika för immunofixering med dynamisk mask.
1.1 ANTISERUM
Se tidigare kapitel 5.1.
1.2 FIXATIV LÖSNING
Se tidigare kapitel 5.2.
2. AVFÄRGNINGSLÖSNING
Förberedelse
Varje flaska med avfärgningsstamlösning (SEBIA, PN 4540, 10 flaskor 100 mL i varje) skall spädas upp till 100 liter med destillerat eller avjoniserat
vatten. Lämpligt att endast späda 5 mL av stamlösning till 5 liter, samma som är volymen hos behållaren för avfärgningslösningen. Efter spädning
innehåller den färdiga avfärgningslösningen: citronsyra, 0.05 g/dL.
Användning
För avfärgning, vilket innebär borttagning av överflödig färg samt bakgrundsfärg från gelerna.
För avsköljning av färgfacket efter tvättsteget.
För att neutralisera den sura avfärgningslösningen, häll 15 mL av en 50 % Natriumhydroxidlösning, in i den tomma avfallsbehållaren.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara avfärgningsstamlösningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar till angivet utgångsdatum på avfärgningslösningens förpackning
eller på flasketiketterna. Bruksavfärgningsslösningen är hållbar i en vecka vid rumstemperatur i stängd flaska. Tillsätt ej natriumazid.
Kassera bruksavfärgningslösningen om den förändras i utseende t.ex., blir grumlig p.g.a. mikrobiell kontaminering.
För att förhindra mikrobiell tillväxt i den spädda avfärgningslösningen (vid lagring mer än 1 vecka) tillsätt 5 µl/dL av ProClin 300.
Bruksavfärgningslösning tillsatt med ProClin är hållbar i stängd flaska, förvarad vid rumstemperatur eller i kylskåp till angivet utgångsdatum på
förpackningen eller på avfärgninglösningens flasketiketter.
3. HYDRASYS TVÄTTLÖSNING
Förberedelse
Varje flaska av HYDRASYS stamtvättlösning (SEBIA, PN 4541, 10 flaskor, 80 mL i varje) skall spädas upp till 5 liter med destillerat eller avjoniserat
vatten. Efter spädning innehåller den färdiga tvättlösningen : alkalisk buffert pH 8.8 ± 0.3 ; natriumazid.
VARNING: Brukstvättlösning innehåller 0.625 % natriumazid. Farligt vid förtäring ! Vid förtäring, kontakta läkare omedelbart ! Natriumazid
kan leda till bildning av explosiva eller giftiga ämnen vid kontakt med syror, bly eller koppar. Spola alltid med en stor mängd vatten vid
avyttring.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Användning
HYDRASYS tvättlösning är designad för att tvätta oprecipiterade proteiner från gelerna. Lösningen används även för rengöring av HYDRASYS
färgfack. Använd regelbundet, t.ex. om instrumentet används dagligen, tvätta färgfacket varje vecka.
Se insticksbladet för användarinstruktioner.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara stam- och brukstvättlösningarna i stängda behållare vid rumstemperatur eller i kylskåp. Lösningarna är hållbara fram till angivet utgångsdatum
på tvättlösningsflaskornas etiketter. Kassera den färdigspädda tvättlösningen om den förändras i utseende, t.ex. blir grumlig på grund av bakteriell
kontaminering.
4. FLUIDIL
Förberedelse
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 flaska med 5 mL) är färdig att använda.
Användning
För spädning av viskösa eller grumliga prov, t.ex. sera som innehåller kryoglobulin eller kryogel.
Lagring, stabilitet och tecken på förändring
Förvara vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är stabil till angivet utgångsdatum på Fluidilflaskans etikett.
Fluidil måste vara fri från fällning.
UTRUSTNING OCH NÖDVÄNDIGA TILLBEHÖR MEN EJ MEDLEVERERADE
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 eller PN 1211.
2. Mikropipett, manuell eller automatisk, t.ex. HYDRAplus SEBIA, PN 1215, ett alternativt sätt att ladda provapplikatorerna och antiserasegmenten.
3. Fuktkammare, PN 1270, levererad med HYDRASYS.
4. Behållarsats levererad med HYDRASYS.
5. Mallguide SEBIA, levererad med HYDRASYS.
6. Dynamisk mask, SEBIA, PN 1255.
7. Pipetteter: 8 µL, 10 µL, 12 µL, 20 µL, 100 µL och 200 µL.
PROV FÖR ANALYS
Provinsamling och förvaring
Färska serumprov rekommenderas för analys. Sera måste insamlas enligt etablerade rutiner som används i kliniska laboratorier.
Vid behov, förvara sera vid 2 till 8 °C upp till en vecka.
Vid längre förvaringsperioder, frys in proven (hållbara minst en månad).
Frysta prov är hållbara i minst en månad.
Tinade prover kan ge lätta appliceringsmärken på grund av protein- eller lipoproteindenaturering.
Frysning av serumprov med natriumazid 0,02 g/dL ökar hållbarheten.
Förberedelse av prov
Använd outspädda serumprov.
Efter lagring vid 2 to 8 °C eller efter frysning, kan vissa sera (speciellt de som innehåller kryoglobulin eller kryogel) bli viskösa eller utveckla grumlighet.
Sådana sera kan ge appliceringsproblem på grund av att diffusionen genom tänderna i provapplikatorn förhindras. I sådant fall, tillsätt 25 µl Fluidil till
75 µl serum och vortexa under 15 sekunder. Följ därefter normalt förfaringssätt.
Vissa monoklonala proteiner kan polymerisera vilket leder till en «monoklonal fraktion» som kan ses på alla immunofixerade spår. I detta fall
(i) förbered 1 % beta-merkaptoetanol (BME, eller 2-merkaptoetanol, 2ME) i Fluidil, (ii) tillsätt 25 µL av denna reducerande lösning till 75 µL rent serum,
(iii) vortexa och vänta i minst 15 minuter (maximum 30 minuter) följ därefter normalt tillvägsgångssätt.
Prov att undvika
Undvik plasmaprov : Fibrinogen ger ett band i referensspåret nära appliceringspunkten som kan tas för ett monoklonalt immunoglobulin.
Undvik hemolyserade prov.
FÖRFARINGSSÄTT
HYDRASYS systemet är ett halvautomatiskt multi-parameter instrument. De automatiska stegen inkluderar bearbetning av HYDRAGEL agarosgeler
i följande ordning: provapplicering, elektroforetisk migrering, inkubering med fixativ lösning och antiserum, torkning, färgning, avfärgning och till sist
torkning. De manuella stegen inkluderar hantering av prov och geler, applicering av fixativ och antiserum samt att förbereda instrumentet för arbete.
LÄS NOGGRANNT HYDRASYS INSTRUKTIONSMANUAL.
I. MIGRERING
1. Starta HYDRASYS instrumentet.
2. Placera en applikator för 6 provanalyser på HYDRAGEL IF Penta 6/12 eller två applikatorer för 12 provanalyser, på en slät yta med brunnarnas
nummer i upprätt läge (Fig. 1).
- Applicera 10 µL outspätt prov in i varje brunn. Ladda varje applikator inom 2 minuter.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
| BRUNNAR |
PROV ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
NOTERA: Brunnar med nummer 1, 8 och 15 används inte i detta test ; de kan markeras med en filtpenna för att undvika att fylla dem av
misstag.
- Placera varje applikator i fuktkammaren med tänderna uppåt [håll i den skyddande plast ramen].
Se fuktkammarens insticksblad för ytterligare detaljer.
- Låt proverna diffundera in i tänderna efter den sista provappliceringen. För senare gelapplicering (upp till 8 timmar), förvara hela kammaren
i kylskåp.
3. Öppna luckan till Migrationsmodulen, och lyft upp elektrod- och applikatorhållarna.
VARNING: Stäng aldrig luckan när hållaren är i höjt läge!
4. Välj «6/12 PENTA SM/DM» migrationsprogram på instrumentmenyn (tangentbordets vänstra sida).
5. Ta ur de buffrade strippsen ur förpackningen ; ta dem i plaständarna. Sätt de hålstansade ändarna på strippsens plaststöd på elektrodhållarens
pinnar ; stripsens plaststöd måste vara vända mot elektrodhållaren (Fig. 2).
6. Ta ut HYDRAGEL plattan.
- Rulla snabbt och jämt med ett tunt filterpapper på gelytan för bortagning av överflödig vätska. Ta direkt bort pappret.
VARNING: För att undvika uttorkning : låt inte filterpappret vara i kontakt med gelen under längre tid.
- Pipettera 200 µL destillerat eller avjoniserat vatten, på den lägre tredjedelen av ramen som är tryckt på migrationsmodulens
temperaturkontrollplatta.
- Placera gelplattan (gelsidan uppåt) med kanterna mot stoppet vid den nedre delen på den tryckta ramen (Fig. 3).
- Böj gelen och släpp den försiktigt ned i vattendroppen (Fig. 3). Förvissa dig om att inga luftbubblor finns kvar, att vattnet fördelar sig under
hela gelplattan och att gelen är i linje med den tryckta ramen.
7. Sänk ned båda hållarna. I detta läge berör inte de buffrade stripsen gelen. TRYCK INTE HÅLLARNA HELA VÄGEN NED.
8. Avlägsna varje applikator från fuktkammaren. Håll i den skyddande ramen.
- Avlägsna applikatorns tandskyddsram.
- För 6 provanalyser på HYDRAGEL IF Penta 6/12, placera applikatorn i position nr. 6 på hållaren.
- För 12 provanalyser, placera två applikatorer i positionerna nr. 3 och 9.
VIKTIGT: Det tryckta numren på applikatorn måste vara vända mot operatören (Fig. 4).
9. Stäng luckan till migrationsmodulen.
10. Starta sekvensen direkt genom att trycka på den gröna piltangenten «START» på tangentbordets vänstra sida.
VIKTIGT: Förvissa dig om att ventilationsintaget på instrumentets högra sida inte är blockerat.
MIGRERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG
• De två hållarna sänker sig så att de buffrade stripsen och applikatorn (applikatorerna) får kontakt med gelytan.
• Provapplikatorn höjer sig.
• Migrering sker under 20 W konstant strömstyrka vid 20 °C kontrollerat av Peltiereffekten, tills 42 Vh har ackumulerats (under ca. 9 minuter).
• Elektrodhållaren höjer sig för koppla ur elektroderna.
• En ljudsignal hörs som aviserar att migrationmodulens lucka låses upp. Följande meddelande visas på skärmen: « AS»/reagensapplicering.
NOTERA: Luckan till migrationsmodulen förblir stängt under alla migrationsstegen.
II. IMMUNOFIXERING
Den dynamiska masken innehåller en färgad referensguide för reagensapplicering, ett antiserasegment, en segmenthållare, en dynamisk mask guide,
samt en längdreducerande ram (Fig. 5).
Under migrering, förbered den dynamiska masken enligt enligt följande:
1. Placera den dynamiska masken på en slät yta.
VIKTIGT : För analys av sex prover på HYDRAGEL IF Penta 6/12, är det nödvändigt att placera en längdreducerande ram på den dynamiska
masken guiden.
2. Placera ett antiserasegment i segmenthållaren (Fig. 6):
- Luta antiserasegmentet i en 45° vinkel och placera det mot plastfjädrarna i segmenthållaren.
- Dra isär de två delarna och vrid ned segmentet så att det fixeras i skårorna på segment-hållaren.
VARNING: Förvissa dig om att segmentet är korrekt placerat i hållaren : pinnarna i ändan av segmentet måste låsas i
segmenthållarens skåror.
3. Sätt hållaren med segmentet på den dynamisk mask guiden (Fig. 7). Sätt därefter den färgade referensguiden för reagentapplicering,
motsvarande den analys som körs, på segmenthållaren framför segmentbrunnarna (Fig. 8).
4. Applicera reagenser enligt följande:
- 8 µL per brunn för 6 provanalyser och,
- 12 µL per brunn för 12 provanalyser.
| RÄNNA | REAGENS | FÄRG |
| ELP | Fixativ lösning | gul |
| Penta | Pentavalent antiserum | gul - brandgul |
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
NOTERA: Reagenserna är färgade och färgerna visas på den färgade referensguiden för att underlätta pipettering av korrekt antisera.
VIKTIGT: Använd inte brunnar med antiserasegment i positionerna 1, 8 och 15.
- Aspirera reagenserna ; undvik luftbubblor vid pipettspetsen.
- Applicera reagenserna (Fig. 9) :
- Håll pipetten i en sådan vinkel att spetsen vilar mot brunnens insida utan att vidröra brunnens botten.
- Pipettera ut reagensdroppen in i brunnen.
5. Avlägsna den färgade referensguiden.
III. IMMUNOFIXERING
1. Öppna luckan till migrationsmodulen.
2. Avlägsna provapplikatorn (provaplikatorerna) och kassera.
3. Lyft bägge hållarna, ta tag i de buffrade stripsens plastsida och kassera.
- Ta bort båda hållarna.
- Torka av elektroderna med en mjuk fuktig servett.
- Lämna gelen på sin plats i migrationsmodulen.
4. Sätt upp den dynamiska masken för reagensapplicering enligt följande (Fig. 10):
- Placera maskguiden på den förankrande klämman (guiden kan vara kvar i migrationsmodulen hela tiden).
- Håll den dynamiska masken i fliken och placera den i guiden med skårorna i linje med markeringarna.
- Sänk ned den dynamiska masken på HYDRASYS plattan.
VIKTIGT : Kontrollera att den dynamiska masken är rätt placerad i perfekt linje mellan de elektroforetiska profilerna och maskens brunnar.
5. Placera segmenthållaren på den lägsta punkten på maskguiden, vänd mot operatören.
Håll segmenthållaren i handtaget placerat på dess högra sida och tryck på den mittersta tryckpunkten så att antiserasegmentet får kontakt
med gelen.
Lätta på trycket ; därefter sprider sig reagenserna under varje spår (Fig. 11).
6. Omedelbart, genom att använda segmenthållarhandtaget, för segmentet sakta men säkert, upp och ned längs hela gelen för att applicera
reagenserna. Applicering bör ta ca. 5 sekunder (Fig. 12).
VARNING: Under detta steg, håll endast i masken med segmenthållarhandtaget. Undvik att röra guiden. Tryck inte en andra gång på
tryckpunkten då detta kan resultera i krosskontaminering av reagenser.
7. Ta bort guiden och den dynamiska masken.
- Avlägsna segmenthållaren med dess handtag.
- Avlägsna antiserasegmentet från hållaren och kasta.
VARNING: Segment med antisera måste behandlas försiktigt.
- Det kan finnas reagens kvar i brunnarna efter applicering. Detta har ingen inverkan på testresultaten.
8. Stäng luckan till migrationsmodulen.
9. Starta sekvensen direkt genom att trycka på den gröna piltangenten «START» på tangentbordets vänstra sida. Ett meddelande
«[INCUBATION]»/Inkubering, visas på skärmen.
IMMUNOFIXERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG
• Inkubera vid 20 °C under 5 minuter (kontrollerat av Peltiereffekten).
• En ljudsignal hörs som aviserar att migrationmodulens lucka låses upp. Följande meddelande visas på skärmen: « PAP.»/ papper-blottning.
NOTERA: Locket till migrationsmodulen förblir stängt under inkubering.
IV. BLOTTNING AV GEL
1. Öppna luckan till migrationsmodulen.
2. Applicera ett tjockt filterpapper på gelen.
- Passa in filterpapprets kant mot gelsidan (luta den i 45° vinkel) släpp försiktigt ned den på gelen.
VIKTIGT: Tryck med stadig hand hela filterpapprets yta mot gelen för att uppnå perfekt kontakt med gelen.
3. Stäng luckan till migrartionsmodulen.
4. Starta sekvensen genom att trycka på tangenten «START» (grön pil på tangentbordets vänstra sida).
BLOTTNING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG
• Blottning vid 40 °C kontrollerat av Peltiereffekten, under 3 minuter. Följande meddelande visas på skärmen: «[BLOTTING]» /papper-blottning
• En ljudsignal hörs. Följande meddelande visas på skärmen «❊ PAP.» ta bort papper.
V. TORKNING AV GEL
1. Öppna luckan till Migrationsmodulen.
2. Avlägsna filterpappret och lämna gelen på sin plats.
3. Stäng luckan.
4. Starta sekvensen genom att trycka ned den gröna pilen «START» på tangentbordets vänstra sida.
TORKNING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG
• Torka vid 50 °C kontrollerat av Peltiereffekten, under 6 minuter.
• En ljudsignal hörs, luckan låses upp. Plattans temperatur hålls vid 50 °C tills luckan öppnas. På skärmen visas följande meddelande” Migration temp
maintained” /migreringstemperatur upprätthållen.
NOTERA: Locket till migrationsmodulen förblir stängt under alla torkningssteget.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
VI. GELBEARBETNING
1. Öppna luckan.
2. Avlägsna den torkade gelen för vidare bearbetning.
3. Öppna Gelhållaren. Lägg den platt och vänd den torkade gelen (med gelsidan vänd uppåt) i fördjupningarna i de två listerna och stäng
hållaren. Förvissa dig om att filmen är korrekt placerad inuti hållaren (Fig. 13).
4. Placera gelhållaren i modulen för gelbearbetning/färgning.
VIKTIGT: Innan start av gelbearbetning / färgning, kontrollera följande :
- att tvättlösningsbehållaren innehåller minst 400 mL tvättlösning ;
- att färgningsbehållaren är fylld med 300 mL färgningslösning ;
- att behållaren för avfärgning innehåller minst 1 liter avfärgningslösning ;
- att avfallsbehållaren är tom.
För reagenslinjeförbindelse: Hänvisas till visad information på instrumentets skärm (välj tangent: REAGENT LINES).
VIKTIGT: Glöm inte att spärra oanvända linjer.
5. Välj «IF AMIDO» färgningsprogram på instrumentmenyn och starta körningen genom att trycka på knappen «START» (grön pil på
tangentbordets högra sida).
Under färgning-, avfärgning- och torkningsstegen, förblir facket låst.
Efter kylningssteget, hörs en ljudsignal när facket öppnas (ventilation upprätthålls tills gelhållaren avlägsnas).
NOTERA:
- Migrationplattans temperatur fortsätter att sjunka p.g.a. luckan har öppnats, tills den når 20 °C (under 5 minuter). En ny migrationskörning kan
startas.
- Placera åter provapplikatorn och elektrodhållarna på sina platser.
- Torka temperaturkontrollplattan med en mjuk fuktig servett.
VII.SLUTGILTIG GELBEARBETNING
1. Avlägsna gelhållaren från facket, öppna och avlägsna den torkade gelen.
2. Vid behov, rengör den torra filmens baksida (stödsidan av plast) med ett fuktat mjukt papper.
ANMÄRKNING : Längden hos de elektroforetiska migreringarna kan vara något olika för geler innehållande 2 eller 3 analysspår, utan några
ofördelaktiga effekter på utförandet.
RESULTAT
Pentavalent antiserum detekterar:
• G, A, M immunoglobuliner, kappa och lambda kedjor,
• fria kappa och lambda lätta kedjor,
• kappa och lambda lätta kedjor bundna till epsilon eller delta tunga kedjor.
Tolkning
Ett normalt serumprov visar en lätt färgad zon, vilken motsvarar polyklonala immunoglobuliner (G, A, M, kappa och lambda), utan några skarpa band.
Hypergammaglobulinemi karrakteriseras av en starkt färgad, diffus zon, utan några begränsande band.
En gammopati karrakteriseras av ett eller flera fokuserande band.
Speciella fall
En lätt monoklonal gammopati kan döljas i en normal elektroforetisk profil (t.ex., beta-rörlig dys-globulin). Detta band kan detekteras med pentavalent
antiserum.
• En hypogammaglobulinemi kan associeras med en monoklonal « free light chain ». Detta protein, på grund av sin låga molekylära vikt, elimineras
genom njuren till urin (Bence Jones Protein). Återstående nivå i serum är vanligtvis mycket låg, men kan detekteras genom immunofixering med
pentavalent antiserum.
• När ett monoklonalt typ av band observeras vid serumelektrofores (ELP spår) men ej kan bekräftas genom immunofixering, bör fibrinogen
(plasmaprov) vara huvudmisstänkt.
• När ett monoklonalt typ av band observeras på alla immunofixeringsspår, bör kryoglobulin eller polymeriserat Ig M misstänkas. Depolymerisera med
ett reducerande agens och upprepa proceduren (se «Prov för analys»).
En monoklonal-liknande fraktion måste ytterligare identifieras med:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, PN 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, PN 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, PN 4304 or 4308, eller HYDRAGEL 9 IF SEBIA,
PN 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4322 eller HYDRAGEL 4 BENCE JONES SEBIA,
PN 4324.
Begränsningar
Att använda andra antisera än de som är specifika för immunofixering med dynamisk mask kan påverka resultaten.
På grund av begränsningar när det gäller upplösning och känslighet hos zonelektrofores, är det möjligt att vissa monoklonala komponenter inte
detekteras med denna metod.
Felsökning
Ring leverantörens tekniska support om testet misslyckas trots att manualen och att givna instruktioner för materialförvaring och förberedelse av test
följts.
Säkerhetsinformation för reagenserna i kiten och information för avfallshantering finns tillgängliga hos leverantörens tekniska serviceavdelning.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
PRESTANDADATA
Reproducerbarhet och specificitet
Reproducerbarhet inom gel påvisades på tre olika patologiska prov ; två prov med en hög nivå för monoklonal komponent och ett prov med en låg
nivå för monoklonal komponent.
Varje prov kördes 12 gånger på 2 batcher av HYDRAGEL IF Penta 6/12 geler, med användning av amidosvart färgningsprocedur.
Alla upprepningar gav identiska resultat inom lot och lot-till-lot. Resultaten var som förväntade för den typ av prov som testades. Immunofixering visade
endast en monoklonal komponent för de tre patologiska proven.
Reproducerbarhet mellan geler och specificitet
Reproducerbarhet mellan geler påvisades på tolv olika patologiska prov med en eller flera monoklonala komponenter.
Dessa prov kördes på 10 HYDRAGEL IF Penta 6/12 geler härrörande från 3 olika batcher, med användning av amidosvart färgningsprocedur.
Alla upprepningar gav identiska resultat för gel till gel. Resultaten var som förväntade för den typ av prov som testades.
Tillförlitlighet
Åttiofem (85) olika patologiska serumprov och elva (11) normala sera kördes med HYDRAGEL 12 IF Penta kit, och andra kommersiellt tillgängliga
agaros gel immunofixerings-system.
I samtliga fall, var de erhållna resultaten från SEBIA:s tester identiska med andra jämförbara och kommersiellt tillgängliga tester.
Sensitivitet
Seriella spädningar förbereddes med 3 patologiska serumprov, vilka alla uppvisade monoklonala komponenter och analyserades därefter på
HYDRAGEL IF Penta 6/12 geler.
Resultaten är summerade nedan :
MONOKLONAL KOMPONENT DETEKTIONSGRÄNS (mg/dL) PROV Nr. TYP KONC. (g/dL) HYDRAGEL IF Penta 6/12 1 gamma, kappa 1.09 12 2 alfa, lambda 0.58 25
| 3 | mu, kappa | 0.34 | 12 |
Beroende på migreringspositionen hos den monoklonala komponenten och nivån av polyklonal bakgrund i gammazonen, kan detektionsgränsen
variera från 12 till 25 mg/dL.
BIBLIOGRAFI
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ
Τα κιτ HYDRAGEL 6 IF Penta και HYDRAGEL 12 IF Penta είναι σχεδιασµένα για την ανίχνευση µονοκλωνικών πρωτεϊνών στον ανθρώπινο
ή ορό, µε ηλεκτροφορητική ανοσοκαθήλωση σε αλκαλική (pH 9.1) γέλη αγαρόζης. Τα κιτ χρησιµοποιούνται µε την ηµι-αυτοµατοποιηµένη
συσκευή ηλεκτροφόρησης HYDRASYS. Οι πρωτεΐνες του ορού, διαχωριζόµενες µε ηλεκτροφόρηση ανοσοκαθηλώνονται και επωάζονται
µε πενταδύναµο αντιορό έναντι γάµµα (Ig G), άλφα (Ig A) και µι (Ig M) βαρέων αλυσίδων καθώς και κάππα (ελεύθερων και συνδεδεµένων)
και λάµδα (ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαφρών αλυσίδων. Μετά την ανοσοκαθήλωση, οι καθιζήσασες πρωτεΐνες υφίστανται χρώση
µε amidoblack. Η περίσσεια χρωστικής αποµακρύνεται µε όξινο διάλυµα.
Κάθε gel αγαρόζης στα κιτ HYDRAGEL 6 IF Penta και HYDRAGEL 12 IF Penta προορίζεται για την ανάλυση 6 ή 12 δειγµάτων, αντίστοιχα.
Για In Vitro διαγνωστική χρήση.
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ
Οι µη φυσιολογικές ζώνες στα ηλεκτροφορήµατα, ιδιαίτερα εκείνες µε γ-κινητικότητα, αλλά και εκείνες µε α- και β- κινητικότητα (αυτές
µπορεί να καλύπτονται από τις κανονικές πρωτεΐνες των αντίστοιχων ζωνών) είναι πάντα ύποπτες ως πιθανές µονοκλωνικές πρωτεΐνες
και εποµένως ως ένδειξη µονοκλωνικής γαµµαπάθειας. Για την ταυτοποίηση αυτών των µη φυσιολογικών ζωνών, εφαρµόζεται η τεχνική
της ανοσοκαθήλωσης. Η ηλεκτροφόρηση µε ανοσοκαθήλωση επιτρέπει τη σταθεροποίηση in situ των πρωτεϊνών µετά την
ηλεκτροφόρηση, καθώς σχηµατίζονται µη διαλυτά συµπλέγµατα των πρωτεϊνών µε τους αντίστοιχους αντιορούς. Η διαδικασία
πραγµατοποιείται εύκολα σε τέσσερα βήµατα και τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται ευχερώς:
1. ∆ιαχωρισµός πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης.
2. Μονιµοποίηση και ανοσοκαθίζηση των ηλεκτροφορηµένων πρωτεϊνών: µονιµοποιητικό διάλυµα και αντιορός απλώνονται ευθέως στην
επιφάνεια του gel στα κατάλληλα ηλεκτροφορητικά ίχνη. Το µονιµοποιητικό διάλυµα και ο αντιορός διαχέονται στο gel, προκαλώντας
καθίζηση των πρωτεϊνών και των αντίστοιχων αντιγόνων.
3. Οι µη κατακρηµνισθείσες διαλυτές πρωτεΐνες αποµακρύνονται από το gel µε στύπωµα και έκπλυνση. Το ίζηµα του συµπλέγµατος
αντιγόνου – αντισώµατος παγιδεύεται στο στρώµα του gel.
4. Οι κατακρηµνισθείσες πρωτεΐνες γίνονται ορατές µε χρώση. Οι ζώνες µετά την ανοσοκαθήλωση συγκρίνονται στη συνέχεια µε τις
ύποπτες ζώνες του ηλεκτροφορητικού προφίλ του δείγµατος.
Για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του ύποπτου µονοκλωνικού κλάσµατος, το δείγµα ηλεκτροφορείται ταυτόχρονα σε δύο ίχνη. Μετά την
ηλεκτροφόρηση, ένα ίχνος χρησιµεύει ως ίχνος αναφοράς (ELP) παρέχοντας το ηλεκτροφορητικό προφίλ των πρωτεϊνών του δείγµατος.
Το ίχνος της ανοσοκαθήλωσης (Penta) αποκαλύπτει µονοκλωνικά κλάσµατα τα οποία αντέδρασαν µε τον πενταδύναµο αντιορό.
Η απλή και γρήγορη αυτή τεχνική παρέχει σαφείς και ευχερώς ερµηνευόµενες εικόνες.
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΑ ΚΙΤ HYDRAGEL 6 IF Penta ΚΑΙ HYDRAGEL 12 IF Penta
ΕΙ∆ΟΣ PN 4341 PN 4342 PN 4384* Gel αγαρόζης (έτοιµα προς χρήση) 10 gel 10 gel 80 gel Ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος (έτοιµες προς χρ.) 10 συσκ., 2 έκαστη 10 συσκ., 2 έκαστη 80 συσκ., 2 έκαστη Μέσο αραίωσης διαλύµατος χρώσης (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλ., 60 mL 1 φιαλ., 60 mL 8 φιαλίδια, 60 mL έκαστο Χρωστική Amidoblack (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλ., 20 mL 1 φιαλ., 20 mL 8 φιαλίδια, 20 mL έκαστο Μονιµοποιητικό διάλυµα (έτοιµο προς χρήση) 2 φιαλίδια, 2.9 mL έκαστο Αντιανθρώπειες ανοσοσφαιρίνες από θηλαστικά αντι-Ig (γ-α-µ-κ-λ) : Πενταδύναµος αντιορός (έτοιµος προς χρήση) 2 φιαλίδια, 2.9 mL έκαστο Εφαρµογείς (έτοιµοι προς χρήση) 1 συσκ. των 10 2 συσκ. των 10 16 συσκ. των 10 Εφαρµογείς αντιορών (έτοιµοι προς χρήση) 1 συσκ. των 10 1 συσκ. των 10 8 συσκ. των 10 ∆ιηθητικά χαρτιά – Λεπτά 1 συσκ. των 10 1 συσκ. των 10 8 συσκ. των 10
| ∆ιηθητικά χαρτιά – Αδρά | 1 συσκ. των 10 | 1 συσκ. των 10 | 8 συσκ. των 10 |
*HYDRAGEL 12 IF Penta MAXI-KIT
ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Το µονιµοποιητικό διάλυµα και ο πενταδύναµος αντιορός παρέχονται χωριστά από τα κιτ µε εξαίρεση τα MAXI-KIT (Βλέπε
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ).
ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Όλα τα αντιδραστήρια από ίδιο κιτ πρέπει να χρησιµοποιούνται πάντα µαζί και σύµφωνα µε τις οδηγίες χρήσης.
ΠΑΡΑΚΑΛΟΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ.
1. GEL ΑΓΑΡΟΖΗΣ
Προετοιµασία
Τα gel αγαρόζης είναι έτοιµα προς χρήση. Κάθε gel περιέχει: αγαρόζη, 0.8 g/dL, ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.1 ± 0.1, πρόσθετα,
µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Τα gel αγαρόζης περιέχουν 0.31 % βαρβιτάλη και 0.34 % νατριούχο βαρβιτάλη. Μην το καταπίνετε! Αν το καταπιείτε,
συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό !
Χρήση
Μέσο για ηλεκτροφόρηση και ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε τα gel οριζόντια εντός της συσκευασίας τους σε θερµοκρασία δωµατίου (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). (Το βέλος
στην πρόσθια επιφάνεια του κουτιού του κιτ πρέπει να δείχνει προς τα άνω). Αποφύγετε την αποθήκευση κοντά σε παράθυρο ή σε πηγή
θερµότητας. Αποφύγετε τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµοκρασίας κατά τη φύλαξη.
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.
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Ο∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Πετάξτε τα gel όταν:
(i) σχηµατιστούν κρύσταλλοι ή ίζηµα στην επιφάνεια του gel ή αν η υφή του gel γίνει πολύ µαλακή (όλα αυτά προκύπτουν αν το gel
καταψυχθεί),
(ii) αναπτυχθούν βακτήρια ή µούχλα,
(iii) υπάρχει µεγαλύτερη από το φυσιολογικό ποσότητα στο κουτί του gel (αποτέλεσµα της εξίδρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος από το
gel λόγω ακατάλληλων συνθηκών φύλαξης).
2. ΤΑΙΝΙΕΣ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ
Προετοιµασία
Σπογγώδεις ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα έτοιµες προς χρήση. Καθεµιά περιέχει: ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.1 ± 0.3, αζίδιο
του νατρίου, πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το ρυθµιστικό διάλυµα στις ταινίες περιέχει 0.92 % βαρβιτάλη, 1.03 % νατριούχο βαρβιτάλη και 0.30 % αζίδιο του
νατρίου. Μην το καταπίνετε! Αν το καταπιείτε, συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό ! Όταν το πετάτε αποφύγετε επαφή µε οξέα, µόλυβδο ή
χαλκό, καθώς µπορεί να σχηµατιστούν εκρηκτικές ή τοξικές ενώσεις µε το αζίδιο του νατρίου.
Χρήση
Οι ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα λειτουργούν ως δεξαµενή ρυθµιστικού διαλύµατος για την ηλεκτροφόρηση και εξασφαλίζουν επαφή
µεταξύ του gel και των ηλεκτροδίων.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε τις ταινίες σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Παραµένουν σταθερές µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται
στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και της συσκευασίας των ταινιών.
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.
Πετάξτε τις ταινίες αν η συσκευασία τους έχει ανοιχθεί και οι ταινίες έχουν στεγνώσει.
3. ΜΕΣΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΧΡΩΣΗΣ
Προετοιµασία
Το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής πρέπει να χρησιµοποιείται όπως περιγράφεται στην παράγραφο “ΧΡΩΣΤΙΚΗ
AMIDOBLACK“.
Περιέχει όξινο διάλυµα.
Χρήση
Για την παρασκευή του διαλύµατος χρωστικής amidoblack.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής σε θερµοκρασία δωµατίου ή στοψυγείο. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία
λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.
Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου.
4. ΧΡΩΣΤΙΚΗ AMIDOBLACK
Προετοιµασία
Η πυκνή χρωστική amidoblack είναι ένα ιξώδες διάλυµα το οποίο ενδέχεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλότητα του πυκνού
διαλύµατος χρωστικής δεν επηρεάζεται από την αύξηση της γλοιότητάς του ή τη στερεοποίησή του.
Σε όλες τις περιπτώσεις, για να επιτύχετε τέλεια ανασύσταση της χρωστικής, σας συνιστούµε να ακολουθήσετε την εξής διαδικασία :
1. Προσθέστε 15 mL του µέσου αραίωσης χρωστικής στο φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος.
2. Κλείστε προσεκτικά το φιαλίδιο.
3. Ανακινήστε έντονα το φιαλίδιο για περίπου 5 δευτερόλεπτα.
4. Αδειάστε αυτό το διάλυµα στο δοχείο που προορίζεται για την επεξεργασία του διαλύµατος χρωστικής.
5. Επαναλάβετε αυτό το βήµα δύο φορές, ή τρεις αν χρειάζεται.
6. Αδειάστε το υπόλοιπο µέσο αραίωσης στο δοχείο και συµπληρώστε µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ έως όγκου 300 mL.
7. Ανακινήστε καλά τα περιεχόµενα του δοχείου για 5 - 10 λεπτά.
Το διάλυµα χρωστικής είναι έτοιµο προς χρήση.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ατελής ανασύσταση της χρωστικής θα οδηγήσει σε υποεκτίµηση του κλάσµατος της αλβουµίνης.
Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας της χρωστικής περιέχει: όξινο διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενογλυκόλη, 6.7 %,
πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Επιβλαβές αν καταποθεί.
Χρήση
Για τη χρώση των gel µετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό πρωτεϊνών.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το διάλυµα χρωστικής είναι σχεδιασµένο για χρώση µόνο 10 gel. Αλλάξτε το διάλυµα µετά από 10 διαδικασίες χρώσης.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε τα διαλύµατα προ και µετά την αραίωση σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο σε κλειστούς περιέκτες για να αποτραπεί η
εξάτµιση. Το πυκνό διάλυµα χρωστικής είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας
του κιτ και των φιαλιδίων.
Το διάλυµα εργασίας είναι σταθερό για 1 µήνα.
Μην αποθηκεύετε το διάλυµα χρώσης κοντά σε πηγή θερµότητας.
5. ΑΝΤΙΟΡΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ (µε το PN 4384)
5.1. ΠΕΝΤΑ∆ΥΝΑΜΟΣ ΑΝΤΙΟΡΟΣ
Προετοιµασία
Έτοιµος προς χρήση. Ο αντιορός είναι µίγµα από προερχόµενες από θηλαστικά πλήρεις αντι-ανθρώπειες αντι-Ig ανοσοσφαιρίνες. Για την
εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, ο αντιορός είναι χρωµατισµένος µε µη επιβλαβή πορτοκαλοκίτρινη
χρωστική η οποία ταιριάζει µε το χρώµα της ετικέττας του φιαλιδίου. Όταν ο αντιορός παρουσιάζει ελαφρά θολερότητα, αφήστε το
φιαλίδιο του αντιορού σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 10 min. Με τον τρόπο αυτό θα πρέπει το διάλυµα να ξαναγίνει διαυγές.
Ωστόσο, αν η θολερότητα παραµένει, δεν θα επηρεάσει την ανοσολογική αντίδραση. Σε περίπτωση σχηµατισµού αδιάλυτου ιζήµατος,
συνιστάται να φυγοκεντρηθεί ο αντιορός για 5 min στις 3000 rpm.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Χρήση
Για ανοσοκαθήλωση ηλεκτροφορηµένων πρωτεϊνών.
Οι αντιοροί µπορεί να προέρχονται από διαφορετικά είδη ζώων. Μην αναµιγνύετε δύο αντιορούς από διαφορετικά φιαλίδια, ακόµη και µε
την ίδια ειδικότητα, και αλλάζετε ΠΑΝΤΑ το ρύγχος της πιπέττας όταν αλλάζετε φιαλίδια αντιορού.
ΠΡΟΣΟΧΗ: Προς αποφυγή οποιασδήποτε ανάµιξης των αντιδραστηρίων, τοποθετήστε προσεκτικά το καπάκι στο αντίστοιχο φιαλίδιο µετά
από κάθε χρήση.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε τον αντιορό στη συντήρηση του ψυγείου (2 έως 8 °C). Παραµένουν σταθεροί µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται
στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων αντιορού.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά τη µεταφορά, οι αντιοροί µπορούν να διατηρούνται εκτός ψυγείου (στους 15 ως 30 °C) για 15 ηµέρες χωρίς δυσµενή
επίδραση στην απόδοσή τους.
5.2. ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ
Προετοιµασία
Έτοιµο προς χρήση. Περιέχει: όξινο διάλυµα, πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη
απόδοση. Για την εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, το µονιµοποιητικό διάλυµα είναι χρωµατισµένο µε µη
επιβλαβή χρωστική.
Χρήση
Για τη µονιµοποίηση των ηλεκτροφορητικά διαχωρισµένων πρωτεϊνών του ίχνους αναφοράς (ELP).
ΠΡΟΣΟΧΗ: Προς αποφυγή οποιασδήποτε ανάµιξης των αντιδραστηρίων, τοποθετήστε προσεκτικά το καπάκι στο αντίστοιχο φιαλίδιο µετά
από κάθε χρήση.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε το µονιµοποιητικό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Παραµένει σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία
σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ ή των φιαλιδίων του διαλύµατος.
Το διάλυµα πρέπει να είναι ελεύθερο ιζήµατος.
6. ΕΦΑΡΜΟΓΕΙΣ
Χρήση
Έτοιµοι, εφαρµογείς µιας χρήσης για τοποθέτηση των δειγµάτων.
Φύλαξη
Φυλάσσετε τους εφαρµογείς σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.
7. ΕΦΑΡΜΟΓΕΙΣ ΑΝΤΙΟΡΩΝ
Χρήση
Μιας χρήσης, έγχρωµοι εφαρµογείς για την εφαρµογή του µονιµοποιητικού διαλύµατος και των αντιορών στο gel για την ανοσοκαθήλωση.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ο χειρισµός των υλικών που έχουν αντιορούς πρέπει να γίνεται µε προσοχή.
8. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - ΛΕΠΤΑ
Χρήση
Μιας χρήσης απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα της υγρασίας από την επιφάνεια του gel πριν την τοποθέτηση των δειγµάτων.
Φύλαξη
Φυλάσσονται σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.
9. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - Α∆ΡΑ
Χρήση
Μιας χρήσης αδρά απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα των µη κατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από την επιφάνεια του gel µετά την
ανοσοκαθήλωση.
Φύλαξη
Φυλάσσονται σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ
1. ΑΝΤΙΟΡΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ (για τα κιτ 4341 και 4342)
Το πακέτο αντιορού και µονιµοποιητικού διαλύµατος, SEBIA, PN 4345, περιέχει 1 φιαλίδιο πενταδύναµου αντιορού και 1 φιαλίδιο
µονιµοποιητικού διαλύµατος, 2.9 mL έκαστο. Είναι ειδικοί για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε δυναµική κάλυψη.
1.1. ΑΝΤΙΟΡΟΣ
Βλ. παρ. 5.1.
1.2. ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ
Βλ. παρ. 5.2.
2. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ
Προετοιµασία
Κάθε φιαλίδιο ∆ιαλύµατος Αποχρωµατισµού (SEBIA, PN 4540, 10 φιαλίδια, 100 mL το καθένα) αραιώνεται µε έως 100 λίτρα απεσταγµένου
ύδατος. Είναι ευχερές να αραιώνονται µόνο 5 mL του διαλύµατος σε 5 λίτρα, τον όγκο του περιέκτη του διαλύµατος αποχρωµατισµού.
Μετά την αραίωση το διάλυµα αποχρωµατισµού περιέχει: κιτρικό οξύ 0.05 g/dL.
Χρήση
Για αποχρωµατισµό, δηλαδή αφαίρεση της περίσσειας χρωστικής από τη γέλη.
Για καθαρισµό του τµήµατος χρώσης.
Για την εξουδετέρωση της οξύτητας του διαλύµατος αποχρωµατισµού, προσθέστε 15 mL διαλύµατος 50 % υδροξειδίου του νατρίου στο
κενό δοχείο αχρήστων.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η
οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων του διαλύµατος.
Το αραιωµένο διάλυµα είναι σταθερό για µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου σε κλειστό δοχείο. Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου.
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.
Για να αποτρέψετε πολλαπλασιασµό µικροβίων στο αραιωµένο διάλυµα αποχρωµατισµού αν πρόκειται να το φυλάξετε για περισσότερο
από µια εβδοµάδα, προσθέστε 5 µL/dL ProClin 300.
Το διάλυµα εργασίας στο οποίο έχει προστεθεί ProClin είναι σταθερό σε κλειστό δοχείο σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο µέχρι την
ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων.
3. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΝΣΗΣ HYDRASYS
Προετοιµασία
Κάθε φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος έκπλυνσης HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 φιαλίδια, 80 mL το καθένα) αραιώνεται έως τα 5 λίτρα,
µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. Μετά την αραίωση το διάλυµα εργασίας περιέχει: αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 8.8 ± 0.3, αζίδιο
του νατρίου.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το πυκνό διάλυµα περιέχει 0.625 % αζίδιο του νατρίου. Μην το πίνετε! Αν το πιείτε, συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό! Το
αζίδιο του νατρίου µπορεί να οδηγήσει σε σχηµατισµό εκρηκτικών ή τοξικών ουσιών όταν έρχεται σε επαφή µε οξέα, µόλυβδο ή χαλκό.
Πάντοτε ξεπλένετε µε άφθονο νερό όταν το πετάτε.
Χρήση
Το διάλυµα έκπλυνσης χρησιµεύει για την αποµάκρυνση των µη κακατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από τα gel. Χρησιµεύει επίσης για
καθαρισµό του θαλάµου χρώσης του HYDRASYS. Χρησιµοποιείτε το περιοδικά, π.χ. αν το όργανο λειτουργεί καθηµερινά, πλένετε το
θάλαµο χρώσης κάθε εβδοµάδα.
∆είτε το φύλλο οδηγιών για οδηγίες χρήσης.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η
οποία σηµειώνεται στις ετικέττες των φιαλιδίων του διαλύµατος.
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.
4. FLUIDIL
Προετοιµασία
Το Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 φιαλίδιο, 5 mL) είναι έτοιµο προς χρήση.
Χρήση
Για τη διάλυση ιξωδών ή θολών δειγµάτων, π.χ. οροί µε κρυοσφαιρίνες.
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης
Φυλάσσεται σε θερµοκρασία δωµατίου. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου του
Fluidil.
Το Fluidil πρέπει να είναι ελεύθερο ιζήµατος.
ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΞΑΡΤΗΜΑΤΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 ή PN 1211.
2. Σύστηµα µικροπιπεττών, χειροκίνητο ή αυτόµατο, όπως το HYDRAplus SEBIA, PN 1215, ως εναλλακτικός τρόπος φόρτωσης των
εφαρµογέων δειγµάτων.
3. Θάλαµος Υγρής Φύλαξης, PN 1270, παρεχόµενος µε το HYDRASYS.
4. Κιτ περιεκτών παρεχόµενο µε το HYDRASYS.
5. Οδηγός µήτρας SEBIA παρεχόµενος µε το HYDRASYS.
6. ∆υναµική καλυπτρίδα, SEBIA, PN 1255.
7. Πιπέττες: 8 µL, 10 µL, 12 µL, 20 µL, 100 µL και 200 µL.
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ
Λήψη και διατήρηση δειγµάτων
Η ανάλυση συνιστάται να γίνεται γενικά σε φρέσκα δείγµατα. Πρέπει να συλλέγονται σύµφωνα µε τις καθιερωµένες διαδικασίες κλινικής
εργαστηριακής πρακτικής. ∆ιατηρήστε τα δείγµατα στο ψυγείο στους 2 ως 8 °C για έως µια εβδοµάδα. Για µακρότερη διατήρηση,
διατηρήστε τα κατεψυγµένα (σταθερά για τουλάχιστον ένα µήνα). Τα αποψυγµένα δείγµατα πιθανόν να παρουσιάζουν ελαφρά σηµάδια
στο σηµείο εφαρµογής λόγω µετουσίωσης των πρωτεϊνών ή λιποπρωτεϊνών.
Κατεψυγµένα δείγµατα ορού µε αζίδιο του νατρίου, 0.02 g/dL διατηρούνται καλύτερα.
Προετοιµασία δειγµάτων
Χρησιµοποιείτε µη αραιωµένα δείγµατα ορού.
Μετά από ψύξη ή κατάψυξη, µερικοί οροί (ιδιαίτερα εκείνοι που περιέχουν κρυοσφαιρίνες) µπορεί να γίνουν ιξώδεις ή να αναπτύξουν
θολερότητα. Τέτοιοι οροί µπορεί να παρουσιάσουν προβλήµατα εφαρµογής λόγω παρακώλυσης της διάχυσης στα δόντια του εφαρµογέα
δείγµατος. Σε αυτήν την περίπτωση, προσθέστε 25 µL Fluidil σε 75 µL ορού και περιδινήστε (vortex) για 15 sec. Στη συνέχεια ακολουθήστε
την τυπική διαδικασία.
Μερικές µονοκλωνικές πρωτεΐνες µπορεί να πολυµεριστούν δίνοντας ένα «µονοκλωνικό κλάσµα» το οποίο εµφανίζεται σε όλα τα ίχνη
µετά από ανοσοκαθήλωση. Στην περίπτωση αυτή (i) ετοιµάστε 1 % βήτα-µερκαπτοαιθανόλη (BME ή 2- µερκαπτοαιθανόλη, 2 ME) σε Fluidil,
(ii) προσθέστε 25 µL αυτού του µέσου αποπολυµερισµού σε 75 µL ορού, (iii) περιδινήστε (vortex) και περιµένετε τουλάχιστον 15 min
(max. 30 min) και στη συνέχεια ακολουθήστε την τυπική διαδικασία.
∆είγµατα προς αποφυγή
Αποφύγετε δείγµατα πλάσµατος. Το ινωδογόνο δίνει µια ζώνη στο ίχνος αναφοράς κοντά στο σηµείο εφαρµογής η οποία θα µπορούσε να
εκληφθεί ως µονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη.
Αποφύγετε αιµολυµένα δείγµατα.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
Το σύστηµα HYDRASYS είναι ένα ηµι-αυτοµατοποιηµένο πολυπαραµετρικό όργανο. Τα αυτοµατοποιηµένα στάδια λειτουργίας
περιλαµβάνουν την επεξεργασία των gel αγαρόζης HYDRAGEL µε την ακόλουθη σειρά: εφαρµογή δειγµάτων, ηλεκτροφόρηση, επώαση µε
αντιορό και µονιµοποιητικό διάλυµα, στέγνωµα, χρώση, αποχρωµατισµός και τελικό στέγνωµα. Τα χειροκίνητα στάδια περιλαµβάνουν το
χειρισµό των δειγµάτων και των gel καθώς και την προετοιµασία του οργάνου για λειτουργία.
∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΕΓΧΕΙΡΙ∆ΙΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ ΤΟΥ HYDRASYS.
I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ
1. Θέστε το HYDRASYS σε λειτουργία.
2. Τοποθετήστε έναν εφαρµογέα για ανάλυση 6 δειγµάτων στο HYDRAGEL IF Penta 6/12 ή δύο εφαρµογείς για ανάλυση 12 δειγµάτων,
σε µια επίπεδη επιφάνεια µε τους αριθµούς των βοθρίων στη δεξιά πλευρά (Εικ. 1).
- Τοποθετήστε 10 µL από τα δείγµατα στα βοθρία του εφαρµογέα ως εξής. Φορτώστε κάθε εφαρµογέα εντός 2 min.
| ΒΟΘΡΙΑ |
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 12
| 6, 12 | 13 | 14 |
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα βοθρία no. 1, 8 και 15 δεν χρησιµοποιούνται. Μπορούν να σηµαδευτούν µε έναν µαρκαδόρο για να αποφευχθεί
λανθασµένη τοποθέτηση δείγµατος σε αυτά.
- Τοποθετήστε τον/τους εφαρµογέα(-είς) στο θάλαµο υγρής φύλαξης µε τα δόντια προς τα άνω (κρατήστε τον/τους από το
πλαστικό προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών).
- Αφήστε τα δείγµατα να διαχυθούν στα δόντια για 5 min µετά την τοποθέτηση του τελευταίου δείγµατος. Για ύστερη χρήση
τοποθετήστε το θάλαµο στο ψυγείο.
Βλέπε το φύλλο οδηγιών του θαλάµου υγρής φύλαξης για περισσότερες λεπτοµέρειες.
3. Ανοίξτε το καπάκι της Μονάδας Ηλεκτροφόρησης και σηκώστε τους φορείς των ηλεκτροδίων και του εφαρµογέα.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ποτέ µην κλείνετε το καπάκι ενώ οι φορείς είναι σηκωµένοι!-
4. Επιλέξτε το πρόγραµµα «6/12 PENTA SM/DM» από το µενού του οργάνου (αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου).
5. Αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από τη συσκευασία τους. Κρατήστε τις από την πλαστική άκρη τους. Προσαρµόστε
τη σηµαδεµένη άκρη των ταινιών στις ακίδες του φορέα ηλεκτροδίων, το πλαστικό κάλυµµα της ταινίας πρέπει να είναι στραµµένο
προς το φορέα (Εικ. 2).
6. Ανοίξτε τη συσκευασία του HYDRAGEL.
- Περάστε γρήγορα και οµοιόµορφα ένα διηθητικό χαρτί στην επιφάνεια του gel για να απορροφήσει την περίσσεια υγρού.
Αφαιρέστε το χαρτί αµέσως.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Μην αφήνετε το διηθητικό χαρτί σε επαφή µε το gel επί µακρόν για να µην αφυδατωθεί.
- Εισαγάγετε 200 µL απεσταγµένου ή απιονισµένου ύδατος µέχρι το κατώτερο τρίτο της κλίµακας που είναι τυπωµένη στην
Πλακέτα Ελέγχου Θερµοκρασίας της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
- Τοποθετήστε την πλάκα του gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) µε το άκρο της να αγγίζει το stop στο κάτω τµήµα της
τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 3).
- Λυγίστε το gel και χαµηλώστε το επί της επιφάνειας του νερού. (Εικ. 3). Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα,
ότι το νερό έχει απλωθεί κάτω από ολόκληρη την πλακέτα του gel και το gel είναι ευθυγραµµισµένο µε την τυπωµένη κλίµακα.
7. Κατεβάστε και τους δύο φορείς. Σε αυτήν τη θέση, οι ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος δεν αγγίζουν το gel. ΜΗΝ ΠΙΕΖΕΤΕ ΤΟΥΣ
ΦΟΡΕΙΣ ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΟΣ ΤΑ ΚΑΤΩ.
8. Αφαιρέστε τον εφαρµογέα από τον υγρό θάλαµο. Κρατήστε τον από το προστατευτικό κάλυµµα.
- Αποσπάστε το προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών του εφαρµογέα.
- Για ανάλυση 6 δειγµάτων, στο HYDRAGEL IF Penta 6/12, τοποθετήστε τον εφαρµογέα στη θέση No 6 στο φορέα.
- Για ανάλυση 12 δειγµάτων, τοποθετήστε τους δύο εφαρµογείς στις θέσεις No 3 και 9.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Οι τυπωµένοι αριθµοί στον εφαρµογέα πρέπει να είναι στραµµένοι προς τον χειριστή (Εικ. 4).
9. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
10. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Βεβαιωθείτε ότι η είσοδος αερισµού στη δεξιά πλευρά του οργάνου είναι ελεύθερη.
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ
• Οι δύο φορείς χαµηλώνουν ώστε οι ταινίες µε το ρυθµιστικό διάλυµα και ο εφαρµογέας να είναι σε επαφή µε την επιφάνεια του gel.
• Ο φορέας του εφαρµογέα σηκώνεται.
• Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό συνεχές ρεύµα 20 W, µέχρι να συµπληρωθούν 42 Vh (για περίπου 9 min) στους 20 °C .
• Ο φορέας ηλεκτροδίων ανυψώνεται για να αποσυνδεθούν τα ηλεκτρόδια.
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας. Το ακόλουθο µήνυµα παρουσιάζεται στην οθόνη :
« AS».
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει ασφαλισµένο κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της ηλεκτροφόρησης.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
II. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗΣ
Η δυναµική καλυπτρίδα περιέχει έναν έγχρωµο οδηγό αναφοράς για την εφαρµογή των αντιδραστηρίων, έναν εφαρµογέα αντιορών, µια
βάση εφαρµογέα αντιορών, έναν οδηγό της δυναµικής καλυπτρίδας και µια συσκευή µείωσης του µήκους (Εικ. 5).
Κατά την ηλεκτροφόρηση, συναρµολογήστε τη δυναµική καλυπτρίδα ως εξής :
1. Τοποθετήστε τον οδηγό της δυναµικής καλυπτρίδας σε επίπεδη επιφάνεια.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ : Για ανάλυση έξι δειγµάτων στο HYDRAGEL IF Penta 6/12, είναι απαραίτητο να τοποθετηθεί στον οδηγό της
δυναµικής καλυπτρίδας µια συσκευή µείωσης του µήκους.
2. Τοποθετήστε έναν εφαρµογέα αντιορών στη βάση εφαρµογέων (Εικ. 6) :
- Κλίνετε τον εφαρµογέα αντιορών κατά 45° και τοποθετήστε τον σε επαφή µε τα πλαστικά ελατήρια της βάσης εφαρµογέων.
- Αποµακρύνετε τα δύο αντικείµενα και περιστρέψτε τον εφαρµογέα για να τον σταθεροποιήσετε στις εγκοπές της βάσης.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ : Βεβαιωθείτε ότι ο εφαρµογέας είναι σωστά τοποθετηµένος στη βάση : οι ακίδες στα άκρα του εφαρµογέα
πρέπει να είναι σταθεροποιηµένες στις εγκοπές της βάσης.
3. Τοποθετήστε τη βάση µε τον εφαρµογέα στον οδηγό της δυναµικής καλυπτρίδας (Εικ. 7). Στη συνέχεια, τοποθετήστε τον έγχρωµο
οδηγό αναφοράς για την εφαρµογή των αντιδραστηρίων, που αντιστοιχεί στην ανάλυση που πραγµατοποιείτε, στη βάση του
εφαρµογέα µπροστά από τα βοθρία του εφαρµογέα αντιδραστηρίων (Εικ. 8).
4. Εφαρµόστε τα αντιδραστήρια ως εξής:
- 8 µL ανά βοθρίο για ανάλυση 6 δειγµάτων,
- 12 µL ανά βοθρίο για ανάλυση 12 δειγµάτων.
| ΙΧΝΟΣ | ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΟ | ΧΡΩΜΑ |
| ELP | µονιµοποιητικό διάλυµα | κίτρινο |
| Penta | πενταδύναµος αντιορός | πορτοκαλοκίτρινο |
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια είναι έγχρωµα και τα χρώµατα παρουσιάζονται στον έγχρωµο οδηγό αναφοράς για τη διευκόλυνση
του πιπετταρίσµατος των αντιορών.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Μην χρησιµοποιείτε τα βοθρία 1, 8 και 15 του εφαρµογέα αντιορών.
- Αναρροφάτε τα αντιδραστήρια αποφεύγοντας φυσαλίδες αέρα στο ρύγχος της πιπέττας.
- Εφαρµόζετε τα αντιδραστήρια (Εικ. 9) :
- Κρατάτε την πιπέττα υπό γωνία και αγγίζετε το ρύγχος της ελαφρά στο πλάγιο του βοθρίου, χωρίς να αγγίζετε τον πυθµένα του
βοθρίου.
- Εγχύστε τη σταγόνα του αντιδραστηρίου στο βοθρίο.
5. Αφαιρέστε τον έγχρωµο οδηγό αναφοράς.
III. ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
2. Αφαιρέστε τους εφαρµογείς δειγµάτων και πετάξτε τους.
3. Σηκώστε και τους δύο φορείς, αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος κρατώντας τις από την πλαστική άκρη τους και
πετάξτε τις.
- Αφαιρέστε και τους δύο φορείς.
- Σκουπίστε τα ηλεκτρόδια µε µαλακό υγρό πανάκι.
- Αφήστε το gel στη θέση του στη µονάδα ηλεκτροφόρησης.
4. Ετοιµάστε τη δυναµική καλυπτρίδα για εφαρµογή των αντιδραστηρίων ως εξής (Εικ. 10):
- Τοποθετήστε τον οδηγό της καλυπτρίδας στο clip συγκράτησης (ο οδηγός µπορεί να παραµένει στη µονάδα ηλεκτροφόρησης
µόνιµα).
- Κρατώντας τη δυναµική καλυπτρίδα από την άκρη της τοποθετήστε την στον οδηγό µε τις εγκοπές ευθυγραµµισµένες µε τα
σηµάδια.
- Χαµηλώστε τη δυναµική καλυπτρίδα επάνω στην πλάκα του HYDRASYS.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ : Προσαρµόστε τη θέση της δυναµικής καλυπτρίδας ώστε να είναι τέλεια ευθυγραµµισµένη µε τα ηλεκτροφορητικά
ίχνη.
5. Τοποθετήστε τη βάση των εφαρµογέων αντιδραστηρίων στο κατώτερο σηµείο του οδηγού της καλυπτρίδας, στραµµένη προς το
χειριστή.
Κρατήστε τη βάση των εφαρµογέων από τη λαβή στα δεξιά της και πιέστε το κεντρικό σηµείο πίεσης ώστε ο εφαρµογέας αντιορών
να ακουµπήσει στο gel.
∆ιακόψτε την πίεση. Τα αντιδραστήρια θα απλωθούν σε κάθε ηλεκτροφορητικό ίχνος (Εικ. 11).
6. Αµέσως, χρησιµοποιώντας τη λαβή της βάσης του εφαρµογέα αντιδραστηρίων, µετακινήστε τον εφαρµογέα αργά αλλά σταθερά
πάνω – κάτω σε όλο το µήκος του gel για να εφαρµόσετε τα αντιδραστήρια. Αυτό θα πρέπει να διαρκέσει περίπου 5 sec (Εικ. 12).
Κατά τη διάρκεια αυτού του βήµατος, κρατήστε την καλυπτρίδα µόνο από τη λαβή της βάσης του εφαρµογέα αντιδραστηρίων.
Αποφύγετε να αγγίζετε τον οδηγό.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ : Μην ξαναπιέζετε το σηµείο πίεσης καθώς αυτό µπορεί να οδηγήσει σε ανάµιξη των αντιδραστηρίων.
7. Αφαιρέστε τον οδηγό και τη δυναµική καλυπτρίδα.
- Αφαιρέστε τη βάση του εφαρµογέα αντιδραστηρίων κρατώντας την από τη λαβή της.
- Αφαιρέστε τον εφαρµογέα αντιδραστηρίων από τη βάση του και πετάξτε τον.
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ο χειρισµός των υλικών που έχουν αντιορούς πρέπει να γίνεται µε προσοχή.
- Κάποια υπολειπόµενη ποσότητα αντιδραστηρίων µπορεί να παραµείνει στα βοθρία µετά την εφαρµογή. Αυτό δεν θα επηρεάσει
τα αποτελέσµατα.
8. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
9. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πατώντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου. Η
λέξη «[INCUBATION]» εµφανίζεται στην οθόνη.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ
• Επώαση στους 20 °C για 5 min (ελεγχόµενη µε το φαινόµενο Peltier).
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας ηλεκτροφόρησης. Το ακόλουθο µήνυµα εµφανίζεται
στην οθόνη: « PAP.».
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει ασφαλισµένο κατά τη διάρκεια της επώασης
IV. ΣΤΥΠΩΜΑ ΤΟΥ GEL
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
2. Τοποθετήστε ένα αδρό διηθητικό χαρτί στο gel:
- ευθυγραµµίστε την άκρη του διηθητικού χαρτιού µε την άκρη του gel (δώστε του κλίση 45°) και πιέστε το ήπια στο gel.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Πιέστε σταθερά σε όλη την επιφάνεια του gel ώστε να εξασφαλιστεί καλή προσκόλληση.
3. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
4. Αρχίστε τη διαδικασία πιέζοντας το «START».
ΣΤΥΠΩΜΑ - ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ
• Στύπωµα στους 40 °C ελεγχόµενο µε το φαινόµενο Peltier, για 3 min. Το ακόλουθο µήνυµα παρουσιάζεται στην οθόνη: «[BLOTTING]».
• Ακούγεται ένα ηχητικό σήµα. Το ακόλουθο µήνυµα παρουσιάζεται στην οθόνη: «❊ PAP.».
V. ΣΤΕΓΝΩΜΑ ΤΟΥ GEL
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.
2. Αφαιρέστε το διηθητικό χαρτί και αφήστε το gel στη θέση του.
3. Κλείστε το καπάκι.
4. Αρχίστε τη διαδικασία πιέζοντας το «START».
ΣΤΕΓΝΩΜΑ - ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ
• Στέγνωµα στους 50 °C ελεγχόµενο µε το φαινόµενο Peltier, για 6 min.
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας ηλεκτροφόρησης. Η θερµοκρασία της πλάκας
παραµένει στους 50 °C µέχρι να ανοιχθεί το καπάκι. Το µήνυµα “Migration temp maintained” εµφανίζεται στην οθόνη.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει ασφαλισµένο κατά τη διάρκεια του στεγνώµατος.
VI. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΟΥ GEL
1. Ανοίξτε το καπάκι.
2. Αφαιρέστε το στεγνωµένο gel για περαιτέρω επεξεργασία.
3. Ανοίξτε τον στατήρα των gel. Τοποθετήστε το στεγνό gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) στις αύλακες και κλείστε τον
στατήρα. Βεβαιωθείτε ότι το film είναι σωστά τοποθετηµένο µέσα στον στατήρα (Εικ. 9).
4. Τοποθετήστε τον στατήρα στη Μονάδα Επεξεργασίας / Χρώσης των gel.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Πριν την έναρξη της επεξεργασίας / χρώσης των gel, ελέγξτε τα ακόλουθα:
- ο περιέκτης διαλύµατος έκπλυνσης περιέχει τουλάχιστον 400 mL διαλύµατος έκπλυνσης,
- ο περιέκτης χρώσης είναι γεµάτος µε 300 mL χρωστικού διαλύµατος,
- ο περιέκτης διαλύµατος αποχρωµατισµού περιέχει τουλάχιστον 1 λίτρο διαλύµατος αποχρωµατισµού,
- ο περιέκτης αχρήστων είναι κενός.
Για τη σύνδεση των γραµµών των αντιδραστηρίων: ανατρέξτε στις πληροφορίες που εµφανίζονται στην οθόνη του οργάνου
(επιλέξτε: REAGENT LINES).
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Μην ξεχνάτε να αποφράσσετε τις µη χρησιµοποιούµενες γραµµές.
5. Επιλέξτε το πρόγραµµα χρώσης «IF AMIDO» από το µενού του οργάνου και αρχίστε τη διαδικασία πατώντας το πλήκτρο «START»
(πράσινο βέλος στη δεξιά πλευρά του πληκτρολογίου).
Κατά τα στάδια χρώσης, αποχρωµατισµού και στεγνώµατος, η µονάδα παραµένει κλειδωµένη.
Μετά το στάδιο ψύξης, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας (ο αερισµός διατηρείται µέχρι την αφαίρεση του
στατήρα των gel).
ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ:
- Η θερµοκρασία της πλάκας της µονάδας ηλεκτροφόρησης µειώνεται από τη στιγµή που ανοίγει το καπάκι µέχρι να φτάσει τους 20 °C
(σε λιγότερο από 5 min). Τότε µπορεί να αρχίσει νέα ηλεκτροφόρηση.
- Επαναφέρετε το φορέα δειγµάτων και τους φορείς ηλεκτροδίων στη θέση τους.
- Σκουπίστε την πλάκα ελέγχου της θερµοκρασίας µε µαλακό υγρό πανάκι.
VII.ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΟΥ GEL
1. Αφαιρέστε τον στατήρα των gel από τη µονάδα, ανοίξτε τον και αφαιρέστε το στεγνό gel.
2. Αν χρειαστεί, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιφάνεια του στεγνού φιλµ µε υγρό χαρτί.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Τα µήκη των ηλεκτροφορηµάτων ενδέχεται να είναι ελαφρώς διαφορετικά στα gel µε 2 ή 3 σειρές ανάλυσης, χωρίς
δυσµενή επίδραση στην απόδοση.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ο Πενταδύναµος αντιορός ανιχνεύει:
• ανοσοσφαιρίνες G, A, M, αλυσίδες κ και λ,
• ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες κ και λ,
• ελαφρές αλυσίδες κ και λ συνδεδεµένες µε έψιλον ή δέλτα βαριές αλυσίδες.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
Ερµηνεία
Ένα φυσιολογικό δείγµα ορού παρουσιάζει µια ελαφριά διάχυτη χρώση των πολυκλωνικών ανοσοσφαιρινών (G, A, M, κάππα και λάµδα)
χωρίς διακριτές ζώνες.
Η υπεργαµµασφαιριναιµία χαρακτηρίζεται από έντονα χρωµατισµένη διάχυτη ζώνη γάµµα και απουσία περιορισµένων ζωνών.
Μια γαµµαπάθεια χαρακτηρίζεται από µια ή περισσότερες καλά αφοριζόµενες ζώνες.
Ειδικές περιπτώσεις
Μια ελαφριά µονοκλωνική γαµµαπάθεια µπορεί να κρύβεται σε ένα φυσιολογικό ηλεκτροφορητικό προφίλ (π.χ. δυσφαιριναιµία µε βήτα
κινητικότητα). Η ζώνη αυτή θα ανιχνευθεί µε τον πενταδύναµο αντιορό.
• Μια υπογαµµασφαιριναιµία µπορεί να σχετίζεται µε µονοκλωνική ελεύθερη ελαφριά αλυσίδα. Η πρωτεΐνη αυτή, λόγω του µοριακού της
βάρους, απεκκρίνεται από τους νεφρούς στα ούρα (πρωτεΐνη Bence Jones). Η παραµένουσα ποσότητα στον ορό είναι συνήθως πολύ
χαµηλή, αλλά µπορεί να ανιχνευθεί µε ανοσοκαθήλωση µε τον πενταδύναµο αντιορό.
• Όταν µια ζώνη µονοκλωνικού τύπου παρατηρείται στην ηλεκτροφόρηση του ορού (ίχνος ELP) αλλά δεν επιβεβαιώνεται µε την
ανοσοκαθήλωση, το ινοδωγόνο (δείγµα πλάσµατος) είναι ο πρώτος ύποπτος.
• Όταν παρατηρείται µονοκλωνική ζώνη σε όλα τα ίχνη, θα πρέπει να υποψιαστείτε κρυοσφαιρίνη ή πολυµερισµένη Ig M. Αποπολυµερίστε
και επαναλάβετε (Βλ. «∆είγµατα προς ανάλυση»).
Οποιοδήποτε µονοκλωνικό κλάσµα πρέπει να ταυτοποιείται µε περαιτέρω διερεύνηση στα:
• HYDRAGEL 1 IF SEBIA, PN 4301, HYDRAGEL 2 IF SEBIA, PN 4302, HYDRAGEL 4 IF SEBIA, PN 4304 ή 4308 ή HYDRAGEL 9 IF SEBIA,
PN 4309,
• HYDRAGEL 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4321, HYDRAGEL 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4322 ή HYDRAGEL 4 BENCE JONES SEBIA,
PN 4324.
Περιορισµοί
Η χρήση άλλων αντιορών από τους ειδικούς για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσµατα.
Λόγω των ορίων διακριτικής ικανότητας και ευαισθησίας της ηλεκτροφόρησης, είναι πιθανό κάποια µονοκλωνικά στοιχεία να µην
ανιχνεύονται µε αυτήν τη µέθοδο.
Ανατρέξτε στην ενότητα «Ευαισθησία».
Αντιµετώπιση προβληµάτων
Καλέστε την Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτουργεί παρόλο που οι οδηγίες προετοιµασίας και φύλαξης των
υλικών και οι οδηγίες λειτουργίας τηρούνται προσεκτικά.
Τα Φύλλα ∆εδοµένων Ασφαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληροφορίες για την ασφαλή απόρριψή τους διατίθενται επίσης από την
Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή.
∆Ε∆ΟΜΕΝΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ
Αναπαραγωγιµότητα στο ίδιο gel και ειδικότητα
Αναπαραγωγιµότητα στο ίδιο gel καταδείχθηκε σε τρία διαφορετικά παθολογικά δείγµατα : δύο δείγµατα µε ένα υψηλού επιπέδου
µονοκλωνικό κλάσµα και ένα δείγµα µε χαµηλού επιπέδου µονοκλωνικό κλάσµα.
Κάθε δείγµα έτρεξε 12 φορές σε 2 παρτίδες gel HYDRAGEL IF Penta 6/12 µε χρώση amidoblack.
Όλες οι επαναλήψεις απέδωσαν όµοια αποτελέσµατα µέσα στην ίδια παρτίδα και µεταξύ των παρτίδων και αναµενόµενα για τα δείγµατα
που αναλύθηκαν.
Η ανοσοκαθήλωση έδειξε µόνο ένα µονοκλωνικό κλάσµα στα τρία παθολογικά δείγµατα.
Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των gel και ειδικότητα
Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των gel καταδείχθηκε σε δώδεκα διαφορετικά παθολογικά δείγµατα µε ένα ή περισσότερα µονοκλωνικά
κλάσµατα.
Αυτά τα δείγµατα έτρεξαν σε 10 gel HYDRAGEL IF Penta 6/12 από 3 διαφορετικές παρτίδες, µε χρώση amidoblack.
Όλες οι επαναλήψεις απέδωσαν όµοια αποτελέσµατα από gel σε gel και αναµενόµενα για τα δείγµατα που αναλύθηκαν.
Ακρίβεια
Ογδόντα πέντε (85) διαφορετικά παθολογικά δείγµατα ορού και έντεκα (11) φυσιολογικά δείγµατα ορού αναλύθηκαν µε gel HYDRAGEL
12 IF Penta και µε άλλο παρόµοιο, εµπορικά διαθέσιµο σύστηµα ανοσοκαθήλωσης σε gel αγαρόζης.
Σε όλες τις περιπτώσεις, τα αποτελέσµατα των δύο διαδικασιών ανοσοκαθήλωσης ήταν σε πλήρη συµφωνία µεταξύ τους.
Ευαισθησία
Σειριακές αραιώσεις 3 παθολογικών δειγµάτων ορού µε µονοκλωνικά κλάσµατα αναλύθηκαν µε gel HYDRAGEL IF Penta 6/12.
Τα αποτελέσµατα συνοψίζονται παρακάτω.
Μονοκλωνικό κλάσµα Όριο ανίχνευσης (mg/dL) ∆είγµα Νο Τύπος Συγκ. (g/dL) HYDRAGEL 12 IF Penta 1 gamma, kappa 1.09 12 2 alfa, lambda 0.58 25
| 3 | mu, kappa | 0.34 | 12 |
Ανάλογα µε τη θέση κίνησης του µονοκλωνικού κλάσµατος στην ηλεκτροφόρηση και το επίπεδο του πολυκλωνικούυποβάθρου στη ζώνη
γάµµα, το όριο ανίχνευσης µπορεί να κυµαίνεται από 12 ως 25 mg/dL.
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
- 74 -

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
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SEBIA INSTRUKTION - Dansk

HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1 Figure 2
1 2 3 4 567 8 9 10 11 121314 15
Figure 3 Figure 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
sebia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 5
Repère couleurs
Colored Reference Guide
ELP G A M K L ELP
HYDRAGEL 9 IF
G A M K L ELP G A M K L
Barrette antisérums
Antisera Segment
Bossage (Boss)
Ergot (Pin)
Support barrette
Segment Holder
Poignée (Flap)
Encoche (notch)
Puits (wells)
Point d'appui central
(Central Pressure Point)
Ressorts (Springs)
Réducteur de course
Length Reducing Device
Guide du masque dynamique
Dynamic Mask Guide
Poignée (Flap)
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7
4
8
1
5
9
2
6
7
4
1
8
5
2
9
6
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 6 Figure 7
1
1
2
Figure 8 Figure 9
ELP G A M K L ELP
G A M K L ELP G A M K L
HYDRAGEL 9 IF
ELP G A M K L ELP
HYDRAGEL 9 IF
G A M K L ELP G A M K L
Figure 10 Figure 11
GEL 9 IF
A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L
DRAGEL 9 IF
G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L
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7
4
8
5
9
HYDRAGEL 6 & 12 IF Penta - 2005/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 12
DRAGEL 9 IF
G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L
ELP G A M K L ELP G A M K L
ELP G A M K L
Figure 13
HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30
sebia
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30
sebia
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
- 79 -

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