HYDRAGEL 6 IF Penta HYDRAGEL 12 IF Penta
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
Ref. 4841<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
Ref. 4842<br />
Ref. 4884*<br />
Masque standard / Standard mask<br />
2005/03
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
UTILISATION<br />
Les kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> et <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> permettent la détection de toute protéine monoclonale dans le sérum humain, par<br />
immunofixation sur gel d’agarose dans le système semi-automatique HYDRASYS. Le système HYDRASYS permet de réaliser toutes les séquences<br />
jusqu’à l’obtention du gel prêt pour l’interprétation. Les protéines sont séparées en tampon alcalin (pH 9,1) puis immunoprécipitées par un antisérum<br />
pentavalent anti-chaînes lourdes gamma (Ig G), alpha (Ig A), mu (Ig M), et anti-chaînes légères kappa et lambda (libres et liées). Après immunofixation,<br />
les protéines précipitées sont colorées par une solution d’amidoschwarz. L’excès de colorant est éliminé en milieu acide.<br />
Chaque gel d’agarose est prévu pour l’analyse de 6 échantillons pour le kit <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> et pour l’analyse de <strong>12</strong> échantillons pour le kit<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
À usage in vitro exclusivement.<br />
PRINCIPE DU TEST<br />
L’électrophorèse et l’immunofixation des protéines permettent de détecter les immunoglobulines mono- et oligoclonales, marqueurs des<br />
gammapathies. Celles-ci peuvent apparaître sous forme de bandes anormales de mobilité généralement gamma ou bêta, mais également alpha,<br />
éventuellement masquées en électrophorèse par les protéines habituelles de ces zones.<br />
L’immunofixation s’effectue grâce à un antisérum pentavalent.<br />
Elle se réalise en quatre étapes :<br />
1. Séparation électrophorétique des protéines en gel d’agarose.<br />
2. Fixation et immunoprécipitation des protéines séparées par électrophorèse : application du fixateur et de l’antisérum sur le gel, au niveau des<br />
pistes de migration. Le fixateur et l’antisérum diffusent dans le gel. Le fixateur précipite toutes les protéines et les anticorps précipitent les<br />
antigènes correspondants.<br />
3. Élimination des protéines non précipitées par pompage et lavage. Les protéines précipitées restent piégées dans le gel.<br />
4. Coloration des protéines et comparaison de la position des bandes immunoprécipitées avec celle des bandes anormales observées après<br />
électrophorèse des protéines.<br />
Pour détecter de façon précise la présence d’une bande monoclonale, l’échantillon est testé sur deux pistes. Après électrophorèse, la piste ELP sert<br />
de référence grâce à la précipitation de toutes les protéines présentes ; la piste immunologique <strong>Penta</strong> permet de détecter la bande monoclonale grâce<br />
à l’antisérum pentavalent.<br />
Cette technique simple et rapide donne une image claire et très facilement interprétable.<br />
RÉACT<strong>IF</strong>S FOURNIS DANS LES KITS <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> ET <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
COMPOSANTS RÉF. N° 4841 RÉF. N° 4842 RÉF. N° 4884* Gels d’agarose (prêts à l’emploi) 10 gels 10 gels 80 gels Mèches tamponnées (prêtes à l’emploi) 10 sachets de 2 10 sachets de 2 80 sachets de 2 Diluant colorant (solution concentrée) 1 fl. de 60 ml 1 fl. de 60 ml 8 fl. de 60 ml Colorant amidoschwarz (solution concentrée) 1 fl. de 20 ml 1 fl. de 20 ml 8 fl. de 20 ml Fixateur (prêt à l’emploi) 3 fl. de 14,4 ml Immunoglobulines totales de mammifère anti-Ig humaines (gamma-alpha-mu-kappa-lambda) = <strong>Penta</strong>valent (prêtes à l’emploi)<br />
3 fl. de 8,0 ml Applicateurs (prêts à l’emploi) 1 boîte de 10 2 boîtes de 10 16 boîtes de 10 Papiers-filtres fins 1 sachet de 10 1 sachet de 10 8 sachets de 10 Peignes de papier-filtre 1 sachet de 10 2 sachets de 10 16 sachets de 10<br />
| Papiers-filtres épais | 1 sachet de 10 | 1 sachet de 10 | 8 sachets de 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTE : Le fixateur et l’antisérum <strong>Penta</strong>valent sont commercialisés séparément sauf pour le MAXI-KIT (voir RÉACT<strong>IF</strong>S NÉCESSAIRES NON<br />
FOURNIS).<br />
POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS<br />
Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice.<br />
LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION.<br />
1. GELS D’AGAROSE<br />
Préparation<br />
Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/l ; tampon tris-barbital, pH 9,1 ± 0,1 ; composants sans danger aux<br />
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Les gels contiennent 0,31 % de barbital et 0,34 % de barbital sodé. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter<br />
immédiatement un médecin !<br />
Utilisation<br />
Support pour l’électrophorèse et l’immunofixation des protéines.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les gels peuvent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date<br />
d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur<br />
le devant du kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation<br />
brutale de température.<br />
NE PAS CONGELER.<br />
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NOTICE D’UTILISATION SEBIA - Français
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Éliminer le gel dans les cas suivants :<br />
(I) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ;<br />
(II) apparition de bactéries ou de moisissures ;<br />
(III) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation).<br />
2. MÈCHES TAMPONNÉES<br />
Préparation<br />
Les mèches en éponge tamponnées sont prêtes à l’emploi. Chaque mèche tamponnée contient : tampon tris-barbital, pH 9,1 ± 0,3 ; azoture de<br />
sodium ; composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Les mèches tamponnées contiennent 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sodé et 0,30 % d’azoture de sodium. Ne pas avaler !<br />
En cas d’ingestion, consulter immédiatement un médecin ! L’azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas<br />
de contact avec des acides, du plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des mèches, éviter tout contact avec ces produits.<br />
Utilisation<br />
Les mèches en éponge tamponnées jouent un rôle de réservoir de tampon pour l’électrophorèse et assurent le contact entre le gel et les électrodes.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les mèches tamponnées peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
Elles doivent être conservées horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur le devant du kit doit être pointée vers le haut).<br />
Elles sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet des mèches tamponnées. NE PAS CONGELER.<br />
Éliminer les mèches tamponnées si le sachet est ouvert ou si les mèches sont sèches.<br />
3. DILUANT COLORANT<br />
Préparation<br />
Le diluant colorant concentré doit être utilisé comme décrit dans le paragrahe " COLORANT AMIDOSCHWARZ ". Il contient une solution acide.<br />
Utilisation<br />
Pour la préparation du colorant amidoschwarz.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le<br />
kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant. NE PAS CONGELER.<br />
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.<br />
4. COLORANT AMIDOSCHWARZ<br />
Préparation<br />
Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la<br />
solution finale et son pouvoir de coloration.<br />
Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant :<br />
1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré.<br />
2. Refermer soigneusement le flacon.<br />
3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes.<br />
4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration.<br />
5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire.<br />
6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration.<br />
7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée.<br />
8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes.<br />
Le colorant est prêt à l’emploi.<br />
NOTE : Une reprise incomplète du colorant peut entraîner une mauvaise coloration de la fraction albumine (baisse du pourcentage ou trou blanc dans<br />
la fraction).<br />
Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux<br />
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion.<br />
Utilisation<br />
Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique des protéines.<br />
IMPORTANT : Le colorant est uniquement destiné à la coloration de 10 gels. Renouveler le colorant après 10 utilisations.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter<br />
l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant.<br />
La solution diluée est stable pendant 1 mois.<br />
Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur.<br />
5. FIXATEUR (Réf. N° 4884)<br />
Préparation<br />
Le fixateur est prêt à l’emploi. Il contient : une solution acide et des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des<br />
performances optimales.<br />
Il a une couleur jaune pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon.<br />
Utilisation<br />
Pour la fixation des protéines séparées par électrophorèse sur la piste référence (ELP).<br />
NOTE : Le fixateur est spécifique à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 6 et <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant<br />
après toute utilisation.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le fixateur peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette<br />
du flacon de fixateur.<br />
Il ne doit pas y avoir de précipité.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
6. ANTISÉRUM PENTAVALENT (Réf. N° 4884)<br />
Préparation<br />
L’antisérum <strong>Penta</strong>valent est prêt à l’emploi. Il contient des immunoglobulines totales de mammifère anti-Ig humaines. Il a une couleur jaune-orangée<br />
pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon.<br />
Lorsque l’antisérum présente un léger trouble ou précipité, il suffit généralement de mettre le flacon à température ambiante environ 10 minutes avant<br />
son utilisation. Si le trouble persiste, il ne perturbe en rien la réaction immunologique. Dans le cas de précipité insoluble, il est recommandé de<br />
centrifuger l’antisérum pendant 5 minutes à 3000 rpm.<br />
Utilisation<br />
Pour l’immunofixation des protéines séparées par électrophorèse.<br />
NOTE : L’antisérum <strong>Penta</strong>valent est spécifique à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 6 et <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Les antisérums peuvent être d’origines animales différentes. Il est donc impératif de ne pas mélanger deux flacons différents d’antisérums, y compris<br />
de la même spécificité, et de TOUJOURS changer l’embout de la pipette lors d’un changement de flacon.<br />
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant<br />
après toute utilisation.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
L’antisérum <strong>Penta</strong>valent doit être conservé au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette<br />
du flacon d’antisérum.<br />
NOTE : Durant le transport, l’antisérum peut rester à température ambiante (entre 15 et 30 °C) pendant 15 jours sans que cela n’affecte la qualité du<br />
test.<br />
7. APPLICATEURS<br />
Utilisation<br />
Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons.<br />
Conservation<br />
Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
8. PAPIERS-FILTRES FINS<br />
Utilisation<br />
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons.<br />
Conservation<br />
Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
9. PEIGNES PAPIER-FILTRE<br />
Utilisation<br />
Feuilles de papier-filtre prédécoupées, à usage unique pour l’absorption de l’excès de réactifs à la surface du gel après l’étape d’immunofixation.<br />
10. PAPIERS-FILTRES ÉPAIS<br />
Utilisation<br />
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption des protéines non précipitées du gel après l’étape d’immunofixation.<br />
Conservation<br />
Les papiers-filtres épais doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
RÉACT<strong>IF</strong>S NÉCESSAIRES NON FOURNIS<br />
1. FIXATEUR<br />
Préparation<br />
Le fixateur pour immunofixation (SEBIA, référence N° 4799, 1 flacon de 2,5 mL) est prêt à l’emploi. Il contient : une solution acide et des composants<br />
sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. Il est spécifique à la technique d’immunofixation réalisée<br />
avec les masques 6 et <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Il a une couleur jaune pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon.<br />
Utilisation, Conservation, stabilité et signes de détérioration : Voir paragraphe 5 précédent.<br />
2. ANTISÉRUM PENTAVALENT<br />
Le flacon d’antisérum <strong>Penta</strong>valent (SEBIA, référence N° 4616, 1 flacon de 1 mL ou référence N° 4738, 1 flacon de 8 mL) contient des<br />
immunoglobulines totales de mammifère anti-Ig humaines. Il est spécifique à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 6 et <strong>12</strong> <strong>IF</strong><br />
<strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Il a une couleur jaune-orangée pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon.<br />
Préparation, Utilisation, Conservation, stabilité et signes de détérioration : Voir paragraphe 6 précédent.<br />
3. DÉCOLORANT<br />
Préparation<br />
Chaque flacon de décolorant concentré (SEBIA, référence N° 4540, 10 flacons de 100 ml chacun) doit être dilué au 1/1 000 avec de l’eau distillée ou<br />
déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution décolorante.<br />
Prélever par quantité de 5 ml et compléter à 5 litres avec de l’eau distillée ou déminéralisée.<br />
Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/l.<br />
Utilisation<br />
Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant après coloration du gel.<br />
Pour le rinçage de la cuve de coloration après lavage.<br />
Pour neutraliser l’acidité du décolorant, mettre dans le flacon de vidange vide, 15 ml de soude à 50 % (solution du commerce).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou<br />
sur l’étiquette du flacon de décolorant.<br />
Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon fermé.<br />
Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.<br />
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.<br />
En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µl/l de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération microbienne.<br />
Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée<br />
sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant.<br />
4. SOLUTION DE LAVAGE HYDRASYS<br />
Préparation<br />
Chaque flacon de solution de lavage HYDRASYS concentrée (SEBIA, référence N° 4541, 10 flacons de 80 ml chacun) doit être complété à 5 litres<br />
avec de l’eau distillée ou déminéralisée.<br />
Après dilution, la solution de lavage contient : tampon alcalin, pH 8,8 ± 0,3 ; azoture de sodium.<br />
ATTENTION : La solution de lavage concentrée contient 0,625 % d'azoture de sodium. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter<br />
immédiatement un médecin ! L'azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de contact avec des acides, du<br />
plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité d’eau.<br />
Utilisations<br />
Pour le lavage du gel après immunofixation afin d’éliminer les protéines résiduelles non précipitées.<br />
Pour le lavage périodique de la cuve de coloration de l’HYDRASYS : par exemple, pour une utilisation journalière, effectuer un lavage hebdomadaire<br />
de la cuve de coloration.<br />
Voir la notice de la solution de lavage pour les instructions d’utilisation.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les solutions de lavage concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés. Elles sont stables<br />
jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de solution de lavage.<br />
Éliminer la solution de lavage diluée s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.<br />
5. FLUIDIL<br />
Préparation<br />
Le Fluidil (SEBIA, référence N° 4587, 1 flacon de 5 ml) est prêt à l’emploi.<br />
Utilisation<br />
Pour la dilution des échantillons visqueux ou troubles (turbidité induite par la présence d’une cryoglobuline ou d’un cryogel).<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le Fluidil peut être conservé à température ambiante. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette du flacon de Fluidil.<br />
Il ne doit pas y avoir de précipité.<br />
ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES<br />
1. Système HYDRASYS SEBIA, référence N° <strong>12</strong>10 ou N° <strong>12</strong>11.<br />
2. Micropipetteur, manuel ou automatique, tel que HYDRAplus SEBIA, référence N° <strong>12</strong>15, pour le chargement des applicateurs.<br />
3. Chambre humide, référence N° <strong>12</strong>70, fournie avec le système HYDRASYS.<br />
4. Bidons plastiques fournis avec le système HYDRASYS.<br />
5 Barre métallique du masque SEBIA, fournie avec le système HYDRASYS.<br />
6. Kit accessoires HYDRASYS <strong>IF</strong> SEBIA, référence N° <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipettes de 10 µl et 200 µl.<br />
ÉCHANTILLONS À ANALYSER<br />
Prélèvement et conservation des échantillons<br />
L’analyse se fait sur sérums frais. Les sérums doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques.<br />
Les sérums peuvent être conservés une semaine au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C).<br />
Pour des conservations prolongées, congeler les échantillons ; les échantillons congelés sont stables au minimum 1 mois. Les échantillons<br />
décongelés peuvent donner au point de dépôt, une trace due à la dénaturation de protéines ou de lipoprotéines.<br />
La conservation des sérums congelés est améliorée par addition à l’échantillon d’azoture de sodium 0,2 g/l.<br />
Préparation des échantillons<br />
Utiliser directement les échantillons de sérum non dilués.<br />
Après conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C) ou congélation, certains sérums (en particulier ceux qui contiennent une cryoglobuline ou un<br />
cryogel) deviennent visqueux ou troubles. Ces sérums présentent des difficultés de manipulation lors du dépôt avec l’applicateur HYDRASYS, car ils<br />
ne diffusent que très difficilement sur les dents de l’applicateur. Prétraiter ces sérums avec le Fluidil : ajouter 25 µl de Fluidil à 75 µl de sérum, agiter<br />
15 secondes au vortex, puis suivre la technique.<br />
Certaines paraprotéines sont polymérisées, le sérum présente alors une bande d'allure "monoclonale" au niveau du point de dépôt sur les deux pistes.<br />
Préparer une solution réductrice en ajoutant 1 % de ß-mercaptoéthanol (BME) dans le Fluidil (cette solution se conserve une semaine à température<br />
ambiante en microtube hermétiquement fermé). Prétraiter ces sérums par cette solution : ajouter 25 µl de solution réductrice à 75 µl de sérum pur,<br />
agiter au vortex et laisser en contact 15 minutes minimum (30 minutes maximum), puis suivre la technique.<br />
Échantillon à éviter<br />
Ne pas utiliser de plasma. Le fibrinogène donne une bande proche du point de dépôt. Cette bande peut fausser l’interprétation du test (confusion avec<br />
une gammapathie).<br />
Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
TECHNIQUE<br />
Le système HYDRASYS est un instrument multiparamétrique semi-automatique qui assure le traitement des <strong>HYDRAGEL</strong> selon les étapes suivantes :<br />
application des échantillons, migration électrophorétique, incubation avec les réactifs, séchage, lavage, coloration, décoloration et séchage final.<br />
Les étapes manuelles sont les suivantes : préparation des échantillons et des gels, dépôt des réactifs et lancement des séquences automatiques.<br />
LIRE ATTENTIVEMENT LE MANUEL D’INSTRUCTIONS D’HYDRASYS.<br />
I. PRÉPARATION DE LA MIGRATION<br />
1. Mettre HYDRASYS sous tension.<br />
2. Poser un applicateur pour l’analyse de 6 échantillons sur <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> ou deux applicateurs pour l’analyse de <strong>12</strong> échantillons,<br />
à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 1).<br />
- Déposer 10 µl d’échantillon pur dans chaque puits. Le chargement de chaque applicateur ne doit pas excéder 2 minutes.<br />
| PUITS DE DÉPÔT |<br />
ÉCHANTILLONS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
IMPORTANT : Ne pas utiliser les puits de l’applicateur numérotés 1, 8 et 15 ; il est recommandé de les identifier au préalable à l’aide d’un<br />
marqueur pour éviter d’y déposer l’échantillon par erreur.<br />
- Placer l’(es) applicateur(s) dans la chambre humide, dents vers le haut (en manipulant l’(es) applicateur(s) par la protection en plastique).<br />
Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation.<br />
- Laisser diffuser 5 minutes après le dépôt du dernier échantillon.<br />
Pour une conservation prolongée (8 heures maximum), placer la chambre humide au réfrigérateur.<br />
3. Ouvrir le capot du module de migration et relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.<br />
ATTENTION : Ne pas fermer le capot de l’appareil si les chariots sont relevés !<br />
4. Sélectionner le programme de migration «6/<strong>12</strong> PENTA MS/MD» dans le menu.<br />
5. Sortir les mèches tamponnées de leur emballage en les manipulant par les languettes plastiques.<br />
Fixer les mèches sur le chariot porte-électrodes à l'aide des languettes perforées. La face de la mèche fixée sur la languette vient en contact<br />
avec l'électrode (Fig. 2).<br />
6. Sortir le gel de son emballage.<br />
- Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin.<br />
ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation.<br />
- Déposer 200 µl d'eau distillée ou déminéralisée sur le plateau de migration dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.<br />
- Placer le gel (face gel orientée vers le haut) sur le plateau contre la barrette, à l'intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 3).<br />
- Donner une forme concave au gel (Fig. 3) et le dérouler sur le plateau jusqu'au contact de la goutte d'eau qui doit se répartir sur toute la<br />
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d'air éventuellement piégées puis dérouler totalement le gel au contact du<br />
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.<br />
7. Abaisser l'ensemble des chariots jusqu'en butée. Dans cette position, les mèches tamponnées ne touchent pas le gel. NE PAS FORCER LA<br />
DESCENTE DES CHARIOTS.<br />
8. Sortir l’(es) applicateur(s) de la chambre humide en le(s) manipulant par la protection plastique.<br />
- Éliminer la protection des dents.<br />
- Pour l’analyse de 6 échantillons sur <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>, placer l'applicateur en position N° 6 sur le porte-applicateurs.<br />
- Pour l’analyse de <strong>12</strong> échantillons, placer les applicateurs en positions N° 3 et N° 9.<br />
Pour une parfaite reproductibilité de la zone de dépôt, amener les applicateurs en butée sur le porte-applicateurs, par exemple du côté gauche.<br />
IMPORTANT : Les numérotations de l'applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4).<br />
9. Fermer le capot du module de migration.<br />
10. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
IMPORTANT : Ne rien placer à proximité immédiate de la grille de ventilation (à droite de l’appareil).<br />
MIGRATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Descente des chariots porte-électrodes et porte-applicateurs pour amener les mèches tamponnées et l’(es) applicateur(s) au contact du gel.<br />
• Remontée du chariot porte-applicateurs.<br />
• Migration à 20 W constants, à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, jusqu’à 42 Vh accumulés (pendant environ 9 minutes).<br />
• Déconnexion des électrodes par remontée du chariot porte-électrodes.<br />
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque.<br />
A l’écran, s’affiche le message : « AS».<br />
NOTE : Pendant toutes les séquences de migration, le capot du module de migration reste verrouillé.<br />
II. IMMUNOFIXATION<br />
1. Ouvrir le capot du module de migration.<br />
2. Retirer l’(es) applicateur(s) et le(s) jeter.<br />
3. Relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes, retirer les mèches par les languettes et les jeter.<br />
- Retirer les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.<br />
- Nettoyer les électrodes avec un papier ouaté humide.<br />
- Laisser le gel en place dans le module de migration.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. Mettre en place le masque de dépôt des réactifs en procédant comme suit (Fig. 5) :<br />
- fixer la tige destinée à l'accrochage du masque d'incubation, à l'aide des plots de fixation. (Une fois mise en place, cette tige peut être laissée<br />
sur l'HYDRASYS) ;<br />
- placer les encoches du masque dans les repères de la tige en tenant le masque par la poignée :<br />
- faire pivoter le masque pour l'appliquer sur le gel.<br />
5. Déposer les réactifs en procédant comme suit :<br />
| PISTE | VOLUME | DÉSIGNATION | COULEUR |<br />
| ELP | 35 µl | solution de fixation | jaune |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µl | antisérum pentavalent | jaune-orangé |<br />
NOTE : Pour éviter les inversions, les réactifs sont colorés et la couleur de la piste à remplir est rappelée sur le masque de dépôt des réactifs.<br />
- Lors du prélèvement des réactifs, ne pas piéger de bulles d'air dans l'embout de la pipette.<br />
- Pour déposer les réactifs (Fig. 6) :<br />
- tenir la pipette verticalement et appliquer légèrement l'embout au fond de l'orifice ;<br />
- injecter très progressivement les réactifs.<br />
6. Fermer le capot du module de migration.<br />
7. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
À l'écran, s'affiche le message : «[INCUBATION]».<br />
IMMUNOFIXATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Incubation à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 5 minutes.<br />
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque.<br />
À l'écran, s'affiche le message : «❊ AS (MS)».<br />
NOTE : Pendant la séquence d'incubation, le capot du module de migration reste verrouillé.<br />
III. ÉLIMINATION DES RÉACT<strong>IF</strong>S<br />
1. Ouvrir le capot du module de migration.<br />
2. Éliminer les réactifs à l'aide des peignes de papier-filtre (Fig. 7) : Un peigne pour le masque <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> et deux peignes pour le<br />
masque <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
- Présenter le(s) peigne(s) à 30 ° (par rapport à l’horizontale) et l’(es) introduire dans la(es) fente(s) pratiquée(s) dans la partie inférieure des<br />
pistes d’incubation, selon le plan incliné de celle(s)-ci ;<br />
- faire glisser très délicatement les dents du peigne de papier-filtre, le long de la paroi verticale opposée de la fente ; les dents viennent en<br />
contact avec les réactifs et les absorbent par capillarité ; si le liquide ne progresse pas, incliner davantage le peigne de papier-filtre en faisant<br />
levier sur son sommet pour amener les dents en contact avec le liquide (Fig. 8).<br />
IMPORTANT : Le peigne de papier-filtre doit rester incliné à environ 45 ° et ne doit pas pénétrer dans le gel.<br />
3. Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
ÉLIMINATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Pompage à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 15 secondes.<br />
• Un signal sonore (bip) retentit.<br />
À l'écran, s'affiche le message : « PAP.».<br />
IV. POMPAGE DU GEL<br />
1. Retirer les peignes de papier-filtre.<br />
2. Contrôler la bonne absorption des différents réactifs :<br />
- absence de réactifs sur le gel ;<br />
- toutes les dents des peignes sont colorées sur toute leur hauteur.<br />
Si l'absorption est insuffisante, introduire à nouveau le même peigne (dans le même sens) et renouveler manuellement l'opération.<br />
3. Retirer le masque de dépôt des réactifs en le tenant par la poignée. Le faire pivoter autour de la tige et le décrocher.<br />
4. Appliquer une feuille de papier-filtre épais sur le gel :<br />
- incliner la feuille de papier-filtre épais d'environ 45 ° et aligner le bord inférieur de la feuille de papier-filtre sur la barrette de positionnement<br />
du gel ;<br />
- faire pivoter la feuille de papier-filtre et l'appliquer sur le gel.<br />
ATTENTION : Bien appuyer sur toute la surface de la feuille de papier-filtre pour assurer un contact parfait entre le gel et le papier.<br />
5. Fermer le capot du module de migration.<br />
6. Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
7. Laver le masque sous l'eau courante avec une petite brosse souple (type brosse à dent). NE PAS UTILISER D'ALCOOL NI TOUT AUTRE<br />
SOLVANT.<br />
Pour l'utilisation suivante, le masque doit être parfaitement sec. Pour éliminer les gouttes d'eau pouvant être piégées dans les puits, tapoter<br />
le masque sur un papier ouaté et l'essuyer.<br />
POMPAGE DU GEL - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Pompage à 40 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 3 minutes.<br />
• Un signal sonore (bip) retentit.<br />
À l'écran, s'affiche le message : «❊ PAP.».<br />
V. SÉCHAGE DU GEL<br />
1. Ouvrir le capot du module de migration.<br />
2. Retirer le papier-filtre en laissant le film en place.<br />
3. Fermer le capot du module de migration.<br />
4. Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
SÉCHAGE - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Séchage à 50 °C, température contrôlée par effet Peltier, pendant 6 minutes.<br />
• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque. Le plateau reste à 50 °C jusqu'à l'ouverture du capot.<br />
NOTE : Pendant toute la séquence de séchage, le capot du module de migration reste verrouillé.<br />
VI. PRÉPARATION DES SÉQUENCES DE LAVAGE, COLORATION ET DÉCOLORATION DU GEL<br />
1. Ouvrir le capot du module de migration.<br />
2. Récupérer le film pour les séquences suivantes.<br />
3. Placer le film sur le porte-film, face gel vers l'opérateur, en procédant comme suit (Fig. 9) :<br />
- ouvrir le porte-film ;<br />
- le poser à plat sur la paillasse ;<br />
- positionner le gel dans les gorges des colonnettes ;<br />
- refermer le porte-film ;<br />
- s'assurer que le film soit bien enfoncé dans les gorges des deux colonnettes.<br />
4. Introduire le porte-film dans le module de traitement / coloration du gel.<br />
IMPORTANT : Avant de lancer un cycle de coloration, s'assurer que :<br />
- le flacon de solution de lavage contienne 400 ml de solution de lavage ;<br />
- le flacon de colorant contienne 300 ml de colorant ;<br />
- le flacon de décolorant contienne 1 litre de décolorant minimum ;<br />
- le flacon de vidange soit vide.<br />
Pour le branchement des canaux réactifs : se référer aux instructions affichées sur l’écran de l’appareil (sélectionner la touche : VISU<br />
CANAUX).<br />
IMPORTANT : Ne pas oublier d’obturer les canaux non utilisés.<br />
5. Sélectionner le programme de coloration «<strong>IF</strong> AMIDO» dans le menu.<br />
- Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à droite du clavier).<br />
Pendant toutes les séquences de coloration, décoloration et séchage, le système reste verrouillé.<br />
Après refroidissement de la cuve, un signal sonore (bip) retentit et le système se débloque (la ventilation se maintient jusqu’à la récupération<br />
du porte-film).<br />
NOTES :<br />
- La température du plateau continue à descendre et atteint 20 °C en 5 minutes environ. À 20 °C, une nouvelle séquence de migration peut être<br />
lancée.<br />
- Remettre les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.<br />
- Nettoyer le plateau avec un papier ouaté humide.<br />
VII.FIN DU TRAITEMENT DU GEL<br />
1. Sortir le porte-film du compartiment ; ouvrir le porte-film et retirer le gel sec.<br />
2. Si nécessaire, nettoyer le dos du gel (support plastique) avec un papier ouaté humide.<br />
NOTE : Pour les gels à rangées multiples (2 ou 3), les longueurs de migration peuvent être sensiblement différentes, sans aucune conséquence<br />
sur les résultats.<br />
RÉSULTATS<br />
L’antisérum pentavalent permet la détection des :<br />
• immunoglobulines : Ig A (K ou L), Ig G (K ou L), Ig M (K ou L) ;<br />
• chaînes légères libres kappa ou lambda ;<br />
• immunoglobulines : Ig D (K ou L), Ig E (K ou L), qui sont détectées par leurs chaînes légères kappa ou lambda.<br />
Interprétation<br />
Un échantillon normal présente une zone diffuse peu colorée, sans bande focalisée, correspondant aux immunoglobulines polyclonales G, A, M, K et L.<br />
Une hypergammaglobulinémie entraîne une zone diffuse beaucoup plus colorée mais sans fraction monoclonale.<br />
La présence d’une gammapathie est caractérisée par une ou plusieurs bandes monoclonales révélées par l’antisérum pentavalent.<br />
Cas particuliers<br />
• Une discrète gammapathie monoclonale (par exemple, une dysglobuline de mobilité bêta) peut être cachée dans un profil électrophorétique normal.<br />
Cette fraction peut être détectée par l’antisérum pentavalent.<br />
• Une hypogammaglobulinémie peut être associée à une chaîne légère libre monoclonale à la limite de détection qui, vu son faible poids moléculaire,<br />
est éliminée dans les urines sous forme de protéine de Bence Jones. La quantité résiduelle dans le sérum est très faible, mais l’antisérum<br />
pentavalent, par sa réaction d’amplification, permet sa détection.<br />
• Une bande d’allure monoclonale observée à l’électrophorèse mais non retrouvée sur la piste immunoprécipitée peut indiquer la présence de<br />
fibrinogène.<br />
• Une précipitation sur les deux pistes, au niveau du point de dépôt, peut indiquer la présence d’une Ig M polymérisée ou d’une cryoglobuline qu’il<br />
conviendra d’identifier après traitement réducteur (voir " Échantillons à analyser ").<br />
Toute bande monoclonale détectée par l’antisérum <strong>Penta</strong>valent nécessite obligatoirement une identification à l’aide des kits <strong>HYDRAGEL</strong><br />
d'immunofixation Masque standard :<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> (SEBIA, réf. N° 4801), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> (SEBIA, réf. N° 4802), <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> (SEBIA, réf. N° 4804 ou 4808) ou <strong>HYDRAGEL</strong><br />
9 <strong>IF</strong> (SEBIA, réf. N° 4809),<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES (SEBIA, réf. N° 4821), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES (SEBIA, réf. N° 4822) ou <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES<br />
(SEBIA, réf. N° 4824).<br />
- 7 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Interférences et limites<br />
L’utilisation d’antisérums autres que ceux spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec le masque standard peut affecter la qualité des<br />
résultats.<br />
Compte-tenu des principes analytiques des techniques actuelles (principes de l’électrophorèse de zone, résolution et sensibilité), aucune garantie ne<br />
peut être donnée quant à la détection totale de toutes les composantes monoclonales.<br />
Assistance technique<br />
Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux.<br />
Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès<br />
du Service Technique SEBIA.<br />
PERFORMANCES<br />
Reproductibilité et spécificité<br />
La reproductibilité a été testée sur deux sérums pathologiques avec une protéine monoclonale à faible et à forte concentration respectivement, un<br />
sérum avec une zone alpha 1 - alpha 2 élevée et un sérum normal. Chaque échantillon a été testé sur trois lots de gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>.<br />
Les résultats ont été identiques et typiques pour les quatre sérums sur les trois lots : l’immunofixation n’a pas mis en évidence de bande monoclonale<br />
pour le sérum présentant un profil inflammatoire et le sérum normal.<br />
Exactitude<br />
Trente sérums dont 29 pathologiques et un normal ont été testés sur <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> et un autre système d’immunofixation<br />
disponible sur le marché. Les échantillons pathologiques ont présenté les mêmes bandes anormales avec les trois systèmes.<br />
Sensibilité<br />
Trois sérums à gammapathies sont dilués en série. Les résultats sont résumés ci-dessous.<br />
BANDE MONOCLONALE LIMITE DE DÉTECTION (g/l) ÉCHANTILLON N° TYPE CONC. (g/l) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> TEST COMPARAT<strong>IF</strong> 1 gamma, kappa 18 0,25 0,25 2 alpha, lambda 7,3 0,<strong>12</strong> 0,5<br />
| 3 | mu, kappa | 9 | 0,5 | 0,5 |<br />
BIBLIOGRAPHIE<br />
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir :<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
- 8 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
INTENDED USE<br />
The <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> and <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kits are designed for the detection of monoclonal proteins in human serum by immunofixation<br />
electrophoresis on alkaline buffered (pH 9.1) agarose gels. They are used in conjunction with the semi-automated HYDRASYS system to perform all<br />
the steps needed to obtain gels ready for interpretation. Serum proteins are electrophoresed and immunofixed by a pentavalent antiserum anti-gamma<br />
(Ig G), alpha (Ig A) and mu (Ig M) heavy chains, and anti-kappa and lambda (free and bound) light chains. After immunofixation, the precipitated<br />
proteins are stained with amidoblack. The excess of stain is removed with an acidic solution.<br />
Each agarose gel in the <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> and <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kits is intended to run six or twelve samples, respectively.<br />
For In Vitro Diagnostic Use.<br />
PRINCIPLE OF THE TEST<br />
Abnormal bands in the electrophoretic pattern of serum proteins, generally with a gamma-mobility, but also alpha- and beta-mobility (these might be<br />
hidden by regular proteins of the corresponding zones), are always suspect of being monoclonal proteins and therefore an indication of gammopathies.<br />
To identify these abnormal bands, the technique of immunofixation is applied.<br />
Immunofixation electrophoresis is a simple technique that allows a protein to be anchored in situ after electrophoresis, by forming an insoluble complex<br />
with its antibody. It is performed in four stages:<br />
1. Separation of proteins by electrophoresis on agarose gel.<br />
2. Fixation and immunoprecipitation of the electrophoresed proteins: fixative solution and antiserum are overlaid directly onto the gel surface over<br />
the appropriate electrophoretic migration tracks. The fixative solution and antiserum diffuse into the gel, precipitating all the proteins and the<br />
corresponding antigens, respectively.<br />
3. The unprecipitated, soluble proteins are removed from the gel by blotting and washing. Precipitin of the antigen-antibody complex is trapped within<br />
the gel matrix.<br />
4. The precipitated proteins are visualized by staining. The immunoprecipitated bands are then compared with the corresponding abnormal bands<br />
seen in the electrophoretic pattern of serum sample.<br />
To detect the suspect monoclonal component(s), the samples are simultaneously electrophoresed in two tracks. After electrophoresis, the ELP track<br />
serves as a reference showing electrophoretic pattern of the sample’s proteins. The immunofixation (<strong>Penta</strong>) track reveals monoclonal components that<br />
reacted with the pentavalent antiserum.<br />
This simple and fast technique gives a clear and easily interpretable picture.<br />
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> AND <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> KITS<br />
ITEMS PN 4841 PN 4842 PN 4884* Agarose Gels (ready to use) 10 gels 10 gels 80 gels Buffered Strips (ready to use) 10 packs of 2 each 10 packs of 2 each 80 packs of 2 each Staining solution diluent (stock solution) 1 vial, 60 mL 1 vial, 60 mL 8 vials, 60 mL Amidoblack Stain (stock solution) 1 vial, 20 mL 1 vial, 20 mL 8 vials, 20 mL Fixative Solution (ready to use) 3 vials, 14.4 mL Mammalian anti-Ig human immunoglobulins (gamma - alpha - mu - kappa - lambda) : pentavalent antiserum (ready to use)<br />
3 vials, 8.0 mL Applicators (ready to use) 1 pack of 10 2 packs of 10 each 16 packs of 10 each Filter Papers-Thin 1 pack of 10 1 pack of 10 8 packs of 10 each Paper combs 1 pack of 10 2 packs of 10 each 16 packs of 10 each<br />
| Filter Papers-Thick | 1 pack of 10 | 1 pack of 10 | 8 packs of 10 each |<br />
*<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTE : The fixative solution and the <strong>Penta</strong>valent antiserum are supplied separately from the kits except for MAXI-KIT (See REAGENTS REQUIRED<br />
BUT NOT SUPPLIED).<br />
FOR OPTIMAL RESULTS<br />
All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions.<br />
PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY.<br />
1. AGAROSE GELS<br />
Preparation<br />
Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations<br />
used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: Agarose gels contain 0.31 % barbital and 0.34 % sodium barbital. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately !<br />
Use<br />
Support medium for protein electrophoresis and immunofixation.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). They are stable until the<br />
expiration date indicated on the kit package and the gel package labels. (The arrow on the front of the kit box must be pointing upwards). Avoid storage<br />
close to a window or to a heat source. Avoid important variation of temperature during storage.<br />
DO NOT FREEZE.<br />
Discard when:<br />
(i) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel),<br />
(ii) bacterial or mold growth is indicated,<br />
(iii) abnormal liquid quantity is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions).<br />
- 9 -<br />
SEBIA INSTRUCTIONS - English
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
2. BUFFERED STRIPS<br />
Preparation<br />
Buffered sponge strips are ready to use. Each contains: tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.3 ; sodium azide ; additives, nonhazardous at concentrations<br />
used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: The buffer in the strips contains 0.92 % barbital, 1.03 % sodium barbital and 0.30 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested<br />
consult physician immediately ! When disposing, prevent contact with acids, lead or copper, as these are known to form explosive or toxic<br />
compounds with sodium azide.<br />
Use<br />
Buffered sponge strips function as electrophoresis buffer reservoir and ensure contact between the gel and electrodes.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the buffered strips horizontally in the original protective packaging at room temperature or refrigerated. (The arrow on the front of the kit box<br />
must be pointing upwards).<br />
They are stable until the expiration date indicated on the kit package or buffered strips package label.<br />
DO NOT FREEZE.<br />
Discard buffered strips if the package is opened and the strips dry out.<br />
3. STAINING SOLUTION DILUENT<br />
Preparation<br />
The stock staining solution diluent must be used as described in paragraph " AMIDOBLACK STAIN ".<br />
It contains an acidic solution.<br />
Use<br />
For the preparation of the amidoblack staining solution.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining<br />
solution diluent vial labels. DO NOT FREEZE.<br />
Do not add any sodium azide.<br />
4. AMIDOBLACK STAIN<br />
Preparation<br />
The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in<br />
viscosity or solidification.<br />
In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure:<br />
1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial.<br />
2. Close carefully the vial.<br />
3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds.<br />
4. Pour this solution in the container for staining solution processing.<br />
5. Repeat this step twice, three times if necessary.<br />
6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water.<br />
7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes.<br />
The staining solution is ready to use.<br />
NOTE : An incomplete reconstitution of the stain will lead to an under-evaluation of albumin fraction (low percentage or white hole inside the fraction).<br />
After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at<br />
concentrations used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: Harmful if swallowed.<br />
Use<br />
For staining gels with electrophoretic protein separations.<br />
IMPORTANT : The staining solution is designed to stain only 10 gels. Change the solution after 10 staining steps.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution<br />
is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels.<br />
Working staining solution is stable for 1 month.<br />
Do not store the working staining solution close to a heat source.<br />
5. FIXATIVE SOLUTION (with PN 4884)<br />
Preparation<br />
Fixative solution is ready to use. It contains: acidic solution ; additives, nonhazardous at concentrations used, necessary for optimum performance.<br />
For easy identification and as an aid in monitoring its application, the fixative is colored with a nonhazardous yellow dye that matches the color of the<br />
vial label.<br />
Use<br />
To fix electrophoresed proteins in the reference track (ELP).<br />
NOTE : The fixative solution is specific for the immunofixation procedure with the 6 and <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> masks.<br />
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the fixative at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or fixative solution vial labels.<br />
Fixative must be free of precipitate.<br />
6. PENTAVALENT ANTISERUM (with PN 4884)<br />
Preparation<br />
<strong>Penta</strong>valent antiserum is ready to use. <strong>Penta</strong>valent antiserum is a mixture of mammalian total anti-Ig human immunoglobulins. For easy identification<br />
and as an aid in monitoring its application, the antiserum is colored with a nonhazardous yellow-orange dye that matches the color of the vial label.<br />
When antiserum exhibits a slight turbidity, leave the antiserum vial at room temperature for a minimum of 10 minutes. This should be sufficient to clear<br />
the solution ; however, if turbidity remains, this should not affect in any way the immunological reaction. In case of insoluble precipitates, it is<br />
recommended to centrifuge antiserum for 5 minutes at 3000 rpm.<br />
- 10 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Use<br />
For immunofixation of the electrophoresed proteins.<br />
NOTE : The <strong>Penta</strong>valent antiserum is specific for the immunofixation procedure with the 6 and <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> masks.<br />
Antisera may originate from different animal species. Don’t mix two different antisera vials, even with the same specificity, and ALWAYS change the<br />
tip of the pipette when changing antiserum vials.<br />
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the <strong>Penta</strong>valent antiserum refrigerated (2 to 8 °C). It is stable until the expiration date indicated on the kit package or antiserum vial labels.<br />
NOTE: During transportation, the antiserum can be kept without refrigeration (15 to 30 °C) for 15 days without any adverse effects on performance.<br />
7. APPLICATORS<br />
Use<br />
Precut, single use applicators for sample application.<br />
Storage<br />
Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated.<br />
8. FILTER PAPERS - THIN<br />
Use<br />
Single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application.<br />
Storage<br />
Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.<br />
9. FILTER PAPER COMBS<br />
Use<br />
Precut, single use, thick absorbent paper combs for blotting excess of fixative solution and antiserum off the gel surface after immunofixation step.<br />
10. FILTER PAPERS - THICK<br />
Use<br />
Single use, thick absorbent paper pads for blotting unprecipitated proteins off the gel after immunofixation step.<br />
Storage<br />
Store the thick filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.<br />
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED<br />
1. FIXATIVE SOLUTION<br />
Preparation<br />
Fixative solution for immunofixation (SEBIA, PN 4799, 1 vial, 2.5 mL) is ready to use. It contains: acidic solution ; additives, nonhazardous at<br />
concentrations used, necessary for optimum performance. The fixative solution is specific for the immunofixation procedure with the 6 and <strong>12</strong> <strong>IF</strong><br />
<strong>Penta</strong> masks, SEBIA.<br />
For an easy identification and as an aid in monitoring its application, the fixative is colored with a non hazardous yellow dye that matches the color of<br />
the vial label.<br />
Use, Storage, stability and signs of deterioration : See previous paragraph 5.<br />
2. PENTAVALENT ANTISERUM<br />
The <strong>Penta</strong>valent antiserum vial (SEBIA, PN 4616, 1 mL or PN 4738, 8 mL), contains a mixture of mammalian total anti-Ig human immunoglobulins. It<br />
is specific for the immunofixation procedure with the 6 and <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> masks, SEBIA.<br />
For easy identification and as an aid in monitoring its application, the antiserum is colored with a nonhazardous yellow-orange dye that matches the<br />
color of the vial label.<br />
Preparation, Use, Storage, stability and signs of deterioration : See previous paragraph 6.<br />
3. DESTAINING SOLUTION<br />
Preparation<br />
Each vial of stock Destaining Solution (SEBIA, PN 4540, 10 vials, 100 mL each) to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is<br />
convenient to dilute only 5 mL of the stock solution to 5 liters, the volume of the destaining solution container. After dilution, the working destaining<br />
solution contains: citric acid, 0.05 g/dL.<br />
Use<br />
For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels.<br />
For rinsing of the staining compartment after wash step.<br />
To neutralize the acidity of the destaining solution, pour 15 mL of a 50 % solution of sodium hydroxide into the empty waste container.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining<br />
solution vial labels. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. Do not add any sodium azide.<br />
Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.<br />
To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µL/dL of ProClin 300.<br />
Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on the<br />
kit package or destaining solution vial labels.<br />
- 11 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. HYDRASYS WASH SOLUTION<br />
Preparation<br />
Each vial of the stock HYDRASYS Wash Solution (SEBIA, PN 4541, 10 vials, 80 mL each) to be diluted up to 5 liters with distilled or deionized water.<br />
After dilution, the working wash solution contains: alkaline buffer pH 8.8 ± 0.3 ; sodium azide.<br />
WARNING: The stock wash solution contains 0.625 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately ! Sodium<br />
azide may lead to formation of explosive or toxic compounds when in contact with acids, lead or copper. Always flush with a large quantity<br />
of water when disposing.<br />
Use<br />
The HYDRASYS wash solution is designed to wash unprecipitated proteins from gels. It also serves for cleaning of the HYDRASYS Staining<br />
Compartment. Use periodically, e.g., if the instrument is used daily, wash the staining compartment weekly.<br />
See the package insert for directions to use.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock and working wash solutions in closed containers at room temperature or refrigerated. They are stable until the expiration date indicated<br />
on the wash solution vial label.<br />
Discard working wash solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.<br />
5. FLUIDIL<br />
Preparation<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 mL) is ready to use.<br />
Use<br />
To dilute viscous or turbid samples, e.g., sera containing cryoglobulin or cryogel.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store at room temperature. It is stable until the expiration date indicated on the Fluidil vial label.<br />
Fluidil must be free of precipitate.<br />
EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN <strong>12</strong>10 or PN <strong>12</strong>11.<br />
2. Micropipettor, either manual or automated, such as HYDRAplus SEBIA, PN <strong>12</strong>15, for an alternative way of loading the sample applicators.<br />
3. Wet Storage Chamber, PN <strong>12</strong>70, supplied with HYDRASYS.<br />
4. Container Kit supplied with HYDRASYS.<br />
5 Template guide Bar SEBIA, supplied with HYDRASYS.<br />
6. Accessory Kit for HYDRASYS <strong>IF</strong>, SEBIA, PN <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipettes: 10 µL and 200 µL.<br />
SAMPLES FOR ANALYSIS<br />
Sample collection and storage<br />
Fresh serum samples are recommended for analysis. Sera must be collected according to established procedures used in clinical laboratory testing.<br />
If needed, store sera at 2 to 8 °C for up to one week.<br />
For longer storage periods, freeze the samples. Frozen samples are stable for at least one month.<br />
Thawed samples may give slight application marks due to protein or lipoprotein denaturation.<br />
Frozen serum samples with sodium azide, 0,02 g/dL improves the storage stability.<br />
Sample preparation<br />
Use undiluted serum samples.<br />
After storage at 2 to 8 °C or freezing, some sera (particularly those containing a cryoglobulin or cryogel) may become viscous or develop turbidity.<br />
Such sera might present application problems due to hindered diffusion through the sample applicator teeth. In such case add 25 µL Fluidil to 75 µL<br />
of serum and vortex for 15 seconds. Then follow the standard procedure.<br />
Some monoclonal proteins can polymerize resulting in a "monoclonal fraction" appearing on all immunofixed tracks. In this case (i) prepare 1 % betamercaptoethanol<br />
(BME, or 2-mercaptoethanol, 2ME) in Fluidil, (ii) add 25 µL of this reducing solution to 75 µL neat serum, (iii) vortex and wait at least<br />
15 minutes minimum (maximum 30 minutes) and then follow the standard procedure.<br />
Sample to avoid<br />
Avoid plasma samples: fibrinogen gives a band in the reference track close to the application point that might be taken for a monoclonal<br />
immunoglobulin.<br />
Avoid hemolyzed samples.<br />
PROCEDURE<br />
The HYDRASYS system is a semi-automated multi-parameter instrument. The automated steps include processing of <strong>HYDRAGEL</strong> agarose gels in<br />
the following sequence: sample application, electrophoretic migration, incubation with fixative solution and antiserum, drying, staining, destaining and<br />
final drying. The manual steps include handling samples and gels, application of fixative and antiserum and setting up the instrument for operation.<br />
READ CAREFULLY HYDRASYS INSTRUCTION MANUAL.<br />
I. MIGRATION SET UP<br />
1. Switch on HYDRASYS instrument.<br />
2. Place one applicator for 6 samples analysis on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> or two applicators for <strong>12</strong> samples analysis, on a flat surface with<br />
the well numbers in the right-side-up position (Fig. 1).<br />
- Apply 10 µL neat sample in each well. Load each applicator within 2 minutes.<br />
- <strong>12</strong> -
| WELLS |<br />
SAMPLES ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
NOTE: The wells no. 1, 8 and 15 are not used in this test ; they may be marked with a fiber tip pen to avoid filling them with samples by mistake.<br />
- Place each applicator into the wet storage chamber with the teeth up [handle it by the plastic tooth protection frame].<br />
See wet chamber package insert for further details.<br />
- Let the samples diffuse into the teeth for 5 minutes after the last sample application. For later use (up to 8 hours), keep the entire chamber<br />
under refrigeration.<br />
3. Open the lid of the Migration Module and raise the electrode and applicator carriers.<br />
WARNING: Never close the lid while the carriers are raised !<br />
4. Select «6/<strong>12</strong> PENTA SM/DM» migration program from the instrument menu (left side of the keyboard).<br />
5. Remove buffered strips from the package ; handle them by the plastic ends. Engage the punched ends of the strip's plastic backing to the pins<br />
on the electrode carrier ; the strip's plastic backing must face the carrier (Fig. 2).<br />
6. Unpack the <strong>HYDRAGEL</strong> plate.<br />
- Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately.<br />
WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration.<br />
- Pool 200 µL of distilled or deionized water on the lower third of the frame printed on the Temperature Control Plate of the migration module.<br />
- Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 3).<br />
- Bend the gel and ease it down onto the water pool (Fig. 3). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire<br />
gel plate and the gel is lined up with the printed frame.<br />
7. Lower both carriers down. In this position the buffered strips do not touch the gel. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY DOWN.<br />
8. Remove each applicator from the wet chamber. Handle it by the protection frame.<br />
- Snap off the applicator teeth's protection frame.<br />
- For 6 samples analysis on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>, place the applicator into position No 6 on the carrier.<br />
- For <strong>12</strong> samples analysis, place the two applicators each into position No 3 and 9.<br />
To improve reproducibility of sample application, always position the applicators on the left side of the carrier.<br />
IMPORTANT: The numbers printed on the applicator must face the operator (Fig. 4).<br />
9. Close the lid of the migration module.<br />
10. Start the procedure immediately by pressing the green arrow «START» key on the left side of the keyboard.<br />
IMPORTANT: Make sure that the ventilation air inlet on the right side of the instrument is not blocked.<br />
MIGRATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• The two carriers are lowered so that buffered strips and applicator(s) contact the gel surface.<br />
• Sample applicator carrier rises up.<br />
• Migration is carried out under 20 W constant at 20 °C controlled by Peltier effect, until 42 Vh accumulated (for about 9 minutes).<br />
• The electrode carrier rises to disconnect the electrodes.<br />
• An audible beep signals that the migration module lid unlocks. The following message is displayed on the screen: « AS».<br />
NOTE: The migration module lid remains locked during all migration steps.<br />
II. IMMUNOFIXATION SET UP<br />
1. Open the migration module lid.<br />
2. Remove the sample applicator(s) and discard.<br />
3. Raise both carriers, remove the buffered strips by their plastic ends and discard.<br />
- Remove both carriers.<br />
- Wipe the electrodes with soft wet tissue.<br />
- Leave the gel in place in the migration module.<br />
4. Set up the reagent application template as follows (Fig. 5):<br />
- Position the application template guide on the anchoring clip (the guide may stay in the migration module all the time).<br />
- Hold the template by the flap and insert it into the template guide (the notches against the marks).<br />
- Lower the template onto the gel.<br />
5. Apply reagents as follows:<br />
| TROUGH | VOLUME | REAGENT | COLOR |<br />
| ELP | 35 µL | fixative solution | yellow |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µL | pentavalent antiserum | yellow - orange |<br />
NOTE: To avoid mix-up, reagent colors are shown both on the vial labels and the application template wells.<br />
- Take the reagents without trapping any air bubbles in the pipette tip.<br />
- Apply the reagents (Fig. 6):<br />
- Hold pipette vertically and rest its tip lightly at the bottom of the well.<br />
- Inject reagent so it spreads through the trough without trapping any bubbles.<br />
6. Close the lid of the migration module.<br />
7. Start the procedure immediately by pressing the green arrow «START» key on the left side of the keyboard. A message «[INCUBATION]»<br />
appears on the screen.<br />
- 13 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
IMMUNOFIXATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• Incubation at 20 °C for 5 minutes (controlled by Peltier effect).<br />
• An audible beep signals that the migration module lid unlocks. The following message is displayed on the screen: «❊ AS (SM)».<br />
NOTE: The migration module lid remains locked during incubation.<br />
III. REMOVAL OF THE EXCESS OF REAGENTS<br />
1. Open the migration module lid.<br />
2. Remove the excess of reagents with the filter paper combs (one comb for <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, two combs for <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>)<br />
(Fig. 7):<br />
- Insert each comb at a 30° angle into the slots at the lower end of the template troughs so that the teeth touch the vertical side away from<br />
the operator.<br />
- Allow the teeth to contact delicately the liquid by tilting each comb to a 45° angle enabling the teeth to wick off the liquid (Fig. 8).<br />
IMPORTANT: Each comb must stay inclined (45°). If it is straight up, it could damage the gel.<br />
3. Start the procedure by pressing the «START» key (green arrow on the left side of the keyboard).<br />
REAGENT REMOVAL - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• The reagents are allowed to wick off the troughs for 15 seconds at 20 °C (controlled by Peltier effect).<br />
• An audible beep rings. The following message is displayed on the screen: « PAP.».<br />
IV. BLOTTING OF THE GEL<br />
1. Remove the comb(s).<br />
2. Check that the reagents are well absorbed as indicated by:<br />
- the absence of reagents on the gel.<br />
- the full lengths of the teeth are stained.<br />
If the reagent absorption is incomplete, insert the same filter paper comb again (in the same position) and repeat manually the removal<br />
procedure.<br />
3. Grasp the reagent application template by the flap, lift it and remove it.<br />
4. Apply a thick filter paper on the gel:<br />
- line up the filter paper edge with the gel edge,<br />
- ease it down onto the gel (incline it to a 45 ° angle).<br />
IMPORTANT: Press firmly on the whole surface of the filter paper to ensure perfect adherence on the gel.<br />
5. Close the lid of the migration module.<br />
6. Start the procedure by pressing the «START» key (green arrow on the left side of the keyboard).<br />
7. Clean the application template with a small brush (e.g., toothbrush). DO NOT USE ALCOHOL OR SOLVENTS. Ensure the template is<br />
completely dry before re-use ; remove water droplets from the wells by tapping it on soft paper.<br />
BLOTTING - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• Blotting at 40 °C controlled by Peltier effect, for 3 minutes.<br />
• An audible signal (beep) rings. The following message is displayed on the screen: «❊ PAP.».<br />
V. DRYING OF THE GEL<br />
1. Open the migration module lid.<br />
2. Remove the filter paper and leave the gel in place.<br />
3. Close the lid.<br />
4. Start the procedure by pressing the «START» key (green arrow on the left side of the keyboard).<br />
DRYING - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• Drying at 50 °C controlled by Peltier effect, for 6 minutes.<br />
• A beep signals that the cover unlocks. The plate temperature remains at 50 °C until the lid is opened.<br />
NOTE: The migration module lid remains locked during the drying step.<br />
VI. GEL PROCESSING SET UP<br />
1. Open the lid.<br />
2. Remove the dried gel for further processing.<br />
3. Open the gel holder. Lay it flat and position the dried gel (with gel side facing up) into the grooves of the two rods and close the holder. Make<br />
sure that the film is correctly positioned inside the holder (Fig. 9).<br />
4. Place the gel holder into the Gel Processing / Staining Module.<br />
IMPORTANT: Before starting the gel processing / staining program, check the following:<br />
- the wash solution container contains at least 400 mL of wash solution ;<br />
- the staining container is filled with 300 mL of staining solution ;<br />
- the destaining container contains at least 1 liter of destaining solution ;<br />
- the waste container is empty ;<br />
For reagent line connection: refer to the information displayed on the screen of the instrument (select key: REAGENT LINES).<br />
IMPORTANT: Do not forget to block up the unused lines.<br />
5. Select «<strong>IF</strong> AMIDO» staining program from the instrument menu and start the run by pressing the «START» key (green arrow on the right side<br />
of the keyboard).<br />
During staining, destaining and drying steps, the compartment remains locked.<br />
After cooling step, an audible beep signals that the compartment unlocks (the ventilation is maintained until the gel holder is removed).<br />
- 14 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
NOTES:<br />
- Temperature of the migration plate keeps decreasing since the lid has been opened until it reaches 20 °C (in less than 5 minutes). Then a new<br />
migration run may start.<br />
- Return the sample applicator and electrode carriers back in place.<br />
- Wipe the temperature control plate with a soft wet tissue.<br />
VII.GEL PROCESSING COMPLETION<br />
1. Remove the gel holder from the compartment, open it and remove the dried gel.<br />
2. If needed, clean the back side (the plastic support side) of the dry film with a damp soft paper.<br />
NOTE : The lengths of electrophoretic migrations may be slightly different with gels containing 2 or 3 analysis rows, without any adverse effects<br />
on performance.<br />
RESULTS<br />
The pentavalent antiserum detects:<br />
• G, A, M immunoglobulins, kappa and lambda each,<br />
• free kappa and lambda light chains,<br />
• kappa and lambda light chains bound to epsilon or delta heavy chains.<br />
Interpretation<br />
A normal serum shows a slightly stained zone, corresponding to the polyclonal immunoglobulins (G, A, M, kappa and lambda), without any sharp<br />
band.<br />
A hypergammaglobulinemia is characterized by a heavily stained, diffused zone, without any restricted bands.<br />
A gammopathy is characterized by one or more focused band(s).<br />
Special cases<br />
A slight monoclonal gammopathy can be hidden in a normal electrophoretic profile (e.g., beta-mobility dysglobulin). This band will be detected with the<br />
pentavalent antiserum.<br />
• A hypogammaglobulinemia might be associated with a monoclonal free light chain. This protein, due to its low molecular weight, is eliminated<br />
through the kidney into urine (Bence Jones Protein). The remaining quantity in the serum is usually very low, but it can be detected by<br />
immunofixation with pentavalent antiserum.<br />
• When a monoclonal type band is observed on serum electrophoresis (ELP track) but fails to be confirmed by immunofixation, fibrinogen (plasma<br />
sample) should be the prime suspect.<br />
• When a monoclonal type band is observed on all immunofixation tracks, cryoglobulin or polymerized Ig M should be suspected. Depolymerize with<br />
a reducing agent and repeat the procedure (see "Samples for analysis").<br />
Any monoclonal-like fraction has to be identified by further investigation on <strong>HYDRAGEL</strong> Immunofixation kits with the standard mask :<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4804 or 4808, or <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong> SEBIA,<br />
PN 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4822 or <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES SEBIA,<br />
PN 4824.<br />
Limitations<br />
The use of antisera other than those specific for the immunofixation procedure with the standard mask may affect the results.<br />
Due to the resolution and sensitivity limits of zone electrophoresis, it is possible that some monoclonal components may not be detected with this<br />
method.<br />
Troubleshooting<br />
Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the<br />
procedure were carefully followed.<br />
Kit reagent Safety Data Sheets and informations on waste products elimination are available from the Technical Service of the supplier.<br />
PERFORMANCE DATA<br />
Reproducibility and specificity<br />
Reproductibility was demonstrated on two pathological serum samples with high and low level of monoclonal component, respectively, one serum with<br />
an increased alpha1-alpha2 zone and one normal serum. Each sample was run on 3 lots of <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kit. All tested samples gave<br />
identical results for the 3 lots showing patterns typical for the type of sample tested. Immunofixation yielded no monoclonal band with the serum<br />
showing an inflammatory pattern and with the normal serum.<br />
Accuracy<br />
Thirty different samples (29 pathological sera and one normal serum sample) were run using the <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kit, <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> kit, and<br />
another commercially available agarose gel immunofixation system. Identical bands were detected on all pathological samples with each system or<br />
procedure.<br />
Sensitivity<br />
Serial dilutions were prepared with 3 pathological serum samples all exhibiting monoclonal components.<br />
The results are summarized below.<br />
- 15 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
MONOCLONAL COMPONENT DETECTION LIMIT (g/L) SAMPLE No TYPE CONC. (g/L) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> COMPARATIVE TEST 1 gamma, kappa 18 0.25 0.25 2 alpha, lambda 7.3 0.<strong>12</strong> 0.5<br />
| 3 | mu, kappa | 9 | 0.5 | 0.5 |<br />
BIBLIOGRAPHY<br />
For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
- 16 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
ANWENDUNGSBEREICH<br />
Die kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> und <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> dienen zum Nachweis monoklonaler Proteine in Humanserum durch<br />
Immunfixationselektrophorese auf Agarosegelen in alkalischem Puffer (pH-Wert 9,1). Sie wurden für das halbautomatische Elektrophoresegerät<br />
HYDRASYS entwickelt, das die Bearbeitung der Gele übernimmt, bis diese für die Auswertung vorliegen. Die Serumproteine werden zunächst<br />
elektrophoretisch getrennt und dann mit pentavalentem Antiserum gegen Ig G-, Ig A- und Ig M-Schwerketten sowie gegen die freien und gebundenen<br />
Kappa- und Lambda-Leichtketten immunfixiert. Nach der Immunfixation werden die ausgefällten Proteine mit Amidoschwarz gefärbt. Überschüssige<br />
Farbe wird durch eine saure Lösung entfernt.<br />
Mit einem Agarosegel des <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Kits können 6 Proben und mit einem Agarosegel des <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Kits <strong>12</strong> Proben<br />
analysiert werden.<br />
In-vitro-Diagnostikum.<br />
TESTPRINZIP<br />
Bei atypischen Banden im elektrophoretischen Muster von Serumproteinen, die vor allem durch eine anomale Mobilität der Gammaglobuline, aber<br />
auch der Alpha- und Betaglobuline hervorgerufen werden (jedoch durch die üblicherweise dort vorgefundenen Proteine der entsprechenden<br />
Fraktionen verborgen sein können), besteht immer der Verdacht, daß es sich um monoklonale Proteine und damit um ein Anzeichen für<br />
Gammopathien handeln könnte. Zur Identifikation dieser atypischen Banden wird die Methode der Immunfixation angewandt.<br />
Die Immunfixationselektrophorese ist eine einfache Methode zur Bindung eines Proteins in situ nach der Elektrophorese, indem es einen unlöslichen<br />
Komplex mit seinem Antikörper bildet. Das Verfahren teilt sich in vier Schritte:<br />
1. Trennung der Proteine durch Elektrophorese auf Agarosegel.<br />
2. Fixierung und Immunpräzipitation der Proteine nach der Elektrophorese: Fixierlösung und Antiserum werden direkt auf die Geloberfläche und<br />
damit auf die entsprechenden elektrophoretischen Migrationsspuren aufgebracht. Die Fixierlösung und das Antiserum diffundieren in das Gel,<br />
wobei alle Proteine bzw. die entsprechenden Antigene ausgefällt werden.<br />
3. Die ungebundenen, löslichen Proteine werden vom Gel durch Abblotten und Waschen entfernt. Das Präzipitat des Antigen-Antikörper-Komplexes<br />
ist in der Gelmatrix eingeschlossen.<br />
4. Die ausgefällten Proteine werden durch Färbung sichtbar gemacht. Die Immunpräzipitationsbanden werden anschließend mit den entsprechenden<br />
atypischen Banden im elektrophoretischen Muster der Serumprobe verglichen.<br />
Zum Nachweis der vermuteten monoklonalen Komponente(n) erfolgt die gleichzeitige Elektrophorese der Proben in zwei Spuren. Nach der<br />
Elektrophorese dient die ELP-Spur, die das elektrophoretische Muster der in der Probe enthaltenen Proteine aufweist, als Referenz. Die<br />
Immunfixations- (<strong>Penta</strong>-) Spur gestattet die Identifikation der monoklonalen Komponenten, die mit dem pentavalenten Antiserum reagierten.<br />
Mit dieser einfachen und schnellen Technik werden eindeutige und leicht interpretierbare Ergebnisse erzielt.<br />
IM <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> KIT UND IM <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> KIT ENTHALTENE REAGENZIEN UND MATERIALIEN<br />
BEZEICHNUNG BESTELL-NR. 4841 BESTELL-NR. 4842 BESTELL-NR. 4884* Agarosegele (gebrauchsfertig) 10 Gele 10 Gele 80 Gele Pufferstreifen (gebrauchsfertig) 10 Pack zu 2 Stück 10 Pack zu 2 Stück 80 Pack zu 2 Stück Verdünnungslösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 60 ml 1 Fläschchen, 60 ml 8 Fläschchen, 60 ml Amidoschwarz-Färbelösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 20 ml 1 Fläschchen, 20 ml 8 Fläschchen, 20 ml Fixierlösung (gebrauchsfertig) 3 Fläschchen, 14,4 ml Säugetier-Anti-Ig-Human- (Gamma-, Alpha-, My-, Kappa-, Lambda-) Immunglobuline: pentavalentes Antiserum (gebrauchsfertig)<br />
3 Fläschchen, 8,0 ml Applikatoren (gebrauchsfertig) 1 Pack zu 10 Stück 2 Pack zu 10 Stück 16 Pack zu 10 Stück Filterpapier, dünn 1 Pack zu 10 Stück 1 Pack zu 10 Stück 8 Pack zu 10 Stück Filterpapier-Kämme 1 Pack zu 10 Stück 2 Pack zu 10 Stück 16 Pack zu 10 Stück<br />
| Filterpapier, dick | 1 Pack zu 10 Stück | 1 Pack zu 10 Stück | 8 Pack zu 10 Stück |<br />
*<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
HINWEIS : Die Fixierlösung und das pentavalente Antiserum werden getrennt vom Kit geliefert, mit Ausnahme beim MAXI-KIT (Siehe erforderliche,<br />
aber nicht mitgelieferte Reagenzien).<br />
FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE<br />
Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden.<br />
BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN.<br />
1. AGAROSEGELE<br />
Vorbereitung<br />
Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 8 g/l ; Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,1 ± 0,1 ; Additiva zur Optimierung der Leistung,<br />
in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.<br />
WARNHINWEIS: Die Agarosegele enthalten 0,31 % Barbital und 0,34 % Natriumbarbital. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen<br />
Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen!<br />
Gebrauch<br />
Hilfsmedium für die Proteinelektrophorese und Immunfixation.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Gele waagerecht in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 bis 30 °C) oder im Kühlschrank (2 bis 8 °C) aufbewahren. Sie bleiben bis zum<br />
Verfalldatum stabil, das auf dem Etikett der Kit- oder Gelverpackung angegeben ist. (Der Pfeil auf der Vorderseite der Kit-Schachtel muß nach oben<br />
zeigen.) Eine Lagerung in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle ist zu vermeiden. Starke Temperaturschwankungen sind zu vermeiden.<br />
NICHT EINFRIEREN.<br />
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SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Das Gel ist zu verwerfen bei:<br />
(i) Kristallen oder Niederschlag auf der Geloberfläche oder sehr weicher Gelstruktur (was darauf hindeutet, daß das Gel gefroren war) ;<br />
(ii) Bakterien- oder Schimmelpilzbildung ;<br />
(iii) einer ungewöhnlich stark ausgeprägten Flüssigkeitsansammlung in der Gel-Box (was auf einen Austritt von Puffer aus dem Gel aufgrund<br />
unsachgemäßer Lagerung hindeutet).<br />
2. PUFFERSTRE<strong>IF</strong>EN<br />
Vorbereitung<br />
Die als Streifen vorliegenden Pufferschwämme sind gebrauchsfertig. Jeder Pufferstreifen enthält: Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,1 ± 0,3, Natriumazid ;<br />
Additiva zur Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.<br />
WARNHINWEIS: Der im Streifen enthaltene Puffer enthält 0,92 % Barbital, 1,03 % Natriumbarbital und 0,30 % Natriumazid. Nicht einnehmen!<br />
Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen! Darf bei der Entsorgung nicht mit Säuren, Blei oder Kupfer in Kontakt<br />
kommen, da sich sonst explosive bzw. toxische Natriumazidverbindungen bilden können.<br />
Gebrauch<br />
Die Pufferstreifen fungieren als Elektrophoresepufferreservoir und gewährleisten den Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Bewahren Sie die Pufferstreifen waagerecht liegend in der Original-Schutzverpackung bei Zimmertemperatur oder gekühlt auf. (Der Pfeil auf der<br />
Verpackungsschachtel muss nach oben zeigen.) Die Pufferstreifen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Schachtel oder auf dem Etikett<br />
der Streifen stabil.<br />
NICHT EINFRIEREN!<br />
Verwerfen Sie die Pufferstreifen, wenn die Verpackung geöffnet ist und die Streifen ausgetrocknet sind.<br />
3. VERDÜNNUNGSLÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Die Amidoschwarz-Verdünnungslösung ist wie im Abschnitt “Amidoschwarz-Färbelösung” beschrieben zu verwenden.<br />
Die Lösung enthält Zitronensäure.<br />
Gebrauch<br />
Zum Herstellen der Amidoschwarz-Färbelösung.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte Verdünnungslösung im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahren. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem<br />
Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN!<br />
Geben Sie kein Natriumazid zu.<br />
4. AMIDOSCHWARZ FÄRBELÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des<br />
Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt.<br />
Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung :<br />
1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben.<br />
2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen.<br />
3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln.<br />
4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer des HYDRASYS überführen.<br />
5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen.<br />
6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen<br />
auffüllen.<br />
7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen.<br />
Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig.<br />
ACHTUNG: Eine unvollständige Lösung des Amidoschwarz Konzentrats kann zu einer Unterbestimmung der Albuminfraktion und/oder zu<br />
Auslöscheffekten der Albuminfraktion führen.<br />
Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2 ; 0,4 g/dl Amidoschwarz ; 6,7% Ethylenglycol ; zusätzliche Additive zur<br />
Optimierung (ungiftig in den verwendeten Konzentrationen).<br />
WARNUNG: Nicht verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen!<br />
Gebrauch<br />
Zum Färben der Agarose Gele nach elektrophoretischer Trennung.<br />
WICHTIG: Die Färbelösung ist für maximal 10 Färbungen konzipiert. Wechseln Sie deshalb die Färbelösung nach 10 Färbungen aus.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Amidoschwarz- Konzentrat und verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank verschlossen aufbewahren um Flüssigkeitsverlust<br />
durch Verdunstung zu vermeiden. Das Amidoschwarz-Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett)<br />
haltbar.<br />
Verdünnte Färbelösung ist einen Monat haltbar.<br />
Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren.<br />
5. FIXIERLÖSUNG (mit Art.-Nr. 4884)<br />
Vorbereitung<br />
Fixierlösung ist gebrauchsfertig und enthält: saure Lösung ; Additiva zur Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.<br />
Damit die Fixierlösung schnell und sicher angewandt werden kann, ist sie mit einem gesundheitlich unbedenklichen gelben Farbstoff markiert. Das<br />
Fläschchenetikett weist dieselbe Farbe auf.<br />
Gebrauch<br />
Zur Fixierung der elektrophoretisch getrennten Proteine in der Referenzspur (ELP).<br />
HINWEIS: Die Fixierlösung ist speziell für die Immunfixationsprozedur mit der 6 und <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Standard Maske abgestimmt.<br />
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Fixierlösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit-Verpackung oder auf dem<br />
Fläschchenetikett der Fixierlösung angegeben ist.<br />
Fixierlösung darf kein Präzipitat aufweisen.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
6. PENTAVALENTES ANTISERUM (mit Art.-Nr. 4884)<br />
Vorbereitung<br />
<strong>Penta</strong>valentes Antiserum ist gebrauchsfertig. Das Antiserum ist eine Mischung aus Säugetier-Anti-Human-Gesamtimmunoglobulinen. Damit das<br />
Antiserum schnell und sicher angewendet werden kann, ist es mit einem gesundheitlich unbedenklichen gelborangefarbenen Farbstoff markiert. Das<br />
Fläschchenetikett weist dieselbe Farbe auf. Sollte das Antiserum eine leichte Trübung aufweisen, sollte es für mindestens 10 Minuten bei<br />
Raumtemperatur inkubiert werden. Dies sollte für die Klärung der Lösung ausreichen. Eine eventuell noch vorhandene leichte Trübung sollte die<br />
immunologische Reaktion nicht beeinflussen. Im Falle von unlöslichen Präzipitaten, wird eine fünfminutige Zentrifugation bei 3000 Upm empfohlen.<br />
Gebrauch<br />
Zur Immunfixation von Proteinen nach der Elektrophorese.<br />
HINWEIS: Das pentavalente Antiserum ist speziell für die Immunfixationsprozedur mit der 6 und <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Standard Maske abgestimmt.<br />
Die Antiseren können von unterschiedlichen Tierspezies stammen. Nicht den Inhalt von zwei unterschiedlichen Antiserenfläschchen mischen, auch<br />
nicht bei gleicher Spezifität und IMMER eine neue Pipettenspitze benutzen, wenn das Antiserumfläschchen gewechselt wird.<br />
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Antiseren im Kühlschrank aufbewahren. Sie sind bis Verfalldatum auf der Kit-Verpackung oder auf den Antiserenfläschchen stabil.<br />
HINWEIS: Während des Transports können die Antiseren ungekühlt (15 bis 30 °C) für 15 Tage ohne nachteilige Effekte für die Durchführung<br />
aufbewahrt werden.<br />
7. APPLIKATOREN<br />
Gebrauch<br />
Einmalapplikatoren für den Probenauftrag.<br />
Lagerung<br />
Applikatoren vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.<br />
8. FILTERPAPIER, DÜNN<br />
Gebrauch<br />
Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten überschüssiger Flüssigkeit von der Geloberfläche vor dem Probenauftrag.<br />
Lagerung<br />
Dünnes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.<br />
9. FILTERPAPIER-KÄMME<br />
Gebrauch<br />
Kämme aus dickem Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten von überschüssiger Fixierlösung und Antiserum von der Geloberfläche nach<br />
der Immunfixation.<br />
10. FILTERPAPIER, DICK<br />
Gebrauch<br />
Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten nicht ausgefällter Proteine nach der Immunfixation.<br />
Lagerung<br />
Das dicke Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.<br />
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN (NICHT IM KIT ENTHALTEN)<br />
1. FIXIERLÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Fixierlösung für die Immunfixation (SEBIA, Art.-Nr. 4799, 1 Fläschchen, 2.5 mL) ist gebrauchsfertig und enthält: saure Lösung; Additiva zur<br />
Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich. Die Fixierlösung ist speziell für die Immunfixationsprozedur mit der<br />
6 und <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Standard Maske, SEBIA, abgestimmt.<br />
Damit die Fixierlösung schnell und sicher angewendet werden kann, ist sie mit einem gesundheitlich unbedenklichen gelben Farbstoff markiert. Das<br />
Fläschchenetikett weist dieselbe Farbe auf.<br />
Gebrauch, Lagerung, Stabilität und Anzeichen von Verfall: siehe vorheriger Abschnitt 5.<br />
2. PENTAVALENT ANTISERUM<br />
Das pentavalente Antiserumfläschchen (SEBIA, Art.-Nr. 4616, 1 mL oder Art.-Nr. 4738, 8 mL), enthält eine Mischung aus Säugetier-Anti-Human-<br />
Gesamtimmunoglobulinen. Das Antiserum ist speziell für die Immunfixationsprozedur mit der 6 und <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Standard Maske, SEBIA,<br />
abgestimmt.<br />
Damit das Antiserum schnell und sicher angewendet werden kann, ist es mit einem gesundheitlich unbedenklichen gelborangefarbenen Farbstoff<br />
markiert. Das Fläschchenetikett weist dieselbe Farbe auf.<br />
Vorbereitung, Gebrauch, Lagerung, Stabilität und Anzeichen von Verfall: siehe vorheriger Abschnitt 6.<br />
3. ENTFÄRBELÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte Entfärbelösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4540, 10 Fläschchen zu je 100 ml) mit destilliertem oder entionisiertem<br />
Wasser auf 100 Liter auffüllen. Es empfiehlt sich, nur 5 ml konzentrierte Lösung auf 5 Liter, dem Fassungsvermögen des Behälters für die<br />
Entfärbelösung, aufzufüllen. Verdünnte Entfärbelösung enthält: Zitronensäure, 0,5 g/l.<br />
Gebrauch<br />
Zum Entfärben, d.h. Auswaschen von überschüssiger Farbe und zur Entfernung der Gelhintergrundfärbung, sowie zum Spülen der Färbekammer nach<br />
dem Waschen.<br />
Zur Neutralisation der sauren Entfärbelösung können 15 ml einer 50 % Natronlauge (NaOH) in den leeren Abfallbehälter gefüllt werden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit-<br />
Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett der Entfärbelösung angegeben ist. Verdünnte Entfärbelösung bleibt bei Raumtemperatur in einem<br />
verschlossenen Behälter eine Woche stabil. Kein Natriumazid zugeben.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.<br />
Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung zu verhindern, wenn sie länger als 1 Woche aufgehoben wird, sollten 50 µl/l ProClin 300<br />
zugesetzt werden.<br />
Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum Verfallsdatum<br />
stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.<br />
4. HYDRASYS WASCHLÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte HYDRASYS Waschlösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4541, 10 Fläschchen zu je 80 ml) mit destilliertem oder<br />
entionisiertem Wasser auf 5 Liter auffüllen. Verdünnte Waschlösung enthält: alkalischen Puffer, pH-Wert 8,8 ± 0,3 ; Natriumazid.<br />
WARNHINWEIS: Konzentrierte Waschlösung enthält 0,625 % Natriumazid. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort<br />
den Arzt aufsuchen! Natriumazid kann bei Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer zu explosiven bzw. toxischen Verbindungen reagieren. Bei<br />
der Entsorgung stets mit reichlich Wasser nachspülen.<br />
Gebrauch<br />
HYDRASYS Waschlösung dient zum Auswaschen der nicht ausgefällten Proteine aus den Gelen. Es wird ebenfalls zum Reinigen des HYDRASYS<br />
Färbemoduls eingesetzt. Die Reinigung in regelmäßigen Abständen durchführen: Wird das Gerät zum Beispiel täglich genutzt, sollte das Färbemodul<br />
einmal pro Woche gereinigt werden.<br />
Hinweise zum Gebrauch finden Sie auf der Packungsbeilage.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte und verdünnte Waschlösung in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum<br />
Verfalldatum stabil, das auf dem Fläschchenetikett der Waschlösung angegeben ist.<br />
Verdünnte Waschlösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.<br />
5. FLUIDIL<br />
Vorbereitung<br />
Fluidil (SEBIA, Bestell-Nr. 4587, 1 Fläschchen, 5 ml) ist gebrauchsfertig.<br />
Gebrauch<br />
Zum Verdünnen zähflüssiger oder trüber Proben, z.B. von Kryoglobulin- oder Kryogel-haltigen Seren.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Fluidil bei Raumtemperatur aufbewahren. Es bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf Kit-Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett angegeben ist.<br />
Fluidil darf kein Präzipitat aufweisen.<br />
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE AUSSTATTUNG (NICHT IM KIT ENTHALTEN)<br />
1. HYDRASYS System, SEBIA, Bestell-Nr. <strong>12</strong>10 oder Nr. <strong>12</strong>11.<br />
2. Für das Beladen der Applikatoren kann alternativ eine manuelle Mikropipette oder der Pipettierautomat HYDRAplus SEBIA, Bestell-Nr. <strong>12</strong>15,<br />
verwendet werden.<br />
3. Feuchte Kammer, Bestell-Nr. <strong>12</strong>70, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.<br />
4. Behälter-Kit, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.<br />
5 Schablonen-Führungsstab SEBIA, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.<br />
6. Zubehörkit für HYDRASYS <strong>IF</strong>, SEBIA, Bestell-Nr. <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipetten: 10 µl und 200 µl.<br />
PROBEN FÜR DIE ANALYSE<br />
Probensammlung und -lagerung<br />
Für die Analyse werden frische Proben empfohlen. Die Gewinnung von Serumproben nach einem gebräuchlichen Verfahren für klinische Labortests<br />
durchführen. Die Proben sollten umgehend bei 2 - 8 °C gekühlt und können bis zu einer Woche gelagert werden. Bei längerer Lagerung die Proben<br />
einfrieren (mindestens 1 Monat stabil).<br />
Nach dem Auftauen können diese Proben aufgrund der Protein bzw. Lipoprotein-Denaturierung leichte Trennspuren an der Auftragsstelle hinterlassen.<br />
Eingefrorene Serumproben, versetzt mit Natriumazid 0,02 g/dl bleiben bei Lagerung länger stabil.<br />
Probenvorbereitung<br />
Unverdünnte Serumproben verwenden.<br />
Nach der Lagerung im Kühl- oder Gefrierschrank können manche Serumproben (insbesondere Kryoglobulin- oder Kryogel-haltige Proben) zähflüssig<br />
oder trüb werden. Derartige Serumproben lassen sich mitunter schwer auftragen, da sie kaum durch die Zähne des Probenapplikators diffundieren.<br />
In diesen Fällen zu 75 µl Serum 25 µl Fluidil zugeben und 15 Sekunden im Rotationsmischer mischen. Anschließend mit dem Standardverfahren<br />
fortfahren.<br />
Einige monoklonale Proteine können in polymerisierter Form vorliegen als läge auf allen immunfixierten Spuren eine monoklonale Fraktion vor. In<br />
diesem Fall (i) eine Fluidil-Lösung herstellen, die 1% Beta-Mercaptoethanol (BME, oder 2-Mercaptoethanol, 2 ME) enthält, (ii) zu 75 µl unverdünntem<br />
Serum 25 µl Reduktionslösung geben, (iii) im Rotationsmischer mischen und mindestens 15 Minuten (maximal 30 Minuten) einwirken lassen.<br />
Anschließend mit dem Standardverfahren fortfahren.<br />
Folgende Proben nicht verwenden<br />
Plasmaproben vermeiden. Das Fibrinogen ergibt eine Bande in der Nähe der Auftragsstelle, die mit monoklonalem Immunglobulin verwechselt werden<br />
könnte.<br />
Keine hämolysierten Proben verwenden.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
DURCHFÜHRUNG<br />
Das HYDRASYS System ist ein halbautomatisches Multiparameter-Gerät, das eine automatische Bearbeitung der <strong>HYDRAGEL</strong> Agarosegele in der<br />
nachstehenden Reihenfolge durchführt: Probenapplikation, elektrophoretische Migration, Inkubation mit Fixierlösung und Antiserum, Trocknen,<br />
Färben, Entfärben und Endtrocknen. Zu den manuellen Schritten gehört die Handhabung der Proben und Gele, der Auftrag der Fixierlösung und des<br />
Antiserums sowie die Bedienung des Geräts.<br />
DIE BEDIENUNGSANLEITUNG ZUM HYDRASYS SYSTEM AUFMERKSAM DURCHLESEN.<br />
I. VORBEREITUNG DER MIGRATION<br />
1. HYDRASYS einschalten.<br />
2. Bei Verwendung von <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> für 6 Proben einen Applikator, bei Verwendung von <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> für <strong>12</strong> Proben zwei<br />
Applikatoren auf eine ebene Unterlage legen, so dass die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (Abb. 1).<br />
- In jede Vertiefung 10 µl unverdünnte Probenflüssigkeit auftragen. Das Füllen eines Applikators darf höchstens 2 Minuten dauern.<br />
| VERTIEFUNG |<br />
PROBE ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
HINWEIS: Die Positionen 1, 8 und 15 des Applikators werden bei diesem Test nicht verwendet. Sie sollten mit einem Filzstift markiert werden,<br />
um ein irrtümliches Beladen mit Proben zu vermeiden.<br />
- Die Applikatoren mit den Zähnen nach oben in die feuchte Kammer legen (nur am Schutzrahmen für die Zähne anfassen).<br />
Hinweise hierzu finden Sie in der Packungsbeilage zur feuchten Kammer.<br />
- Die Proben nach dem Auftragen der letzten Probe 5 Minuten lang in die Zähne einziehen lassen. Erfolgt die Anwendung erst (bis zu<br />
8 Stunden) später, die komplette Kammer in den Kühlschrank stellen.<br />
3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen, und die Elektroden-/Applikatoren-Halter nach oben klappen.<br />
WARNHINWEIS: Die Abdeckung bei hochgestelltem Elektroden-/Applikatoren-Halter nicht schliessen!<br />
4. Im Gerätemenü das Programm «6/<strong>12</strong> PENTA SM/DM» wählen (an der Tastatur links).<br />
5. Die Pufferstreifen an den Kunststoffenden aus der Packung nehmen. Die Perforation des Plastikfilms in die Stifte des Elektroden-Halters<br />
einführen. Die Plastikfolie muß dabei zum Applikator-Halter zeigen (siehe Abb. 2).<br />
6. Das Gel aus der Verpackung nehmen.<br />
- Ein dünnes Filterpapier vorsichtig und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier<br />
sofort wieder entfernen.<br />
WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange auf dem Gel lassen, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.<br />
- 200 µl destilliertes oder entionisiertes Wasser in das untere Drittel des Rahmens geben, der auf der Peltier-Platte des Migrationsmoduls<br />
aufgedruckt ist.<br />
- Das Gel (mit der Gelseite nach oben) an die untere Kante des aufgedruckten Rahmens anlegen (siehe Abb. 3).<br />
- Das Gel biegen und auf dem Wasser abrollen (siehe Abb. 3). Darauf achten, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden, das Wasser<br />
unter der gesamten Gelplatte verteilt ist und das Gel am aufgedruckten Rahmen anliegt.<br />
7. Beide Halter nach unten klappen. In dieser Position dürfen die Pufferstreifen keinen Kontakt mit dem Gel haben. DIE HALTER NICHT MIT<br />
GEWALT BIS GANZ NACH UNTEN DRÜCKEN.<br />
8. Die Applikatoren aus der feuchten Kammer nehmen. Dabei nur am Schutzrahmen anfassen.<br />
- Den Schutzrahmen für die Zähne entfernen.<br />
- Bei Verwendung von <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> (6 proben), einen Applikator an Position 6 auf dem Halter einsetzen.<br />
- Bei Verwendung von <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> (<strong>12</strong> proben), je einen Applikator an Position 3 und 9 einsetzen.<br />
WICHTIG: Die auf dem Applikator aufgedruckten Ziffern müssen immer zum Bediener zeigen (siehe Abb. 4).<br />
9. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.<br />
10. Die Migration sofort starten. Dazu die grüne Pfeiltaste «START» auf der linken Seite der Tastatur drücken.<br />
WICHTIG: Darauf achten, daß die Lüftungsschlitze an der rechten Geräteseite nicht verdeckt sind.<br />
MIGRATION - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Die beiden Halter werden soweit gesenkt, daß die Pufferstreifen und der/die Applikator(en) in Kontakt mit der Geloberfläche kommen.<br />
• Der Probenapplikator-Halter wird angehoben.<br />
• Die Migration erfolgt unter Anlegen eines Gleichstroms von 20 W und bei einer Temperatur von 20 °C, die durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten<br />
wird, bis 42 Vh erreicht sind (nach etwa 9 Minuten).<br />
• Der Elektroden-Halter wird angehoben und unterbricht dabei den Kontakt der Elektroden.<br />
• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Am Bildschirm wird folgende Meldung angezeigt: « AS».<br />
HINWEIS: Während der Migration bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.<br />
II. VORBEREITUNG DER IMMUNFIXATION<br />
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.<br />
2. Den/die Probenapplikator(en) herausnehmen und verwerfen.<br />
3. Beide Halter anheben, die Pufferstreifen an den Plastikenden herausnehmen und verwerfen.<br />
- Beide Halter herausnehmen.<br />
- Die Elektroden mit einem weichen, angefeuchteten Papiertuch abwischen.<br />
- Das Gel im Migrationsmodul belassen.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. Die Schablone für den Reagenzauftrag wie folgt vorbereiten (siehe Abb. 5):<br />
- Die Schablonenführung an der Halteklemme anbringen (nach der Anbringung kann sie im Migrationsmodul verbleiben).<br />
- Die Schablone an der Lasche halten und auf die Schablonenführung schieben. (Die Nut muß dabei zur Markierung zeigen).<br />
- Die Schablone auf das Gel absenken.<br />
5. Reagenzien wie folgt auftragen:<br />
| VERTIEFUNG | VOLUMEN | REAGENZ | FARBE |<br />
| ELP | 35 µl | Fixierlösung | gelb |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µl | <strong>Penta</strong>valentes Antiserum | gelborange |<br />
HINWEIS: Zur Vermeidung von Verwechslungen sind sowohl die Fläschchenetiketten der Reagenzien als auch die Vertiefungen der<br />
Schablone jeweils mit der gleichen Farbe markiert.<br />
- Die Reagenzien ohne Luftblasen in die Pipettenspitze aufziehen.<br />
- Die Reagenzien auftragen (siehe Abb. 6):<br />
- Die Pipette senkrecht halten, und die Spitze vorsichtig auf den Boden der Vertiefung aufsetzen.<br />
- Das Reagenz so in die Vertiefung spritzen, daß es sich gleichmäßig darin verteilt und keine Luftblasen entstehen.<br />
6. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.<br />
7. Die Migration sofort starten. Dazu die grüne Pfeiltaste «START» auf der linken Seite der Tastatur drücken. Am Bildschirm erscheint die<br />
Meldung «[INKUBATION]».<br />
IMMUNFIXATION - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Es erfolgt eine 5 minütige Inkubation bei 20 °C (durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten).<br />
• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Am Bildschirm wird folgende Meldung angezeigt:<br />
«❊ AS (SM)».<br />
HINWEIS: Während der Inkubation bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.<br />
III. ENTFERNEN ÜBERSCHÜSSIGER REAGENZIEN<br />
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.<br />
2. Überschüssige Reagenzien mit Filterpapier-Kämmen entfernen. Bei Verwendung von <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> einen Kamm, bei Verwendung<br />
von <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> zwei Kämme benutzen (siehe Abb. 7):<br />
- Den Kamm in einem 30°-Winkel halten und in die Vertiefungen der Schablonen einführen. Die Zähne müssen dabei vom Bediener weg<br />
zeigen.<br />
- Die Zähne leicht in die Flüssigkeit eintauchen. Dazu die Zähne etwas steiler stellen, damit die Flüssigkeit von den Zähnen durch<br />
Kapillarwirkung aufgesogen wird (siehe Abb. 8).<br />
WICHTIG: Die Zähne dürfen nicht steiler als 45° aufgestellt werden, da sonst das Gel beschädigt werden könnte.<br />
3. Das Verfahren starten. Dazu die «START»-Taste (grüne Pfeiltaste auf der linken Seite der Tastatur) drücken.<br />
ENTFERNEN ÜBERSCHÜSSIGER REAGENZIEN - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Das Entfernen der Reagenzien erfolgt 15 Sekunden lang bei 20 °C (durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten).<br />
• Ein akustisches Signal ertönt, und am Bildschirm wird folgende Meldung angezeigt: « PAP.».<br />
IV. ABBLOTTEN DES GELS<br />
1. Den Kamm/die Kämme abnehmen.<br />
2. Überprüfen, daß die Reagenzien vollständig aufgesogen wurden. Dies ist daran erkennbar, daß:<br />
- sich auf dem Gel kein Reagenz mehr befindet<br />
- die Zähne in ihrer gesamten Länge gefärbt sind.<br />
Falls noch nicht das gesamte Reagenz aufgesaugt wurde, den Filterpapier-Kamm (wie zuvor) nochmals einführen und das Abblotten manuell<br />
vornehmen.<br />
3. Die Schablone für den Reagenzauftrag an der Lasche ergreifen, anheben und herausnehmen.<br />
4. Ein dickes Filterpapier auf das Gel legen:<br />
- Das Filterpapier in einem Winkel von 45° halten und mit dem unteren Rand an die Kante anlegen, die zur Ausrichtung des Gels dient.<br />
- Das Filterpapier auf dem Gel abrollen.<br />
ACHTUNG : Das dicke Filterpapier sollte fest auf die gesamte Geloberfläche angedrückt werden, um eine optimale Anhaftung an das<br />
Gel zu ermöglichen.<br />
5. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.<br />
6. Das Verfahren starten. Dazu die «START»-Taste (grüne Pfeiltaste auf der linken Seite der Tastatur) drücken.<br />
7. Die Auftragsschablone mit einer kleinen Bürste (z.B. mit einer Zahnbürste) reinigen. KEINEN ALKOHOL ODER SONSTIGE<br />
LÖSUNGSMITTEL VERWENDEN! Vor der nächsten Anwendung muß die Schablone wieder absolut trocken sein ; zum Entfernen von<br />
Wassertropfen, die an den Vertiefungen haften, die Schablone auf einem weichen Papiertuch ausklopfen.<br />
ABBLOTTEN - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Das Abblotten erfolgt 3 Minuten lang bei 40 °C (durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten).<br />
• Ein akustisches Signal ertönt, und am Bildschirm wird folgende Meldung angezeigt: «❊ PAP.».<br />
V. TROCKNEN DES GELS<br />
1. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen.<br />
2. Das Filterpapier herausnehmen. Das Gel im Migrationsmodul belassen.<br />
3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.<br />
4. Das Verfahren starten. Dazu die «START»-Taste (grüne Pfeiltaste auf der linken Seite der Tastatur) drücken.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
TROCKNEN - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Das Trocknen erfolgt 6 Minuten lang bei 50 °C (durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten).<br />
• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Bis zum Öffnen der Abdeckung wird die Temperatur auf<br />
50 °C gehalten.<br />
HINWEIS: Während des Trocknens bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.<br />
VI. VORBEREITUNG DER GELBEARBEITUNG<br />
1. Die Abdeckung öffnen.<br />
2. Das getrocknete Gel zur weiteren Bearbeitung herausnehmen.<br />
3. Den Gel-Halter öffnen und flach hinlegen. Das Gel (mit der Gelseite nach oben) in die Ausfräsung des Gel-Halters einsetzen, und den Gel-<br />
Halter schließen. Darauf achten, daß das Gel im Halter korrekt positioniert ist (siehe Abb. 9).<br />
4. Den Gel-Halter in das Gelbearbeitungs-/Färbemodul einsetzen.<br />
WICHTIG: Vor dem Start des Gelbearbeitungs-/Färbeprogramms überprüfen, daß:<br />
- der Waschlösungsbehälter mindestens 400 ml Waschlösung enthält,<br />
- der Färbelösungsbehälter 300 ml Färbelösung enthält,<br />
- der Entfärbelösungsbehälter mindestens 1 Liter Entfärbelösung enthält,<br />
- der Abfallbehälter leer ist,<br />
- die nicht benötigten Kanäle blockiert sind.<br />
5. Im Gerätemenü das Färbeprogramm «<strong>IF</strong> AMIDO» wählen, und den Vorgang durch Drücken der «START»-Taste (grüner Pfeil auf der rechten<br />
Seite der Tastatur) starten.<br />
Während der Färbe-, Entfärbe- und Trocknungsschritte bleibt das Färbemodul verriegelt.<br />
Nach einer Abkühlphase des Moduls ertönt ein akustisches Signal, und das Färbemodul entriegelt sich (die Luftkühlung erfolgt solange, bis<br />
der Gel-Halter entnommen wird).<br />
HINWEIS:<br />
- Die Temperatur der Peltier-Platte sinkt nach dem Öffnen (innerhalb von 5 Minuten) auf 20 °C. Danach kann die nächste Migration durchgeführt<br />
werden.<br />
- Den Probenapplikator-/Elektroden-Halter wieder einsetzen.<br />
- Die Peltier-Platte mit einem weichen, feuchten Papiertuch abwischen.<br />
VII.ABSCHLUSS DER GELBEARBEITUNG<br />
1. Den Gel-Halter aus dem Färbemodul nehmen, die Bügel nach oben klappen und das getrocknete Gel entnehmen.<br />
2. Bei Bedarf die Rückseite (den Plastikfilm) der trockenen Folie mit einem weichen, feuchten Papiertuch reinigen.<br />
HINWEIS: Die Migrationslänge kann bei Gelen mit 2 oder 3 Analysereihen unterschiedlich sein, ohne jegliche Beeinträchtigung der Leistung.<br />
ERGEBNISSE<br />
<strong>Penta</strong>valentes Antiserum dient zum Nachweis von:<br />
• Immunglobulinen: Ig G, Ig A, Ig M, jeweils Kappa und Lambda,<br />
• freien Kappa- und Lamda-Leichtketten,<br />
• an Epsilon- oder Delta-Schwerketten gebundenen Kappa- und Lamda-Leichtketten.<br />
Interpretation<br />
Eine normale Serumprobe weist eine leicht gefärbte Fraktion ohne scharf abgegrenzte Banden auf, die den polyklonalen Immunglobulinen (G-, A-,<br />
M-, Kappa und Lambda) entspricht.<br />
Eine Hypergammaglobulinämie ist durch eine stark gefärbte, diffuse Fraktion und das Fehlen jeglicher scharf abgegrenzter Banden gekennzeichnet.<br />
Eine Gammopathie ist durch eine oder mehrere scharf abgegrenzte Banden gekennzeichnet.<br />
Sonderfälle<br />
• Eine leichte monoklonale Gammopathie (wie bei atypischen Globulinen mit Betamobilität) ist in einem normalen elektrophoretischen Profil nicht<br />
sichtbar. Eine solche Bande läßt sich mit pentavalentem Antiserum nachweisen.<br />
• Eine Hypogammaglobulinämie kann mit einer monoklonalen freien Leichtkette assoziiert sein. Dieses Protein wird aufgrund seiner geringen<br />
Molmasse von den Nieren über den Urin ausgeschieden (Bence-Jones-Protein). Die im Serum verbleibende Menge ist zwar in der Regel sehr<br />
gering, läßt sich aber durch Immunfixation mit pentavalentem Antiserum nachweisen.<br />
• Wird bei der Serum Elektrophorese (ELP Spur) eine monoklonale Fraktion gefunden, die durch Immunfixation nicht bestätigt werden kann, sollte<br />
Fibrinogen (Plasmaprobe) als wahrscheinlichste Ursache angenommen werden.<br />
• Wird eine monoklonale Bande auf allen Immunfixationsspuren gefunden, sollte als Ursache Kryoglobulin oder polymerisiertes Ig M angenommen<br />
werden. Die Probe mit einem reduzierenden Agenz depolymerisieren und das Verfahren wiederholen (siehe "Proben für die Analyse").<br />
Werden monoklonale Fraktionen durch pentavalentes Antiserum gefunden, sind zu ihrer Identifikation weitere Untersuchungen erforderlich. Dazu<br />
eignen sich folgende <strong>HYDRAGEL</strong> Immunfixations-Kits mit der Standard Maske:<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, Art.-Nr. 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, Art.-Nr. 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, Art.-Nr. 4804 oder 4808, oder <strong>HYDRAGEL</strong><br />
9 <strong>IF</strong> SEBIA, Art.-Nr. 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, Art.-Nr. 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, Art.-Nr. 4822 oder <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES<br />
SEBIA, Art.-Nr. 4824.<br />
Interferenzen und Einschränkungen<br />
Die Antiseren für die Verwendung mit der Standard Maske sind speziell auf diese abgestimmt. Die Verwendung von anderen Antiseren kann Ihre<br />
Ergebnisse beeinträchtigen.<br />
Es wird darauf hingewiesen, dass aufgrund der derzeitigen Kenntnis des zugrundeliegenden Analysenprinzips (Theorie der Zonenelektrophorese,<br />
Auflösungsvermögen und Sensitivität) keine Garantie für ein 100 % Erkennen aller monoklonalen Komponenten gewährt werden kann.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Fehlersuche<br />
Kommt es trotz sachgerechter Lagerung und Vorbereitung der Materialien und Beachtung der Verfahrensbeschreibung zum Versagen des Tests,<br />
wenden Sie sich bitte an den SEBIA Kundendienst.<br />
Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen.<br />
LEISTUNGSSPEZ<strong>IF</strong>IKATIONEN<br />
Reproduzierbarkeit und Spezifität<br />
Die Reproduzierbarkeit wurde an zwei pathologischen Serumproben mit hoher bzw. niedriger Konzentration der monoklonalen Komponente und an<br />
einer Serumprobe mit erhöhter Alpha1-Apha2-Fraktion sowie an einer normalen Serumprobe nachgewiesen. Jede Probe wurde auf drei Chargen<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> getestet und ergab identische Ergebnisse. Die Muster entsprachen dem Typ der jeweils getesteten Probe. Die<br />
Immunfixation ergab weder beim Serum mit dem Entzündungsmuster noch beim normalen Serum eine monoklonale Bande.<br />
Richtigkeit<br />
Dreißig verschiedene Proben (29 pathologische Seren und eine normale Serumprobe) wurden mit dem <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Kit, <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong><br />
Kit und mit einem anderen handelsüblichen Agarosegelimmunfixationssystem analysiert. Bei allen pathologischen Proben wurden mit jedem System<br />
bzw. Verfahren identische Banden festgestellt.<br />
Empfindlichkeit<br />
Aus 3 pathologischen Proben, die alle monoklonale Komponenten aufwiesen, wurden Verdünnungsserien hergestellt.<br />
Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt.<br />
MONOKLONALE KOMPONENTE NACHWEISGRENZE (g/l) PROBEN-Nr. TYP KONZ. (g/l) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> VERGLEICHSTEST 1 Gamma, Kappa 18 0,25 0,25 2 Alpha, Lambda 7,3 0,<strong>12</strong> 0,5<br />
| 3 | My, Kappa | 9 | 0,5 | 0,5 |<br />
LITERATUR<br />
Zur Interpretation von Immunfixationsmustern siehe auch:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
GEBRUIKSAANWIJZING<br />
De <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> en <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kits zijn bedoeld voor het opsporen van monoclonale proteïnen in menselijk serum door middel<br />
van immunofixatie-elektroforese op alkalisch gebufferde (pH 9,1) agarose-gels. De kits worden samen met het HYDRASYS systeem toegepast om zo<br />
alle fasen uit te voeren die nodig zijn om gels te verkrijgen die gereed zijn voor interpretatie. De serumproteïnen ondergaan elektroforese en<br />
immunofixatie door een pentavalent antiserum anti-gamma (Ig G), alfa (Ig A) en mu (Ig M) zware ketens en anti-kappa en lambda (vrije en gebonden)<br />
lichte ketens. Na immunofixatie worden de geprecipiteerde proteïnen met amidozwart gekleurd. De overtollige kleurstof wordt met een zure oplossing<br />
verwijderd.<br />
Iedere gel in de <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> en <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kits is bedoeld voor de analyse van respectievelijk 6 en <strong>12</strong> monsters.<br />
Voor gebruik bij in vitro diagnostiek.<br />
PRINCIPE VAN DE TEST<br />
Abnormale banden in het elektroforetisch patroon van serumproteïnen, en dan vooral met een gammamobiliteit, maar ook met alfa- en bètamobiliteit<br />
(deze kunnen verborgen zijn door de normale proteïnen van de corresponderende zones), kunnen altijd monoclonaal zijn en zodoende een indicatie<br />
leveren voor gammopathieën. Om deze abnormale banden te kunnen identificeren wordt de techniek van de immunofixatie toegepast.<br />
Immunofixatie-elektroforese is een eenvoudige techniek waarbij een proteïne na elektroforese in situ wordt gebonden door de vorming van een<br />
onoplosbaar complex met zijn anti-lichaam.<br />
Het wordt in vier fasen uitgevoerd:<br />
1. Separatie van proteïnen door elektroforese op agarose-gel.<br />
2. Fixatie en immunoprecipitatie van de proteïnen na elektroforese: de fixeeroplossing en het antiserum worden direct op het geloppervlak<br />
aangebracht op de juiste elektroforetische-migratiesporen. De fixeeroplossing en het antiserum trekken in de gel terwijl zij respectievelijk al de<br />
proteïnen en de corresponderende antigenen precipiteren.<br />
3. De niet-geprecipiteerde, oplosbare proteïnen worden door middel van deppen en spoelen van de gel verwijderd. De geprecipiteerde proteïnen<br />
blijven vastzitten in de gel.<br />
4. De geprecipiteerde proteïnen worden door middel van kleuring zichtbaar gemaakt. De immuno-geprecipiteerde banden worden vervolgens<br />
vergeleken met de corresponderende abnormale banden die werden waargenomen in het elektroforetisch patroon van het serummonster.<br />
Om detectie en identificatie van de verdachte monoclonale component(en) mogelijk te maken ondergaan de monsters simultaan in twee sporen<br />
elektroforese. Na de elektroforese dient één spoor (ELP) als referentie, en deze geeft het elektroforetisch patroon van de monsterproteïnen te zien.<br />
Het immunofixatie-spoor (<strong>Penta</strong>) toont de monoclonale componenten uit hun reactie met het pentavalente antiserum.<br />
Deze eenvoudige en snelle techniek levert een duidelijk en gemakkelijk te interpreteren beeld op.<br />
DE <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> EN <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> KITS BEVATTEN DE VOLGENDE REAGENTIA EN ANDERE MATERIALEN<br />
BESTANDDELEN PROD. NR. 4841 PROD. NR. 4842 PROD. NR. 4884* Agarose-gels (klaar voor gebruik) 10 gels 10 gels 80 gels Gebufferde strips (klaar voor gebruik) 10 pakjes, 2 elk 10 pakjes, 2 elk 80 pakjes, 2 elk Verdunner voor de kleuroplossing (geconcentreerde oplossing) 1 flesje, 60 ml 1 flesje, 60 ml 8 flesjes van 60 ml Amidozwart kleurstof (geconcentreerde oplossing) 1 flesje, 20 ml 1 flesje, 20 ml 8 flesjes van 20 ml Fixeeroplossing (klaar voor gebruik) 3 flesjes, 14,4 ml Totaal immunoglobulinen, dierlijk anti-Ig menselijk (gamma - alfa - 3 flesjes, 8,0 ml mu - kappa - lambda) pentavalent antiserum (klaar voor gebruik) Applicators (klaar voor gebruik) 1 pakje, 10 stuks 2 pakjes, 10 stuks 16 pakjes, 10 stuks Filterpapierstrips - dun - 1 pakje, 10 stuks 1 pakje, 10 stuks 8 pakjes, 10 stuks Filterpapierstrips - kam - 1 pakje, 10 stuks 2 pakjes, 10 stuks 16 pakjes, 10 stuks<br />
| Filterpapierstrips - dik - | 1 pakje, 10 stuks | 1 pakje, 10 stuks | 8 pakjes, 10 stuks |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
OPMERKING: De fixeeroplossing en het <strong>Penta</strong>valent (vijfwaardig) antiserum worden los van de kits geleverd, behalve bij de MAXI-KIT (zie<br />
BENODIGDE MAAR NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA).<br />
VOOR OPTIMALE RESULTATEN<br />
Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter.<br />
LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR.<br />
1. AGAROSE-GELS<br />
Voorbereiding<br />
De agarose-gels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; tris-barbital buffer, pH 9,1 ± 0,1 ; in de gebruikte concentraties niet schadelijke<br />
toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: De agarose-gels bevatten 0,31 % barbital en 0,34 % natriumbarbital. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname<br />
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden!<br />
Gebruik<br />
Draagmedium voor elektroforese en immunofixatie van proteïnen.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking en gekoeld (bij 2 tot 8 °C) of bij kamertemperatuur<br />
(15 tot 30 °C) bewaard worden. De gels zijn stabiel tot de houdbaarheidsdatum die op de kit, of op het verpakkingslabel van de gel, staat aangegeven.<br />
(De pijl op de voorzijde van de verpakking moet naar boven wijzen.) Vermijd opslag dicht bij een raam of een warmtebron. Vermijd belangrijke<br />
temperatuurwisselingen tijdens de opslag. NIET INVRIEZEN.<br />
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SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Verwijder de gel wanneer er :<br />
(I) zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft<br />
aan dat de gel bevroren is geweest) ;<br />
(II) bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ;<br />
(III) een abnormale hoeveelheid vloeistof in de geldoos aanwezig is (wijst erop dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens<br />
onjuiste opslagomstandigheden).<br />
2. GEBUFFERDE STRIPS<br />
Voorbereiding<br />
Gebufferde sponsstrips zijn gereed voor gebruik. Elke strip bevat: tris-barbital buffer, pH 9,1 ± 0,3 ; natriumazide ; in de gebruikte concentraties niet<br />
schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: De gebufferde strips bevatten 0,92 % barbital, 1,03 % natriumbarbital en 0,30 % natriumazide. Niet voor inwendig<br />
gebruik! Bij abusievelijke inname dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Bij verwijdering contact met zuren, lood of koper<br />
vermijden aangezien deze explosieve of toxische verbindingen aangaan met natriumazide.<br />
Gebruik<br />
Gebufferde sponsstrips fungeren als bufferreservoir bij elektroforese en zorgen voor contact tussen de gel en de elektroden.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Bewaar de gebufferde strips horizontaal in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur of in de koeling. (De pijl aan de voorkant van<br />
de kitdoos dient omhoog te wijzen.)<br />
De strips blijven stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of de etiketten van de verpakking van<br />
de gebufferde strips.<br />
NIET INVRIEZEN.<br />
Gooi de gebufferde strips weg als de verpakking geopend is en de strips uitdrogen.<br />
3. VERDUNNER VOOR DE KLEUROPLOSSING<br />
Bereiding<br />
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing moet toegepast worden volgens de beschrijving in de paragraaf "AMIDOZWART KLEUROPLOSSING".<br />
Het bevat een zure oplossing.<br />
Toepassing<br />
Bij de preparatie van de amidozwart kleuroplossing.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum<br />
zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET<br />
INVRIEZEN!<br />
Geen natriumazide toevoegen.<br />
4. AMIDOZWART KLEUROPLOSSING<br />
Bereiding<br />
De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed<br />
door de toename van de viscositeit of de hardwording.<br />
In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden:<br />
1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe.<br />
2. Sluit het flesje zorgvuldig.<br />
3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden.<br />
4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt.<br />
5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal.<br />
6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water.<br />
7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten.<br />
De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik.<br />
OPMERKING : Een onvolledige oplossing van de kleurstof zal een onvolledige kleuring van de albuminefractie opleveren (een laag percentage of een<br />
wit gat in de fractie).<br />
Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven,<br />
ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname.<br />
Toepassing<br />
Bij het kleuren van gels tijdens elektroforetische proteïneseparatie.<br />
BELANGRIJK : De kleuroplossing is ontwikkeld voor het kleuren van een maximum van 10 gels. Na het kleuren van 10 gels dient u de oplossing te<br />
vervangen.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping<br />
te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het<br />
label van de flesjes met kleuroplossing.<br />
De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel.<br />
De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren.<br />
5. FIXEEROPLOSSING (bij productnummer 4884)<br />
Voorbereiding<br />
De fixeeroplossing is klaar voor gebruik. Het bevat: een zuuroplossing en in de gebruikte concentraties niet schadelijke toevoegingen die noodzakelijk<br />
zijn voor een optimale werking.<br />
De fixeeroplossing is gekleurd met een niet-schadelijke gele kleurstof, om vergissingen te vermijden. Het etiket op het flesje heeft dezelfde gele kleur.<br />
Gebruik<br />
Voor het fixeren van elektroforetisch gescheiden proteïnen in de referentiespleet (ELP).<br />
OPMERKING: De fixeeroplossing is specifiek voor de immunofixatie procedure met de 6 en <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> maskers.<br />
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke<br />
flacon zetten.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De fixeeroplossing bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. De oplossing blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de<br />
labels op de flesjes fixeer.<br />
De fixeeroplossing mag geen precipitaat bevatten.<br />
6. PENTAVALENT ANTISERUM (met PN 4884)<br />
Bereiding<br />
<strong>Penta</strong>valent antiserum is gereed voor gebruik. <strong>Penta</strong>valent antiserum is een mengsel van zoogdier totaal anti-Ig menselijk immunoglobulines. Voor<br />
eenvoudige identificatie van de antisera en als steun bij het controleren van de toepassing er van, worden de antisera gekleurd met opvallende<br />
oranjegele, maar ongevaarlijke kleurstof met dezelfde kleur als op de label van het flesje.<br />
Indien het antiserum een lichte troebeling vertoont, laat het antiserum dan gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Dit zou voldoende<br />
moeten zijn om een heldere oplossing te verkrijgen; indien de troebeling echter blijft, dan zal deze in geen geval invloed hebben op de immunologische<br />
reactie. In geval van onoplosbare precipitaten wordt het aanbevolen de antisera gedurende 5 minuten te centrifugeren met 3000 rpm.<br />
Toepassing<br />
Bij immunofixatie van proteïnen die elektroforese ondergingen.<br />
OPMERKING: Het <strong>Penta</strong>valent antiserum is specifiek voor de immunofixatieprocedure met de 6 en <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> maskers.<br />
Antisera kunnen van diverse diersoorten afkomstig zijn. Daarom moet u twee verschillende antiseraflesjes nooit mengen ook niet als deze dezelfde<br />
specificiteit hebben en dient u ALTIJD het uiteinde van de pipet te vervangen bij het wisselen van het flesje met antiserum.<br />
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke<br />
flacon zetten.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De <strong>Penta</strong>valent antisera worden gekoeld bewaard (2 tot 8 °C). Zij zijn stabiel tot de vervaldatum die op de kit of op de label van het flesje met antiserum<br />
staat aangegeven.<br />
OPMERKING: Tijdens transport kunnen de antisera gedurende 15 dagen zonder koeling (15 tot 30 °C) zonder dat dit negatieve gevolgen heeft voor<br />
de werking er van.<br />
7. APPLICATORS<br />
Gebruik<br />
Voorgesneden applicators, voor eenmalig gebruik, voor het aanbrengen van de monsters.<br />
Opslag<br />
Bewaar de applicators droog en bij kamertemperatuur of gekoeld.<br />
8. FILTERPAPIER - DUN<br />
Gebruik<br />
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het absorberen van overtollige vloeistof van het oppervlak van de gel vóór het aanbrengen van de<br />
monsters.<br />
Opslag<br />
Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.<br />
9. FILTERPAPIER - KAM<br />
Gebruik<br />
Voorgesneden papieren kammen, voor het opdeppen van overtollige fixeeroplossing en antiserum van het oppervlak van de gel na de<br />
immunofixatiefase. Voor eenmalig gebruik.<br />
10. FILTERPAPIER - DIK<br />
Gebruik<br />
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het opdeppen van niet-geprecipiteerde proteïnen na de immunofixatiefase.<br />
Opslag<br />
Bewaar de dikke velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.<br />
BENODIGDE, NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA<br />
1. FIXEEROPLOSSING<br />
Bereiding<br />
Fixeeroplossing voor immunofixatie (SEBIA, PN 4799, 1 flesje, 2.5 ml) is gereed voor gebruik. Het bevat: een zure oplossing ; additieven, ongevaarlijk<br />
bij de toegepaste concentraties welke nodig zijn voor de optimale werking. De fixeeroplossing is specifiek voor de immunofixatieprocedure met<br />
de 6 en <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> maskers van SEBIA.<br />
Voor eenvoudige identificatie van de antisera en als steun bij het controleren van de toepassing er van, worden de antisera gekleurd met opvallende,<br />
maar ongevaarlijke gele kleurstof met dezelfde kleur als op de label van het flesje.<br />
Gebruik, opslag, stabiliteit en tekenen van verval: Zie vorig hoofdstuk 5.<br />
2. PENTAVALENT ANTISERUM<br />
Het <strong>Penta</strong>valent antiserum flesje (SEBIA, PN 4616, 1 ml of PN 4738, 8 ml), bevat een mengsel van zoogdier totaal anti-Ig menselijke<br />
immunoglobulines. Het is specifiek voor de immunofixatie procedure met de 6 en <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> maskers van SEBIA.<br />
Voor eenvoudige identificatie van de antisera en als steun bij het controleren van de toepassing er van, worden de antisera gekleurd met opvallende,<br />
maar ongevaarlijke oranjegele kleurstof met dezelfde kleur als op de label van het flesje.<br />
Bereiding, gebruik, opslag, stabiliteit en tekenen van verval: Zie vorig hoofdstuk 6.<br />
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3. ONTKLEURINGSOPLOSSING<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Voorbereiding<br />
Elk flesje ontkleuringsoplossing (SEBIA, prod. nr. 4540, 10 flesjes, 100 ml elk) wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water.<br />
Het is praktisch om een verdunning van een klein deel van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 5 ml concentraat te verdunnen tot 5 liter, de<br />
inhoud van de container voor de ontkleuringsoplossing. Na verdunning bevat de ontkleuringsoplossing: citroenzuur, 0,5 g/l.<br />
Gebruik<br />
Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleurstof van de gels.<br />
Voor het spoelen van het kleurcompartiment na de spoelstap.<br />
Giet om de zuurgraad van de vlekkenoplosser te neutraliseren 15 mL van een 50 % Sodium Hydroxyde-oplossing in de lege afvalbak.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De concentraat-ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de labels<br />
op de flesjes met ontkleuringsoplossing. De verdunde ontkleuringsoplossing is, in een afgesloten fles en bij kamertemperatuur, gedurende 1 week<br />
stabiel. Geen natriumazide toevoegen.<br />
Verwijder de verdunde ontkleuringsoplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting<br />
met microben.<br />
Om te voorkomen dat micro-organismen zich kunnen verspreiden in de verdunde ontkleuringsoplossing wanneer deze langer dan een week bewaard<br />
moet worden, kunt u er 5 µL/dL ProClin 300 aan toevoegen.<br />
De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot<br />
aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing.<br />
4. HYDRASYS SPOELOPLOSSING<br />
Voorbereiding<br />
Ieder flesje geconcentreerde HYDRASYS Spoeloplossing (SEBIA, prod. nr. 4541, 10 flesjes, 80 ml elk) wordt verdund tot 5 liter met gedestilleerd of<br />
gedeïoniseerd water.<br />
Na verdunning bevat de spoeloplossing: alkalische buffer, pH 8,8 ± 0,3 ; natriumazide.<br />
WAARSCHUWING: De geconcentreerde spoeloplossing bevat 0,625 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname<br />
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Natriumazide kan explosieve of toxische verbindingen aangaan met zuren, lood en<br />
koper. Na gebruik spoelen met grote hoeveelheden water.<br />
Gebruik<br />
De HYDRASYS spoeloplossing is ontwikkeld voor het afspoelen van niet-geprecipiteerde proteïnen, en dient tevens voor het spoelen van het<br />
HYDRASYS Kleuringscompartiment. Gebruik periodiek, d.w.z. als het instrument dagelijks wordt gebruikt, spoelt u het kleuringscompartiment<br />
wekelijks.<br />
Voor verdere instructies met betrekking tot het gebruik wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De geconcentreerde oplossing en de verdunde oplossing in gesloten containers bewaren bij kamertemperatuur of gekoeld. De oplossingen blijven<br />
stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de labels op de flesjes met spoeloplossing. Ruim de verdunde spoeloplossing op<br />
zodra hij van uiterlÿk verandert, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben.<br />
5. FLUIDIL<br />
Voorbereiding<br />
Fluidil (SEBIA, prod. nr. 4587, 1 flesje, 5 ml) is gereed voor gebruik.<br />
Gebruik<br />
Voor de verdunning van viskeuze of troebele monsters, bijvoorbeeld sera die cryoglobuline of cryogel bevatten.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Bewaren bij kamertemperatuur. Blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de labels op de flesjes met Fluidil.<br />
Het Fluidil moet vrij van neerslag zijn.<br />
BENODIGDE UITRUSTING EN ACCESSOIRES<br />
1. HYDRASYS Systeem SEBIA, prod. nr. <strong>12</strong>10 of nr. <strong>12</strong>11.<br />
2. Micro-pipet, voor handmatig dan wel automatisch gebruik, zoals bijvoorbeeld de HYDRAplus SEBIA, prod. nr. <strong>12</strong>15, als extra keuzemogelijkheid<br />
voor het vullen van de monsterapplicators.<br />
3. Vochtige kamer, prod. nr. <strong>12</strong>70, geleverd met HYDRASYS.<br />
4. Container Kit, geleverd met HYDRASYS.<br />
5 Malgeleidestaaf SEBIA, geleverd met HYDRASYS.<br />
6. Accessoires Kit voor HYDRASYS <strong>IF</strong> SEBIA, prod. nr. <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipetten: 10 µl en 200 µl.<br />
MONSTERS VOOR ANALYSE<br />
Verzameling en opslag van monsters<br />
Voor de analyse wordt het gebruik van verse serummonsters aanbevolen. De sera dienen te worden verzameld overeenkomstig de vastgestelde<br />
procedures zoals die worden gehanteerd bij klinische laboratoriumproeven.<br />
Indien nodig kunnen de sera tot maximaal één week worden bewaard bij een temperatuur van 2 tot 8 °C.<br />
Voor langduriger opslagperiodes kunnen de monsters worden ingevroren. Ingevroren monsters blijven ten minste één maand stabiel.<br />
Ontdooide monsters kunnen lichte applicatiesporen vertonen als gevolg van proteïne- of lipoproteïnedenaturatie.<br />
Wanneer aan ingevroren serummonsters natriumazide wordt toegevoegd, 0,02 g/dl, zorgt dit voor een verbeterde opslagstabiliteit.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Voorbereiding van de monsters<br />
Gebruik onverdunde serummonsters.<br />
Na bewaring bij 2 tot 8 °C kunnen sommige monsters (vooral die die cryoglobuline of cryogel bevatten) viskeus of troebel worden. Dergelijke monsters<br />
kunnen bewerkingsproblemen met zich meebrengen als gevolg van behinderde diffusie door de strips van de monsterapplicator. In een dergelijk geval<br />
wordt 25 µl Fluidil aan 75 µl serum toegevoegd, waarna het mengsel gedurende 15 seconden in de vortexmixer wordt gemengd. Vervolgens wordt de<br />
standaardprocedure gevolgd.<br />
Sommige monoklonale proteïnen kunnen polymeriseren, waardoor er een "monoklonale fractie" verschijnt op alle geïmmunofixeerde sporen. In dit<br />
geval kunt u als volgt te werk gaan: (I) prepareer 1% bèta-mercapto-ethanol (BME, of 2-mercapto-ethanol, 2 ME) in Fluidil, (II) voeg 25 µl van deze<br />
reductie-oplossing toe aan 75 µl puur serum, (III) mix dit in de vortexmixer en wacht ten minste 15 minuten (15 minuten minimum, 30 minuten<br />
maximum), en volg daarna de standaardprocedure.<br />
Te vermijden monsters<br />
Gebruik geen plasmamonsters: fibrinogeen geeft een band dicht bij het punt van applicatie die voor de band van een monoclonale immunoglobuline<br />
gehouden kan worden.<br />
Vermijd gehemolyseerde monsters.<br />
PROCEDURE<br />
Het HYDRASYS systeem is een multiparameter-instrument. Tot de geautomatiseerde fasen behoort bewerking van <strong>HYDRAGEL</strong> agarose-gels in de<br />
volgende volgorde: applicatie van de monsters, elektroforetische migratie, incubatie met de reagentia, drogen, spoelen, kleuren, ontkleuren en een<br />
laatste droogfase. Tot de handmatige stappen behoren de voorbereiding van de monsters en de gel, het aanbrengen van de reagentia en het in<br />
werking stellen van de automatische fasen.<br />
LEES HET HYDRASYS-INSTRUCTIEHANDBOEK NAUWKEURIG.<br />
I. VOORBEREIDING VAN DE MIGRATIE<br />
1. Schakel het HYDRASYS instrument in.<br />
2. Plaats één applicator voor de analyse van 6 monsters op <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>, of twee applicators voor de analyse van <strong>12</strong> monsters,<br />
op een vlakke ondergrond met de holtenummers met de goede kant naar boven (Fig. 1).<br />
- Breng 10 µl zuiver monster aan in elke holte. Vul elke applicator binnen 2 min.<br />
| PUTTEN |<br />
MONSTERS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
OPMERKING: De holtes met de nummers 1, 8 en 15 worden in deze test niet gebruikt. U kunt deze holtes eventueel markeren met een viltstift<br />
om te voorkomen dat u ze per ongeluk toch vult met monsters.<br />
- Plaats iedere applicator in de vochtige kamer, met de strips omhoog. Manipuleer deze aan het plastic beschermframe van de strips.<br />
Voor verdere informatie wordt u naar de bijsluiter van de vochtige kamer verwezen.<br />
- Laat de monsters gedurende 5 minuten, na de applicatie van het laatste monster, in de strips trekken. Voor later gebruik (tot maximaal 8 uur<br />
later) houdt u de gehele kamer gekoeld.<br />
3. Open het deksel van de Migratiemodule en til de dragers van de elektroden en de applicators op.<br />
WAARSCHUWING: Sluit het deksel niet als de dragers nog omhoog staan.<br />
4. Selecteer het «6/<strong>12</strong> PENTA SM/DM» migratieprogramma uit het menu op het instrument (linkerzijde van het bedieningspaneel).<br />
5. Neem de gebufferde strips uit de verpakking ; manipuleer ze aan de plastic uiteinden. Druk de geperforeerde einden van de plastic achterzijde<br />
van de strips over de pinnen op de elektrodedrager ; de plastic achterzijden van de strips moeten tegen de drager liggen (Fig. 2).<br />
6. Pak de <strong>HYDRAGEL</strong> agarose-gel uit.<br />
- Rol een dun filter voorzichtig en gelijkmatig over het oppervlak om zo het teveel aan vloeistof te absorberen. Verwijder het filterpapier direct.<br />
WAARSCHUWING : Laat het filtreerpapier niet te lang in contact met de gel om dehydratatie van de gel te vermijden.<br />
- Giet 200 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het migratieframe dat afgedrukt is op de temperatuurcontroleplaat van de migratiemodule.<br />
- Plaats de gelplaat (de gelzijde omhoog) met de rand tegen de begrenzer aan de onderzijde van het afgedrukte frame (Fig. 3).<br />
- Buig de gel en breng deze naar beneden op het water (Fig. 3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingesloten en dat het water zich<br />
onder de gehele gelplaat verspreidt (Fig. 3), en tevens dat de gel parallel met het afgedrukte frame ligt.<br />
7. Breng beide dragers omlaag. In deze positie raken de gebufferde strips de gel niet. FORCEER DE DRAGERS NIET HELEMAAL NAAR<br />
BENEDEN.<br />
8. Haal de applicator(s) uit de vochtige kamer. Manipuleer ze aan het plastic beschermframe.<br />
- Breek het beschermframe los van de tanden van de applicators.<br />
- Voor de analyse van 6 monsters op <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> plaatst u de applicator in positie nr. 6 op de drager.<br />
- Voor de analyse van <strong>12</strong> monsters plaatst u de twee applicators in de posities nr. 3 en 9.<br />
BELANGRIJK: De nummers die op de applicators zijn geprint moeten door de bediener gelezen kunnen worden (Fig. 4).<br />
9. Sluit het deksel van de migratiemodule.<br />
10. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de «START»-knop met de groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.<br />
BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de ventilatieopening aan de rechterzijde van het instrument niet geblokkeerd is.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
MIGRATIE - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN<br />
• De beide dragers worden omlaag gebracht zodat de gebufferde strips en applicators in contact komen met de gel.<br />
• De drager van de monsterapplicator komt omhoog.<br />
• De migratie wordt uitgevoerd bij 20 W continustroom bij 20 °C, geregeld door het Peltier-effect tot 42 Vh (gedurende ongeveer 9 minuten).<br />
• De elektrodedrager komt omhoog zodat de elektroden uitgeschakeld worden.<br />
• Een hoorbaar piepsignaal geeft aan dat het deksel van de module ontsloten wordt. Het volgende bericht verschijnt op het scherm: « AS».<br />
OPMERKING: Gedurende alle migratiestappen blijft het deksel van de migratiemodule vergrendeld.<br />
II. IMMUNOFIXATIE<br />
1. Open het deksel van de migratiemodule.<br />
2. Verwijder de monsterapplicator(s) en gooi ze weg.<br />
3. Breng beide dragers omhoog, verwijder de gebufferde strips aan hun plastic uiteinden en gooi ze weg.<br />
- Verwijder beide dragers.<br />
- Maak de elektroden schoon met een vochtig doekje.<br />
- Laat de gel op zijn plaats in de migratiemodule.<br />
4. Installeer de applicatiemal voor het reagens als volgt (Fig. 5):<br />
- Breng de geleider voor de applicatiemal op de verankeringsclip (de geleider kan de gehele tijd in de migratiemodule blijven).<br />
- Houd de mal bij de flap en breng deze in de geleider (de uitsparingen tegen de markeringen).<br />
- Draai de mal omlaag tot op de gel.<br />
5. Breng de reagentia als volgt aan:<br />
| SPLEET | HOEVEELHEID | REAGENS | KLEUR |<br />
| ELP | 35 µl | fixeeroplossing | geel |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µl | pentavalent antiserum | geel-oranje |<br />
OPMERKING: Om verwisseling te voorkomen zijn de kleuren van de reagentia zowel op de flesjes als op de putten in de applicatiemal<br />
aangegeven.<br />
- Neem de reagentia op zonder luchtbellen in het uiteinde van de pipet te trekken.<br />
- Breng de reagentia aan (Fig. 6):<br />
- Houd de pipet verticaal en laat het uiteinde licht tegen de bodem van het putje rusten ;<br />
- Injecteer het reagens zó dat het zich door de spleet verspreidt zonder dat er luchtbellen in komen.<br />
6. Sluit het deksel van de migratiemodule.<br />
7. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de «START»-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel. Op<br />
het scherm verschijnt het volgende bericht: «[INCUBATION]».<br />
IMMUNOFIXATIE - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN<br />
• Incubatie bij 20 °C gedurende 5 minuten (temperatuur gecontroleerd door het Peltier-effect).<br />
• Een signaaltoon geeft aan dat het deksel van de migratiemodule ontsloten wordt. Op het scherm verschijnt het volgende bericht: «❊ AS (SM)».<br />
OPMERKING: Het deksel van de migratiemodule blijft gedurende de incubatie vergrendeld.<br />
III. VERWIJDERING VAN OVERTOLLIGE REAGENTIA<br />
1. Open het deksel van de migratiemodule.<br />
2. Verwijder overtollige reagentia met de filterpapierkam (één kam voor <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, twee kammen voor <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>) (Fig. 7).<br />
- Breng de kammen elk onder een hoek van 30° in de sleuven aan de onderzijde van de malspleten, zo dat de strips de verticale zijde raken<br />
(de zijde die het verst verwijderd is van de bediener).<br />
- Laat de strips de vloeistof licht aanraken door iedere kam tot een hoek van 45° te kantelen zodat de strips de vloeistof kunnen afnemen (Fig. 8).<br />
BELANGRIJK: Iedere kam moet onder een hoek van 45° blijven. Onder een andere hoek of rechtop kunnen zij de gel beschadigen.<br />
3. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de «START»-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.<br />
VERWIJDERING VAN REAGENTIA - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN<br />
• Bij 20 °C gedurende 15 seconden kunnen de reagentia opgenomen worden uit de spleten (temperatuur gecontroleerd door het Peltier-effect).<br />
• Er klinkt een signaaltoon. Op het scherm verschijnt het volgende bericht: « PAP.».<br />
IV. HET DEPPEN VAN DE GEL<br />
1. Verwijder de kam(men).<br />
2. Controleer of de reagentia goed zijn opgenomen, zoals wordt aangegeven door:<br />
- de afwezigheid van reagentia op de gel ;<br />
- alle strips zijn over de gehele hoogte gekleurd.<br />
Als de absorbtie van de reagentia niet volledig is, dan wordt dezelfde papierkam opnieuw (in dezelfde positie) aangebracht en wordt de<br />
verwijderingsprocedure handmatig herhaald.<br />
3. Neem de reagentia-applicatiemal bij de flap en verwijder de mal.<br />
4. Breng een velletje dik filterpapier op de gel aan:<br />
- plaats het filterpapier parallel aan de rand van de gel (onder een hoek van 45°) ;<br />
- laat het voorzichtig op de gel zakken ;<br />
WAARSCHUWING: Goed aandrukken over het gehele oppervlak van het filterpapier zodat het papier goed aan de gel kan hechten.<br />
5. Sluit het deksel van de migratiemodule.<br />
6. Start de procedure door het indrukken van de «START»-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.<br />
7. Maak de applicatiemal schoon met een kleine, soepele borstel (bijvoorbeeld een tandenborstel), onder stromend water. GEBRUIK GEEN<br />
ALCOHOL OF OPLOSMIDDELEN. Zorg ervoor dat de mal volledig droog is voordat deze opnieuw gebruikt wordt ; verwijder waterdruppels<br />
uit de putjes door met de mal op tissuepapier te tikken en hem af te vegen.<br />
HET DEPPEN VAN DE GEL - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN<br />
• Bij 40 °C gedurende 3 minuten deppen (temperatuur gecontroleerd door het Peltier-effect).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
• Er klinkt een signaaltoon. Op het scherm verschijnt het volgende bericht: «❊ PAP.».<br />
V. HET DROGEN VAN DE GEL<br />
1. Open het deksel van de migratiemodule.<br />
2. Verwijder het filterpapier en laat de gel op zijn plaats.<br />
3. Sluit het deksel van de migratiemodule.<br />
4. Start de procedure door het indrukken van de «START»-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel.<br />
HET DROGEN VAN DE GEL - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE FASEN<br />
• Bij 50 °C gedurende 6 minuten drogen (temperatuur gecontroleerd door het Peltier-effect).<br />
• Er klinkt een signaaltoon, en de veiligheidsvergrendeling van het deksel van de migratiemodule wordt ontsloten. De temperatuur van de plaat blijft<br />
50 °C totdat het deksel wordt geopend.<br />
OPMERKING: Het deksel van de migratiemodule blijft gedurende de gehele droogfase vergrendeld.<br />
VI. VOORBEREIDING VAN DE GELVERWERKINGSFASEN: SPOELEN, KLEUREN EN ONTKLEUREN<br />
1. Open het deksel van de migratiemodule.<br />
2. Neem de gedroogde gelfilm eruit voor verdere bewerking.<br />
3. Open de gelhouder. Leg deze vlak op het rooster, en plaats de gedroogde gel (met de gelkant naar boven gericht) in de spleten van de beide<br />
stangen. Sluit de houder. Zorg ervoor dat de film op de juiste wijze in de houder geplaatst is (Fig. 9).<br />
4. Plaats de gelhouder in de gelverwerkings-/ kleuringsmodule.<br />
BELANGRIJK: Voordat begonnen kan worden met het gelverwerkings-/ kleuringsprogramma, moet het volgende gecontroleerd worden:<br />
- de spoelcontainer is gevuld met 400 ml spoeloplossing ;<br />
- de kleuringscontainer is gevuld met 300 ml kleuringsoplossing ;<br />
- de ontkleuringscontainer bevat ten minste 1 liter ontkleuringsoplossing ;<br />
- de afvalcontainer is leeg ;<br />
- de ongebruikte kanalen zijn geblokkeerd.<br />
5. Selecteer het «<strong>IF</strong> AMIDO» kleuringsprogramma uit het menu op het instrument. Start de procedure door het indrukken van de «START»-knop<br />
(groene pijl op de rechterzijde van het bedieningspaneel).<br />
Gedurende de kleur-, onkleur- en droogstappen blijft het compartiment gesloten.<br />
Na de koelstap geeft een audiosignaal aan dat het compartiment ontsloten wordt (de ventilatie wordt doorgezet totdat de gelhouder<br />
verwijderd is).<br />
OPMERKINGEN:<br />
- De temperatuur van de migratieplaat blijft dalen nadat het deksel geopend werd, tot een temperatuur van 20 °C is bereikt (in ongeveer 5 minuten).<br />
Dan kan met een nieuwe migratiecyclus begonnen worden.<br />
- Veeg de temperatuurcontroleplaat schoon met een vochtig doekje.<br />
- Breng de monsterapplicator- en elektrodedragers terug in positie.<br />
VII. AFRONDING VAN DE GELVERWERKING<br />
1. Haal de gelhouder uit het compartiment ; open de gelhouder en haal de droge gel eruit.<br />
2. Indien nodig kunt u de achterzijde van de gel (plastic steun) met een vochtig doekje schoonmaken.<br />
NOOT: Voor de gels met verschilende rijen (2 of 3) kunnen de migratielengtes aanzienlijk verschillen, zonder de resultaten te beïnvloeden.<br />
RESULTATEN<br />
Het pentavalent antiserum detecteert:<br />
• immunoglobulinen: Ig A (K of L), Ig G (K of L), Ig M (K of L) ;<br />
• vrije kappa en lambda lichte ketens ;<br />
• immunoglobulinen: Ig D (K of L), Ig E (K of L), die worden gedetecteerd aan de hand van hun kappa en lambda lichte ketens.<br />
Interpretatie<br />
Een normaal serum geeft een lichtelijk gekleurde, gediffundeerde zone te zien, zonder scherpe begrenzing, die overeenkomt met de polyclonale<br />
immnunoglobulinen (G, A, M, kappa en lambda).<br />
Een hypergammaglobulinemie wordt gekarakteriseerd door een veel sterker gekleurde gediffundeerde zone, maar zonder monoclonale fractie.<br />
Een gammopathie wordt gekarakteriseerd door één of meer monoclonale banden, aangetoond met behulp van het pentavalent antiserum.<br />
Speciale gevallen<br />
• Een lichte monoclonale gammopathie kan in een normaal elektroforetisch profiel verborgen blijven (bijvoorbeeld bèta-mobiliteit dysglobuline). Deze<br />
band kan met het pentavalent antiserum worden ontdekt.<br />
• Een hypogammaglobulinemie kan met een monoclonale vrije lichte keten geassocieerd worden. Dit proteïne wordt, vanwege zijn lage moleculaire<br />
gewicht, door de nier geëlimineerd en via de urine afgevoerd (Bence Jones Proteïne). De resterende hoeveelheid in het serum is gewoonlijk erg<br />
gering, maar het kan aangetoond worden door middel van immunofixatie met pentavalent antiserum.<br />
• Wanneer een monoklonaal type band wordt waargenomen op serum-elektroforese (ELP-spoor) maar dit niet wordt bevestigd door immunofixatie,<br />
dient u primair verdacht te zijn op fibrinogeen (plasmamonster).<br />
• Wanneer een monoklonaal type band wordt waargenomen op alle immunofixatiesporen, dient de verdenking uit te gaan naar cryoglobuline of<br />
gepolymeriseerd Ig M. Depolymeriseer met een reductiemiddel en herhaal de procedure (zie "Monsters ter analyse").<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Een monoklonaal lijkende fractie moet geïdentificeerd worden door middel van verder onderzoek met <strong>HYDRAGEL</strong> Immunofixatie kits met het<br />
standaard masker:<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4804 of 4808, of <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong> SEBIA,<br />
PN 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4822 of <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES SEBIA,<br />
PN 4824.<br />
Interferentie en begrenzingen<br />
Het gebruik van antisera die niet specifiek zij voor de immunofixatieprocedure met het standaard masker kan de resultaten beïnvloeden.<br />
Met het oog op de resolutie- en gevoeligheidsbeperkingen van zone-elektroforese is het mogelijk dat niet alle monoclonale componenten met deze<br />
methode volledig worden gedetecteerd.<br />
Troubleshooting<br />
Bel de technische dienst van de leverancier als de test mislukt terwijl u de instructies voor voorbereiding en opslag van materialen, en voor de<br />
procedure, nauwkeurig hebt gevolgd.<br />
De veiligheidsbladen behorend bij de reagentia in de Kit als ook informatie over de verwerking van afval of restproducten kunt u verkrijgen bij de<br />
Technische Dienst van de leverancier.<br />
RELEVANTE TESTRESULTATEN<br />
Reproduceerbaarheid en specificiteit<br />
De reproduceerbaarheid werd op twee pathologische serummonsters aangetoond met respectievelijk een hoog en een laag niveau monoclonale<br />
component, een serum met een verhoogde alfa-1 - alfa-2 zone, en een normaal serum. Elk monster werd op 3 partijen <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Kit<br />
getest.<br />
Alle geteste monsters produceerden identieke resultaten voor de 3 lotnummers waarbij, voor het type monster dat werd getest, de verwachte<br />
typerende patronen verschenen. Immunofixatie leverde geen monoclonale banden op bij het serum dat een ontstekingspatroon liet zien, noch bij het<br />
normale serum.<br />
Nauwkeurigheid<br />
Dertig (30) verschillende monsters (29 pathologische sera en een normaal serum) werden elk getest op de <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Kit, <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>IF</strong> Kit en een ander in de handel verkrijgbaar agarose-gel-immunofixatiesysteem. Bij alle pathologische monsters werden, met elk systeem of elke<br />
procedure, identieke banden aangetoond.<br />
Gevoeligheid<br />
Er werden seriële verdunningen geprepareerd van 3 pathologische serummonsters, die alledrie een monoclonale component vertoonden.<br />
De resultaten worden hieronder samengevat:<br />
MONOCLONALE COMPONENT DETECTIELIMIET (g/l) MONSTER Nr. TYPE CONC. (g/l) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> VERGELIJKENDE TEST 1 gamma, kappa 18 0,25 0,25 2 alfa, lambda 7,3 0,<strong>12</strong> 0,5 | 3 | mu, kappa | 9 | 0,5 | 0,5 |<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
Voor aanvullende informatie met betrekking tot de interpretatie van immunofixatiepatronen wordt verwezen naar:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
UTILIZZO<br />
II kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> sono stati progettati per l’identificazione di proteine monoclonali nel siero umano mediante<br />
elettroforesi ed immunofissazione su gel di agarosio tamponato in mezzo alcalino (pH 9.1). I kits sono usati in combinazione con il sistema semiautomatico<br />
HYDRASYS per eseguire tutte le fasi necessarie all’ottenimento di gels pronti per l’interpretazione. Le sieroproteine sono fatte migrare ed<br />
immunofissate mediante un antisiero pentavalente anti catene pesanti gamma (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M) ed anti catene leggere kappa e lambda<br />
(libere e legate). Dopo l’immunofissazione, le proteine precipitate sono colorate con amidoschwarz. L’eccesso di colorante è rimosso con una<br />
soluzione acida.<br />
Ogni gel dei kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> permette di processare rispettivamente 6 e <strong>12</strong> campioni.<br />
Per uso diagnostico in vitro.<br />
PRINCIPIO DEL METODO<br />
Bande anomale nel quadro elettroforetico sieroproteico, generalmente con mobilità in zona gamma, ma anche in zona alfa e beta (queste possono<br />
essere nascoste dalle normali proteine delle zone corrispondenti), sono presunte essere proteine monoclonali e pertanto un indice di gammapatie.<br />
Per identificare tali bande anomale si utilizza la tecnica dell’immunofissazione.<br />
L’immunofissazione elettroforetica è una semplice tecnica che permette di fissare una proteina in situ formando un complesso insolubile con anticorpi<br />
specifici.<br />
Tale tecnica consta di quattro fasi:<br />
1. Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel di agarosio.<br />
2. Fissazione ed immunoprecipitazione delle proteine migrate: soluzione fissativa ed antisiero sono stratificati direttamente sulla superficie del gel<br />
nelle appropriate corsie di migrazione. Soluzione fissativa ed antisiero diffondono nel gel precipitando, rispettivamente, le proteine ed i<br />
corrispondenti antigeni.<br />
3. Le proteine non precipitate e quindi solubili sono rimosse dal gel mediante asciugatura e lavaggio. Il complesso antigene-anticorpo precipitato è<br />
intrappolato all’interno della matrice del gel.<br />
4. Le proteine precipitate sono evidenziate con la colorazione. Le bande immunoprecipitate sono poi comparate con le corrispondenti bande anomale<br />
visibili nel quadro elettroforetico sieroproteico di riferimento.<br />
Per evidenziare ed identificare le presunte componenti monoclonali i campioni sono fatti migrare contemporaneamente in due corsie. Dopo<br />
l’elettroforesi la corsia ELP serve da riferimento, mostrando il quadro elettroforetico delle proteine del campione. La corsia immunologica (<strong>Penta</strong>), rivela<br />
le componenti monoclonali che hanno reagito con l’antisiero pentavalente.<br />
Questa semplice e rapida tecnica fornisce un quadro chiaro e facilmente interpretabile.<br />
REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEL KIT <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> E <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
COMPONENTI PN 4841 PN 4842 PN 4884* Gels di Agarosio (pronti all’uso) 10 gels 10 gels 80 gels Strisce tamponate (pronte all’uso) 10 confezioni da 2 10 confezioni da 2 80 confezioni da 2 Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 flacone da 60 ml 1 flacone da 60 ml 8 flaconi da 60 ml Colorante Amidoschwarz (soluzione concentrata) 1 flacone da 20 ml 1 flacone da 20 ml 8 flaconi da 20 ml Soluzione Fissativa (pronta all’uso) 3 flaconi da 14.4 ml Immunoglobuline di mammifero anti-Ig catene umane (gamma, 3 flaconi da 8.0 ml alfa, mu, kappa e lambda): antisiero pentavalente (pronto all’uso) Applicatori (pronti all’uso) 1 confezione da 10 2 confezioni da 10 16 confezioni da 10 Cartine da filtro sottili 1 confezione da 10 1 confezione da 10 8 confezioni da 10 Pettini di carta da filtro 1 confezione da 10 2 confezioni da 10 16 confezioni da 10<br />
| Cartine da filtro spesse | 1 confezione da 10 | 1 confezione da 10 | 8 confezioni da 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTA: La soluzione fissativa e l’antisiero <strong>Penta</strong>valente sono forniti separatamente dal kit ad esclusione del MAXI-KIT (Vedi REAGENTI RICHIESTI<br />
MA NON FORNITI).<br />
PER RISULTATI OTTIMALI<br />
I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit.<br />
LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO.<br />
1. GELS DI AGAROSIO<br />
Preparazione<br />
I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 8 g/l ; tampone tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle<br />
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.<br />
AVVERTENZA: I gels di agarosio contengono 0.31 % di barbital e 0.34 % di barbital sodico. Non ingerire! Se ingerito consultare<br />
immediatamente un medico!<br />
Utilizzo<br />
Mezzo di supporto per elettroforesi ed immunofissazioni proteiche.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare i gels orizzontalmente nella confezione originale protettiva a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono stabili<br />
fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). Evitare<br />
la conservazione nelle seguenti condizioni: in prossimità di fenestre ; in prossimità di sorgenti di calore ; in presenza di brusche e/o significative<br />
variazioni di temperatura. NON CONGELARE.<br />
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FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Non utilizzare il gel quando:<br />
(i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del<br />
congelamento del gel),<br />
(ii) è presente muffa o flora batterica,<br />
(iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni<br />
di conservazione improprie).<br />
2. STRISCE TAMPONATE<br />
Preparazione<br />
Le strisce tamponate sono pronte all’uso. Ogni striscia contiene: tampone tris-barbital pH 9.1 ± 0.3 ; sodio azide ; additivi, non rischiosi alle<br />
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.<br />
AVVERTENZA: Il tampone nelle strisce contiene 0.92 % di barbital, 1.03 % di barbital sodico e 0.30 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerite<br />
consultare immediatamente un medico! Quando smaltite, evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono originare composti<br />
esplosivi o tossici con la sodio azide.<br />
Utilizzo<br />
Le strisce di spugna tamponate funzionano da riserva di tampone per l’elettroforesi ed assicurano il contatto tra il gel e gli elettrodi.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare le strisce tamponate orizzontalmente nella loro confezione protettiva, a temperatura ambiente o in frigorifero. (La freccia sulla scatola del<br />
kit deve essere rivolta verso l’alto).<br />
Le strisce sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta della confezione delle strisce.<br />
NON CONGELARE.<br />
Non utilizzare le strisce se la confezione è aperta e le strisce sono asciutte.<br />
3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE<br />
Preparazione<br />
Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ".<br />
Contiene una soluzione acida.<br />
Utilizzo<br />
Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola<br />
del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE.<br />
Non aggiungere sodio azide.<br />
4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ<br />
Preparazione<br />
Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del<br />
suo potere colorante siano minimamente alterati.<br />
Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo.<br />
1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato.<br />
2. Chiudere accuratamente il flacone.<br />
3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi.<br />
4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.<br />
5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario.<br />
6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.<br />
7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata.<br />
8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti.<br />
Il colorante è pronto all’uso.<br />
NOTA : Una risospensione incompleta del colorante può causare una cattiva colorazione della frazione albumina (percentaule bassa di albumina o<br />
svuotamento al centro della frazione).<br />
Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi<br />
alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali.<br />
AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione.<br />
Utilizzo<br />
Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine.<br />
IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire<br />
l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante.<br />
Il colorante diluito è stabile 1 mese.<br />
Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore.<br />
5. SOLUZIONE FISSATIVA (con PN 4884)<br />
Preparazione<br />
La soluzione fissativa è pronta all’uso. Contiene: soluzione acida ; additivi, non rischiosi alle concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.<br />
Per una facile identificazione e come aiuto nel controllo della sua corretta applicazione, il fissativo è colorato con un colorante atossico, tale colore è<br />
riportato sull’etichetta del flacone e sulla corrispondente pista della maschera di stratificazione dei reagenti.<br />
Utilizzo<br />
Per fissare le proteine separate mediante l’elettroforesi nella pista di riferimento (ELP).<br />
NOTA : La soluzione fissativa è specifica per la tecnica di immunofissazione realizzata con le maschere 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni<br />
utilizzo.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare la soluzione fissativa a temperatura ambiente o in frigorifero. Il fissativo è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del<br />
kit o sulla etichetta del flacone del fissativo.<br />
La soluzione fissativa deve essere priva di precipitato.<br />
6. ANTISIERO PENTAVALENTE (con PN 4884)<br />
Preparazione<br />
L’antisiero pentavalente è pronto all’uso. Contiene delle immunoglobuline totali di mammifero anti-umane. Ha un colore giallo-arancio per evitare errori<br />
durante l’utilizzo. Lo stesso colore è riportato sull’etichetta del flacone.<br />
Se l’antisiero è leggermente torbido o presenta un precipitato, generalmente basta mettere il flacone a temperatura ambiente circa 10 minuti prima<br />
del suo utilizzo. L’aspetto torbido, anche se persiste, non altera la reazione immunologica. In caso di precipitato insolubile, si raccomanda di<br />
centrifugare l’antisiero per 5 minuti a 3000 rpm.<br />
Utilizzo<br />
Per l’immunoprecipitazione delle proteine separate elettroforeticamente.<br />
NOTA: L’antisiero <strong>Penta</strong>valente è specifico per la tecnica di immunofissazione realizzata con le maschere 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Gli antisieri possono essere di differenti origini animali. Non bisogna quindi assolutamente mescolare due flaconi di antisieri, anche se con la stessa<br />
specificità, e bisogna SEMPRE cambiare il puntale della pipetta quando si usa un flacone diverso.<br />
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni<br />
utilizzo.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
L’antisiero <strong>Penta</strong>valente deve essere conservato in frigorifero (tra 2 e 8 °C). E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o<br />
sull’etichetta del flacone di antisiero.<br />
NOTA : Durante il trasporto, l’antisiero può restare a temperatura ambiente (tra 15 e 30 °C) per 15 giorni senza che ciò alteri la qualità del test.<br />
7. APPLICATORI<br />
Utilizzo<br />
Applicatori monouso, pretagliati, per l’applicazione dei campioni.<br />
Conservazione<br />
Conservare gli applicatori lontano dall’umidità a temperatura ambiente o in frigorifero.<br />
8. CARTINE DA FILTRO - SOTTILI<br />
Utilizzo<br />
Cartine assorbenti sottili, pretagliate, monouso per l’eliminazione dell’eccesso di liquido dalla superficie del gel prima dell’applicazione dei campioni.<br />
Conservazione<br />
Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.<br />
9. PETTINI DI CARTA DA FILTRO<br />
Utilizzo<br />
Pettini di carta assorbente spessa, pretagliati, monouso per l’eliminazione dell’eccesso di soluzione fissativa e di antisiero dalla superficie del gel dopo<br />
l’incubazione.<br />
10. CARTINE DA FILTRO - SPESSE<br />
Utilizzo<br />
Cartine assorbenti spesse, pretagliate, monouso per l’eliminazione dal gel delle proteine non precipitate dopo la fase di immunofissazione.<br />
Conservazione<br />
Conservare le cartine da filtro spesse in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.<br />
REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI<br />
1. SOLUZIONE FISSATIVA<br />
Preparazione<br />
La soluzione fissativa per immunofissazione (SEBIA, Ref N° 4799, 1 flacone da 2,5 mL) è pronta all’uso. Contiene: una soluzione acida e dei<br />
componenti senza pericolo alle concentrazioni utilizzate, necessari per ottimizzare l’analisi. E’ specifico per la tecnica di immunofissazione<br />
realizzata con le maschere 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Ha un colore giallo per evitare errori durante l’utilizzo. Lo stesso colore è riportato sull’etichetta del flacone.<br />
Utilizzo, conservazione, stabilità e segni di deterioramento : vedere paragrafo 5 precedente.<br />
2. ANTISIERO PENTAVALENTE<br />
Il flacone di antisiero <strong>Penta</strong>valente (SEBIA, Ref N° 4616, 1 flacone da 1 mL o Ref N° 4738, 1 flacone da 8 mL) contiene delle immunoglobuline totali<br />
di mammifero anti-Ig umane. E’ specifico per la tecnica di immunofissazione realizzata con le maschere 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Ha un colore giallo-arancio per evitare errori durante l’utilizzo. Lo stesso colore è riportato sull’etichetta del flacone.<br />
Preparazione, Utilizzo, Conservazione e stabilità: Vedere paragrafo 6 precedente.<br />
3. SOLUZIONE DECOLORANTE<br />
Preparazione<br />
Ogni flacone di Soluzione Decolorante concentrata (SEBIA, PN 4540, 10 flaconi da 100 ml ciascuno) deve essere diluito a 100 litri con acqua<br />
deionizzata o distillata. Per convenienza diluire solo 5 ml di soluzione concentrata a 5 litri, ossia al volume della tanica della soluzione decolorante.<br />
Dopo la diluizione la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.5 g/l.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Utilizzo<br />
Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel.<br />
Per il risciacquo del compartimento di colorazione dopo la fase di lavaggio.<br />
Per neutralizzare l’acidità della soluzione decolorante versare, nella tanica vuota dei liquidi reflui, 15 mL di una soluzione al 50 % di Idrossido di Sodio.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino all data di scadenza<br />
indicata sulla scatola del kit o sulla etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente<br />
in flacone chiuso. Non aggiungere sodio azide.<br />
Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.<br />
Per prevenire le proliferazioni microbiche nella soluzione decolorante diluita, da conservare oltre una settimana, aggiungere 5 µL/dL di ProClin 300.<br />
La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data<br />
di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante.<br />
4. SOLUZIONE DI LAVAGGIO HYDRASYS<br />
Preparazione<br />
Ogni flacone di Soluzione di Lavaggio concentrata HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 flaconi da 80 ml ciascuno) deve essere diluito a 5 litri con acqua<br />
distillata o deionizzata. Dopo la diluizione la soluzione di lavaggio contiene: tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; sodio azide.<br />
AVVERTENZA: La soluzione di lavaggio concentrata contiene 0.625 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerita consultare immediatamente<br />
un medico! La sodio azide può portare alla formazione di composti tossici o esplosivi se posta a contatto con acidi, piombo o rame. Quando<br />
smaltita, fare scorrere un’abbondante quantità di acqua.<br />
Utilizzo<br />
La soluzione di lavaggio HYDRASYS ha la funzione di rimuovere le proteine non precipitate dai gels. Serve inoltre per lavare il compartimento di<br />
colorazione di HYDRASYS. Usare periodicamente ; per esempio, se lo strumento è usato giornalmente lavare il compartimento di colorazione<br />
settimanalmente.<br />
Consultare l’inserto nella confezione per la procedura di utilizzo.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare sia la soluzione di lavaggio concentrata che quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero in contenitore chiuso. Entrambe le<br />
soluzioni sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone della soluzione di lavaggio.<br />
Eliminare la soluzione di lavaggio diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.<br />
5. FLUIDIL<br />
Preparazione<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 flacone da 5 ml) è pronto all’uso.<br />
Utilizzo<br />
Per diluire campioni viscosi o torbidi, per esempio, sieri contenenti criogloguline o criogel.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento.<br />
Conservare a temperatura ambiente. Fluidil è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone.<br />
Fluidil deve essere privo di precipitato.<br />
APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI<br />
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN <strong>12</strong>10 o PN <strong>12</strong>11.<br />
2. Dispensatore manuale, o in alternativa, per il caricamento degli applicatori dei campioni, campionatore automatico HYDRAplus SEBIA, PN <strong>12</strong>15.<br />
3. Camera umida, PN <strong>12</strong>70, fornita con HYDRASYS.<br />
4. Kit di taniche fornito con HYDRASYS.<br />
5 Barra metallica per il fissagio della maschera SEBIA, fornita con HYDRASYS.<br />
6. Kit di accessori per HYDRASYS <strong>IF</strong>, SEBIA, PN <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipette: 10 µl e 200 µl.<br />
CAMPIONI PER L’ANALISI<br />
Raccolta e conservazione del campione<br />
Per l’analisi sono raccomandati campioni freschi. I sieri devono essere prelevati seguendo le procedure convenzionali per i tests clinici di laboratorio.<br />
Refrigerare i campioni (2 - 8 °C) subito dopo il prelievo e conservare al massimo una settimana.<br />
Per periodi di conservazioni più lunghi, congelare i campioni. I campioni congelati sono stabili fino ad 1 mese.<br />
I campioni scongelati possono dar luogo a leggeri segni nel punto di applicazione causati dalla denaturazione delle proteine o delle lipoproteine.<br />
I sieri congelati con aggiunta di sodio azide, 0.2 g/L, migliorano la stabilità di conservazione.<br />
Preparazione del campione<br />
Usare campioni di siero non diluiti.<br />
Dopo refrigerazione o congelamento, alcuni sieri, in particolare quelli contenenti crioglobuline o criogel, possono essere viscosi o torbidi. Tali sieri<br />
possono presentare problemi di applicazione dovuti alla impedita diffusione nei dentini di applicazione. In questi casi, aggiungere 25 µl di Fluidil a 75 µl<br />
di campione ed agitare per 15 secondi. Seguire quindi la procedura.<br />
Alcune proteine monoclonali possono polimerizzare dando luogo ad una "frazione monoclonale" che si presenta in tutte le piste di immunofissazione.<br />
In questo caso (i) preparare una soluzione all’1 % di beta-mercaptoetanolo (BME, o 2-mercaptoethanol, 2ME) in Fluidil, (ii) aggiungere 25 µL di<br />
soluzione riducente a 75 µL di siero non diluito, (iii) agitare ed attendere per almeno 15 minuti (massimo 30 minuti) e quindi eseguire la procedura.<br />
Campioni da evitare<br />
Evitare campioni di plasma. Il fibrinogeno dà luogo ad una banda vicino al punto di applicazione che può essere scambiata per una banda<br />
monoclonale.<br />
Non utilizzare campioni emolizzati.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
PROCEDURA<br />
Il sistema HYDRASYS è uno strumento multiparametrico semi-automatico. Le fasi automatiche includono il trattamento dei gels di agarosio<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> nella seguente sequenza: applicazione del campione, migrazione elettroforetica, incubazione con la soluzione fissativa e con l’antisiero,<br />
essiccazione, colorazione, decolorazione ed essiccazione finale. Le fasi manuali includono la manipolazione dei campioni, dei gels, l’applicazione del<br />
fissativo e dell’antisiero e la preparazione dello strumento per l’uso.<br />
LEGGERE ATTENTAMENTE IL MANUALE DI ISTRUZIONE HYDRASYS.<br />
I. MIGRAZIONE<br />
1. Accendere lo strumento HYDRASYS.<br />
2. Posizionare un applicatore per l’analisi di 6 campioni su <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> o due applicatori per l’analisi di <strong>12</strong> campioni, su una<br />
superficie piana con i numeri dei pozzetti rivolti verso l’alto (Fig. 1).<br />
- Applicare 10 µl di campione in ogni pozzetto. Caricare ciascun applicatore entro 2 minuti.<br />
| POZZETTI |<br />
CAMPIONI ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
NOTA: I pozzetti no. 1, 8 e 15 non sono utilizzati, per evitarne il riempimento con il campione, possono essere marcati con un pennarello.<br />
- Inserire ciascun applicatore nella camera umida di conservazione, con i dentini rivolti verso l’alto (maneggiare i depositori mediante la cornice<br />
protettiva in plastica).<br />
Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli.<br />
- Lasciare che i campioni diffondano nei dentini per 5 minuti dall’applicazione dell’ultimo campione. Mantenere la camera, così preparata, in<br />
frigorifero se si intende usare gli applicatori più tardi (fino ad 8 ore).<br />
3. Aprire lo sportello del modulo di migrazione ed alzare le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori<br />
AVVERTENZA: Non chiudere mai lo sportello se le cornici mobili sono alzate.<br />
4. Selezionare il programma di migrazione «6/<strong>12</strong> PENTA MS/MD» dal menù dello strumento (lato sinistro della tastiera).<br />
5. Estrarre le strisce tamponate dalla confezione ; maneggiarle mediante le estremità in plastica. Agganciare le estremità in plastica forate agli<br />
spinotti della cornice porta elettrodi ; le estremità in plastica della striscia devono essere rivolte verso la cornice mobile (Fig. 2).<br />
6. Estrarre il gel dalla confezione.<br />
- Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido dalla superficie del gel, facendo aderire sul gel una cartina da filtro sottile.<br />
AVVERTENZA: Non lasciare assolutamente la cartine da filtro in contatto prolungato con il gel in modo da evitare la sua disidratazione.<br />
- Dispensare 200 µl di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sulla piastra di controllo temperatura del modulo<br />
di migrazione.<br />
- Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 3)<br />
- Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia di acqua. Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere<br />
uniformemente stratificata al di sotto della lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato.<br />
7. Abbassare entrambe le cornici mobili. In questa posizione le strisce tamponate non toccano il gel. NON FORZARE LE CORNICI MOBILI AD<br />
ABBASSARSI ULTERIORMENTE.<br />
8. Estrarre ciascun applicatore dalla camera di umidificazione. Maneggiare gli applicatori mediante la cornice di protezione.<br />
- Staccare la cornice di protezione dei dentini dell’applicatore.<br />
- Per l’analisi di 6 campioni con <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> 6/<strong>12</strong> <strong>Penta</strong>, inserire l’applicatore sulla cornice mobile in posizione No 6.<br />
- Per l’analisi di <strong>12</strong> campioni, inserire i due applicatori in posizione No 3 e 9.<br />
IMPORTANTE: I numeri stampati sugli applicatori devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4).<br />
9. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.<br />
10. Avviare la procedura immediatamente premendo la freccia verde «START» sul lato sinistro della tastiera.<br />
IMPORTANTE: Assicurarsi che la griglia di ventilazione sul lato destro dello strumento non sia ostruita.<br />
MIGRAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• Le due cornici mobili vengono abbassate in modo che le strisce tamponate e gli applicatori entrino in contatto con il gel.<br />
• La cornice mobile porta applicatori si alza.<br />
• Ha luogo la migrazione in condizioni di potenza costante, 20 W a 20 °C controllati mediante effetto Peltier, fino ad accumulare 42 Vh (per circa 9 minuti).<br />
• La cornice mobile porta elettrodi si alza interrompendo il contatto.<br />
• Un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione è stato sbloccato. Sullo schermo compare il messaggio: « AS».<br />
NOTA: Lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato durante tutte le fasi della migrazione.<br />
II. IMMUNOFISSAZIONE<br />
1. Aprire lo sportello del modulo di migrazione.<br />
2. Rimuovere l’applicatore o gli applicatori ed eliminarli.<br />
3. Alzare entrambe le cornici mobili, rimuovere le strisce tamponate mediante le estremità in plastica ed eliminarle.<br />
- Estrarre il carrello porta applicatori ed elettrodi.<br />
- Pulire gli elettrodi con della carta soffice inumidita.<br />
- Lasciare il gel in posizione nel modulo di migrazione.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. Posizionare la maschera per l’applicazione dei reattivi come segue (Fig. 5):<br />
- Posizionare la guida per la maschera di applicazione sui due spinotti inferiori di ancoraggio (la guida può essere sempre lasciata nel modulo<br />
di migrazione).<br />
- Tenere la maschera tramite la aletta superiore ed inserirla nella guida (il gancio destro della maschera si inserisce nell’incavo della guida).<br />
- Abbassare la maschera sul gel.<br />
5. Applicare i reattivi come segue.<br />
| PISTA | VOLUME | REATTIVO | COLORE |<br />
| ELP | 35 µl | soluzione fissativa | giallo |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µl | antisiero pentavalente | giallo-arancio |<br />
NOTA: Per evitare scambi i colori dei reattivi sono indicati sia sulle etichette dei flaconi che sui pozzetti di applicazione della maschera.<br />
- Prelevare i reagenti evitando di intrappolare bolle di aria nel puntale della pipetta.<br />
- Applicare i reattivi (Fig. 6):<br />
- Tenere la pipetta verticalmente ed appoggiare leggermente il puntale alla base del pozzetto.<br />
- Iniettare il reattivo in modo che si stratifichi lungo tutta la pista senza intrappolare bolle di aria.<br />
6. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.<br />
7. Far partire la procedura immediatamente premendo la freccia verde «START» sul lato sinistro della tastiera. Sullo schermo compare il<br />
messaggio “[INCUBAZIONE]”.<br />
IMMUNOFISSAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• Incubazione a 20 °C per 5 minuti (la temperatura è controllata mediante effetto Peltier).<br />
• Un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione si sta sbloccando. Sullo schermo compare il messaggio: «❊ AS (MS)».<br />
NOTA: Durante l’incubazione lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato.<br />
III. ELIMINAZIONE DELL’ECCESSO DI REATTIVI<br />
1. Alzare lo sportello del modulo di migrazione.<br />
2. Rimuovere l’eccesso di reattivi con i pettini di carta da filtro (un pettine per <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, due pettini per <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>)<br />
(Fig. 7):<br />
- Inserire il pettine(i) con un angolo di 30°, nelle fessure, sottostanti le piste della maschera, in modo che i denti ne tocchino il lato verticale,<br />
opposto all’operatore.<br />
- Permettere ai denti di entrare delicatamente in contatto con il liquido inclinando il pettini a 45° e consentendo così ai pettini di aspirare il<br />
liquido (Fig. 8).<br />
IMPORTANTE: I pettini non devono toccare il gel. Ogni pettine deve rimanere inclinato a 45°. Se sono tenuti in posizione verticale potrebbero<br />
danneggiare il gel.<br />
3. Avviare la procedura premendo il tasto «START» (freccia verde sul lato sinistro della tastiera).<br />
ELIMINAZIONE DEI REATTIVI - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• I reagenti sono assorbiti dai denti per 15 secondi a 20 °C (controllati mediante effetto Peltier).<br />
• Viene emesso un segnale acustico. Sullo schermo compare il messaggio: « CARTA».<br />
IV. ASCIUGATURA DEL GEL<br />
1. Rimuovere i pettini.<br />
2. Controllare che i reattivi siano stati correttamente assorbiti come indicato da:<br />
- assenza di reattivi sul gel.<br />
- denti colorati in tutta la loro lunghezza.<br />
Se l’assorbimento dei reattivi risultasse incompleto inserire nuovamente il medesimo pettine nella medesima posizione e ripetere<br />
manualmente la procedura di eliminazione.<br />
3. Afferrare la maschera per la deposizione dei reattivi mediante la aletta, alzarla ed estrarla.<br />
4. Applicare una cartina da filtro spessa sul gel:<br />
- allineare il margine della cartina da filtro sul margine del gel inclinandola di 45°.<br />
- abbassarla sul gel.<br />
ATTENZIONE: Premere sull’intera superficie della carta da filtro, per assicurare la perfetta aderenza tra il gel e la carta.<br />
5. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.<br />
6. Avviare la procedura premendo il tasto «START» (freccia verde sul lato sinistro della tastiera).<br />
7. Pulire la maschera con acqua ed uno spazzolino (es., spazzolino da denti). NON USARE ALCOOL O SOLVENTI. Assicurarsi che la maschera<br />
sia completamente asciutta prima di utilizzarla nuovamente ; rimuovere le gocce di acqua dai pozzetti scuotendola leggermente su della carta<br />
assorbente soffice.<br />
ASCIUGATURA - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• Asciugatura a 40 °C mediante effetto Peltier per 3 minuti.<br />
• Viene emesso un segnale acustico. Sullo schermo compare il messaggio: «❊ CARTA».<br />
V. ESSICCAZIONE DEL GEL<br />
1. Aprire lo sportello del modulo di migrazione.<br />
2. Rimuovere la cartina da filtro lasciando il gel in posizione.<br />
3. Chiudere lo sportello.<br />
4. Avviare la procedura premendo il tasto «START» (freccia verde sul lato sinistro della tastiera).<br />
ESSICCAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• Essiccazione a 50 °C controllati mediante effetto Peltier per 6 minuti.<br />
• Un segnale acustico avverte che lo sportello è sbloccato. La temperatura della piastra rimane a 50 °C finchè lo sportello non viene aperto.<br />
NOTA: Il modulo di migrazione rimane bloccato durante la fase di essiccazione.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
VI. TRATTAMENTO DEL GEL<br />
1. Aprire lo sportello.<br />
2. Estrarre il gel essiccato pronto per i trattamenti successivi.<br />
3. Aprire il telaio porta gel. Metterlo in posizione piana ed inserire la lastrina (con il gel rivolto verso l’operatore) nelle scanalature delle due guide,<br />
quindi chiudere il telaio. Assicurarsi che il gel sia correttamente posizionato all’interno del telaio.<br />
4. Inserire il telaio porta gel nel Modulo di trattamento/colorazione del gel.<br />
IMPORTANTE: Prima di avviare il programma di trattamento/colorazione del gel controllare che:<br />
- la tanica della soluzione di lavaggio contenga almeno 400 ml di soluzione di lavaggio.<br />
- la tanica del colorante sia riempita con 300 ml di soluzione colorante.<br />
- la tanica del decolorante contenga almeno 1 litro di soluzione decolorante.<br />
- la tanica dei liquidi reflui sia vuota.<br />
Per la connessione dei reagenti: Riferirsi alle informazioni mostrate sul visore dello strumento (premere il tasto: VISUAL CANALI).<br />
IMPORTANTE: Non dimenticare di chiudere gli ingressi dei reagenti non utilizzati.<br />
5. Selezionare il programma di colorazione «<strong>IF</strong> AMIDO» dal menù dello strumento ed avviare la procedura premendo il tasto «START» (freccia<br />
verde sul lato destro dello strumento).<br />
Durante i cicli di colorazione, decolorazione e asciugatura, il compartimento rimane bloccato.<br />
Dopo il ciclo di raffreddamento, un segnale acustico indica che il compartimento è sbloccato (la ventilazione è mantenuta fino a quando il<br />
supporto del gel viene rimosso)<br />
NOTE:<br />
- La temperatura della piastra di migrazione decresce a partire dall’apertura del coperchio finchè non raggiunge 20 °C (in meno di 5 minuti). A questo<br />
punto può essere avviata una nuova migrazione.<br />
- Rimettere in posizione le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori.<br />
- Pulire la piastra di migrazione con della carta soffice inumidita.<br />
VII.COMPLETAMENTO DEL TRATTAMENTO DEL GEL<br />
1. Rimuovere il telaio porta gel dal compartimento ; aprirlo e rimuovere il gel essiccato.<br />
2. Se necessario pulire il retro della lastrina di gel (la faccia con la plastica di supporto) con una carta soffice inumidita.<br />
NOTA : Le lunghezze di migrazione dei gels con 2 o 3 righe analitiche possono essere sensibilmente differenti, senza alcuna conseguenza sui<br />
risultati.<br />
RISULTATI<br />
L’antisiero pentavalente permette di rivelare:<br />
• Immunoglobuline G, A, M sia con catena leggera di tipo kappa che lambda,<br />
• Catene leggere libere kappa e lambda,<br />
• Catene leggere kappa e lambda legate a catene pesanti epsilon o delta.<br />
Interpretazione<br />
Un siero normale mostra una leggera colorazione diffusa, senza nessuna frazione netta, corrispondente alle immunoglobuline policlonali (G, A, M,<br />
kappa e lambda).<br />
L’ipergammaglobulinemia è caratterizzata dalla presenza di una zona diffusa marcatamente colorata e dall’assenza di bande nette.<br />
La gammapatia è caratterizzata dalla presenza di una o più bande ben delimitate e nette.<br />
Casi particolari<br />
• Una modesta componente monoclonale può essere nascosta in un protidogramma normale (disglobuline con mobilità beta). Tale banda sarà messa<br />
in evidenza grazie all’antisiero pentavalente.<br />
• La ipogammaglobulinemia può essere associata ad una catena monoclonale libera leggera. Questa proteina, a causa del basso peso molecolare,<br />
è eliminata attraverso il rene nelle urine (proteina di Bence Jones). La quantità residua nel siero è generalmente molto bassa, ma grazie alla<br />
amplificazione della reazione con l’antisiero pentavalente, tale frazione è facilmente messa in evidenza.<br />
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile sull’elettroforesi del siero (pista ELP) ma non viene confermata dall’immunofissazione, il primo<br />
sospetto deve essere per la presenza di fibrinogeno (campione di plasma).<br />
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile su tutte le piste di immunofissazione, deve essere sospettata la presenza di crioglobuline o<br />
Ig M polimerizzate. Depolimerizzare con un agente riducente e ripetere la procedura (vedi "Campioni per l’analisi").<br />
Una banda monoclonale rivelata dall’antisiero <strong>Penta</strong>valente deve essere obbligatoriamente identificata utilizzando i kits <strong>HYDRAGEL</strong><br />
immunofissazione Maschera standard :<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4801), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4802), <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4804 o 4808) o <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong><br />
(SEBIA, ref. N° 4809),<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4821), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4822) o <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES<br />
(SEBIA, ref. N° 4824).<br />
Interferenze e limitazioni<br />
L’utilizzo di antisieri diversi da quelli specifici per la tecnica di immunofissazione realizzata con la maschera standard può alterare la qualità dei risultati.<br />
Per i limiti di risoluzione e sensibilità dell’elettroforesi zonale, è possibile che alcune componenti monoclonali possano non essere rilevate con questo<br />
metodo.<br />
Eliminazione errori<br />
Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e<br />
conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche.<br />
Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica<br />
SEBIA.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
DATI SULLE PRESTAZIONI<br />
Riproducibilità e sensibilità<br />
La riproducibilità è stata dimostrata su due campioni di siero patologico con un livello di componente monoclonale rispettivamente alto e basso, un<br />
siero con la zona alfa1-alfa2 aumentata ed un siero normale. Ogni campione è stato processato su 3 lotti del kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Tutti i campioni hanno fornito identici risultati per i 3 lotti, mostrando i quadri tipici ed attesi per il campione processato, per esempio,<br />
l’immunofissazione non ha evidenziato nessuna banda monoclonale nel campione con il quadro infiammatorio e nel siero normale.<br />
Accuratezza<br />
Trenta differenti campioni (29 sieri patologici ed un campione di siero normale) sono stati processati usando il kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, il kit<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> ed un diverso kit di immunofissazione su gel di agarosio, reperibile in commercio. Le stesse bande sono state evidenziate, su tutti i<br />
campioni patologici, da ciascun sistema usato.<br />
Sensibilità<br />
Sono state preparate diluizioni scalari di 3 campioni di siero patologici, tutti con componenti monoclonali.<br />
I risultati sono riportati nella tabella che segue.<br />
COMPONENTE MONOCLONALE LIMITE DI SENSIBILITA (g/l) CAMPIONE N°. TIPO CONC. (g/l) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> TEST DI CONFRONTO 1 gamma, kappa 18 0.25 0.25 2 alfa, lambda 7.3 0.<strong>12</strong> 0.5<br />
| 3 | mu, kappa | 9 | 0.5 | 0.5 |<br />
BIBLIOGRAFIA<br />
Per ulteriori informazioni sulla interpretazione dei quadri immunofissativi consultare:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
ESPEC<strong>IF</strong>ICACIONES DE USO<br />
Los kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> están diseñados para la detección de proteínas monoclonales en suero humano mediante<br />
electroforesis e inmunofijación en geles de agarosa tamponados alcalinamente (pH 9.1). Se utilizan conjuntamente con el equipo semiautomático<br />
HYDRASYS, permitiendo ello realizar un conjunto de pasos que llevan a la obtención de geles listos para su posterior interpretación. Las proteínas<br />
presentes en el suero son sometidas a electroforesis e inmunofijación mediante el uso de un antisuero pentavalente de cadenas pesadas anti-gamma<br />
(Ig G), alfa (Ig A) y mu (Ig M), y cadenas ligeras anti-kappa y lambda (libres o no). Después de realizar la inmunofijación, las proteínas precipitadas<br />
se tiñen con Negro Amido. El exceso de colorante es eliminado con una solución ácida.<br />
Cada gel de los kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> y <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> está preparado para la realización de 6 ó <strong>12</strong> muestras respectivamente.<br />
Para Uso Diagnóstico In Vitro.<br />
PRINCIPIO DEL TEST<br />
La presencia de bandas anormales en una electroforesis de proteínas séricas, mayoritariamente en la zona gamma, pero también en las zonas alfa<br />
y beta (éstas pueden estar ocultas por las proteínas normales de las zonas correspondientes), es un indicio de la presencia de proteínas<br />
monoclonales y por tanto es indicativo de gammapatías. La inmunofijación está indicada para la identificación de estas bandas anormales. La<br />
inmunofijación es una técnica simple, que permite la fijación de una proteína, después de realizar una electroforesis, mediante la formación de un<br />
compuesto insoluble con su anticuerpo correspondiente. Se realiza en cuatro etapas.<br />
1. Separación electroforética de proteínas en gel de agarosa.<br />
2. Fijación e inmunoprecipitación de las proteínas ya separadas. Una solución fijadora y antisuero son dispensados en las pistas electroforéticas<br />
correspondientes. La solución fijadora y los antisueros difunden en el gel, precipitando todas las proteínas y los correspondientes antígenos.<br />
3. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. El precipitado del complejo antígeno - anticuerpo<br />
queda fijado en la matriz del gel.<br />
4. Las proteínas precipitadas se visualizarán mediante tinción. Las bandas inmunoprecipitadas serán comparadas con la presencia de bandas<br />
anormales en el patrón electroforético.<br />
Para la detección de los componentes monoclonales, las muestras son sometidas a separación electroforética en dos pistas. Después de la<br />
electroforesis, la pista ELP sirve como referencia, al mostrar el patrón de migración de las proteínas presentes en la muestra. La pista de<br />
inmunofijación (<strong>Penta</strong>) revela los componentes monoclonales que han reaccionado con el antisuero pentavalente.<br />
Esta técnica, simple y rápida, permite la obtención de resultados claros y fáciles de interpretar.<br />
REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> Y <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
ARTÍCULO PN 4841 PN 4842 PN 4884* Geles de Agarosa (listos para su uso) 10 geles 10 geles 80 geles Esponjas Tamponadas (listas para su uso) 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 80 bolsas de 2 Diluyente del colorante (solución stock) 1 vial, 60 ml 1 vial, 60 ml 8 viales de 60 ml Colorante Negro Amido (solución stock) 1 vial, 20 ml 1 vial, 20 ml 8 viales de 20 ml Solución Fijadora (lista para su uso) 3 viales, 14.4 ml Inmunoglobulinas de Mamífero anti-Ig humanas (gamma - alfa - mu - kappa - lambda) : antisuero pentavalente (listo para su uso)<br />
3 viales, 8.0 ml Aplicadores (listos para su uso) 1 caja de 10 2 cajas de 10 16 cajas de 10 Papeles de Filtro - Finos 1 bolsa de 10 1 bolsa de 10 8 bolsas de 10 Peines de Papel 1 bolsa de 10 2 bolsas de 10 16 bolsas de 10<br />
| Papeles de Filtro - Gruesos | 1 bolsa de 10 | 1 bolsa de 10 | 8 bolsas de 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTA: La solución fijadora y el antisuero <strong>Penta</strong>valente se comercializan por separado excepto en el MAXI-KIT (consulte REACTIVOS NECESARIOS<br />
NO SUMINISTRADOS).<br />
PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS<br />
Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas.<br />
LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES.<br />
1. GELES DE AGAROSA<br />
Preparación<br />
Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 8 g/l ; tampón tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.<br />
ATENCION: Los geles de agarosa contienen barbital 0.31 % y barbital sódico 0.34 % . ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere accidentalmente consultar<br />
al médico inmediatamente !<br />
Uso<br />
Medio de soporte para la separación electroforética de proteínas e inmunofijación posterior.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar los geles en posición horizontal en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C).<br />
Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores. (La flecha situada en la cara frontal del kit debe<br />
apuntar hacia arriba). Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evitar variaciones importantes de temperatura durante<br />
su almacenamiento. NO CONGELAR.<br />
Desechar cuando:<br />
(i) haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel),<br />
(ii) se observe crecimiento bacteriano o fúngico,<br />
(iii) se evidencie una cantidad excesiva de líquido en el recipiente del gel (consecuencia de la exudación del tampón debida a un almacenamiento<br />
inadecuado).<br />
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INSTRUCCIONES SEBIA - Español
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
2. ESPONJAS TAMPONADAS<br />
Preparación<br />
Las esponjas tamponadas están listas para su uso. Contienen: tampón tris-barbital pH 9.1 ± 0.3 ; azida sódica ; aditivos, inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.<br />
ATENCION: El tampón de las esponjas contiene barbital 0.92 %, barbital sódico 1.03 % y azida sódica 0.30 %. ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere<br />
accidentalmente consultar al médico inmediatamente! Al desechar, evitar el contacto con ácidos, plomo o cobre, ya que se conoce su<br />
tendencia a formar compuestos explosivos o tóxicos con la azida sódica.<br />
Uso<br />
Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio del tampón de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera.<br />
Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora (la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba).<br />
Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora. NO LAS CONGELE.<br />
Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa está abierta o si las esponjas están secas.<br />
3. DILUYENTE DEL COLORANTE<br />
Preparación<br />
El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el párrafo "COLORANTE NEGRO AMIDO". Contiene una solución<br />
ácida.<br />
Uso<br />
Para la preparación del colorante negro amido.<br />
Conservación, estabilidad y señales de deterioro<br />
El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada<br />
en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente. NO LO CONGELE.<br />
No le añada azida sódica.<br />
4. COLORANTE NEGRO AMIDO<br />
Preparación<br />
El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución<br />
final y su capacidad de coloración.<br />
Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación :<br />
1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado.<br />
2. Cierre el vial con cuidado.<br />
3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos.<br />
4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración.<br />
5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario.<br />
6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración.<br />
7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.<br />
8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos.<br />
El colorante está listo para usar.<br />
NOTA : Una reconstitución incompleta del colorante puede implicar una mala coloración de la fracción albúmina (disminución de su porcentaje o<br />
aparición de un agujero blanco en el centro de la fracción).<br />
Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.<br />
ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión.<br />
Uso<br />
Para la coloración de los geles después de la separación electroforética de las proteínas.<br />
IMPORTANTE: El colorante está destinado para colorear sólo 10 geles. Cambie el colorante después de 10 usos.<br />
Conservación, estabilidad y señales de deterioro<br />
Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera, en contenedores cerrados para evitar<br />
la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante.<br />
La solución diluida es estable durante 1 mes.<br />
No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor.<br />
5. SOLUCION FIJADORA (Ref. N° 4884)<br />
Preparación<br />
La solución fijadora está lista para su uso. Contiene: solución ácida ; aditivos, inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un<br />
funcionamiento óptimo. Para facilitar su identificación y como control de su aplicación, la solución fijadora está coloreada con un colorante no tóxico,<br />
del mismo color que el reflejado en la etiqueta del vial.<br />
Uso<br />
Fijación de las proteínas separadas electroforéticamente en la pista de referencia (ELP).<br />
NOTA: La solución fijadora es específica de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 6 y <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente<br />
después de usarlo.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad del kit o la que muestra la etiqueta del vial.<br />
La solución fijadora debe estar exenta de precipitados.<br />
6. ANTISUERO PENTAVALENTE (Ref. Nº 4884)<br />
Preparación<br />
El antisuero <strong>Penta</strong>valente está listo para su uso. Contiene inmunoglobulinas totales de mamífero anti-Ig humanas. Es de color anaranjado para evitar<br />
errores al usarlo. El color es el mismo que el de la etiqueta del vial.<br />
- 42 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Cuando el antisuero presenta una ligera turbidez o precipitados, generalmente basta con poner el vial a temperatura ambiente unos 10 minutos antes<br />
de su utilización. Si la turbidez persiste, no perturbará la reacción inmunológica. Si hay un precipitado insoluble, se recomienda centrifugar el antisuero<br />
durante 5 minutos a 3000 r.p.m.<br />
Utilización<br />
Para la inmunoprecipitación de las proteínas separadas mediante electroforesis.<br />
NOTA: El antisuero <strong>Penta</strong>valente es específico de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 6 y <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Los antisueros pueden ser de orígenes animales diferentes. Es por tanto imperativo no mezclar dos viales diferentes de antisueros, incluso si son de<br />
la misma especificidad, y SIEMPRE hay que cambiar la punta de la pipeta al cambiar de vial.<br />
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente<br />
después de usarlo.<br />
Conservación, estabilidad y señales de deterioro<br />
El antisuero <strong>Penta</strong>valente debe ser conservado en nevera (entre 2 y 8 °C). Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la<br />
etiqueta del vial de antisuero.<br />
NOTA: Durante el transporte, el antisuero puede permanecer a temperatura ambiente (entre 15 y 30 °C) durante 15 días sin que esto afecte a la<br />
calidad del test.<br />
7. APLICADORES<br />
Uso<br />
Aplicadores precortados, de un solo uso, para la aplicación de la muestra.<br />
Almacenamiento<br />
Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados.<br />
8. PAPELES DE FILTRO - FINOS<br />
Uso<br />
Papeles de filtro finos, de un solo uso, para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de la muestra.<br />
Conservación<br />
Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.<br />
9. PAPELES DE FILTRO - PEINES<br />
Uso<br />
Peines de papel de filtro grueso precortados, de un solo uso, para absorber el exceso de solución fijadora y antisuero de la superficie del gel después<br />
de la inmunofijación.<br />
10. PAPELES DE FILTRO - GRUESOS<br />
Uso<br />
Papeles de filtro gruesos, de un solo uso, para absorber las proteínas no precipitadas del gel después de la inmunofijación.<br />
Conservación<br />
Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.<br />
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS<br />
1. SOLUCIÓN FIJADORA<br />
Preparación<br />
La solución fijadora para inmunofijación (SEBIA, referencia N° 4799, 1 vial de 2,5 mL) está lista para su uso. Contiene: una solución ácida y aditivos,<br />
inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. Es específica de la técnica de inmunofijación realizada con<br />
las plantillas 6 y <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Es de color amarillo para evitar errores al usarla. El color es el mismo que el de la etiqueta del vial.<br />
Utilización, Conservación, estabilidad y señales de deterioro: Ver el párrafo 5.<br />
2. ANTISUERO PENTAVALENTE<br />
El vial de antisuero <strong>Penta</strong>valente (SEBIA, referencia N° 4616, 1 vial de 1 mL ó referencia N° 4738, 1 vial de 8 mL) contiene inmunoglobulinas totales<br />
de mamífero anti-Ig humanas. Es específico de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 6 y <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Es de color anaranjado para evitar errores al usarlo. El color es el mismo que el de la etiqueta del vial.<br />
Preparación, Utilización, Conservación, estabilidad y señales de deterioro: Ver el párrafo 6.<br />
3. SOLUCION DECOLORANTE<br />
Preparación<br />
Diluir cada vial de la Solución Decolorante stock (SEBIA, PN 4540, 10 viales de 100 ml) hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es<br />
conveniente diluir sólo 5 ml de la solución stock hasta 5 litros, que es el volumen del contenedor de la solución decolorante. Después de la dilución,<br />
la solución de trabajo contiene: ácido cítrico, 0.5 g/l.<br />
Uso<br />
Para decolorar: eliminar el exceso de colorante y coloración de fondo de los geles.<br />
Para el lavado del compartimento de coloración.<br />
Para neutralizar la acidez del decolorante, introduzca dentro del contenedor de desechos vacío 15 ml de sosa al 50 % (solución comercial).<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar la solución stock de decolorante a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit<br />
o en las etiquetas del vial. La solución de trabajo del decolorante es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella cerrada.<br />
No añadir azida sódica.<br />
Desechar la solución de trabajo del decolorante si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.<br />
Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µL/dL de<br />
ProClin 300.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de<br />
caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante.<br />
4. SOLUCION DE LAVADO HYDRASYS<br />
Preparación<br />
Cada vial de la Solución de Lavado stock HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 viales de 80 ml) se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada.<br />
Después de la dilución, la solución de lavado de trabajo contiene: tampón alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; azida sódica.<br />
ATENCION: La solución de lavado stock contiene azida sódica 0.625 % . ¡No ingerir ! ¡Si se ingiere accidentalmente consultar al médico<br />
inmediatamente ! La azida sódica puede formar compuestos explosivos o tóxicos si entra en contacto con ácidos, plomo o cobre. Lavar<br />
siempre con gran cantidad de agua al desechar.<br />
Uso<br />
La solución de lavado HYDRASYS está diseñada para lavar las proteínas no precipitadas de los geles. También sirve para lavar el Compartimento<br />
de Tinción del HYDRASYS. Usarla periódicamente ; por ejemplo, si el aparato se usa diariamente, lavar el compartimento de tinción una vez por<br />
semana.<br />
Ver las instrucciones de su caja para conocer las directrices de uso.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar las soluciones de lavado stock y de trabajo en contenedores cerrados a temperatura ambiente o refrigeradas. Son estables hasta la fecha<br />
de caducidad indicada en la etiqueta del vial.<br />
Desechar la solución de lavado de trabajo si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.<br />
5. FLUIDIL<br />
Preparación<br />
El Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 ml) está listo para su uso.<br />
Uso<br />
Para diluir muestras viscosas o turbias, por ejemplo, sueros que contengan crioglobulinas o criogeles.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar a temperatura ambiente. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial.<br />
El Fluidil debe estar exento de precipitados.<br />
EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS<br />
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN <strong>12</strong>10 o PN <strong>12</strong>11.<br />
2. Micropipeteador, manual o automatico, como el HYDRAplus SEBIA, PN <strong>12</strong>15, para cargar los aplicadores de muestra de una forma alternativa.<br />
3. Cámara húmeda, PN <strong>12</strong>70, suministrada con HYDRASYS.<br />
4. Kit de Contenedores suministrado con HYDRASYS.<br />
5. Barra de Guia de la Plantilla SEBIA, suministrada con HYDRASYS.<br />
6. Kit de Accesorios para HYDRASYS <strong>IF</strong>, SEBIA, PN <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipetas: 10 µl y 200 µl.<br />
MUESTRAS PARA ANALISIS<br />
Extracción y almacenamiento de muestras<br />
El análisis se hace con sueros frescos. Los sueros deben ser obtenidos de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio<br />
clínico.<br />
Los sueros pueden ser conservados una semana en la nevera (entre 2 y 8 °C).<br />
Para conservaciones prolongadas, congele las muestras; las muestras congeladas son estables 1 mes como mínimo. Las muestras descongeladas<br />
pueden dejar una marca en el punto de aplicación, debida a la desnaturalización de proteínas o lipoproteínas.<br />
La conservación de los sueros congelados mejora añadiendo a la muestra azida sódica 0.2 g/l.<br />
Preparación de las muestras<br />
Usar muestras de suero sin diluir.<br />
Después del almacenaje entre 2 y 8 °C o de la congelación, algunos sueros (particularmente aquellos que contengan crioglobulina o criogel) pueden<br />
volverse viscosos o desarrollar turbidez. Tales sueros pueden presentar problemas de aplicación a causa de que difunden mal por el peine del<br />
aplicador de muestras. En ese caso añadir 25 µl de Fluidil a 75 µl de suero y agitar en el vórtex durante 15 segundos. Seguir entonces el<br />
procedimiento habitual.<br />
Algunas paraproteínas están polimerizadas, y el suero presenta entonces una banda de aspecto "monoclonal" a la altura del punto de aplicación en<br />
los dos carriles. Prepare una solución reductora añadiendo un 1 % de ß-mercaptoetanol (BME) en Fluidil (esta solución se conserva una semana a<br />
temperatura ambiente en un microtubo cerrado herméticamente). Trate estos sueros antes de aplicarlos con esta solución: añada 25 µl de solución<br />
reductora a 75 µl de suero puro, agite en el vórtex y deje en reposo durante 15 minutos como mínimo (máximo 30 minutos), y luego siga con el<br />
procedimiento habitual.<br />
Muestras a descartar<br />
No usar muestras de plasma : el fibrinógeno da lugar a una banda cerca del punto de aplicación que puede ser confundida con una inmunoglobulina<br />
monoclonal y afectar a la cuantificación de la fracción correspondiente.<br />
No use muestras hemolizadas.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
PROCEDIMIENTO<br />
El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautomático multiparamétrico. Las etapas automáticas incluyen el procesado de los geles de agarosa<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> en la siguiente secuencia: aplicación de la muestra, migración electroforética, incubación con solución fijadora y antisuero, secado,<br />
tinción, decoloración y secado final. Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles, aplicación de la solución fijadora y antisuero,<br />
y la puesta en marcha del instrumento para la operación.<br />
LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS.<br />
I. PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACION<br />
1. Encender el HYDRASYS.<br />
2. Coloque un aplicador para el análisis de 6 muestras en el <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> o dos aplicadores para el análisis de <strong>12</strong> muestras, en<br />
una superficie plana, con los números de los pocillos hacia arriba (Fig. 1).<br />
- Aplicar 10 µl de muestra en cada pocillo (Esperar 2 minutos).<br />
| POCILLOS |<br />
MUESTRAS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
NOTA : Los pocillos no. 1, 8 y 15 no se utilizan en esta prueba, por lo que pueden ser señalados con un rotulador para evitar llenarlos con<br />
muestra por error.<br />
- Colocar cada aplicador en la cámara húmeda, con el peine hacia arriba.(asirlos por el plástico protector del peine).<br />
Ver la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles.<br />
- Dejar difundir las muestras durante 5 minutos después de la última aplicación. Para un uso posterior (hasta 8 horas después), mantener la<br />
cámara húmeda en el refrigerador.<br />
3. Abrir la puerta del Módulo de Migración y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador.<br />
ATENCION: ¡Nunca cerrar la puerta cuando los soportes estan elevados!<br />
4. Seleccionar el programa de migración «6/<strong>12</strong> PENTA ME/MD» en el menú del instrumento (mitad izquierda del teclado).<br />
5. Extraer la esponjas tamponadas de su envoltorio ; asirlas por los extremos de plástico. Engarzar los extremos de plástico agujereados con<br />
las puntas metálicas del soporte de los electrodos ; los extremos de plástico deben quedar encarados al soporte (Fig. 2).<br />
6. Abrir el contenedor del <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel<br />
inmediatamente.<br />
ADVERTENCIA: No deje que el papel de filtro contacte demasiado rato con el gel para evitar que se deshidrate.<br />
- Dispensar 200 µl de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Superficie de Control de Temperatura<br />
del módulo de migración.<br />
- Colocar el gel (la cara de agarosa hacia arriba) con su borde inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado (Fig. 3).<br />
- Aplicar el gel en la superficie, haciéndolo contactar con el agua (Fig. 3). Asegurarse de que no queden burbujas, que el agua esté extendida<br />
bajo toda la superficie del gel y que éste esté alineado con el marco serigrafiado.<br />
7. Devolver ambos soportes a su posición original. Las esponjas tamponadas no deben tocar el gel. NO FORZAR LOS SOPORTES HACIA<br />
ABAJO.<br />
8. Extraer el(los) aplicador(es) de la cámara húmeda. Asirlo(s) po el plástico protector.<br />
- Romper el plástico protector precortado del peine.<br />
- Para el análisis de 6 muestras en el <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>, ponga el aplicador en la posición N° 6 del soporte de los aplicadores.<br />
- Para el análisis de <strong>12</strong> muestras, ponga los aplicadores en las posiciones N° 3 y N° 9.<br />
IMPORTANTE: Los números impresos en los aplicadores deben quedar de cara al usuario (Fig. 4).<br />
9. Cerrar la puerta del módulo de migración.<br />
10. Iniciar el procedimiento inmediatamente, presionando la tecla «START» (flecha verde) en el lado izquierdo del teclado.<br />
IMPORTANTE: Asegurarse de que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no está bloqueada.<br />
MIGRACION - DESCRIPCION DE LAS ETAPAS AUTOMATICAS<br />
• Los dos soportes descienden, con lo cual las esponjas tamponadas y y aplicador(es) entran en contacto con la superficie del gel.<br />
• El soporte del aplicador se eleva.<br />
• La migración se realiza a potencia constante de 20 W, a 20 °C controlados por efecto Peltier, hasta que se han acumulado 42 Vh (unos 9 minutos).<br />
• El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos.<br />
• Un pitido audible se produce al finalizar la migración. En pantalla aparece el siguiente mensaje: « AS».<br />
NOTA: El módulo de migración permanece con la puerta cerrada durante los pasos de migración correspondientes.<br />
II. PUESTA EN MARCHA DE LA INMUNOFIJACION<br />
1. Abrir la tapa del módulo de migración.<br />
2. Extraer los aplicador(es) y desechar.<br />
3. Elevar ambos soportes, extraer las esponjas tamponadas por sus extremos de plástico y desechar.<br />
- Extraer el portaaplicadores.<br />
- Limpiar los electrodos con un trapo húmedo.<br />
- Mantener el gel en su posición dentro de la cámara de migración.<br />
4. Colocar la plantilla de aplicación de antisueros acto siguiente (Fig. 5):<br />
- La posición de la plantilla de aplicación vendrá determinada por una hendidura existente en la guía metálica (la cual puede permanecer en<br />
el módulo de migración todo el tiempo).<br />
- Sostener la plantilla por la muesca superior e insertarla en la guía (los extremos deben coincidir con los de la superficie serigrafiada).<br />
- Hacer descender la plantilla hasta que se ponga en contacto con el gel.<br />
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5. Aplicar los reactivos como sigue:<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
| CANAL | VOLUMEN | REACTIVO | COLOR |<br />
| ELP | 35 µl | solución fijadora | amarilla |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µl | antisuero pentavalente | amarillo-naranja |<br />
NOTA: Para evitar mezclar los reactivos, estos están coloreados de igual modo que en las etiquetas del vial y los pocillos de la plantilla de<br />
aplicación.<br />
- Dispensar los reactivos evitando la formación de burbujas en la punta de la pipeta.<br />
- Aplicar los reactivos (Fig. 6):<br />
- Mantener la pipeta en posición perpendicular a la plantilla, dejando que repose suavemente en el centro del pocillo.<br />
- Inyectar el antisuero mientras va formándose el canal por capilaridad, sin que se formen burbujas en el mismo.<br />
6. Cerrar la tapa del módulo de migración.<br />
7. Iniciar el proceso inmediatamente, presionando la tecla «START» (flecha verde), situada a la izquierda del teclado. En pantalla aparece el<br />
mensaje «[INCUBACIÓN]».<br />
INMUNOFIJACION - DESCRIPCION DE LOS PASOS AUTOMATIZADOS<br />
• Incubación a 20 °C durante 5 minutos (termostatización mediante efecto Peltier).<br />
• Una señal audible advierte de la necesidad de levantar la tapa. El siguiente mensaje que aparece en pantalla es “❊ AS (ME)”.<br />
NOTA: La tapa del módulo de migración permanece cerrada durante la incubación.<br />
III. ELIMINACION DEL EXCESO DE REACTIVOS<br />
1. Abrir la tapa del módulo de migración.<br />
2. Eliminar el exceso de reactivos con los papeles de filtro(peines) ; uno para <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, dos para <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> (Fig. 7):<br />
- Insertar cada peine formando un ángulo de 30° en los hueco situados en el límite inferior de la plantilla, hasta que toque la cara vertical<br />
más alejada del operador.<br />
- Permitir que el peine toque delicadamente el líquido, formando un ángulo de 45°, permitiendo la absorción del mismo. (Fig. 8).<br />
IMPORTANTE: Cada peine debe permanecer inclinado (45°). Si se coloca derecho puede llegar a dañar la superficie del gel.<br />
3. Apretar la tecla «START» (flecha verde situada a la izquierda en el teclado).<br />
ELIMINACION DE REACTIVOS - DESCRIPCION DE LOS PASOS AUTOMATIZADOS<br />
• Los reactivos difunden durante 15 segundos a 20° C (temperatura controlada por efecto Peltier).<br />
• En este momento, suena una alarma audible. El siguiente mensaje que aparece en pantalla es : «PAP.».<br />
IV. BLOTTING<br />
1. Eliminar los peines.<br />
2. Comprobar visualmente que los antisueros se han eliminado de forma correcta, lo cual podremos saber por:<br />
- ausencia de antisueros en la superficie del gel.<br />
- los extremos del peine se hallan coloreados en su totalidad.<br />
Si la absorción es incompleta, insertar el mismo peine (y en la misma posición), repitiendo de forma manual el procedimiento de eliminación<br />
3. Coger el aplicador de reactivos por la pestaña, elevar y quitar.<br />
4. Aplicar un papel de filtro grueso sobre el gel:<br />
- alinear los bordes del papel con el gel,<br />
- colocarlo encima del gel suavemente (inclinarlo con un ángulo de 45°).<br />
ATENCIÓN : Asegurarse de apoyar correctamente toda la superficie de la hoja de papel de filtro, para conseguir un perfecto contacto<br />
entre el gel y el papel.<br />
5. Cerrar la tapa del módulo de migración.<br />
6. Apretar la tecla «START» (flecha verde situada a la izquierda del teclado).<br />
7. Limpiar la plantilla de aplicación con un pequeño cepillo (por ej., de dientes). NO UTILIZAR ALCOHOL O DISOLVENTES. Verificar que la<br />
plantilla se encuentra totalmente seca antes de ser reutilizada ; eliminar las pequeñas gotas de agua con un papel suave.<br />
BLOTTING - DESCRIPCION DE LOS PASOS AUTOMATIZADOS<br />
• Blotting a 40 °C controlado mediante efecto Peltier, durante 3 minutos.<br />
• Suena una señal audible. El siguiente mensaje que aparece en pantalla es: «❊ PAP.».<br />
V. SECADO DEL GEL<br />
1. Abrir la tapa del módulo de migración.<br />
2. Extraer el papel de filtro, dejando el gel en su posición actual.<br />
3. Cerrar la tapa.<br />
4. Apretar la tecla «START» (flecha verde situada a la izquierda del teclado).<br />
SECADO - DESCRIPCION DE LOS PASOS AUTOMATIZADOS<br />
• Secado a 50 °C controlado por efecto Peltier, durante 6 minutos.<br />
• Un pitido nos indica que debemos levantar la tapa. El gel permanecerá a 50 °C mientras la tapa permanezca cerrada.<br />
NOTA: El módulo de migración permanece cerrado mientras se produce el proceso de secado.<br />
VI. PROCESADO DEL GEL<br />
1. Abrir la tapa.<br />
2. Extraer el gel (una vez seco) para su procesado posterior.<br />
3. Abrir el soporte del gel. Colocar el gel seco (con la superficie mirando hacia arriba) en los orificios de los dos cilindros y cerrar el soporte.<br />
Comprobar que el gel está colocado adecuadamente dentro del soporte (Fig. 9).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. Colocar el soporte en el Módulo de Procesado/Tinción.<br />
IMPORTANTE : Antes de comenzar con el procesado/coloración comprobar lo siguiente:<br />
- el contenedor de Solución de Lavado contiene al menos 400 ml de solución de lavado ;<br />
- el contenedor de Colorante contiene al menos 300 ml de colorante ;<br />
- el contenedor de Decolorante contiene como mínimo 1 litro de decolorante ;<br />
- el contenedor de Deshechos está vacío.<br />
Para conocer en qué posiciones conectar los reactivos, consultar la información que aparece en la pantalla del instrumento (seleccionar la<br />
tecla : VER CANALES).<br />
IMPORTANTE : No olvidar bloquear los canales no utilizados.<br />
5. Seleccionar el programa de coloración «<strong>IF</strong> AMIDO» e iniciar el proceso apretando la tecla «START» (flecha verde situada a la derecha en el teclado).<br />
Durante todas las secuencias de coloración, decoloración y secado, el sistema permanece bloqueado.<br />
Después del enfriamiento de la cubeta, una señal sonora (bip) suena y el sistema se desbloquea (la ventilación se mantiene hasta la<br />
recuperación del porta-films).<br />
NOTAS:<br />
- La temperatura de la placa de migración desciende hasta 20 °C (en menos de 5 minutos). En este momento podremos iniciar una nueva migración.<br />
- Volver a colocar el portaaplicadores en su ubicación original.<br />
- Lavar la placa de migración con un trapo suave ligeramente humedecido.<br />
VII.PROCESADO DEL GEL: FINALIZACION DEL PROCEDIMIENTO<br />
1. Retirar el soporte del compartimento, abrirlo y extraer el gel ya seco.<br />
2. Si procede, limpiar el reverso del gel (soporte plástico) con un trapo seco y suave.<br />
NOTA: En los geles con varias filas de muestras (2 ó 3), las longitudes de migración pueden ser ligeramente diferentes, sin ninguna repercusión<br />
en los resultados.<br />
RESULTADOS<br />
El antisuero pentavalente detecta:<br />
• Inmunoglobulinas G, A, M, kappa y lambda cada una,<br />
• cadenas ligeras libres kappa y lambda,<br />
• cadenas ligeras kappa y lambda unidas a cadenas pesadas épsilon (E) o delta (D).<br />
Interpretación<br />
Un suero normal muestra una zona ligeramente teñida, que corresponde a las inmunoglobulinas policlonales (G, A, M, kappa y lambda), sin ninguna<br />
banda definida.<br />
Una hipergammaglobulinemia se caracteriza por una tinción fuerte y difusa en la zona de las gamma, sin presentar bandas claramente definidas.<br />
Una gammapatía se caracteriza por la presencia de una o más banda(s) focalizada(s).<br />
Casos particulares<br />
• Una gammapatía monoclonal leve puede quedar oculta en un perfil electroforético normal (por ej., componente monoclonal con movilidad en la<br />
zona beta). Esta banda será detectada con el antisuero pentavalente.<br />
• Una hipogammaglobulinemia podría estar asociada con una cadena ligera libre monoclonal. Esta proteína, debido a su bajo peso molecular, es<br />
eliminada por el riñón a través de la orina (Proteína de Bence Jones). La cantidad presente en el suero es normalmente muy baja, pero puede<br />
detectarse realizando una inmunofijación con el antisuero pentavalente.<br />
• Una banda de aspecto monoclonal observada en la electroforesis pero que no aparece en el carril inmunoprecipitado puede indicar la presencia<br />
de fibrinógeno.<br />
• Una precipitación en los dos carriles, a la altura del punto de aplicación, puede indicar la presencia de una Ig M polimerizada o de una crioglobulina,<br />
que habrá que identificar tras aplicar a la muestra un tratamiento reductor (vea " Muestras para el análisis ").<br />
Cualquier banda monoclonal detectada con el antisuero <strong>Penta</strong>valente debe ser identificada obligatoriamente usando los kits <strong>HYDRAGEL</strong> de<br />
inmunofijación con Plantilla estándar:<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4801), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4802), <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> (SEBIA, ref. N° 4804 ó 4808) ó <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong><br />
(SEBIA, ref. N° 4809),<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4821), <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES (SEBIA, ref. N° 4822) ó <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES<br />
(SEBIA, ref. N° 4824).<br />
Interferencias y limitaciones<br />
Vea MUESTRAS PARA ANILISIS.<br />
La utilización de antisueros distintos a los especificados para la técnica de inmunofijación realizada con la plantilla estándar puede afectar a la calidad<br />
de los resultados.<br />
Teniendo en cuenta los principios analíticos de las técnicas actuales (principios de la electroforesis de zona, resolución y sensibilidad), no puede darse<br />
ninguna garantía respecto a la detección de la totalidad de todos los componente monoclonales.<br />
Resolución de problemas<br />
Avisar al Servicio de Atención Técnica del distribuidor cuando el test no funcione, pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la<br />
preparación y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir.<br />
Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles<br />
en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
CARACTERISTICAS TECNICAS<br />
Reproducibilidad y especificidad<br />
Reproducibilidad : demostrada mediante dos muestras de suero patológicas con un nivel elevado y bajo de componente monoclonal,<br />
respectivamente, un suero con la zona alfa 1-alfa 2 aumentada y un suero normal. Cada muestra fue ensayada en 3 lotes del kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong><br />
<strong>Penta</strong>. Todas las muestras ensayadas mostraron idénticos resultados para los 3 lotes, mostrando un patrón típico, según lo esperado en función del<br />
tipo de muestra utilizado. La inmunofijación no detectó ninguna banda monoclonal con el suero que presentaba un patrón inflamatorio ni con el suero<br />
normal.<br />
Exactitud<br />
Treinta muestras diferentes (29 sueros patológicos y una muestra de suero normal) se ensayaron usando el kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, el kit<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong>, y otro sistema comercial de <strong>IF</strong> en geles de agarosa. Se identificaron idénticas bandas en las muestras patológicas fuese cual fuese<br />
el sistema o procedimiento de trabajo.<br />
Sensibilidad<br />
Se prepararon diluciones seriadas con 3 muestras de sueros patológicos, conteniendo componentes monoclonales.<br />
Resultados obtenidos:<br />
COMPONENTE MONOCLONAL LIMITE DE DETECCION (g/l) MUESTRA No TIPO CONC. (g/l) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> TEST COMPARATIVO 1 gamma, kappa 18 0.25 0.25 2 alfa, lambda 7.3 0.<strong>12</strong> 0.5<br />
| 3 | mu, kappa | 9 | 0.5 | 0.5 |<br />
BIBLIOGRAFIA<br />
Para información adicional o interpretación de resultados consultar:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
UTILIZAÇÃO PREVISTA<br />
Os kits <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> destinam-se à detecção de proteínas monoclonais no soro humano, por imunofixação no<br />
sistema semi-automático HYDRASYS. O sistema HYDRASYS permite permite realizar todas as sequências, até à obtenção do gel para interpretação.<br />
As proteínas do soro são separadas por electroforese em tampão alcalino (pH 9,1) e depois imunoprecipitadas com um antisoro pentavalente anticadeias<br />
pesadas gama (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M), e anti-cadeias leves kapa e lambda (livres e ligadas). Após imunofixação, as proteínas<br />
precipitadas são coradas com negro de amido. O excesso de corante é removido em meio ácido.<br />
Cada cada gel de agarose poderá analisar 6 amostras no kit <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e <strong>12</strong> amostras no kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED.<br />
PRINCÍPIO DO TESTE<br />
A electroforese e imunofixação das proteínas permite detectar as imunoglobulinas mono e oligoclonais, que são marcadores das gamapatias. Estas<br />
podem surgir sob a forma de bandas anómalas de mobilidade gama ou beta, geralmente, mas igualmente alfa, eventualmente mascaradas na<br />
electroforese pelas proteínas habituais destas zonas.<br />
A imunofixação efectua-se graças a um antisoro pentavalente.<br />
A operação é feita em quatro fases:<br />
1. Separação das proteínas por electroforese em gel de agarose.<br />
2. Fixação e imunoprecipitação das proteínas sujeitas a electroforese: aplicação do fixador e do antisoro pentavalente directamente sobre o gel, ao<br />
nível das pistas de migração. O fixador e o antisoro difundem-se no gel ; o fixador precipita todas as proteínas e os anticorpos precipitam os<br />
antigénios correspondentes.<br />
3. As proteínas solúveis, não precipitadas, são removidas do gel por lavagem e secagem com papel de filtro. As proteínas precipitadas ficam retidas<br />
no interior da matriz do gel.<br />
4. Coloração das proteínas e comparação da posição das bandas imunoprecipitadas com as bandas anómalas observadas no perfil electroforético<br />
da amostra de soro.<br />
Para identificar de forma precisa a natureza das bandas monoclonais, as amostras são testadas simultaneamente em duas pistas. Depois da<br />
electroforese, a pista ELP serve como referência, mostrando o perfil electroforético das proteínas da amostra. A pista imunológica <strong>Penta</strong> permite a<br />
caracterização dos componentes monoclonal(is) que reagiram com o antisoro pentavalente.<br />
Esta técnica simples e rápida proporciona uma imagem clara e fácil de interpretar.<br />
REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS NOS KITS <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> E <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
ITEM REF. N° 4841 REF. N° 4842 REF. N° 4884* Geles de agarose (prontos a usar) 10 geles 10 geles 80 geles Tiras de tampão (prontas a usar) 10 pacotes de 2 10 pacotes de 2 80 pacotes de 2 Diluente da solução corante (solução concentrada) 1 frasco, 60 ml 1 frasco, 60 ml 8 frascos, 60 ml Corante negro de amido (solução concentrada) 1 frasco, 20 ml 1 frasco, 20 ml 8 frascos, 20 ml Fixador (pronto a usar) 3 frascos, 14,4 ml Imunoglobulinas totais de mamífero anti-Ig humanas (gama-alfa-mu-kapa-lambda) = antisoro pentavalente (pronto a usar)<br />
3 frascos, 8,0 ml Aplicadores (prontos a usar) 1 caixa de 10 2 caixas de 10 16 caixas de 10 Papéis de filtro finos 1 pacote de 10 1 pacote de 10 8 pacotes de 10 Pentes de papel de filtro 1 pacote de 10 2 pacotes de 10 16 pacotes de 10<br />
| Papéis de filtro espessos | 1 pacote de 10 | 1 pacote de 10 | 8 pacotes de 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTA: O Fixador e os Antisoros <strong>Penta</strong>valentes são fornecidos separadamente, excepto para o MAXI-KIT (ver REAGENTES NECESSÁRIOS MAS<br />
NÃO FORNECIDOS).<br />
PARA OPTIMIZAÇÃO DOS RESULTADOS<br />
Os elementos de um mesmo kit devem ser utilizados em conjunto, e de acordo com as instruções de utilização.<br />
LER ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO.<br />
1. GELES DE AGAROSE<br />
Preparação<br />
Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão tris-barbital pH 9,1 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas<br />
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: Os geles de agarose contêm 0,31 % de barbital e 0,34 % de barbital sódico. Não ingerir! Se ingerido, consultar imediatamente um<br />
médico!<br />
Utilização<br />
Meio de suporte para electroforese e imunofixação das proteínas.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar os geles horizontalmente, na embalagem protectora de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 °C) ou no frigorífico (2 - 8 °C) (a seta<br />
existente na parte da frente da caixa do kit deve ficar voltada para cima). Os geles são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit e nos<br />
rótulos das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de uma<br />
fonte de calor).<br />
NÃO CONGELAR!<br />
- 49 -<br />
INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Deitar fora o gel quando:<br />
(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo for muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ;<br />
(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ;<br />
(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de<br />
armazenamento inadequadas).<br />
2. TIRAS DE TAMPÃO<br />
Preparação<br />
As tiras de esponja com tampão estão prontas a usar. Cada uma contém: tampão tris-barbital pH 9,1 ± 0,3 ; azida de sódio ; aditivos, não perigosos<br />
nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: As tiras contêm 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sódico e 0,3 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingeridas, consultar<br />
imediatamente um médico! Quando deitar fora as tiras evitar o seu contacto com ácidos, chumbo ou cobre, já que estes elementos formam<br />
compostos explosivos ou tóxicos com a azida de sódio.<br />
Utilização<br />
As tiras de tampão funcionam como reservatório de tampão da electroforese e asseguram o contacto entre o gel e os eléctrodos.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
As tiras de tampão podem ser conservadas à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C).<br />
As tiras de tampão devem ser conservadas horizontalmente dentro da embalagem protectora (a seta na parte da frente da caixa deve permanecer<br />
apontada para cima).<br />
As tiras são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou na embalagem protectora das tiras. NÃO CONGELAR.<br />
3. DILUENTE DA SOLUÇÃO CORANTE<br />
Preparação<br />
O diluente da solução corante deverá ser utilizado como está descrito no parágrafo " SOLUÇÃO CORANTE NEGRO DE AMIDO ".<br />
Contém uma solução ácida.<br />
Utilização<br />
Para a preparação das soluções de corante negro de amido.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. NÃO<br />
CONGELAR.<br />
Não adicionar azida de sódio.<br />
4. CORANTE NEGRO DE AMIDO<br />
Preparação<br />
O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final<br />
e o seu poder de coloração.<br />
Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte:<br />
1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado.<br />
2. Fechar cuidadosamente o frasco.<br />
3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos.<br />
4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração.<br />
5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes.<br />
6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração.<br />
7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada.<br />
8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos.<br />
A solução corante está pronta a utilizar.<br />
NOTA : Uma reconstituição incompleta do corante pode provocar uma má coloração da fracção de albumina (baixa da percentagem ou lacuna dentro<br />
da fracção).<br />
Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/l ; etilenoglicol, 6,7 % ; aditivos, não perigosos nas<br />
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: Nocivo em caso de ingestão.<br />
Utilização<br />
Para corar geles depois da electroforese das proteínas.<br />
Misture bem até homogeneização.<br />
IMPORTANTE : A solução corante é unicamente destinada à coloração de 10 geles. Recomenda-se a renovação da solução após as 10 utilizações.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a<br />
evaporação.<br />
A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos.<br />
A solução diluída de corante é estável por um mês.<br />
Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor.<br />
5. FIXADOR (com ref. n° 4884)<br />
Preparação<br />
O fixador vem pronto a usar. Contém: solução ácida ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. Tem<br />
uma cor amarela para evitar todos os erros de utilização. A cor é igual à do rótulo do frasco.<br />
Utilização<br />
Para fixar as proteínas separadas por electroforese na pista de referência (ELP).<br />
NOTA: A solução fixadora é específica da técnica de imunofixação com as máscaras 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,<br />
após utilização.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar o fixador à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco.<br />
O fixador deve estar livre de precipitados.<br />
6. ANTISORO PENTAVALENTE (com ref. n° 4884)<br />
Preparação<br />
O Antisoro <strong>Penta</strong>valente está pronto a usar. Todos os antisoros são imunoglobulinas totais de mamífero anti-Ig humanas. Para facilitar a identificação<br />
e como ajuda na monitorização da aplicação, o antisoro foi corado com corante não perigoso, amarelo-alaranjado, coincidente com a cor do rótulo<br />
do frasco.<br />
Se o antisoro apresentar uma certa turvação, deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente durante, pelo menos, 10 minutos antes da sua<br />
utilização. No entanto e caso a turvação persista, a reacção imunológica não será afectada. Em caso de formação de precipitado insolúvel, é<br />
recomendada a centrifugação do antisoro durante 5 minutos à rotação de 3000 rpm.<br />
Utilização<br />
Para imunoprecipitação das proteínas previamente separadas por electroforese.<br />
NOTA: O antisoro pentavalente é específico para a técnica de imunofixação com máscaras 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
O antisoro pode ser originário de variadas espécies animais. Não misture o conteúdo de dois frascos diferentes de antisoros, mesmo que com a<br />
mesma especificidade. Actualize SEMPRE a etiqueta da pipeta quando mudar de frasco.<br />
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,<br />
após utilização.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar os antisoros no frigorífico (2 - 8 °C). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos de antisoro.<br />
NOTA: Durante o transporte, os antisoros podem ser mantidos à temperatura ambiente (15 - 30 °C) durante 15 dias sem que isso afecte a qualidade<br />
do teste.<br />
7. APLICADORES<br />
Utilização<br />
Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras.<br />
Armazenamento<br />
Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.<br />
8. PAPEIS DE FILTRO FINOS<br />
Utilização<br />
Pré-cortados, de utilização única, destinam-se a absorver o excesso de humidade da superfície do gel antes da aplicação da amostra.<br />
Armanezamento<br />
Armazenar os papéis de filtro finos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.<br />
9. PENTES DE PAPEL DE FILTRO<br />
Utilização<br />
Pré-cortados, de utilização única, estes pentes de papel de filtro destinam-se a absorver o excesso de fixador e antisoro da superfície do gel depois<br />
da fase da imunofixação.<br />
10. PAPEIS DE FILTRO ESPESSOS<br />
Utilização<br />
De utilização única, destinam-se a absorver as proteínas não precipitadas da superfície do gel depois da fase da imunofixação.<br />
Armazenamento<br />
Armazenar os papéis de filtro espessos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.<br />
REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS<br />
1. FIXADOR<br />
Preparação<br />
O fixador para imunofixação (SEBIA, ref. nº 4799, 1 frasco, 2,5 ml) vem pronto a usar. Contém: solução ácida ; aditivos, não perigosos nas<br />
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. A solução fixadora é específica da técnica de imunofixação com as máscaras 6 e<br />
<strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Para facilitar a identificação e como ajuda na monitorização da aplicação, o antisoro foi corado com corante não perigoso, amarelo-alaranjado,<br />
coincidente com a cor do rótulo do frasco.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração: ver parágrafo 5 anterior.<br />
2. ANTISORO PENTAVALENTE<br />
O frasco de antisoro pentavalente (SEBIA, ref. nº 4616, 1 ml ou ref. nº 4738, 8 ml), contém imunoglobulinas totais de mamífero anti-Ig humanas. O<br />
antisoro pentavalente é específico para a técnica de imunofixação com máscaras 6 e <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Para facilitar a identificação e como ajuda na monitorização da aplicação, o antisoro foi corado com corante não perigoso, amarelo-alaranjado,<br />
coincidente com a cor do rótulo do frasco.<br />
Preparação, Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração: Ver parágrafo 6 anterior.<br />
3. SOLUÇÃO DESCORANTE<br />
Preparação<br />
Cada frasco de solução descorante concentrada (SEBIA, ref. n° 4540, 10 frascos de 100 ml cada) deve ser diluída a 1/1000 com água destilada ou<br />
desmineralizada e permite obter 100 litros de solução total. É conveniente diluir apenas 5 ml da solução concentrada de cada vez, para o volume<br />
final de 5 litros (a capacidade do recipiente onde se vai colocar a solução descorante). Após diluição, a solução descorante contém: ácido cítrico,<br />
0,5 g/l.<br />
- 51 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Utilização<br />
Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel. No enxaguamento da câmara de coloração, após lavagem. Para neutralizar a acidez<br />
do descorante, colocar no frasco de despejo vazio, 15 ml de soda a 50 % (solução disponível comercialmente).<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou<br />
nos rótulos dos frascos da solução descorante. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente, quando conservada<br />
em recipiente fechado. Não adicionar azida de sódio.<br />
Em caso de conservação mais prolongada da solução diluída (superior a uma semana), adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar qualquer<br />
proliferação microbiana.<br />
A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao<br />
fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante.<br />
4. SOLUÇÃO DE LAVAGEM HYDRASYS<br />
Preparação<br />
Cada frasco de solução de lavagem concentrada HYDRASYS (SEBIA, ref. n° 4541, 10 frascos de 80 ml cada) deve ser diluído para a obtenção do<br />
volume final de 5 litros com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução de lavagem contém: tampão alcalino pH 8,8 ± 0,3 ; azida de<br />
sódio.<br />
AVISO: A solução de lavagem contém 0,625 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerida, consultar imediatamente um médico! Quando em<br />
contacto com ácidos, chumbo ou cobre, a azida de sódio pode levar à formação de compostos explosivos ou tóxicos. Quando deitar fora<br />
lavar abundantemente com grande quantidade de água.<br />
Utilização<br />
Para a lavagem do gel após imunofixação de modo a eliminar as proteínas residuais não precipitadas. Para a lavagem da câmara de coloração do<br />
HYDRASYS. Utilizar periodicamente. Por exemplo, se o aparelho for utilizado diariamente, fazer a lavagem da câmara de coloração uma vez por<br />
semana.<br />
Ver as instruções de utilização incluídas na embalagem.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução concentrada e a solução diluída em recipientes fechados à temperatura ambiente ou no frigorífico. As soluções são estáveis<br />
até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco da solução de lavagem.<br />
Deitar fora a solução de lavagem diluída se houver alterações no seu aspecto, por exemplo, se ficar turva devido a contaminação microbiana.<br />
5. FLUIDIL<br />
Preparação<br />
O Fluidil (SEBIA ref. n° 4587, 1 frasco de 5 ml) vem pronto a ser usado.<br />
Utilização<br />
Destina-se a diluir amostras viscosas ou turvas, por exemplo, soro contendo uma crioglobulina ou um criogel.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco de Fluidil.<br />
O Fluidil não deve conter quaisquer precipitados.<br />
EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS<br />
1. Sistema SEBIA HYDRASYS, ref. n° <strong>12</strong>10 ou ref. n° <strong>12</strong>11.<br />
2. HYDRAplus SEBIA, ref. n° <strong>12</strong>15, micropipetador, manual ou automático, como alternativa na pipetagem das amostras para os aplicadores<br />
respectivos.<br />
3. Câmara húmida fornecida com o sistema HYDRASYS, ref. n° <strong>12</strong>70.<br />
4. Frascos de plástico fornecidos com o HYDRASYS.<br />
5. Barra metálica para a fixação da máscara SEBIA, fornecida com o sistema HYDRASYS.<br />
6. Kit de acessórios para o HYDRASYS <strong>IF</strong> SEBIA, ref. n° <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipetas: 10 µl e 200 µl.<br />
AMOSTRAS<br />
Colheita e conservação das amostras<br />
É recomendada a utilização de amostras de soro frescas. Os soros devem ser colhidos de acordo com os métodos utilizados nos laboratórios de<br />
análises clínicas. Se necessário, armazenar o soro entre 2 - 8 °C até uma semana. Para conservação prolongada, congelar as amostras. As amostras<br />
congeladas são estáveis durante pelo menos um mês. As amostras descongeladas podem levar ao aparecimento de ligeiras bandas no ponto de<br />
aplicação, devido à desnaturação das proteínas ou lipoproteínas.<br />
A estabilidade do armazenamento do congelamento aumenta com a adição de azida de sódio a 0,2 g/l.<br />
Preparação das amostras<br />
Utilizar directamente amostras de soro puras. Após conservação a 2 - 8 °C ou congelamento, alguns soros (especialmente os que contêm uma<br />
crioglobulina ou um criogel) podem tornar-se viscosos ou turvos. Estes soros podem apresentar problemas na aplicação porque difundem com muita<br />
dificuldade pelos dentes do aplicador de amostras. Neste caso, adicionar 25 µl de Fluidil a 75 µl de soro e agitar no vortex durante 15 segundos.<br />
Depois, seguir o método normal.<br />
Certas paraproteínas são polimerizadas, o que resulta no aparecimento de uma "banda monoclonal" em todas as pistas. Neste caso preparar uma<br />
solução de ß-mercaptoetanol (BME) a 1% em Fluidil (esta solução redutora é estável por uma semana num microtubo hermeticamente fechado e à<br />
temperatura ambiente). Adicionar 25 µl de solução redutora a 75 µl de soro puro, agitar no vortex e aguardar pelo menos 15 minutos (máximo de<br />
30 minutos) e depois seguir o método normal.<br />
Amostras a evitar<br />
Não utilizar amostras de plasma. O fibrinogénio leva ao aparecimento de uma banda perto do ponto de aplicação que pode ser confundida com uma<br />
gamapatia monoclonal.<br />
Não utilizar amostras hemolisadas.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
TÉCNICA<br />
O sistema HYDRASYS é um aparelho semi-automático multi-paramétrico. Os passos automáticos incluem o tratamento dos geles de agarose<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> segundo as etapas seguintes: aplicação das amostras, migração electroforética, incubação com os reagentes, secagem, lavagem,<br />
coloração, descoloração e secagem final. Os passos manuais são os seguintes: preparação das amostras e dos geles, aplicação dos reagentes e<br />
lançamento das sequências automáticas. LER ATENTAMENTE O MANUAL DE INSTRUÇÕES DO HYDRASYS.<br />
I. PREPARAÇÃO DA MIGRAÇÃO<br />
1. Ligar o aparelho HYDRASYS.<br />
2. Colocar 1 aplicador para a análise de 6 amostras pelo <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> ou 2 aplicadores para analisar <strong>12</strong> amostras, numa superfície<br />
plana, com os números dos poços voltados para cima (Fig. 1):<br />
- Aplicar 10 µl de amostra pura em cada poço. A pipetagem das amostras em cada aplicador não deve ultrapassar o tempo de dois minutos.<br />
| POÇOS |<br />
AMOSTRAS ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
NOTA: Os poços nº 1, 8 e 15 não são utilizadas neste ensaio; pode-se marcar estas pistas com uma caneta, de modo a evitar a colocação<br />
de amostras por enganos.<br />
- Colocar os aplicadores na câmara húmida com os dentes voltados para cima (segure-os pela protecção de plástico).<br />
Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes.<br />
- Deixar as amostras difundirem-se pelos dentes durante cinco minutos após a aplicação da última amostra. Para uma conservação<br />
prolongada (8 horas no máximo), colocar a câmara húmida no frigorífico.<br />
3. Abrir a tampa da câmara de migração e levantar os suportes do aplicador e dos eléctrodos.<br />
AVISO: Nunca fechar a tampa quando os suportes estão levantados!<br />
4. Seleccionar o programa de migração "6/<strong>12</strong> PENTA MP/MD" no menu apresentado pelo aparelho (lado esquerdo do teclado).<br />
5. Retirar as tiras de tampão da embalagem ; colocar as tiras de tampão sobre os eléctrodos fixando as extremidades de plástico perfuradas<br />
aos pinos do suporte dos eléctrodos. A face das tiras de tampão onde estão fixadas as partes de plástico fica em contacto com os eléctrodos.<br />
(Fig. 2).<br />
6. Desempacotar a placa <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino.<br />
ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação.<br />
- Aplicar 200 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso na placa de migração.<br />
- Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso na placa de migração (Fig. 3).<br />
- Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 3) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura<br />
do gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal.<br />
7. Baixar os dois suportes. Nesta posição as tiras de tampão não tocam no gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA DOS SUPORTES MANUALMENTE.<br />
8. Retirar os aplicadores da câmara húmida. Segurá-los pela estrutura de protecção plástica.<br />
- Quebrar e retirar a protecção dos dentes.<br />
- Para analisar 6 amostras com <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> PENTA 6/<strong>12</strong>, colocar o aplicador na posição n° 6 do suporte dos aplicadores,<br />
- Para analisar <strong>12</strong> amostras, colocar os aplicadores nas posições n° 3 e n° 9 do suporte dos aplicadores.<br />
IMPORTANTE: Os números impressos nos aplicadores devem ficar virados para o operador (Fig. 4).<br />
9. Fechar a tampa da câmara de migração.<br />
10. Dar início imediatamente ao processo apoiando em "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).<br />
IMPORTANTE: Assegure-se de que a grelha de ventilação não está bloqueada (à direita do aparelho).<br />
MIGRAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Descida dos suportes do aplicador e dos eléctrodos de forma a que as tiras de tampão e os aplicadores contactem com a superfície do gel.<br />
• Subida do aplicador de amostras.<br />
• A migração é feita à potência constante de 20 W, a 20 °C, controlada por efeito de Peltier, até que tenham sido atingidos 42 Vh, durante cerca de<br />
9 minutos.<br />
• Os eléctrodos são desligados com a subida do suporte.<br />
• A audição de um sinal sonoro indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada. A seguinte mensagem aparece no ecrã: " AS".<br />
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante todos os passos da migração.<br />
II. IMUNOFIXAÇÃO<br />
1. Abrir a tampa.<br />
2. Retirar os aplicadores e deitá-los fora.<br />
3. Levantar os suportes, retirar as tiras de tampão pegando-lhes pelas suas extremidades de plástico e deitá-las fora.<br />
- Retirar os suportes.<br />
- Limpar os eléctrodos com um pano macio e húmido.<br />
- Deixar o gel no seu lugar na câmara de migração.<br />
- 53 -
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
4. Colocar em posição a máscara para aplicação dos reagentes, da seguinte forma (Fig. 5):<br />
- Colocar a barra metálica para a ligação da máscara nos pinos de fixação (a barra metálica pode permanecer permanentemente no<br />
HYDRASYS).<br />
- Segurar a máscara pela pega e colocá-la sobre a barra metálica (encaixando as extremidades nas reentrâncias da mesma).<br />
- Baixar a máscara sobre o gel.<br />
5. Aplicar os reagentes da seguinte forma:<br />
| PISTA | VOLUME (µl) | REAGENTE | COR |<br />
| ELP | 35 | Fixador | amarelo |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 | Anti-soro pentavalente | amarelo-laranja |<br />
NOTA: Para evitar enganos, as cores dos reagentes são as mesmas tanto nos rótulos dos frascos como nos respectivos poços da máscara.<br />
- Pipetar os reagentes, evitando introduzir bolhas de ar na ponta da pipeta.<br />
- Aplicar os reagentes (Fig. 6).<br />
- Segure a pipeta na vertical e assente levemente a sua ponta no fundo do poço.<br />
- Cuidadosa e progressivamente, injectar o reagente de forma a que se espalhe pela pista (cuidado para não haver introdução de bolhas<br />
de ar).<br />
6. Fechar a tampa da câmara de migração.<br />
7. Iniciar imediatamente o processo de incubação premindo a tecla "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado). Aparece a<br />
mensagem "[INCUBAÇÃO]" no ecrã.<br />
IMUNOFIXAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Incubação a 20 °C durante 5 minutos (controlada pelo efeito de Peltier).<br />
• A audição de um sinal sonoro indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada. A seguinte mensagem aparece no ecrã: "❊ AS (MP)".<br />
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante a incubação.<br />
III. REMOÇÃO DO EXCESSO DE REAGENTES<br />
1. Abrir a tampa da câmara de migração.<br />
2. Retirar o excesso de reagentes com pentes de papel de filtro (Fig. 7): um pente para a máscara do <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> e dois pentes para<br />
o <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
- Colocar os pentes num ângulo de 30° (em relação ao plano horizontal) e introduzi-los nas fendas existentes na parte inferior das pistas de<br />
incubação, segundo o seu plano inclinado ;<br />
- Deslizar lentamente os dentes do pente de papel de filtro ao longo da parede vertical oposta à fenda ; os dentes ficam em contacto com<br />
os antisoros, que são absorvidos por capilaridade ; se há dificuldade na absorção do liquido, carregar ligeiramente no pente de modo a que<br />
este fique em contacto com o liquido. (Fig. 8).<br />
IMPORTANTE: Cada pente deve permanecer inclinado (45°). Se ficar na vertical pode danificar o gel.<br />
3. Dar início ao processo premindo a tecla "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).<br />
REMOÇÃO DOS REAGENTES - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Absorção dos reagentes durante 15 segundos a 20 °C (controlada pelo efeito de Peltier).<br />
• Ouve-se um sinal sonoro e a seguinte mensagem aparece no ecrã: " PAP.".<br />
IV. ABSORÇÃO DO GEL<br />
1. Retirar os pentes.<br />
2. Verificar se os reagentes foram bem absorvidos, o que é indicado por:<br />
- ausência de reagentes no gel ;<br />
- os dentes dos pentes estão manchados em todo o seu comprimento.<br />
Se a absorção dos reagentes tiver sido incompleta, voltar a inserir o mesmo pente de papel de filtro (na mesma posição) e repetir a técnica<br />
de remoção de reagentes, manualmente.<br />
3. Segure a máscara de aplicação dos reagentes pela pega, levante-a e remova-a.<br />
4. Aplicar um papel de filtro espesso ao gel:<br />
- inclinar o papel de filtro 45°.<br />
- alinhar a sua margem inferior com a margem do gel e aplicar sobre o gel.<br />
ATENÇÃO: Pressionar uniformemente toda a folha de papel de filtro, para assegurar um contacto perfeito entre o gel e o papel.<br />
5. Fechar a tampa da câmara de migração.<br />
6. Dar início à absorção premindo a tecla "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).<br />
7. Limpar a máscara de aplicação sob água corrente, com uma pequena escova (ex: escova de dentes). NÃO UTILIZAR ÁLCOOL OU<br />
SOLVENTES.<br />
Assegure-se de que a máscara de aplicação está completamente seca antes de a reutilizar ; retirar as gotículas de água dos poços batendo<br />
com ela levemente sobre papel absorvente.<br />
ABSORÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Secagem a 40 °C controlada pelo efeito de Peltier, durante 3 minutos.<br />
• Ouve-se um sinal sonoro e a seguinte mensagem aparece no ecrã: "❊ PAP.".<br />
V. SECAGEM DO GEL<br />
1. Abrir a tampa da câmara de migração.<br />
2. Retirar o papel de filtro e deixar o gel no seu lugar.<br />
3. Fechar a tampa.<br />
4. Dar início ao processo premindo a tecla “START” (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
SECAGEM DO GEL - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Secagem a 50 °C, controlada pelo efeito de Peltier, durante 6 minutos.<br />
• Ouve-se um sinal sonoro e a tampa da câmara de migração é desbloqueada. A temperatura da placa permanece a 50 °C até a tampa ser aberta.<br />
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante a fase de secagem.<br />
VI. PREPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE TRATAMENTO DO GEL<br />
1. Abrir a tampa.<br />
2. Retirar a película seca de gel para tratamento posterior.<br />
3. Abrir o suporte do gel. Colocar o gel seco na horizontal (com o lado do gel virado para cima), nas ranhuras das duas barras e fechar o suporte.<br />
Certifique-se de que o filme está correctamente posicionado no interior do suporte (Fig. 9).<br />
4. Colocar o suporte do gel na câmara de coloração.<br />
IMPORTANTE: Antes de dar início ao programa de coloração do gel, verificar o seguinte:<br />
- se o frasco da solução de lavagem está cheio com pelo menos 400 ml de solução de lavagem ;<br />
- se o frasco do corante está cheio com 300 ml de solução corante ;<br />
- se o frasco de descorante contem pelo menos 1 litro de solução descorante ;<br />
- se o frasco de despejo está vazio.<br />
Para seleccionar os canais de entrada dos reagentes: Consultar a informação indicada no ecrã do aparelho (premir a tecla: “VER CANAIS”).<br />
IMPORTANTE: Não esquecer de tapar os canais não utilizados.<br />
5. Seleccionar o programa de coloração "<strong>IF</strong> AMIDO" no menu do aparelho. Iniciar a operação premindo a tecla "START" (flecha verde no lado<br />
direito do teclado).<br />
Durante as etapas de coloração, descoloração e secagem o sistema permanece fechado. Após arrefecimento da câmara, ouve-se um sinal<br />
sonoro e o sistema desbloqueia-se (a ventilação mantém-se até que se retire o gel).<br />
NOTAS:<br />
- A temperatura da placa de migração continua a decrescer quando a tampa está aberta até chegar aos 20 °C (em menos de 5 minutos). Depois<br />
pode-se dar início a um novo processo de migração.<br />
- Repor o aplicador de amostras e os suportes do eléctrodo no seu lugar.<br />
- Limpar a placa de controlo de temperatura com um pano macio e húmido.<br />
VII.FINALIZAÇÃO DO TRATAMENTO DO GEL<br />
1. Retirar o suporte do gel da câmara, abrir e retirar o gel seco.<br />
2. Se necessário, limpar a parte de trás (suporte plástico) do gel com um papel macio e húmido.<br />
NOTA : Para os geles com linhas de migração múltiplas (2 ou 3), as extensões da migração podem ser sensivelmente diferentes, sem qualquer<br />
consequência negativa nos resultados.<br />
RESULTADOS<br />
O antisoro pentavalente permite a detecção das:<br />
• Imunoglobulinas: Ig A (K ou L), Ig G (K ou L) e Ig M (K ou L) ;<br />
• Cadeias leves livres kapa ou lambda ;<br />
• Imunoglobulinas: Ig D (K ou L), Ig E (K ou L), que são detectadas pelas suas cadeias leves kapa ou lambda.<br />
Interpretação<br />
Uma amostra de soro normal apresenta uma zona pouco corada difusa de imunoglobulinas policlonais (G, A, M, kapa e lambda), sem nenhuma<br />
banda focalizada.<br />
Uma hipergamaglobulinémia é caracterizada por uma zona difusa fortemente corada, sem apresentar bandas monoclonais.<br />
Uma gamapatia é caracterizada por uma ou mais bandas monoclonais bem demarcadas, detectadas pelo soro pentavalente.<br />
Casos especiais<br />
• Uma gamapatia monoclonal ligeira (ex. disglobulina de mobilidade beta) pode ser camuflada por um perfil electroforético normal. Esta fracção será<br />
detectada pelo antisoro pentavalente.<br />
• Uma hipogamaglobulinémia pode estar associada a uma cadeia leve livre monoclonal. Esta proteína, devido ao seu baixo peso molecular, é<br />
eliminada pelos rins na urina (proteína Bence Jones). A quantidade remanescente no soro é normalmente muito baixa, mas pode ser detectada por<br />
imunofixação com o antisoro pentavalente, através da sua reacção de amplificação.<br />
• Quando uma banda do tipo monoclonal é observada por electroforese (pista ELP) mas falha na confirmação por imunofixação, a primeira suspeita<br />
deverá ser a presença de fibrinogénio (numa amostra de plasma).<br />
• Quando a mesma banda monoclonal é observada em todas as pistas de imunofixação, deverá suspeitar-se de crioglobulina ou Ig M polimerizada.<br />
Despolimerizar com agente redutor e repetir a técnica (ver "AMOSTRAS").<br />
Qualquer fracção monoclonal-like terá de ser identificada numa investigação seguinte com kits de imunofixação <strong>HYDRAGEL</strong> de máscara padrão:<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, ref. nº 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, ref. nº 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, ref. nº 4804 ou 4808, ou <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong><br />
SEBIA, ref. nº 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, ref. nº 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, ref. nº 4822 ou <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES SEBIA,<br />
ref. nº 4824.<br />
Interferências e limitações<br />
O uso de outros antisoros que não o específico para a técnica de imunofixação com máscara padrão, pode afectar os resultados.<br />
De acordo com os princípios analíticos das técnicas actuais (princípios de electroforese de zona, resolução e sensibilidade), não pode ser dada<br />
qualquer garantia quanto à detecção total de todos os compostos monoclonais.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Assistência técnica<br />
Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor, ainda que tenham sido seguidas, escrupulosamente, as instruções para<br />
a preparação e armazenamento dos reagentes, assim como as instruções de utilização da técnica.<br />
Estão disponíveis nos Serviços Técnicos da SEBIA fichas de dados de segurança dos diversos reagentes do kit, bem como informação relativa à<br />
eliminação dos desperdícios.<br />
CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO<br />
Reprodutibilidade e especificidade<br />
A reprodutibilidade foi demonstrada com duas amostras de soro patológico com alto e baixo nível de componente monoclonal, uma amostra de soro<br />
com uma zona α-1 e α-2 aumentada e outra de soro normal. Cada amostra foi ensaiada em três lotes de gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>. Todos os<br />
quatro soros ensaiados deram resultados idênticos para os 3 lotes mostrando perfis típicos para cada tipo de amostra testada. A imunofixação não<br />
mostrou nenhuma banda monoclonal na amostra de soro com perfil inflamatório nem com o soro normal e revelou as fracções monoclonais esperadas<br />
nas duas amostras de soro patológico.<br />
Precisão<br />
Trinta amostras diferentes (29 de soro patológico e uma de soro normal) foram testadas com o kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, com o kit <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>IF</strong> e com outro sistema de imunofixação por geles de agarose disponível comercialmente. As amostras patológicas apresentaram as mesmas bandas<br />
anormais com os três sistemas.<br />
Sensibilidade<br />
Três soros com gamapatias foram diluídos em série. Os resultados são indicados no quadro abaixo:<br />
COMPONENTE MONOCLONAL LIMITE DE DETECÇÃO (g/l) AMOSTRA N° TIPO CONCENTRAÇÃO (g/L) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> TESTE COMPARATIVO 1 gama, kapa 18 0,25 0,25 2 alfa, lambda 7,3 0,<strong>12</strong> 0,5<br />
| 3 | mu, kapa | 9 | 0,5 | 0,5 |<br />
BIBLIOGRAFIA<br />
Para informação adicional sobre a interpretação dos padrões de imunofixação, consultar:<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
ANVÄNDNINGSOMRÅDE<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> och <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kit är designade för detektering av monoklonala proteiner i humant serum med immunofixering<br />
elektrofores på alkaliskt buffrade (pH 9.1) agaros geler. De används tillsammans med det halvautomatiska HYDRASYS systemet för att utföra alla<br />
nödvändiga steg klara för geltolkning. Serumproteinerna genomgår elektrofores och immunofixering med ett pentavalent antiserum anti-gamma (Ig G),<br />
alfa (Ig A) och mu (Ig M) tunga kedjor, och anti-kappa och lambda (fria & bundna) lätta kedjor. Efter immunofixering, färgas de utfällda proteinerna<br />
med amidosvart. Eventuell överflödig färg avlägsnas med en sur lösning.<br />
Varje agaros gel i <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> och <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kiten är avsedda för att köra sex eller tolv prov.<br />
Endast för in vitro diagnostik.<br />
TESTPRINCIPER<br />
Abnormala band hos elektroforetiska mönster i serumproteiner, primärt dem med gammarörlighet, men även alfa- och beta-rörlighet (dessa kan vara<br />
gömda av regelbundna proteiner i motsvarande zoner), misstänks alltid vara monoklonala proteiner och därmed en indikation på gammopatier. För<br />
identifiering av dessa abnormala band används immunofixeringstekniken.<br />
Immunofixerings-elektrofores är en enkel teknik som tillåter ett protein att bli förankrad in situ (på plats) efter elektrofores, genom bildning av ett olösligt<br />
komplex med sin antikropp. Detta genomförs i fyra steg:<br />
1. Proteinseparering med elektrofores på agaros gel.<br />
2. Fixering och immunoprecipitering av elektroforiserade proteiner: Fixativ lösning och antiserum läggs direkt på gelytan över passande<br />
elektroforetiskt migreringsspår. Fixativ lösning och antiserum diffunderar in i gelen, alla proteiner och motsvarande antigener precipiterar därmed.<br />
3. De oprecipiterade, lösliga proteinerna avlägsnas från gelen med blottning och tvättning. Fällning av antigen-antikropp komplex fångas i<br />
gelmatrisen.<br />
4. De fällda proteinerna visualiseras med färgning. De immunoprecipiterade banden jämförs sedan med motsvarande abnormala band som kan ses<br />
i serumprovets elektroforetiska mönster.<br />
För att detektera en misstänkt monoklonal komponent (komponenter), genomgår proven samtidig elektrofores i två spår. Efter elektrofores, används<br />
ELP- spåret som referens, vilket visar elektroforetiska mönster hos provets proteiner. Immunofixeringsspåret (<strong>Penta</strong>) visar monoklonala komponenter<br />
som har reagerat med pentavalent antiserum.<br />
Denna enkla och snabba teknik, ger en klar och lätt tolkningsbar bild.<br />
MEDFÖLJANDE REAGENSER OCH MATERIAL I KITEN : <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> OCH <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
OBJEKT PN 4841 PN 4842 PN 4884* Agaros geler (färdiga att anv.) 10 geler 10 geler 80 geler Buffrade strips (färdiga att anv.) 10 förp. med 2 10 förp. med 2 80 förp. med 2 Färglösningsdiluent 1 flaska, 60 mL 1 flaska, 60 mL 8 flaskor, 60 mL Amidosvart färg (stamlösning) 1 flaska, 20 mL 1 flaska, 20 mL 8 flaskor, 20 mL Fixativ lösning (färdig att anv.) 3 flaskor, 14.4 mL Anti-Ig human immunoglobuliner-däggdjursursprung (gamma - alfa - mu - kappa - lambda) : pentavalent antiserum (färdig att anv.)<br />
3 flaskor, 8.0 mL Applikatorer (färdiga att anv.) 1 förp. med 10 2 förp. med 10 16 förp. med 10 Filterpapper-tunna 1 förp. med 10 1 förp. med 10 8 förp. med 10 Filterpapperkammar 1 förp. med 10 2 förp. med 10 16 förp. med 10<br />
| Filterpapper-tjocka | 1 förp. med 10 | 1 förp. med 10 | 8 förp. med 10 |<br />
*<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
NOTERA : Fixativ lösning och pentavalent antiserum levereras separat med undantag för MAXI-KIT (Se ERFORDERLIGA REAGENSER MEN EJ<br />
MEDLEVERERADE).<br />
FÖR OPTIMALA RESULTAT<br />
Reagenser från samma kit måste alltid användas tillsammans och enligt de instruktioner som anges på förpackningens insticksblad.<br />
LÄS NOGGRANNT FÖRPACKNINGENS INSTICKSBLAD.<br />
1. AGAROS GELER<br />
Förberedelse<br />
Agaros geler är färdiga att använda. Varje gel innehåller: agaros, 0.8 g/dL ; Tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.1 ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer men nödvändiga för optimal prestanda.<br />
VARNING: Agaros geler innehåller 0.31 % barbital och 0.34 % natrium barbital. Färtär inte ! Vid förtäring, kontakta läkare omedelbart.<br />
Användning<br />
Hjälpmedel för proteinelektrofores och immunofixering.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara gelerna upprätt, i originalförpackningen och vid rumstemperatur (15 till 30 °C) eller i kylskåp (2 till 8 °C). Pilen på förpackningens framsida<br />
måste peka uppåt. De är hållbara fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på gelförpackningens etiketter. Undvik förvaring nära fönster<br />
eller värmekälla. Undvik större temperaturvariationer under lagring.<br />
FRYS INTE IN GELEN.<br />
- 57 -<br />
SEBIA INSTRUKTIONER - Svenska
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Släng gelen om:<br />
(i) kristaller eller fällning bildats på gelytan eller gelkonsistensen blivit väldigt mjuk (inträffar när gelen varit fryst),<br />
(ii) bakteriell tillväxt eller mögeltillväxt påvisas,<br />
(iii) onormal mängd vätska är närvarande i gelpåsen (som ett resultat av buffertutsöndring från gelen på grund av felaktiga lagringsförhållanden).<br />
2. BUFFRADE STRIPS<br />
Förberedelse<br />
Buffrade svampstrips är färdiga att använda. Varje strips innehåller: Tris-barbital buffert pH 9.1 ± 0.3 ; natriumazid ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer, men nödvändiga för optimal prestanda.<br />
VARNING: Bufferten i stripsen innehåller 0.92 % barbital, 1.03 % natriumbarbital och 0.30 % natriumazid. Förtär inte ! Vid förtäring, kontakta<br />
läkare omedelbart! Vid avyttring, undvik kontakt med syra, bly eller koppar, då dessa kan bilda explosiva eller giftiga föreningar med<br />
natriumazid.<br />
Användning<br />
Buffrade svampstrips fungerar som en elektroforetisk buffertreservoar och säkerställer kontakt mellan gel och elektroder.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara de buffrade stripsen liggande i den skyddande originalförpackningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. Pilen på förpackningens framsida<br />
måste peka uppåt. De är hållbara fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på de buffrade stripsens förpackningsetikett.<br />
FRYS INTE IN STRIPSEN.<br />
Kassera om förpackningen är öppen eller om stripsen är uttorkade.<br />
3. FÄRGNINGSLÖSNING DILUENT<br />
Förberedelse<br />
Färglösningsdiluent för amidosvart måste användas enligt beskrivning i paragraf " AMIDOSVART FÄRG ".<br />
Den innehåller en sur lösning.<br />
Användning<br />
För förberedelse av amidosvart färglösning.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara diluenten vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på diluentens flasketiketter.<br />
FRYS INTE IN.<br />
Tillsätt inte natriumazid.<br />
4. AMIDOSVART FÄRG<br />
Förberedelse<br />
Amidosvart koncentratet är visköst och kan bli trögflytande. Egenskaperna hos stamlösningen påverkas ej av ökad viskositet eller löslighet.<br />
För att uppnå en perfekt rekonstituering av färgen, vänligen respektera nedansående procedur:<br />
1. Tillsätt 15 ml färgdiluent till vialen amidosvartkoncentrat.<br />
2. Stäng vialen omsorgsfullt.<br />
3. Skaka vialen kraftigt i c:a 5 sekunder.<br />
4. Häll lösningen i behållaren för färgprocessning.<br />
5. Repetera dessa steg 2 eller 3 gånger om nödvändigt.<br />
6. Överför återstående diluent till behållaren och fyll upp till 300 mL med destillerat eller avjoniserat vatten.<br />
7. Blanda innehållet i behållaren noga 5 till 10 minuter. Färglösningen är nu redo att användas.<br />
NOTERA: En icke komplett reconstituerad färglösning kan leda till en undervärdering av albuminfraktionen (lågt procenttal eller vita hål i fraktionen).<br />
Efter spädning innehåller arbetsfärglösningen : sur lösning pH ≈ 2 ; amidosvart, 0.4 g/dL ; etylen-glykol, 6.7 % ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda.<br />
VARNING: Farligt att svälja.<br />
Användning<br />
För färgning av geler vid elektroforetiska proteinsepareringar.<br />
VIKTIGT : Färglösningen är avsedd för färgning av 10 geler. Byt lösning efter färgning av 10 geler.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Lagra både stam-och bruks-färglösningar vid rumstemperatur eller i kylskåp i väl tillslutna behållare för att förhindra avdunstning. Stamfärglösningen<br />
är hållbar till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på färgflaskornas etiketter.<br />
Brukslösningen är hållbar i en månad.<br />
Förvara inte arbetsfärglösningen i närheten av en värmekälla.<br />
5. FIXATIV LÖSNING (med PN 4884)<br />
Förberedelse<br />
Fixativ lösning är färdig att använda. Den innehåller: sur lösning ; tillsatser som är ofarliga vid de använda koncentrationerna men nödvändiga för<br />
optimal prestanda. Fixativet är färgat med en ofarlig färg som matchar flasketiketten för lätt identifikation och som en hjälp för att övervaka dess<br />
användning.<br />
Användning<br />
Används för fixering av elektroforetiskt separerade proteiner i referensspåret (ELP).<br />
NOTERA : Fixativ lösning är specifik för immunofixering med maskerna 6 och <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
VIKTIGT: För att undvika kontaminering mellan reagens, var noggrann med att sätta tillbaka skruvlocket på motsvarande flaska efter varje användning.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara fixativ lösning vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på fixativlösningens<br />
flasketiketter.<br />
Fixativ lösning måste vara fri från fällning.<br />
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6. PENTAVALENT ANTISERUM (med PN 4884)<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Förberedelse<br />
<strong>Penta</strong>valent antiserum är färdig att använda. <strong>Penta</strong>valent antiserum är en blandning av totalt immunoglobulin av icke-Ig humant däggdjursursprung.<br />
Antiserum är färgat med en ofarlig gul-orange färg som matchar färgen på flaskans etikett, dels för lätt identifikation av antiserumet och dels som en<br />
hjälp för att övervaka dess användning.<br />
Om antiserum visar en lätt grumlighet, lämna antiserumflaskan vid rumstemperatur i minst 10 minuter. Detta bör vara tillräckligt för att lösningen skall<br />
klarna, men om grumligheten kvarstår skall detta inte på något sätt påverka den immunologiska reaktionen. Om olösliga precipitat kvarstår<br />
rekommenderas att centrifugera antiserumet vid 3000 rpm i 5 minuter.<br />
Användning<br />
Används för immunofixering av proteiner efter elektrofores.<br />
NOTERA : <strong>Penta</strong>valent antiserum är specifik för immunifixering med maskerna 6 och <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Antisera kan härröra från olika djurarter. Blanda aldrig två olika antiserumflaskor, även om de har samma specificitet, och byt ALLTID pipettspets mellan<br />
antiserumflaskor.<br />
VIKTIGT: För att undvika kontaminering mellan reagens, var noggrann med att sätta tillbaka skruvlocket på motsvarande flaska efter varje användning.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara <strong>Penta</strong>valent antiserum i kylskåp (2 till 8 °C). Det är hållbart fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på antiserumflaskans etikett.<br />
NOTERA: Under transport kan antiserum förvaras utan kyla (15 till 30 °C) i 15 dagar utan några negativa effekter på prestandan.<br />
7. APPLIKATORER<br />
Användning<br />
Tillskurna applikatorer för engångsbruk. För provapplicering.<br />
Förvaring<br />
Förvara applikatorerna på en torr plats, vid rumstemperatur eller i kylskåp.<br />
8. FILTERPAPPER - TUNNA<br />
Användning<br />
Tunnt tillskurna och absorberande pappersbitar för engångsbruk. Används för borttagning av överflödig fukt på gelytan innan provapplicering.<br />
Förvaring<br />
Förvara de tunna filterpappren på ett torrt ställe i rumstemperatur eller i kylskåp.<br />
9. FILTERPAPPERKAMMAR<br />
Användning<br />
För engångsanvändning, tjockt tillskurna papperskammar för borttagning av överflödig fixativ lösning och antiserum från gelytan efter immunofixering.<br />
10. FILTERPAPPER-TJOCKA<br />
Användning<br />
Engångsbruk, tjocka absorberande pappersbitar för blottning av oprecipiterade proteiner från gelen efter immunofixeringssteget.<br />
Förvaring<br />
Förvara de tjocka filterpappren på en torr plats vid rumstemperatur eller i kylskåp.<br />
ERFORDERLIGA REAGENSER MEN INTE MEDLEVERERADE<br />
1. FIXATIV LÖSNING<br />
Förberedelse<br />
Fixativ lösning för immunofixering (SEBIA, PN 4799, 1 flaska, 2.5 mL) är färdig att använda. Fixativ lösning innehåller: sur lösning ; tillsatser som är<br />
ofarliga vid de använda koncentrationerna men nödvändiga för optimal prestanda. Fixativ lösning är specifik för immunofixering med maskerna<br />
6 och <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Fixativet är färgat med en ofarlig färg som matchar flasketiketten för lätt identifikation och som en hjälp för att övervaka dess användning.<br />
Användning, lagring, stabilitet och tecken på förändring : Se tidigare paragraf 5.<br />
2. PENTAVALENT ANTISERUM<br />
Flaska med pentavalent antiserum (SEBIA, PN 4616, 1 mL eller PN 4738, 8 mL), innehåller en blandning av totalt immunoglobulin av icke-Ig humant<br />
däggdjursursprung. Den är specifik för immunofixering med maskerna 6 och <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Antiserum är färgat med en ofarlig gul-orange färg som matchar färgen på flaskans etikett, dels för lätt identifikation av antiserumet och dels som en<br />
hjälp för att övervaka dess användning.<br />
För förberedelse, användning, lagring, stabilitet och tecken på förändring: Se tidigare paragraf 6.<br />
3. AVFÄRGNINGSLÖSNING<br />
Förberedelse<br />
Varje flaska med stamavfärgningslösning (SEBIA, PN 4540, 10 flaskor 100 mL i varje) skall spädas upp till 100 liter med destillerat eller avjoniserat<br />
vatten. Lämpligt att endast späda 5 mL av stamlösning till 5 liter, samma som är volymen hos behållaren för avfärgningslösningen. Efter spädning<br />
innehåller den färdiga avfärgningslösningen: citronsyra, 0.05 g/dL.<br />
Användning<br />
För avfärgning, vilket innebär borttagning av överflödig färg samt bakgrundsfärg från gelerna.<br />
För avsköljning av färgfacket efter tvättsteget.<br />
För att neutralisera den sura avfärgningslösningen, häll 15 mL av en 50 % Natriumhydroxidlösning, i den tomma avfallsbehållaren.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara stamavfärgningslösningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på avfärgningslösningens<br />
förpackning eller på flasketiketterna. Bruksavfärgningsslösning är hållbar i en vecka vid rumstemperatur i väl tillsluten flaska. Tillsätt ej natriumazid.<br />
Kassera bruksavfärgningslösningen om den förändras i utseende t.ex., blir grumlig p.g.a. mikrobiell kontaminering.<br />
För att förhindra mikrobiell tillväxt i den spädda avfärgningslösningen (vid lagring mer än 1 vecka) tillsätt 5 µl/dL av ProClin 300.<br />
Bruksavfärgningslösning tillsatt med ProClin är hållbar i stängd flaska, förvarad vid rumstemperatur eller i kylskåp till angivet utgångsdatum på<br />
förpackningen eller på avfärgninglösningens flasketiketter.<br />
4. HYDRASYS TVÄTTLÖSNING<br />
Förberedelse<br />
Varje flaska av HYDRASYS stamtvättlösning (SEBIA, PN 4541, 10 flaskor, 80 mL i varje) skall spädas upp till 5 liter med destillerat eller avjoniserat<br />
vatten. Efter spädning innehåller den färdiga tvättlösningen : alkalisk buffert pH 8.8 ± 0.3 ; natriumazid.<br />
VARNING: Brukstvättlösning innehåller 0.625 % natriumazid. Farligt vid förtäring ! Vid förtäring, kontakta läkare omedelbart ! Natriumazid<br />
kan leda till bildning av explosiva eller giftiga ämnen vid kontakt med syror, bly eller koppar. Spola alltid med en stor mängd vatten vid<br />
avyttring.<br />
Användning<br />
HYDRASYS tvättlösning är designad för att tvätta oprecipiterade proteiner från gelerna. Lösningen används även för rengöring av HYDRASYS<br />
färgfack. Använd regelbundet, t.ex. om instrumentet används dagligen, tvätta färgfacket varje vecka.<br />
Se förpackningens insticksblad för användarinstruktioner.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara stam- och brukstvättlösningarna i väl tillslutna behållare vid rumstemperatur eller i kylskåp. Lösningarna är hållbara fram till angivet<br />
utgångsdatum på tvättlösningsflaskornas etiketter. Kassera den färdigspädda tvättlösningen om den förändras i utseende, t.ex. blir grumlig på grund<br />
av bakteriell kontaminering.<br />
5. FLUIDIL<br />
Förberedelse<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 flaska med 5 mL) är färdig att använda.<br />
Användning<br />
För spädning av viskösa eller grumliga prov, t.ex. sera som innehåller kryoglobulin eller kryogel.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på Fluidilflaskans etikett.<br />
Fluidil måste vara fri från fällning.<br />
UTRUSTNING OCH NÖDVÄNDIGA TILLBEHÖR MEN EJ MEDLEVERERADE<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN <strong>12</strong>10 eller PN <strong>12</strong>11.<br />
2. Mikropipett, manuell eller automatisk, t.ex. HYDRAplus SEBIA, PN <strong>12</strong>15, ett alternativt sätt att ladda provapplikatorerna.<br />
3. Fuktkammare, PN <strong>12</strong>70, levererad med HYDRASYS.<br />
4. Behållarsats levererad med HYDRASYS.<br />
5 Mallguide (färgkodsguide) SEBIA, levererad med HYDRASYS.<br />
6. Tillbehörskit HYDRASYS <strong>IF</strong>, SEBIA, PN <strong>12</strong>60.<br />
7. Pipetter: 10 µL och 200 µL.<br />
PROV FÖR ANALYS<br />
Provinsamling och förvaring<br />
Färska serumprov rekommenderas för analys. Sera måste insamlas enligt etablerade rutiner som används i kliniska laboratorier.<br />
Vid behov, förvara sera vid 2 till 8 °C upp till en vecka.<br />
Vid längre förvaringsperioder, frys in proven. Frysta prov är hållbara i minst en månad.<br />
Tinade prover kan ge lätta appliceringsmärken på grund av protein- eller lipoproteindenaturering.<br />
Frysning av serumprov med natriumazid 0,02 g/dL ökar hållbarheten.<br />
Förberedelse av prov<br />
Använd ospädda serumprov.<br />
Efter lagring vid 2 till 8 °C eller efter frysning, kan vissa sera (speciellt de som innehåller kryoglobulin eller kryogel) bli viskösa eller utveckla grumlighet.<br />
Sådana sera kan ge appliceringsproblem på grund av förhindrad diffundering i provapplikatorns tänder. Vid sådana fall, tillsätt 25 µl Fluidil till 75 µl<br />
serum och vortexa under 15 sekunder. Följ därefter normalt förfaringssätt.<br />
Vissa monoklonala proteiner kan polymerisera vilket leder till en "monoklonal fraktion" som kan ses på alla immunofixerade spår. I detta fall (i) förbered<br />
1 % beta-merkaptoetanol (BME, eller 2-merkaptoetanol, 2ME) i Fluidil, (ii) tillsätt 25 µL av denna reducerande lösning till 75 µL ospätt serum, (iii)<br />
vortexa och vänta i minst 15 minuter (maximum 30 minuter) följ därefter normalt tillvägsgångssätt.<br />
Prov att undvika<br />
Undvik plasmaprov : Fibrinogen ger ett band i referensspåret nära appliceringspunkten som kan tas för ett monoklonalt immunoglobulin.<br />
Undvik hemolyserade prov.<br />
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT<br />
HYDRASYS systemet är ett halvautomatiskt multi-parameter instrument. De automatiska stegen inkluderar bearbetning av <strong>HYDRAGEL</strong> agarosgeler<br />
i följande ordning: provapplicering, elektroforetisk migrering, inkubering med fixativ lösning och antiserum, torkning, färgning, avfärgning och till sist<br />
torkning. De manuella stegen inkluderar hantering av prov och geler, applicering av fixativ och antiserum samt att förbereda instrumentet för arbete.<br />
LÄS NOGGRANNT HYDRASYS INSTRUKTIONSMANUAL.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
I. MIGRERING<br />
1. Starta HYDRASYS instrumentet.<br />
2. Placera en applikator för 6 provanalyser på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong> eller två applikatorer för <strong>12</strong> provanalyser, på en slät yta med brunnarnas<br />
nummer i upprätt läge (Fig. 1).<br />
- Applicera 10 µL outspätt prov in i varje brunn. Ladda varje applikator inom 2 minuter.<br />
| BRUNNAR |<br />
PROV ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
NOTERA: Brunnar med nummer 1, 8 och 15 används inte i detta test ; de kan markeras med en filtpenna för att undvika att fylla dem av<br />
misstag.<br />
- Placera varje applikator i fuktkammaren med tänderna uppåt [håll i den skyddande plast ramen].<br />
Se fuktkammarens insticksblad för ytterligare detaljer.<br />
- Låt proverna diffundera in i tänderna efter den sista provappliceringen. För senare gelapplicering (upp till 8 timmar), förvara hela kammaren<br />
i kylskåp.<br />
3. Öppna luckan till Migrationsmodulen, och lyft upp elektrod- och applikatorhållarna.<br />
VARNING: Stäng aldrig luckan när hållarna är i höjt läge!<br />
4. Välj "6/<strong>12</strong> PENTA SM/DM" migrationsprogram på instrumentmenyn (tangentbordets vänstra sida).<br />
5. Ta ur de buffrade stripsen ur förpackningen ; ta dem i dess plaständar. Sätt de hålstansade ändarna på stripsens plaststöd på elektrodhållarens<br />
pinnar ; stripsens plaststöd måste vara vända mot elektrodhållaren (Fig. 2).<br />
6. Ta ut <strong>HYDRAGEL</strong> gelplatta.<br />
- Rulla snabbt och jämt med ett tunt filterpapper på gelytan för bortagning av överflödig vätska. Ta omedelbart bort pappret.<br />
VARNING: För att undvika uttorkning : låt inte filterpappret vara i kontakt med gelen under längre tid.<br />
- Pipettera 200 µL destillerat eller avjoniserat vatten, på den lägre tredjedelen av ramen som är tryckt på migrationsmodulens<br />
temperaturkontrollplatta.<br />
- Placera gelplattan (gelsidan uppåt) med kanterna mot stoppet vid den nedre delen på den tryckta ramen (Fig. 3).<br />
- Böj gelen och släpp den försiktigt ned i vattendroppen (Fig. 3). Förvissa dig om att inga luftbubblor finns kvar, att vattnet fördelar sig jämt<br />
under hela gelplattan och att gelen är i linje med den tryckta ramen.<br />
7. Fäll ned båda hållarna. I detta läge berör inte de buffrade stripsen gelen. TRYCK INTE HÅLLARNA HELA VÄGEN NED.<br />
8. Avlägsna varje applikator från fuktkammaren. Håll i den skyddande ramen.<br />
- Avlägsna applikatorns tandskyddsram.<br />
- För 6 provanalyser på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>, placera applikatorn i position nr. 6 på hållaren.<br />
- För <strong>12</strong> provanalyser, placera två applikatorer i positionerna nr. 3 och 9.<br />
För att förbättra reproducerbarheten vid provapplicering, finjustera alltid applikatorerna mot hållarens vänstra sida.<br />
VIKTIGT: Det tryckta numren på applikatorn måste vara vända mot operatören (Fig. 4).<br />
9. Stäng luckan till migrationsmodulen.<br />
10. Starta proceduren direkt genom att trycka på den gröna piltangenten "START" på tangentbordets vänstra sida.<br />
VIKTIGT: Förvissa dig om att ventilationsintaget på instrumentets högra sida inte är blockerat.<br />
MIGRERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG<br />
• Båda hållarna sänker sig så att de buffrade stripsen och applikatorn (applikatorerna) får kontakt med gelytan.<br />
• Provapplikatorn höjer sig.<br />
• Migrering sker vid 20 W konstant strömstyrka vid 20 °C kontrollerat av Peltiereffekten, tills 42 Vh har ackumulerats (under ca. 9 minuter).<br />
• Elektrodhållaren höjer sig för koppla ur elektroderna.<br />
• En ljudsignal hörs som aviserar att migrationmodulens lucka låses upp. Följande meddelande visas på skärmen: " AS"/reagensapplicering.<br />
NOTERA: Luckan till migrationsmodulen förblir stängt under alla migrationsstegen.<br />
II. IMMUNOFIXERING<br />
1. Öppna luckan till migrationsmodulen.<br />
2. Avlägsna provapplikatorn (provaplikatorerna) och kassera.<br />
3. Lyft upp båda hållarna, avlägsna de buffrade stripsen genom att ta dem i dess plasändar och kassera.<br />
- Ta bort båda hållarna.<br />
- Torka av elektroderna med en mjuk fuktig servett.<br />
- Lämna kvar gelen på sin plats i migrationsmodulen.<br />
4. Sätt upp antiseramasken för reagensapplicering (reagensappliceringsmall) enligt följande (Fig. 5) :<br />
- Placera antiseramasken på den förankrande metallstången (masken kan vara kvar i migrationsmodulen hela tiden).<br />
- Håll antiseramasken i fliken och placera den i guiden med skårorna i linje med markeringarna.<br />
- Fäll ned antiseramasken på HYDRASYS gelen.<br />
5. Applicera reagenserna neligt nedan :<br />
| SPÅR | VOLYM | REAGENS | FÄRG |<br />
| ELP | 35 µL | fixativ lösning | gul |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µL | pentavalent antiserum | gul-orange |<br />
NOTERA: För att undvika förväxling, visas reagensfärgerna både på flasketiketterna och på appliceringmallens brunnar.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
- Pipettera upp reagenserna ; undvik luftbubblor vid pipettspetsen.<br />
- Applicera reagenserna (Fig. 6):<br />
- Håll pipetten upprätt, låt pipettspetsen lät vila mot brunnens botten.<br />
- Pipettera ut reagenserna så att de sprider sig under mallen, se till att inga luftbubblor göms.<br />
6. Stäng luckan till migrationsmodulen.<br />
7. Starta proceduren genom att trycka på den gröna piltangenten "START" på tangentbordets vänstra sida. Ett meddelande "[INCUBATION]"<br />
visas på skärmen.<br />
IMMUNOFIXERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG<br />
• Inkubering vid 20 °C under 5 minuter (kontrollerat av Peltiereffekten).<br />
• En ljudsignal hörs som aviserar att migrationmodulens lucka låses upp. Följande meddelande visas på skärmen: "❊ AS (MS)" (borttagning av<br />
reagens).<br />
NOTERA: Luckan till migrationsmodulen förblir stängd under hela inkuberingen.<br />
III. BORTTAGNING AV ÖVERFLÖDIGA REAGENSER<br />
1. Öppna luckan till migrationsmodulen.<br />
2. Avlägsna överflödiga reagenser med filterpapperkammarna (en kam <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, två kammar för <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>)<br />
(Fig. 7) :<br />
- Sätt kammen (kammarna) i 30° vinkel mot dig i öppningen i mallens fördjupningar så att tänderna berör den vertikala sidan.<br />
- Se till att tänderna försiktigt når vätskeytan genom att vinkla kammen (kammarna) i 45° vinkel så att vätskan kan absorberas i tänderna<br />
(Fig. 8).<br />
VIKTIGT: Tänderna får inte röra gelen. Varje kam måste vara lutad (45°). Om den är i upprätt läge, kan den skada gelen.<br />
3. Starta proceduren genom att trycka på tangenten "START" (grön pil på tangentbordets vänstra sida).<br />
BORTTAGNING AV REAGENS - BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG<br />
• Reagenserna absorberas under 15 sekunder vid 20 °C (kontrollerat av Peltiereffekten).<br />
• En ljudsignal hörs. Följande meddelande visas på skärmen : " PAP.".<br />
IV. BLOTTNING AV GEL<br />
1. Avlägsna kammen (kammarna).<br />
2. Kontrollera att reagenserna har absorberats vilket visas genom:<br />
- Frånvaro av reagenser på gelen.<br />
- Tänderna är färgade till sin fulla längd.<br />
Om absorbering av reagens är otillräcklig, sätt in samma filterpapperkam igen (i samma position) och upprepa manuellt<br />
borttagningsproceduren.<br />
3. Lyft upp antiseramasken och avlägsna den.<br />
4. Applicera ett tjockt filterpapper på gelen:<br />
- Passa in filterpapprets nedre del mot gelkanten.<br />
- Sänk ned den på gelen (luta filterpappret i 45° vinkel).<br />
VARNING: Tryck med stadig hand på filterpapprets hela yta för att uppnå perfekt kontakt med gelen.<br />
5. Stäng luckan till migrationsmodulen.<br />
6. Starta proceduren genom att trycka på tangenten "START" key (grön pil på tangentbordets vänstra sida).<br />
7. Rengör appliceringsmallen med en liten borste (t.ex., tandborste). ANVÄND INTE ALKOHOL ELLER LÖSNINGAR. Innan återanvändning,<br />
förvissa dig om att mallen är helt torr, avlägsna vattendroppar från brunnarna genom att knacka med ett mjukt papper.<br />
BLOTTNING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG<br />
• Blottning vid 40 °C kontrollerat av Peltiereffekten, under 3 minuter.<br />
• En ljudsignal hörs. Följande meddelande visas på skärmen "❊ PAP." / ta bort papper.<br />
V. TORKNING AV GEL<br />
1. Öppna luckan till migrationsmodulen.<br />
2. Ta bort filterpappret men lämna gelen kvar på sin plats.<br />
3. Stäng luckan.<br />
4. Starta proceduren genom att trycka på tangenten "START" (grön pil på tangentbordets vänstra sida).<br />
TORKNING - BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG<br />
• Torkning vid 50 °C kontrollerat av Peltiereffekten, under 6 minuter.<br />
• En ljudsignal hörs och luckan öppnas. Plattans temperatur stannar vid 50 °C tills luckan öppnas.<br />
NOTERA: Luckan till migrationsmodulen förblir stängd under torkning.<br />
VI. GELBEARBETNING<br />
1. Öppna luckan.<br />
2. Avlägsna den torkade gelfilmen för vidare bearbetning.<br />
3. Öppna gelhållaren. Lägg den platt med gelsidan uppåt i fördjupningarna på de två listerna och stäng hållaren. Förvissa dig om att filmen är<br />
korrekt placerad inuti hållaren (Fig. 9).<br />
4. Placera gelhållaren i modulen för gelbearbetning/färgning.<br />
VIKTIGT: Innan start av färgningsprogrammet, kontrollera följande :<br />
- att behållaren med tvättlösning innehåller minst 400 mL tvättlösning ;<br />
- att färgningsbehållaren är fylld med 300 mL färgningslösning ;<br />
- att behållaren för avfärgning innehåller minst 1 liter avfärgningslösning ;<br />
- att avfallsbehållaren är tom.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
För reagenslinjeförbindelse: Hänvisas till visad information på instrumentets skärm (välj tangent: "REAGENT LINES").<br />
VIKTIGT: Glöm inte att blockera oanvända linjer.<br />
5. Välj "<strong>IF</strong> AMIDO" färgningsprogram på instrumentmenyn och starta körningen genom att trycka på tangenten "START" (grön pil på<br />
tangentbordets högra sida).<br />
Under färgning-, avfärgning- och torkningsstegen, förblir facket låst. Efter kylningssteget, hörs en ljudsignal när facket öppnas (ventilation<br />
upprätthålls tills gelhållaren avlägsnas).<br />
NOTERA:<br />
- När luckan öppnas fortsätter migrationplattans temperatur att sjunka tills den når 20 °C (inte mer än 5 minuter). Därefter kan en ny migrationskörning<br />
startas.<br />
- Placera åter provapplikator- och elektrodhållaren på sina platser.<br />
- Torka temperaturkontrollplattan med en mjuk fuktad servett.<br />
VII.SLUTFÖRANDE AV GELBEARBETNING<br />
1. Avlägsna gelhållaren från facket, öppna den och av ta bort den torkade gelen.<br />
2. Om nödvändigt, rengör den torra filmens baksida (stödsidan av plast) med ett fuktat mjukt papper.<br />
ANMÄRKNING : Längden hos de elektroforetiska migreringarna kan vara något olika för geler innehållande 2 eller 3 analysspår, utan några<br />
ofördelaktiga effekter på utförandet.<br />
RESULTAT<br />
<strong>Penta</strong>valent antiserum detekterar :<br />
• G, A, M immunoglobuliner, kappa och lambda kedjor,<br />
• fria kappa och lambda lätta kedjor,<br />
• kappa och lambda lätta kedjor bundna till epsilon eller delta tunga kedjor.<br />
Tolkning<br />
Ett normalt serumprov visar en lätt färgad zon, vilken motsvarar de polyklonala immunoglobulinerna (G, A, M, kappa och lambda), utan några skarpa<br />
band.<br />
Hypergammaglobulinemi karaktäriseras av en starkt färgad, diffus zon, utan några begränsande band.<br />
En gammopati karaktäriseras av ett eller flera fokuserande band.<br />
Speciella fall<br />
En lätt monoklonal gammopati kan döljas i en normal elektroforetisk profil (t.ex., beta-rörlig dys-globulin). Detta band kan detekteras med pentavalent<br />
antiserum.<br />
• En hypogammaglobulinemi kan associeras med en monoklonal "free light chain". Detta protein, på grund av sin låga molekylära vikt, elimineras<br />
genom njuren till urin (Bence Jones Protein). Återstående nivå i serum är vanligtvis mycket låg, men kan detekteras genom immunofixering med<br />
pentavalent antiserum.<br />
• När ett monoklonalt typ av band observeras vid serumelektrofores (ELP spår) men ej kan bekräftas genom immunofixering, bör fibrinogen<br />
(plasmaprov) vara huvudmisstänkt.<br />
• När ett monoklonalt typ av band observeras på alla immunofixeringsspår, bör kryoglobulin eller polymeriserat Ig M misstänkas. Depolymerisera med<br />
ett reducerande agens och upprepa proceduren (se "Prov för analys").<br />
En monoklonal-liknande fraktion måste ytterligare identifieras med <strong>HYDRAGEL</strong> kits för immunofixering med standard mask :<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4804 eller 4808, eller <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong> SEBIA,<br />
PN 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4822 eller <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES SEBIA,<br />
PN 4824.<br />
Begränsningar<br />
Att använda andra antisera än de som är specifika för immunofixering med antiseramask kan påverka resultaten.<br />
På grund av begränsningar när det gäller upplösning och känslighet hos zonelektrofores, är det möjligt att vissa monoklonala komponenter inte<br />
detekteras med denna metod.<br />
Felsökning<br />
Ring leverantörens tekniska support om testet misslyckas trots att manualen och att givna instruktioner för materialförvaring och förberedelse av test<br />
följts.<br />
Säkerhetsinformation för reagenserna i kiten och information för avfallshantering finns tillgängliga hos leverantörens tekniska serviceavdelning.<br />
PRESTANDADATA<br />
Reproducerbarhet och specificitet, inom serie<br />
Reproducerbarhet inom gel demonstrerades på två patologiska serumprov, en hög, en låg nivå av monoklonal komponent, en med ökad alfa1-alfa 2<br />
zon smat ett normalt serum. Varje prov kördes på 3 batcher av <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kit. Alla testade prov uppvisade identiska resultat för de<br />
3 batcherna och de visade typiska resultat för den typ av prov som testades. Immunofixering gav inget monoklonalt band med serum som visade<br />
inflammatoriska mönster ej heller med normalt serum.<br />
Tillförlitlighet<br />
Trettio olika prov (29 patologiska sera och ett normalt serumprov) kördes med <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> kit, <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> kit, och ett annat<br />
kommersiellt tillgängligt agaros gel immunofixeringssystem. Identiska band detekterades för alla patologiska prov med samtliga testade system.<br />
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Sensitivitet<br />
Seriella spädningar preparerades för 3 patologiska serumprov, vilka alla uppvisade monoklonala komponenter.<br />
Resultaten är summerade nedan :<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
MONOKLONAL KOMPONENT DETEKTERINGSGRÄNS (g/L) PROV nr. TYP Konc. (g/L) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> KOMPARATIV TEST 1 gamma, kappa 18 0,25 0,25 2 alfa, lambda 7,3 0,<strong>12</strong> 0,5<br />
| 3 | mu, kappa | 9 | 0,5 | 0,5 |<br />
BIBLIOGRAFI<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ<br />
Τα κιτ <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> και <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> είναι σχεδιασµένα για την ανίχνευση µονοκλωνικών πρωτεϊνών σε ανθρώπινo ορό,<br />
µε ηλεκτροφορητική ανοσοκαθήλωση σε αλκαλικά ρυθµισµένα gel αγαρόζης (pH 9.1). Χρησιµοποιούνται µε το ηµι-αυτοµατοποιηµένο<br />
σύστηµα HYDRASYS, το οποίο εκτελεί όλα τα αναγκαία στάδια για να ληφθούν gel έτοιµα για αξιολόγηση. Οι πρωτεΐνες του ορού,<br />
διαχωριζόµενες µε ηλεκτροφόρηση ανοσοκαθηλώνονται και επωάζονται µε πενταδύναµο αντιορό έναντι γάµµα (Ig G), άλφα (Ig A) και µι<br />
(Ig M) βαρέων αλυσίδων καθώς και κάππα (ελεύθερων και συνδεδεµένων) και λάµδα (ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαφρών αλυσίδων.<br />
Μετά την ανοσοκαθήλωση, οι κατακρηµνισθείσες πρωτεΐνες υφίστανται χρώση µε amidoblack. Η περίσσεια χρωστικής αποµακρύνεται µε<br />
όξινο διάλυµα.<br />
Κάθε gel αγαρόζης στα κιτ <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> και <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> προορίζεται για την ανάλυση 6 ή <strong>12</strong> δειγµάτων, αντίστοιχα.<br />
Για In Vitro ∆ιαγνωστική Χρήση.<br />
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ<br />
Οι µη φυσιολογικές ζώνες στα ηλεκτροφορήµατα, ιδιαίτερα εκείνες µε γ-κινητικότητα, αλλά και εκείνες µε α- και β- κινητικότητα (αυτές<br />
µπορεί να καλύπτονται από τις κανονικές πρωτεΐνες των αντίστοιχων ζωνών) είναι πάντα ύποπτες ως πιθανές µονοκλωνικές πρωτεΐνες<br />
και εποµένως ως ένδειξη µονοκλωνικής γαµµαπάθειας. Για την ταυτοποίηση αυτών των µη φυσιολογικών ζωνών, εφαρµόζεται η τεχνική<br />
της ανοσοκαθήλωσης.<br />
Η ηλεκτροφόρηση µε ανοσοκαθήλωση είναι µια απλή τεχνική η οποία επιτρέπει τη σταθεροποίηση in situ των πρωτεϊνών µετά την<br />
ηλεκτροφόρηση, καθώς σχηµατίζονται µη διαλυτά συµπλέγµατα των πρωτεϊνών µε τα αντίστοιχα αντισώµατα. Η διαδικασία<br />
πραγµατοποιείται σε τέσσερα στάδια:<br />
1. ∆ιαχωρισµός πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης.<br />
2. Μονιµοποίηση και ανοσοκαθίζηση των ηλεκτροφορηµένων πρωτεϊνών: µονιµοποιητικό διάλυµα και αντιορός απλώνονται ευθέως στην<br />
επιφάνεια του gel στα κατάλληλα ηλεκτροφορητικά ίχνη. Το µονιµοποιητικό διάλυµα και ο αντιορός διαχέονται στο gel, προκαλώντας<br />
καθίζηση των πρωτεϊνών και των αντίστοιχων αντιγόνων.<br />
3. Οι µη κατακρηµνισθείσες διαλυτές πρωτεΐνες αποµακρύνονται από το gel µε στύπωµα και έκπλυνση. Το ίζηµα του συµπλέγµατος<br />
αντιγόνου – αντισώµατος παγιδεύεται στο στρώµα του gel.<br />
4. Οι κατακρηµνισθείσες πρωτεΐνες γίνονται ορατές µε χρώση. Οι ζώνες µετά την ανοσοκαθήλωση συγκρίνονται στη συνέχεια µε τις<br />
ύποπτες ζώνες του ηλεκτροφορητικού προφίλ του δείγµατος.<br />
Για την ανίχνευση του ύποπτου µονοκλωνικού κλάσµατος, το δείγµα ηλεκτροφορείται ταυτόχρονα σε δύο ίχνη. Μετά την ηλεκτροφόρηση,<br />
ένα ίχνος χρησιµεύει ως ίχνος αναφοράς παρέχοντας το ηλεκτροφορητικό προφίλ των πρωτεϊνών του δείγµατος. Το ίχνος της<br />
ανοσοκαθήλωσης (<strong>Penta</strong>) αποκαλύπτει µονοκλωνικά κλάσµατα τα οποία αντέδρασαν µε τον πενταδύναµο αντιορό.<br />
Η απλή και γρήγορη αυτή τεχνική παρέχει σαφείς και ευχερώς ερµηνευόµενες εικόνες.<br />
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΑ ΚΙΤ <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> ΚΑΙ <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong><br />
ΕΙ∆ΟΣ PN 4841 PN 4842 PN 4884* Gel αγαρόζης (έτοιµα προς χρήση) 10 gel 10 gel 80 gel Ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος (έτοιµες προς χρ.) 10 συσκ. των 2 10 συσκ. των 2 80 συσκ. των 2 Μέσο αραίωσης του διαλύµατος χρώσης (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 60 mL 1 φιαλίδιο, 60 mL 8 φιαλίδια, 60 mL Χρωστική amidoblack (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 20 mL 1 φιαλίδιο, 20 mL 8 φιαλίδια, 20 mL Μονιµοποιητικό διάλυµα (έτοιµο προς χρήση) 3 φιαλίδια, 14.4 mL Αντιανθρώπειες ανοσοσφαιρίνες από θηλαστικά (γάµµα - άλφα - µι - κάππα - λάµδα) : πενταδύναµος αντιορός (έτοιµος προς χρήση) 3 φιαλίδια, 8.0 mL Εφαρµογείς (έτοιµοι προς χρήση) 1 συσκ. των 10 2 συσκ. των 10 16 συσκ. των 10 ∆ιηθητικά χαρτιά - Λεπτά 1 συσκ. των 10 1 συσκ. των 10 8 συσκ. των 10 ∆ιηθητικά χαρτιά κτενοειδή 1 συσκ. των 10 2 συσκ. των 10 16 συσκ. των 10<br />
| ∆ιηθητικά χαρτιά - Αδρά | 1 συσκ. των 10 | 1 συσκ. των 10 | 8 συσκ. των 10 |<br />
*<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> MAXI-KIT<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το µονιµοποιητικό διάλυµα και ο πενταδύναµος αντιορός παρέχονται χωριστά από τα κιτ µε εξαίρεση το MAXI-KIT (Βλέπε<br />
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ).<br />
ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ<br />
Όλα τα αντιδραστήρια από ίδιο κιτ πρέπει να χρησιµοποιούνται πάντα µαζί και σύµφωνα µε τις οδηγίες χρήσης.<br />
ΠΑΡΑΚΑΛΟΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ.<br />
1. GEL ΑΓΑΡΟΖΗΣ<br />
Προετοιµασία<br />
Τα gel αγαρόζης είναι έτοιµα προς χρήση. Κάθε gel περιέχει: αγαρόζη, 0.8 g/dL, ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.1 ± 0.1, πρόσθετα,<br />
µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Τα gel αγαρόζης περιέχουν 0.31 % βαρβιτάλη και 0.34 % νατριούχο βαρβιτάλη. Μην το καταπίνετε! Αν καταποθεί,<br />
αναζητήστε αµέσως ιατρική συµβουλή!<br />
Χρήση<br />
Μέσο για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και ανοσοκαθήλωση.<br />
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Ο∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τα gel οριζόντια εντός της συσκευασίας τους σε θερµοκρασία δωµατίου (15 έως 30 °C) ή στο ψυγείο (2 έως 8 °C). Είναι σταθερά<br />
µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των gel. (Το βέλος στην πρόσθια επιφάνεια<br />
του κουτιού του κιτ πρέπει να δείχνει προς τα άνω). Αποφύγετε την αποθήκευση κοντά σε παράθυρο ή σε πηγή θερµότητας. Αποφύγετε<br />
τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµοκρασίας κατά τη φύλαξη.<br />
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Πετάξτε τα gel όταν :<br />
(i) σχηµατιστούν κρύσταλλοι ή ίζηµα στην επιφάνεια του gel ή αν η υφή του gel γίνει πολύ µαλακή (όλα αυτά προκύπτουν αν το gel<br />
καταψυχθεί),<br />
(ii) αναπτυχθούν βακτήρια ή µούχλα,<br />
(iii) υπάρχει µεγαλύτερη από το φυσιολογικό ποσότητα υγρού στο κουτί του gel (αποτέλεσµα της εξίδρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος<br />
από το gel λόγω ακατάλληλων συνθηκών φύλαξης).<br />
2. ΤΑΙΝΙΕΣ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ<br />
Προετοιµασία<br />
Σπογγώδεις ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα έτοιµες προς χρήση. Καθεµιά περιέχει: ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.1 ± 0.3,<br />
πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το ρυθµιστικό διάλυµα στις ταινίες περιέχει 0.92 % βαρβιτάλη, 1.03 % νατριούχο βαρβιτάλη και 0.30 % αζίδιο του<br />
νατρίου. Μην το καταπίνετε! Αν καταποθεί, αναζητήστε αµέσως ιατρική συµβουλή! Όταν το πετάτε αποφύγετε επαφή µε οξέα, µόλυβδο<br />
ή χαλκό, καθώς µπορεί να σχηµατιστούν εκρηκτικές ή τοξικές ενώσεις µε το αζίδιο του νατρίου.<br />
Χρήση<br />
Οι ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα λειτουργούν ως δεξαµενή ρυθµιστικού διαλύµατος για την ηλεκτροφόρηση και εξασφαλίζουν επαφή<br />
µεταξύ του gel και των ηλεκτροδίων.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τις ταινίες οριζόντια εντός της συσκευασίας τους σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. (Το βέλος στην πρόσθια επιφάνεια<br />
του κουτιού του κιτ πρέπει να δείχνει προς τα άνω).<br />
Είναι σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και της συσκευασίας των ταινιών.<br />
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Πετάξτε τις ταινίες αν η συσκευασία τους έχει ανοιχθεί και οι ταινίες έχουν στεγνώσει.<br />
3. ΜΕΣΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΧΡΩΣΗΣ<br />
Προετοιµασία<br />
Το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής πρέπει να χρησιµοποιείται όπως περιγράφεται στην παράγραφο “ΧΡΩΣΤΙΚΗ<br />
AMIDOBLACK“.<br />
Περιέχει όξινο διάλυµα.<br />
Χρήση<br />
Για την παρασκευή του διαλύµατος χρωστικής amidoblack.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Είναι σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία<br />
λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου.<br />
4. ΧΡΩΣΤΙΚΗ AMIDOBLACK<br />
Προετοιµασία<br />
Η πυκνή χρωστική amidoblack είναι ένα ιξώδες διάλυµα το οποίο ενδέχεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλότητα του πυκνού<br />
διαλύµατος χρωστικής δεν επηρεάζεται από την αύξηση της γλοιότητάς του ή τη στερεοποίησή του.<br />
Σε όλες τις περιπτώσεις, για να επιτύχετε τέλεια ανασύσταση της χρωστικής, σας συνιστούµε να ακολουθήσετε την εξής διαδικασία :<br />
1. Προσθέστε 15 mL του µέσου αραίωσης χρωστικής στο φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος.<br />
2. Κλείστε προσεκτικά το φιαλίδιο.<br />
3. Ανακινήστε έντονα το φιαλίδιο για περίπου 5 δευτερόλεπτα.<br />
4. Αδειάστε αυτό το διάλυµα στο δοχείο που προορίζεται για την επεξεργασία του διαλύµατος χρωστικής.<br />
5. Επαναλάβετε αυτό το βήµα δύο φορές, ή τρεις αν χρειάζεται.<br />
6. Αδειάστε το υπόλοιπο µέσο αραίωσης στο δοχείο και συµπληρώστε µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ έως όγκου 300 mL.<br />
7. Ανακινήστε καλά τα περιεχόµενα του δοχείου για 5 - 10 λεπτά.<br />
Το διάλυµα χρωστικής είναι έτοιµο προς χρήση.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ατελής ανασύσταση της χρωστικής θα οδηγήσει σε υποεκτίµηση του κλάσµατος της αλβουµίνης.<br />
Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας της χρωστικής περιέχει: όξινο διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενογλυκόλη, 6.7 %,<br />
πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Επιβλαβές αν καταποθεί.<br />
Χρήση<br />
Για τη χρώση των gel µετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό πρωτεϊνών.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το διάλυµα χρωστικής είναι σχεδιασµένο για χρώση µόνο 10 gel. Αλλάξτε το διάλυµα µετά από 10 διαδικασίες χρώσης.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τα διαλύµατα προ και µετά την αραίωση σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο σε κλειστούς περιέκτες για να αποτραπεί η<br />
εξάτµιση. Το πυκνό διάλυµα χρωστικής είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας<br />
του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
Το διάλυµα εργασίας είναι σταθερό για 1 µήνα.<br />
Μην αποθηκεύετε το διάλυµα χρώσης κοντά σε πηγή θερµότητας.<br />
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5. ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ (µε το PN 4884)<br />
Προετοιµασία<br />
Το µονιµοποιητικό διάλυµα είναι έτοιµο προς χρήση. Περιέχει: όξινο διάλυµα, πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες<br />
συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση. Για την εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, το µονιµοποιητικό<br />
διάλυµα είναι χρωµατισµένο µε κίτρινη µη επιβλαβή χρωστική η οποία ταιριάζει µε το χρώµα της ετικέττας του φιαλιδίου.<br />
Χρήση<br />
Για τη µονιµοποίηση των ηλεκτροφορητικά διαχωρισµένων πρωτεϊνών του ίχνους αναφοράς (ELP).<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το µονιµοποιητικό διάλυµα είναι ειδικό για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 6 <strong>IF</strong> και <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
ΠΡΟΣΟΧΗ: Προς αποφυγή οποιασδήποτε ανάµιξης των αντιδραστηρίων, τοποθετήστε προσεκτικά το καπάκι στο αντίστοιχο φιαλίδιο µετά<br />
από κάθε χρήση.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το µονιµοποιητικό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία<br />
σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
Το µονιµοποιητικό διάλυµα πρέπει να είναι ελεύθερο ιζήµατος.<br />
6. ΠΕΝΤΑ∆ΥΝΑΜΟΣ ΑΝΤΙΟΡΟΣ (µε το PN 4884)<br />
Προετοιµασία<br />
Ο πενταδύναµος αντιορός είναι έτοιµος προς χρήση. Ο πενταδύναµος αντιορός είναι µίγµα προερχόµενων από θηλαστικά, αντιανθρώπειων<br />
ακέραιων ανοσοσφαιρινών. Για την εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, ο αντιορός είναι<br />
χρωµατισµένος µε κίτρινη µη επιβλαβή χρωστική η οποία ταιριάζει µε το χρώµα της ετικέττας του φιαλιδίου.<br />
Όταν ο αντιορός παρουσιάζει ελαφρά θολερότητα, αφήστε το φιαλίδιο του αντιορού σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 10 min.<br />
Με τον τρόπο αυτό θα πρέπει το διάλυµα να ξαναγίνει διαυγές. Ωστόσο, αν η θολερότητα παραµένει, δεν θα επηρεάσει την ανοσολογική<br />
αντίδραση. Σε περίπτωση σχηµατισµού αδιάλυτου ιζήµατος, συνιστάται να φυγοκεντρείται ο αντιορός για 5 min στις 3000 rpm.<br />
Χρήση<br />
Για ανοσοκαθήλωση ηλεκτροφορηµένων πρωτεϊνών.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο πενταδύναµος αντιορός είναι ειδικός για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 6 <strong>IF</strong> και <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Οι αντιοροί µπορεί να προέρχονται από διαφορετικά είδη ζώων. Μην αναµιγνύετε δύο αντιορούς από διαφορετικά φιαλίδια, ακόµη και µε<br />
την ίδια ειδικότητα, και αλλάζετε ΠΑΝΤΑ το ρύγχος της πιπέττας όταν αλλάζετε φιαλίδια αντιορού.<br />
ΠΡΟΣΟΧΗ: Προς αποφυγή οποιασδήποτε ανάµιξης των αντιδραστηρίων, τοποθετήστε προσεκτικά το καπάκι στο αντίστοιχο φιαλίδιο µετά<br />
από κάθε χρήση.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τον πενταδύναµο αντιορό στο ψυγείο (2 έως 8 °C). Είναι σταθερός µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις<br />
ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά τη µεταφορά, ο αντιορός µπορεί να διατηρείται εκτός ψυγείου (στους 15 ως 30 °C) για 15 ηµέρες χωρίς δυσµενή<br />
επίδραση στην απόδοσή του.<br />
7. ΕΦΑΡΜΟΓΕΙΣ<br />
Χρήση<br />
Εφαρµογείς µιας χρήσης για τοποθέτηση των δειγµάτων.<br />
Φύλαξη<br />
Φυλάσσετε τους εφαρµογείς σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
8. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - ΛΕΠΤΑ<br />
Χρήση<br />
Μιας χρήσης, λεπτά απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα της υγρασίας από την επιφάνεια του gel πριν την τοποθέτηση των δειγµάτων.<br />
Φύλαξη<br />
Φυλάσσονται σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.<br />
9. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - ΚΤΕΝΟΕΙ∆Η<br />
Χρήση<br />
Μιας χρήσης, αδρά απορροφητικά κτενοειδή χαρτιά για στύπωµα της περίσσειας µονιµοποιητικού διαλύµατος και αντιορού από την<br />
επιφάνεια του gel µετά την ανοσοκαθήλωση.<br />
10. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - Α∆ΡΑ<br />
Χρήση<br />
Μιας χρήσης, αδρά απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα των µη κατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από την επιφάνεια του gel µετά την<br />
ανοσοκαθήλωση.<br />
Φύλαξη<br />
Φυλάσσονται σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.<br />
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ<br />
1. ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ<br />
Προετοιµασία<br />
Μονιµοποιητικό διάλυµα για ανοσοκαθήλωση (SEBIA, PN 4799, 1 φιαλίδιο, 2.5 mL), έτοιµο προς χρήση. Περιέχει: όξινο διάλυµα, πρόσθετα,<br />
µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση. Το µονιµοποιητικό διάλυµα είναι ειδικό για τη<br />
διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 6 <strong>IF</strong> και <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>.<br />
Για την εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, ο αντιορός είναι χρωµατισµένος µε µη επιβλαβή χρωστική η<br />
οποία ταιριάζει µε το χρώµα της ετικέττας του φιαλιδίου.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης Βλ. προηγούµενη παράγραφο 5.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
2. ΠΕΝΤΑ∆ΥΝΑΜΟΣ ΑΝΤΙΟΡΟΣ<br />
Ο πενταδύναµος αντιορός (SEBIA, PN 4616, 1 mL ή PN 4738, 8 mL) είναι µίγµα προερχόµενων από θηλαστικά, αντι-ανθρώπειων ακέραιων<br />
αντι-Ig ανοσοσφαιρινών. Είναι ειδικός για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 6 <strong>IF</strong> και <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, SEBIA.<br />
Για την εύκολη αναγνώρισή του και την παρακολούθηση της χρήσης του, ο αντιορός είναι χρωµατισµένος µε κίτρινη µη επιβλαβή χρωστική<br />
η οποία ταιριάζει µε το χρώµα της ετικέττας του φιαλιδίου.<br />
Προετοιµασία, χρήση, φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης : Βλ. προηγούµενη παράγραφο 6.<br />
3. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ<br />
Προετοιµασία<br />
Κάθε φιαλίδιο πυκνού ∆ιαλύµατος Αποχρωµατισµού (SEBIA, PN 4540, 10 φιαλίδια, 100 mL έκαστο) αραιώνεται έως όγκου 100 λίτρων µε<br />
απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. Είναι ευχερές να αραιώνονται µόνο 5 mL του πυκνού διαλύµατος σε όγκο 5 λίτρα, τον όγκο του<br />
περιέκτη του διαλύµατος αποχρωµατισµού. Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας αποχρωµατισµού περιέχει: κιτρικό οξύ, 0.05 g/dL.<br />
Χρήση<br />
Για αποχρωµατισµό, δηλαδή αφαίρεση της περίσσειας χρωστικής από τη γέλη.<br />
Για καθαρισµό του τµήµατος χρώσης µετά το στάδιο της πλύσης.<br />
Για την εξουδετέρωση της οξύτητας του διαλύµατος αποχρωµατισµού, προσθέστε 15 mL διαλύµατος 50 % υδροξειδίου του νατρίου, στο<br />
κενό δοχείο αχρήστων.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται<br />
στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. Το διάλυµα εργασίας είναι σταθερό για µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου<br />
σε κλειστό δοχείο. Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου.<br />
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. αν θολώσει λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.<br />
Για να αποτρέψετε πολλαπλασιασµό µικροβίων στο αραιωµένο διάλυµα αποχρωµατισµού αν πρόκειται να το φυλάξετε για περισσότερο<br />
από µια εβδοµάδα, προσθέστε 5 µL/dL ProClin 300.<br />
Το διάλυµα εργασίας στο οποίο έχει προστεθεί ProClin είναι σταθερό σε κελιστό δοχείο σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο µέχρι την<br />
ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
4. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΠΛΥΣΗΣ HYDRASYS<br />
Προετοιµασία<br />
Κάθε φιαλίδιο του πυκνού ∆ιαλύµατος Πλύσης HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 φιαλίδια, 80 mL το καθένα) αραιώνεται σε όγκο 5 λίτρα, µε<br />
απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας περιέχει : αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 8.8 ± 0.3, αζίδιο του<br />
νατρίου.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το πυκνό διάλυµα πλύσης περιέχει 0.625 % αζίδιο του νατρίου. Μην το καταπίνετε! Αν καταποθεί, αναζητήστε αµέσως<br />
ιατρική συµβουλή! Το αζίδιο του νατρίου µπορεί να οδηγήσει στο σχηµατισµό εκρηκτικών ή τοξικών ενώσεων ερχόµενο σε επαφή µε οξέα,<br />
µόλυβδο ή χαλκό. Πάντοτε ξεπλένετε µε άφθονο νερό όταν το πετάτε.<br />
Χρήση<br />
Το διάλυµα πλύσης χρησιµεύει για την αποµάκρυνση των µη κακατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από τα gel. Χρησιµεύει επίσης για<br />
καθαρισµό του θαλάµου χρώσης του HYDRASYS. Χρησιµοποιείτε το περιοδικά, π.χ. αν το όργανο χρησιµοποιείται καθηµερινά, πλένετε το<br />
θάλαµο χρώσης κάθε εβδοµάδα.<br />
∆είτε το φύλλο οδηγιών για οδηγίες χρήσης.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα και το διάλυµα εργασίας σε κλειστά δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Είναι σταθερά µέχρι την<br />
ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες των φιαλιδίων.<br />
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. αν θολώσει λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.<br />
5. FLUIDIL<br />
Προετοιµασία<br />
Το Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 φιαλίδιο, 5 mL) είναι έτοιµο προς χρήση.<br />
Χρήση<br />
Για τη διάλυση ιξωδών ή θολών δειγµάτων, π.χ. ορών µε κρυοσφαιρίνες.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσεται σε θερµοκρασία δωµατίου. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στην ετικέττα του φιαλιδίου του<br />
Fluidil.<br />
Το Fluidil πρέπει να είναι ελεύθερο ιζήµατος.<br />
ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΞΑΡΤΗΜΑΤΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN <strong>12</strong>10 ή PN <strong>12</strong>11.<br />
2. Σύστηµα µικροπιπεττών, χειροκίνητο ή αυτόµατο, όπως το HYDRAplus SEBIA, PN <strong>12</strong>15, ως εναλλακτικός τρόπος φόρτωσης των<br />
εφαρµογέων δειγµάτων.<br />
3. Θάλαµος Υγρής Φύλαξης, PN <strong>12</strong>70, παρεχόµενος µε το HYDRASYS.<br />
4. Κιτ περιεκτών παρεχόµενο µε το HYDRASYS.<br />
5. Οδηγός µήτρας SEBIA παρεχόµενος µε το HYDRASYS.<br />
6. Κιτ συµπληρωµατικών εξαρτηµάτων για το HYDRASYS <strong>IF</strong> SEBIA, PN <strong>12</strong>60.<br />
7. Πιπέττες: 10 µL και 200 µL.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ<br />
Λήψη και διατήρηση δειγµάτων<br />
Η ανάλυση συνιστάται να γίνεται σε φρέσκα δείγµατα ορού. Οι οροί πρέπει να λαµβάνονται σύµφωνα µε τις καθιερωµένες διαδικασίες<br />
στην κλινική εργαστηριακή πράξη.<br />
Αν χρειάζεται, τα δείγµατα µπορούν να φυλάσσονται επί ως µια εβδοµάδα στο ψυγείο (2 ως 8 °C).<br />
Για µεγαλύτερες περιόδους διατήρησης, καταψύξτε τα δείγµατα. Τα κατεψυγµένα δείγµατα είναι σταθερά για τουλάχιστον ένα µήνα.<br />
Τα αποψυγµένα δείγµατα µπορεί να δώσουν ελαφρά σηµάδια στο σηµείο εφαρµογής οφειλόµενα σε µετουσίωση πρωτεϊνών ή<br />
λιποπρωτεϊνών.<br />
Κατάψυξη των δειγµάτων ορού µε αζίδιο του νατρίου, 0.02 g/dL, βελτιώνει τη σταθερότητά τους.<br />
Προετοιµασία των δειγµάτων<br />
Χρησιµοποιείτε µη αραιωµένα δείγµατα ορού.<br />
Μετά από ψύξη ή κατάψυξη, µερικοί οροί (ιδιαίτερα εκείνοι που περιέχουν κρυοσφαιρίνες) µπορεί να γίνουν ιξώδεις ή να αναπτύξουν<br />
θολερότητα. Τέτοιοι οροί µπορεί να παρουσιάσουν προβλήµατα εφαρµογής λόγω παρακώλυσης της διάχυσης στα δόντια του εφαρµογέα<br />
δείγµατος. Σε αυτήν την περίπτωση, προσθέστε 25 µL Fluidil σε 75 µL ορού και περιδινήστε (vortex) για 15 sec. Στη συνέχεια ακολουθήστε<br />
την τυπική διαδικασία.<br />
Μερικές µονοκλωνικές πρωτεΐνες µπορεί να πολυµεριστούν δίνοντας ένα «µονοκλωνικό κλάσµα» το οποίο εµφανίζεται σε όλα τα ίχνη<br />
µετά από ανοσοκαθήλωση. Στην περίπτωση αυτή (i) ετοιµάστε 1 % βήτα-µερκαπτοαιθανόλη (BME ή 2- µερκαπτοαιθανόλη, 2 ME) σε Fluidil,<br />
(ii) προσθέστε 25 µL αυτού του µέσου σε 75 µL ορού, (iii) περιδινήστε (vortex) και περιµένετε τουλάχιστον 15 min (max. 30 min) και στη<br />
συνέχεια ακολουθήστε την τυπική διαδικασία.<br />
∆είγµατα προς αποφυγή<br />
Αποφύγετε δείγµατα πλάσµατος: το ινωδογόνο δίνει µια ζώνη κοντά στο σηµείο εφαρµογής, η οποία θα µπορούσε να εκληφθεί ως<br />
µονοκλωνική πρωτεΐνη.<br />
Αποφύγετε αιµολυµένα δείγµατα.<br />
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ<br />
Το σύστηµα HYDRASYS είναι ένα ηµι-αυτοµατοποιηµένο πολυπαραµετρικό όργανο. Τα αυτοµατοποιηµένα στάδια λειτουργίας<br />
περιλαµβάνουν την επεξεργασία των gel αγαρόζης <strong>HYDRAGEL</strong> µε την ακόλουθη σειρά: εφαρµογή δείγµατος, ηλεκτροφόρηση, επώαση<br />
µε µονιµοποιητικό διάλυµα και αντιορό, στέγνωµα, χρώση, αποχρωµατισµός και τελικό στέγνωµα. Τα µη αυτοµατοποιηµένα στάδια<br />
περιλαµβάνουν το χειρισµό των δειγµάτων και των gel, την εφαρµογή µονιµοποιητικού διαλύµατος και αντιορού και τη ρύθµιση της<br />
συσκευής για λειτουργία.<br />
∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΕΓΧΕΙΡΙ∆ΙΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ ΤΟΥ HYDRASYS.<br />
I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ<br />
1. Θέστε το HYDRASYS σε λειτουργία.<br />
2. Τοποθετήστε έναν εφαρµογέα για ανάλυση 6 δειγµάτων ή δύο εφαρµογείς για ανάλυση <strong>12</strong> δειγµάτων στο <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> 6/<strong>12</strong>,<br />
σε µια επίπεδη επιφάνεια µε τους αριθµούς των βοθρίων στη δεξιά πλευρά (Εικ. 1).<br />
- Εφαρµόστε 10 µL ορού σε κάθε βοθρίο. Φορτώστε κάθε εφαρµογέα εντός 2 min.<br />
| ΒΟΘΡΙΑ |<br />
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ELP PENTA 1, 7 2 3 2, 8 4 5 3, 9 6 7 4, 10 9 10 5, 11 11 <strong>12</strong><br />
| 6, <strong>12</strong> | 13 | 14 |<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα βοθρία no. 1, 8 και 15 δεν χρησιµοποιούνται. Μπορούν να σηµειωθούν µε έναν µαρκαδόρο για να αποφευχθεί<br />
λανθασµένη τοποθέτηση δείγµατος σε αυτά.<br />
- Τοποθετήστε τον/τους εφαρµογέα/είς στο θάλαµο υγρής φύλαξης µε τα δόντια προς τα άνω (κρατήστε τον/τους από το πλαστικό<br />
προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών).<br />
Βλέπε το φύλλο οδηγιών του θαλάµου υγρής φύλαξης για περισσότερες λεπτοµέρειες.<br />
- Αφήστε τα δείγµατα να διαχυθούν στα δόντια για 5 min µετά την τοποθέτηση του τελευταίου δείγµατος. Για ύστερη χρήση (ως<br />
8 ώρες), διατηρήστε ολόκληρο τον θάλαµο στο ψυγείο.<br />
3. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης και σηκώστε τους φορείς των ηλεκτροδίων και των εφαρµογέων.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ποτέ µην κλείνετε το καπάκι ενώ οι φορείς είναι σηκωµένοι!<br />
4. Επιλέξτε το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «6/<strong>12</strong> PENTA SM/DM» από το µενού της συσκευής (αριστερή πλευρά του<br />
πληκτρολογίου).<br />
5. Αφαιρέστε της ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από τη συσκευασία τους, κρατώντας τις από τις πλαστικές τους άκρες.<br />
Προσαρµόστε τη διάτρητη άκρη των ταινιών στις ακίδες του φορέα ηλεκτροδίων. Το πλαστικό κάλυµµα της ταινίας πρέπει να είναι<br />
στραµµένο προς το φορέα (Εικ. 2).<br />
6. Αποσυσκευάστε το gel <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Περάστε γρήγορα και οµοιόµορφα ένα διηθητικό χαρτί στην επιφάνεια του gel για να απορροφήσει την περίσσεια υγρού.<br />
Αποµακρύνετε αµέσως το χαρτί.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Μην αφήνετε το διηθητικό χαρτί σε επαφή µε το gel επί µακρόν για να µην αφυδατωθεί.<br />
- Εισαγάγετε 200 µL απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ µέχρι το κατώτερο τρίτο του πλαισίου που είναι τυπωµένο στην Πλάκα<br />
Ελέγχου Θερµοκρασίας της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
- Τοποθετήστε την πλάκα του gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) µε το άκρο της να αγγίζει το stop στο κάτω τµήµα του<br />
τυπωµένου πλαισίου κλίµακας (Εικ. 3).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
- Λυγίστε το gel και χαµηλώστε το επί της επιφάνειας του νερού (Εικ. 3). Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα,<br />
ότι το νερό έχει απλωθεί κάτω από ολόκληρη την πλακέτα του gel και το gel είναι ευθυγραµµισµένο µε το τυπωµένο πλαίσιο.<br />
7. Κατεβάστε τους δύο φορείς. Σε αυτήν τη θέση, οι ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος δεν αγγίζουν το gel. ΜΗΝ ΠΙΕΖΕΤΕ ΤΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ<br />
ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΟΣ ΤΑ ΚΑΤΩ.<br />
8. Αφαιρέστε τον/τους εφαρµογέα/είς από τον υγρό θάλαµο. Κρατήστε τον από το προστατευτικό κάλυµµα.<br />
- Αποσπάστε το προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών του εφαρµογέα.<br />
- Για ανάλυση 6 δειγµάτων, τοποθετήστε τον εφαρµογέα στη θέση N° 6 του φορέα.<br />
- Για ανάλυση <strong>12</strong> δειγµάτων, τοποθετήστε τους δύο εφαρµογείς στις θέσεις N° 3 και 9 του φορέα.<br />
Για να αυξήσετε την επαναληψιµότητα της εφαρµογής των δειγµάτων, τοποθετείτε πάντα τους εφαρµογείς στην αριστερή πλευρά<br />
του φορέα.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Οι τυπωµένοι αριθµοί στον εφαρµογέα δειγµάτων πρέπει να είναι πάντα στραµµένοι προς το χειριστή (βλ. εικ. 4).<br />
9. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
10. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Βεβαιωθείτε ότι η είσοδος αερισµού στη δεξιά πλευρά του οργάνου είναι ελεύθερη.<br />
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Οι δύο φορείς χαµηλώνουν ώστε οι ταινίες µε το ρυθµιστικό διάλυµα και ο/οι εφαρµογέας/είς να έρθουν σε επαφή µε την επιφάνεια του<br />
gel.<br />
• Ο φορέας των εφαρµογέων δειγµάτων ανυψώνεται.<br />
• Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό σταθερή ισχύ 20 W στους 20 °C, µέχρι να συµπληρωθούν 42 Vh (για περίπου 9 min).<br />
• Ο φορέας ηλεκτροδίων ανυψώνεται για να αποσυνδεθούν τα ηλεκτρόδια.<br />
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας. Το ακόλουθο µήνυµα εµφανίζεται τότε στην οθόνη :<br />
“ AS”.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει κλειστό κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της ηλεκτροφόρησης.<br />
II. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗΣ<br />
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
2. Αφαιρέστε τον/τους εφαρµογέα/είς και πετάξτε τον/τους.<br />
3. Σηκώστε και τους δύο φορείς, αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από την πλαστική άκρη τους και πετάξτε τις.<br />
- Αφαιρέστε και τους δύο φορείς.<br />
- Σκουπίστε τα ηλεκτρόδια µε µαλακό υγρό απορροφητικό χαρτί.<br />
- Αφήστε το gel στη θέση του στη µονάδα ηλεκτροφόρησης.<br />
4. Ετοιµάστε τη µήτρα εφαρµογής των αντιδραστηρίων ως εξής (Εικ. 5):<br />
- Τοποθετήστε τον οδηγό της µήτρας στο clip συγκράτησης (ο οδηγός µπορεί να παραµένει στη µονάδα ηλεκτροφόρησης µόνιµα).<br />
- Κρατώντας τη µήτρα από την άκρη της τοποθετήστε την στον οδηγό (µε τις εγκοπές ευθυγραµµισµένες µε τα σηµάδια).<br />
- Χαµηλώστε το πάνω στο gel.<br />
5. Τοποθετήστε τα αντιδραστήρια ως εξής:<br />
| ΒΟΘΡΙΟ | ΟΓΚΟΣ | ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΟ | ΧΡΩΜΑ |<br />
| ELP | 35 µL | µονιµοποιητικό διάλυµα | κίτρινο |<br />
| <strong>Penta</strong> | 25 µL | πενταδύναµος αντιορός | κίτρινο-πορτοκαλί |<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για την αποφυγή σφαλµάτων, τα χρώµατα των αντιδραστηρίων εµφανίζονται τόσο στις ετικέττες των φιαλιδίων όσο και<br />
δίπλα στα βοθρία της µήτρας.<br />
- Αναρροφάτε τα αντιδραστήρια αποφεύγοντας φυσαλίδες αέρα στο ρύγχος της πιπέττας.<br />
- Τοποθετήστε τα αντιδραστήρια (Εικ. 6) :<br />
- Κρατήστε την πιπέττα κατακόρυφα και ακουµπήστε το ρύγχος της ελαφρά στο βοθρίο.<br />
- Εγχύστε το αντιδραστήριο έτσι ώστε να απλωθεί στο βοθρίο χωρίς να παγιδευτούν φυσαλίδες.<br />
6. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
7. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου. Η<br />
λέξη «[INCUBATION]» εµφανίζεται στην οθόνη.<br />
ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Επώαση στους 20 °C για 5 min (ελεγχόµενη µε το φαινόµενο Peltier).<br />
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας. Το ακόλουθο µήνυµα εµφανίζεται τότε στην οθόνη :<br />
«❊ AS (SM)».<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει ασφαλισµένο κατά τη διάρκεια της επώασης.<br />
III. ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΗΣ ΠΕΡΙΣΣΕΙΑΣ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ<br />
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
2. Αποµακρύνετε την περίσσεια αντιδραστηρίων µε το κτενοειδές διηθητικό χαρτί (ένα χαρτί για το <strong>HYDRAGEL</strong> 6 <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, δύο για<br />
το <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>) (Εικ. 7):<br />
- Εισαγάγετε το διηθητικό χαρτί υπό γωνία 30° στις σχισµές στο κάτω άκρο των βοθρίων της µήτρας ώστε τα δόντια να αγγίζουν<br />
την κάθετη πλευρά µακριά από το χειριστή.<br />
- Αφήστε τα δόντια να ακουµπήσουν µαλακά στο υγρό δίνοντας κλίση 45° στο κτενοειδές διηθητικό χαρτί (Εικ. 8).<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το κτενοειδές διηθητικό χαρτί πρέπει να είναι υπό κλίση (45°). Αν είναι κάθετο µπορεί να προκαλέσει βλάβη στο gel.<br />
3. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.<br />
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ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Τα αντιδραστήρια αφήνονται να απορροφηθούν από τα βοθρία για 15 sec στους 20 °C.<br />
• Ακούγεται ένα ηχητικό σήµα. Το ακόλουθο µήνυµα εµφανίζεται τότε στην οθόνη : «PAP.».<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
IV. ΣΤΥΠΩΜΑ ΤΟΥ GEL<br />
1. Αποµακρύνετε το(α) χαρτί(ιά).<br />
2. Ελέγξτε αν τα αντιδραστήρια απορροφήθηκαν, όπως µαρτυρούν:<br />
- η απουσία αντιδραστηρίων από gel.<br />
- όλο το µήκος των δοντιών έχει χρωµατιστεί.<br />
Αν η απορρόφηση των αντιδραστηρίων είναι ατελής, επαναλάβετε τη διαδικασία µε το κτενοειδές διηθητικό χαρτί.<br />
3. Κρατήστε τη µήτρα εφαρµογής αντιδραστηρίων από το ωτίο της, σηκώστε την και αφαιρέστε την.<br />
4. Τοποθετήστε ένα αδρό διηθητικό χαρτί στο gel:<br />
- ευθυγραµµίστε την άκρη του διηθητικού χαρτιού µε την άκρη του gel,<br />
- χαµηλώστε το πάνω στο gel (δώστε του κλίση 45°).<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Πιέστε σταθερά σε όλη την επιφάνεια του gel ώστε να εξασφαλιστεί καλή προσκόλληση.<br />
5. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
6. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.<br />
7. Καθαρίστε τη µήτρα µε µικρή βούρτσα (π.χ. οδοντόβουρτσα). ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΑΛΚΟΟΛΗ Ή ∆ΙΑΛΥΤΕΣ. Πριν την<br />
ξαναχρησιµοποιήσετε, βεβαιωθείτε ότι η µήτρα είναι τελείως στεγνή. Αποµακρύνετε τυχόν σταγονίδια νερού χτυπώντας την σε<br />
µαλακό χαρτί.<br />
ΣΤΥΠΩΜΑ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Στύπωµα στους 40 °C, για 3 min.<br />
• Ακούγεται ένα ηχητικό σήµα. Το ακόλουθο µήνυµα εµφανίζεται τότε στην οθόνη :<br />
«❊ PAP.».<br />
V. ΣΤΕΓΝΩΜΑ ΤΟΥ GEL<br />
1. Ανοίξτε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
2. Αφαιρέστε το διηθητικό χαρτί και αφήστε το gel στη θέση του.<br />
3. Κλείστε το καπάκι.<br />
4. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.<br />
ΣΤΕΓΝΩΜΑ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Στέγνωµα στους 50 °C ελεγχόµενο µε το φαινόµενο Peltier, για 6 min.<br />
• Ένα ηχητικό σήµα σηµατοδοτεί την απασφάλιση του σκεπάσµατος της µονάδας. Η θερµοκρασία της πλάκας παραµένει στους 50 °C<br />
µέχρι να ανοιχθεί το καπάκι.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει κλειστό κατά τη διάρκεια του στεγνώµατος.<br />
VI. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL<br />
1. Ανοίξτε το καπάκι.<br />
2. Αφαιρέστε το στεγνωµένο gel για περαιτέρω επεξεργασία.<br />
3. Ανοίξτε το στατήρα των gel. Τοποθετήστε το στεγνό gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) στις αύλακες των δύο ράβδων και<br />
κλείστε τον στατήρα. Βεβαιωθείτε ότι το film είναι σωστά τοποθετηµένο µέσα στον στατήρα (Εικ. 9).<br />
4. Τοποθετήστε τον στατήρα στη Μονάδα Επεξεργασίας / Χρώσης των gel.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ : Πριν την έναρξη του προγράµµατος επεξεργασίας / χρώσης των gel, ελέγξτε τα ακόλουθα :<br />
- ο περιέκτης διαλύµατος πλύσης περιέχει τουλάχιστον 400 mL διαλύµατος πλύσης,<br />
- ο περιέκτης χρωστικής είναι γεµάτος µε 300 mL χρωστικού διαλύµατος,<br />
- ο περιέκτης διαλύµατος αποχρωµατισµού περιέχει τουλάχιστον 1 λίτρο διαλύµατος αποχρωµατισµού,<br />
- ο περιέκτης αχρήστων είναι κενός.<br />
Για τη σύνδεση των γραµµών των αντιδραστηρίων: ανατρέξτε στις πληροφορίες που εµφανίζονται στην οθόνη του οργάνου<br />
(επιλέξτε: REAGENT LINES).<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ : Μην ξεχνάτε να αποφράσσετε τις µη χρησιµοποιούµενες γραµµές.<br />
5. Επιλέξτε το πρόγραµµα χρώσης «<strong>IF</strong> AMIDO» από το µενού του οργάνου και αρχίστε τη διαδικασία πατώντας το πλήκτρο «START»<br />
(πράσινο βέλος στη δεξιά πλευρά του πληκτρολογίου).<br />
Κατά τα στάδια χρώσης, αποχρωµατισµού και στεγνώµατος, η µονάδα παραµένει κλειδωµένη.<br />
Μετά το στάδιο ψύξης, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας (ο αερισµός διατηρείται µέχρι την αφαίρεση του<br />
στατήρα των gel).<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ:<br />
- Η θερµοκρασία της πλάκας της µονάδας ηλεκτροφόρησης µειώνεται από τη στιγµή που ανοίγει το καπάκι µέχρι να φτάσει τους 20 °C<br />
(σε λιγότερο από 5 min). Τότε µπορεί να αρχίσει νέα ηλεκτροφόρηση.<br />
- Επαναφέρετε τους φορείς των εφαρµογέων δειγµάτων και των ηλεκτροδίων στη θέση τους.<br />
- Σκουπίστε την πλάκα ελέγχου της θερµοκρασίας µε µαλακό υγρό απορροφητικό χαρτί.<br />
VII.ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL<br />
1. Αφαιρέστε τον στατήρα των gel από τη µονάδα, ανοίξτε τον και αφαιρέστε το στεγνό gel.<br />
2. Αν χρειάζεται, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιφάνεια του στεγνού φιλµ µε υγρό µαλακό χαρτί.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Τα µήκη των ηλεκτροφορηµάτων ενδέχεται να είναι ελαφρώς διαφορετικά στα gel µε 2 ή 3 σειρές ανάλυσης, χωρίς<br />
δυσµενή επίδραση στην απόδοση.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ<br />
Ο πενταδύναµος αντιορός ανιχνεύει:<br />
• ανοσοσφαιρίνες G, A, M, αλυσίδες κ και λ για καθεµιά εξ αυτών,<br />
• ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες κ και λ,<br />
• ελαφρές αλυσίδες κ και λ συνδεδεµένες µε έψιλον ή δέλτα βαριές αλυσίδες.<br />
Ερµηνεία<br />
Ένα φυσιολογικό δείγµα ορού παρουσιάζει µια ελαφριά διάχυτη χρώση των πολυκλωνικών ανοσοσφαιρινών (G, A, M, κάππα και λάµδα)<br />
χωρίς ευκρινώς αφοριζόµενες ζώνες.<br />
Η υπεργαµµασφαιριναιµία χαρακτηρίζεται από έντονα χρωµατισµένη διάχυτη ζώνη γάµµα και απουσία εντοπισµένων ζωνών.<br />
Μια γαµµαπάθεια χαρακτηρίζεται από µια ή περισσότερες καλά αφοριζόµενες ζώνες.<br />
Ειδικές περιπτώσεις<br />
Μια ελαφριά µονοκλωνική γαµµαπάθεια µπορεί να κρύβεται σε ένα φυσιολογικό ηλεκτροφορητικό προφίλ (π.χ. δυσφαιριναιµία µε βήτα<br />
κινητικότητα). Η ζώνη αυτή θα ανιχνευθεί µε τον πενταδύναµο αντιορό.<br />
• Μια υπογαµµασφαιριναιµία ενδέχεται να σχετίζεται µε µονοκλωνική ελεύθερη ελαφριά αλυσίδα. Η πρωτεΐνη αυτή, λόγω του µικρού<br />
µοριακού της βάρους, απεκκρίνεται από τους νεφρούς στα ούρα (πρωτεΐνη Bence Jones). Η παραµένουσα ποσότητα στον ορό είναι<br />
συνήθως πολύ χαµηλή, αλλά µπορεί να ανιχνευθεί µε ανοσοκαθήλωση µε τον πενταδύναµο αντιορό.<br />
• Όταν παρατηρείται µονοκλωνική ζώνη στην ηλεκτροφόρηση του ορού (ίχνος ELP) αλλά δεν επιβεβαιώνεται µε την ανοσοκαθήλωση, το<br />
ινοδωγόνο (δείγµα πλάσµατος) είναι ο πρώτος ύποπτος.<br />
• Όταν παρατηρείται µονοκλωνική ζώνη σε όλα τα ίχνη, θα πρέπει να υποψιαστείτε κρυοσφαιρίνη ή πολυµερισµένη Ig M. Αποπολυµερίστε<br />
και επαναλάβετε (Βλ. «∆είγµατα προς ανάλυση»).<br />
Οποιοδήποτε µονοκλωνικό κλάσµα πρέπει να ταυτοποιείται µε περαιτέρω διερεύνηση µε κιτ ανοσοκαθήλωσης <strong>HYDRAGEL</strong> µε απλή<br />
κάλυψη (standard mask) :<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4801, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4802, <strong>HYDRAGEL</strong> 4 <strong>IF</strong> SEBIA, PN 4804 ή 4808 ή <strong>HYDRAGEL</strong> 9 <strong>IF</strong> SEBIA,<br />
PN 4809,<br />
• <strong>HYDRAGEL</strong> 1 BENCE JONES SEBIA, PN 4821, <strong>HYDRAGEL</strong> 2 BENCE JONES SEBIA, PN 4822 ή <strong>HYDRAGEL</strong> 4 BENCE JONES SEBIA,<br />
PN 4824.<br />
Περιορισµοί<br />
Η χρήση άλλων αντιορών από τους ειδικούς για τη διαδικασία ανοσοκαθήλωσης µε απλή κάλυψη µπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσµατα.<br />
Λόγω των ορίων διακριτικής ικανότητας και ευαισθησίας της ηλεκτροφόρησης ζώνης, είναι πιθανό κάποια µονοκλωνικά στοιχεία να µην<br />
ανιχνεύονται µε αυτήν τη µέθοδο.<br />
Αντιµετώπιση προβληµάτων<br />
Καλέστε την Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτουργεί παρόλο που οι οδηγίες προετοιµασίας και φύλαξης των<br />
υλικών και οι οδηγίες λειτουργίας τηρούνται προσεκτικά.<br />
Τα Φύλλα ∆εδοµένων Ασφαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληροφορίες για την ασφαλή απόρριψή τους διατίθενται από την Τεχνική<br />
Υπηρεσία του προµηθευτή.<br />
∆Ε∆ΟΜΕΝΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ<br />
Αναπαραγωγιµότητα και ειδικότητα<br />
Η αναπαραγωγιµότητα καταδείχθηκε σε δύο παθολογικά δείγµατα ορού µε υψηλού επιπέδου και χαµηλού επιπέδου µονοκλωνικό κλάσµα<br />
αντίστοιχα και ένα δείγµα ορού µε αυξηµένη ζώνη άλφα1-άλφα2 και ένα φυσιολογικό δείγµα ορού. Κάθε δείγµα έτρεξε σε 3 παρτίδες gel<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>. Όλες οι επαναλήψεις απέδωσαν όµοια αποτελέσµατα για τις 3 παρτίδες και αναµενόµενα για τα δείγµατα που<br />
αναλύθηκαν. Η ανοσοκαθήλωση δεν ανέδειξε µονοκλωνικό κλάσµα στον ορό µε εικόνα φλεγµονής και στο φυσιολογικό δείγµα.<br />
Ακρίβεια<br />
Τριάντα διαφορετικά δείγµατα (29 παθολογικά και ένα φυσιολογικό) αναλύθηκαν µε gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong>, <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>IF</strong> και µε άλλο<br />
παρόµοιο εµπορικά διαθέσιµο σύστηµα ανοσοκαθήλωσης σε gel αγαρόζης. Οι ίδιες ζώνες ανιχνεύθηκαν σε όλα τα παθολογικά δείγµατα<br />
µε όλα τα συστήµατα.<br />
Ευαισθησία<br />
Παρασκευάστηκαν σειριακές αραιώσεις 3 παθολογικών δειγµάτων ορού µε µονοκλωνικά κλάσµατα.<br />
Τα αποτελέσµατα συνοψίζονται παρακάτω.<br />
ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΟ ΚΛΑΣΜΑ ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ (g/L) ∆ΕΙΓΜΑ Νο ΤΥΠΟΣ ΣΥΓΚ (g/L) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑ 1 γάµµα, κάππα 18 0.25 0.25 2 άλφα, λάµδα 7.3 0.<strong>12</strong> 0.5<br />
| 3 | µι, κάππα | 9 | 0.5 | 0.5 |<br />
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ<br />
(1) Le Carrer Didier, «Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation», Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.<br />
(2) Keren D. F., «High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation», Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
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e-mail : ils@ilsdk.dk<br />
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SEBIA INSTRUKTION - Dansk
3<br />
4<br />
2<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> 6 & <strong>12</strong> <strong>IF</strong> <strong>Penta</strong> - 2005/03<br />
SCHÉMAS / FIGURES<br />
Figure 1 Figure 2<br />
1 2 3 4 567 8 9 10 11 <strong>12</strong>1314 15<br />
Figure 3 Figure 4<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 <strong>12</strong><br />
sebia<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 <strong>12</strong> 13 14 15<br />
Figure 5<br />
Figure 6<br />
sebia<br />
3 4<br />
1 2<br />
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SCHÉMAS / FIGURES<br />
Figure 7 Figure 8<br />
Figure 9<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> PROTEIN(E) 15/30<br />
sebia<br />
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 <strong>12</strong> 13 14 15<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> PROTEIN(E) 15/30<br />
sebia<br />
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 <strong>12</strong> 13 14 15<br />
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