HYDRAGEL 54 PROTEIN(E)
HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) - Sebia Electrophoresis
HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) - Sebia Electrophoresis
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
Ref. 4145<br />
Ref. 4260*<br />
2005/02
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
UTILISATION<br />
L’<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) est un gel d’agarose qui permet la séparation en tampon alcalin (pH 9,2), des protéines du sérum humain et de l’urine,<br />
par électrophorèse dans le système semi-automatique HYDRASYS. Les protéines du sérum normal humain sont séparées en cinq fractions majeures.<br />
Le système HYDRASYS permet de réaliser toutes les séquences jusqu’à l’obtention du gel prêt pour l’analyse qualitative ou quantitative. Les protéines<br />
séparées sont colorées par une solution d’amidoschwarz et l’excès de colorant est éliminé en milieu acide. Les profils électrophorétiques sont<br />
analysés visuellement pour détecter les anomalies. La densitométrie donne une quantification relative précise de chaque zone individualisée.<br />
Chaque gel d’agarose est prévu pour l’analyse de <strong>54</strong> échantillons.<br />
À usage in vitro exclusivement.<br />
PRINCIPE DU TEST 1-16<br />
L’électrophorèse des protéines du sérum ou d’autres liquides biologiques humains est une analyse très utile en laboratoire d’analyses cliniques pour<br />
rechercher les modifications du profil protéique. Des techniques d’électrophorèse de zone ont été développées, sur différents supports, chacun<br />
donnant un fractionnement des protéines sériques en fonction de leur charge, dans un tampon de pH donné. L’agarose, d’utilisation très facile, a été<br />
choisi comme support. Il donne une séparation des constituants sériques humains en cinq fractions de mobilité différente : albumine, alpha-1<br />
globulines, alpha-2 globulines, bêta globulines et gamma globulines. Chaque zone contient un ou plusieurs constituants sériques. Le profil<br />
électrophorétique de l’urine ressemble à celui du sérum. Néanmoins, la présence et l’intensité relative des fractions dépendent fortement de la<br />
capacité de filtration des reins.<br />
RÉACTIFS FOURNIS DANS LE KIT <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
COMPOSANTS RÉF. N° 4145 RÉF. N° 4260* Gels d’agarose (prêts à l’emploi) 10 gels 80 gels Mèches tamponnées (prêtes à l’emploi) 10 sachets de 2 80 sachets de 2 Diluant colorant (solution concentrée) 1 fl. de 60 ml 8 fl. de 60 ml Colorant amidoschwarz (solution concentrée) 1 fl. de 20 ml 8 fl. de 20 ml Applicateurs (prêts à l’emploi) 3 boîtes de 10 (18 dents) 24 boîtes de 10 (18 dents)<br />
| Papiers-filtres fins | 1 sachet de 10 | 8 sachets de 10 |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS<br />
Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice.<br />
LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION.<br />
1. GELS D’AGAROSE<br />
Préparation<br />
Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/l ; tampon tris-barbital, pH 9,2 ± 0,1 ; composants sans danger aux<br />
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Les gels contiennent 0,31 % de barbital et 0,34 % de barbital sodé. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter<br />
immédiatement un médecin !<br />
Utilisation<br />
Support pour l’électrophorèse des protéines.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les gels doivent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date d’expiration<br />
indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur le devant du<br />
kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation brutale de<br />
température.<br />
NE PAS CONGELER.<br />
Éliminer le gel dans les cas suivants :<br />
(I) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ;<br />
(II) apparition de bactéries ou de moisissures ;<br />
(III) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation).<br />
2. MÈCHES TAMPONNÉES<br />
Préparation<br />
Les mèches en éponge tamponnées sont prêtes à l’emploi. Chaque mèche tamponnée contient : tampon tris-barbital, pH 9,2 ± 0,3 ; azoture de<br />
sodium ; composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Les mèches tamponnées contiennent 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sodé et 0,30 % d’azoture de sodium. Ne pas avaler !<br />
En cas d’ingestion, consulter immédiatement un médecin ! L’azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas<br />
de contact avec des acides, du plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des mèches, éviter tout contact avec ces produits.<br />
Utilisation<br />
Les mèches en éponge tamponnées jouent un rôle de réservoir de tampon pour l’électrophorèse et assurent le contact entre le gel et les électrodes.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les mèches tamponnées peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
Elles doivent être conservées horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur le devant du kit doit être pointée vers le haut).<br />
Elles sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet des mèches tamponnées. NE PAS CONGELER.<br />
Éliminer les mèches tamponnées si le sachet est ouvert ou si les mèches sont sèches.<br />
- 1 -<br />
NOTICE D’UTILISATION SEBIA - Français
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. DILUANT COLORANT<br />
Préparation<br />
Le diluant colorant concentré doit être utilisé comme décrit dans le paragraphe " COLORANT AMIDOSCHWARZ ". Il contient une solution acide.<br />
Utilisation<br />
Pour la préparation du colorant amidoschwarz.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le<br />
kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant. NE PAS CONGELER.<br />
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.<br />
4. COLORANT AMIDOSCHWARZ<br />
Préparation<br />
Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la<br />
solution finale et son pouvoir de coloration.<br />
Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant :<br />
1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré.<br />
2. Refermer soigneusement le flacon.<br />
3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes.<br />
4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration.<br />
5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire.<br />
6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration.<br />
7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée.<br />
8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes.<br />
Le colorant est prêt à l’emploi.<br />
REMARQUE : Une reprise incomplète du colorant peut entraîner une mauvaise coloration de la fraction albumine (baisse du pourcentage ou trou<br />
blanc dans la fraction).<br />
Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux<br />
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.<br />
ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion.<br />
Utilisation<br />
Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique des protéines.<br />
IMPORTANT : Le colorant est uniquement destiné à la coloration de 10 gels. Renouveler le colorant après 10 utilisations.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter<br />
l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant.<br />
La solution diluée est stable pendant 1 mois.<br />
Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur.<br />
5. APPLICATEURS<br />
Utilisation<br />
Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons.<br />
Conservation<br />
Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
6. PAPIERS-FILTRES FINS<br />
Utilisation<br />
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons.<br />
Conservation<br />
Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.<br />
RÉACTIFS NÉCESSAIRES<br />
1. DÉCOLORANT<br />
Préparation<br />
Chaque flacon de décolorant concentré (SEBIA, référence N° 4<strong>54</strong>0 : 10 flacons de 100 ml chacun) doit être dilué au 1/1 000 avec de l’eau distillée<br />
ou déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution décolorante. Prélever par quantité de 5 ml et compléter à 5 litres avec de l’eau distillée ou<br />
déminéralisée.<br />
Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/l.<br />
Utilisation<br />
Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant après coloration du gel.<br />
Pour le rinçage de la cuve de coloration après lavage.<br />
Pour neutraliser l’acidité du décolorant, mettre dans le flacon de vidange vide, 15 ml de soude à 50 % (solution du commerce).<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou<br />
sur l’étiquette du flacon de décolorant. NE PAS CONGELER. Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon<br />
fermé.<br />
Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.<br />
Ne pas ajouter d’azoture de sodium.<br />
En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µl/l de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération microbienne.<br />
Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée<br />
sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant.<br />
- 2 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. SOLUTION DE LAVAGE HYDRASYS<br />
Préparation<br />
Chaque flacon de solution de lavage HYDRASYS concentrée (SEBIA, référence N° 4<strong>54</strong>1 : 10 flacons de 80 ml chacun) doit être complété à 5 litres<br />
avec de l’eau distillée ou déminéralisée.<br />
Après dilution, la solution de lavage contient : tampon alcalin, pH 8,8 ± 0,3 ; azoture de sodium.<br />
ATTENTION : La solution de lavage concentrée contient 0,625 % d'azoture de sodium. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter<br />
immédiatement un médecin ! L'azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de contact avec des acides, du<br />
plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité d’eau.<br />
Utilisation<br />
Pour le lavage périodique de la cuve de coloration de l’HYDRASYS : Par exemple, pour une utilisation journalière, effectuer un lavage hebdomadaire<br />
de la cuve de coloration.<br />
Voir la notice de la solution de lavage pour les instructions d’utilisation.<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Les solutions de lavage concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés. Elles sont stables<br />
jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de solution de lavage.<br />
Éliminer la solution de lavage diluée s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.<br />
3. FLUIDIL<br />
Préparation<br />
Le Fluidil (SEBIA, référence N° 4587 : 1 flacon de 5 ml) est prêt à l’emploi.<br />
Utilisation<br />
Pour la dilution des échantillons visqueux ou troubles (turbidité induite par la présence d’une cryoglobuline ou d’un cryogel).<br />
Conservation, stabilité et signes de détérioration<br />
Le Fluidil peut être conservé à température ambiante. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette du flacon de Fluidil.<br />
Il ne doit pas y avoir de précipité.<br />
ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES<br />
1. Système HYDRASYS SEBIA, référence N° 1210 ou N° 1211.<br />
2. Micropipetteur, manuel ou automatique, tel que HYDRAplus SEBIA, référence N° 1215, pour le chargement des applicateurs.<br />
3. Chambre humide, référence N° 1270, fournie avec le système HYDRASYS.<br />
4. Bidons plastiques fournis avec le système HYDRASYS.<br />
5. Pipettes de 10 µl et 200 µl.<br />
6. Densitomètre / scanner capable de lire un film de 82 x 102 mm à 570 nm (filtre jaune) : HYRYS SEBIA ou scanner équipé du logiciel PHORESIS<br />
SEBIA. Se reporter aux instructions de chaque appareil pour son utilisation et sa calibration.<br />
ÉCHANTILLONS À ANALYSER<br />
Prélèvement et conservation des échantillons<br />
L’analyse se fait sur échantillons frais. Les sérums ou les urines doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire<br />
d’analyses cliniques.<br />
Les échantillons peuvent être conservés une semaine au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Pour des conservations prolongées, congeler les échantillons ;<br />
les échantillons congelés sont stables au minimum 1 mois.<br />
La conservation des sérums congelés est améliorée par addition à l’échantillon d’azoture de sodium 0,2 g/l.<br />
La conservation des urines congelées est améliorée par addition à l’échantillon de tampon HEPES 0,1 M (pH 6,75) et d’azoture de sodium 0,2 g/l.<br />
IMPORTANT : Ne pas utiliser de conservateur contenant de l’acide borique.<br />
Les échantillons décongelés peuvent donner, au point de dépôt, une trace due à la dénaturation de protéines ou de lipoprotéines.<br />
Plus le sérum vieillit, plus les bêta lipoprotéines sont anodiques. De même, après congélation, les bêta lipoprotéines sont beaucoup plus anodiques<br />
que sur sérums frais : leur migration varie de la zone bêta à la zone alpha-2 voire alpha-1.<br />
Préparation des échantillons<br />
1. Sérums<br />
Utiliser directement les échantillons de sérum non dilués.<br />
Après conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C) ou congélation, certains sérums (en particulier ceux qui contiennent une cryoglobuline ou un<br />
cryogel) deviennent visqueux ou troubles. Ces sérums présentent des difficultés de manipulation lors du dépôt avec l’applicateur HYDRASYS, car<br />
ils ne diffusent que très difficilement sur les dents de l’applicateur. Prétraiter ces sérums avec le Fluidil : ajouter 25 µl de Fluidil à 75 µl de sérum,<br />
agiter 15 secondes au vortex, puis suivre la technique.<br />
2. Urines concentrées<br />
L’analyse est réalisée sur des échantillons dont la concentration protéique est ramenée à environ 15 - 20 g/l par concentration au moyen d’un<br />
dispositif approprié.<br />
IMPORTANT : Certaines urines contiennent une concentration importante de sels. Il s’ensuit une déformation du gel au cours de la migration qui<br />
risque de conduire à une perturbation des profils après électrophorèse. Il convient d’éliminer cet excès de sels par une dialyse.<br />
NOTE : En cas d’urines troubles (concentrées ou non), il est recommandé d’éliminer les particules en centrifugeant les échantillons (pendant<br />
10 minutes à 3000 rpm) ou par filtration (sur filtre de 0,45 µm) afin d’obtenir une bonne diffusion sur les applicateurs.<br />
Échantillons à éviter<br />
• Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé. L’hémolyse entraîne une augmentation des zones alpha-2 et bêta.<br />
• Ne pas utiliser de plasma. Le fibrinogène donne une bande proche du point de dépôt. Cette bande peut fausser l’interprétation du test (confusion<br />
avec une gammapathie et augmentation du pourcentage de la fraction correspondante).<br />
• Ne pas utiliser les échantillons d’urine anciens ou conservés dans de mauvaises conditions, des dégradations enzymatiques peuvent les altérer.<br />
- 3 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
TECHNIQUE<br />
Le système HYDRASYS est un instrument multiparamétrique semi-automatique qui assure le traitement des <strong>HYDRAGEL</strong> selon les étapes suivantes :<br />
application des échantillons, migration électrophorétique, séchage, coloration, décoloration et séchage final.<br />
Les étapes manuelles sont les suivantes : préparation des échantillons et du gel, lancement des séquences automatiques.<br />
LIRE ATTENTIVEMENT LE MANUEL D’INSTRUCTIONS D’HYDRASYS.<br />
I. PRÉPARATION DE LA MIGRATION<br />
1. Mettre HYDRASYS sous tension.<br />
2. Poser trois applicateurs à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 1).<br />
- Déposer 10 µl de sérum pur ou d’urine concentrée dans chaque puits ; le chargement de chaque applicateur ne doit pas excéder 2 minutes.<br />
- Placer les applicateurs dans deux chambres humides, dents vers le haut (en manipulant les applicateurs par la protection en plastique).<br />
Laisser diffuser 5 minutes après le dépôt du dernier échantillon. Pour une conservation prolongée (8 heures maximum), placer les chambres<br />
humides au réfrigérateur.<br />
Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation.<br />
3. Ouvrir le capot du module de migration et relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes.<br />
ATTENTION : Ne pas fermer le capot de l’appareil si les chariots sont relevés !<br />
4. Sélectionner le programme de migration «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» dans le menu.<br />
5. Sortir les mèches tamponnées de leur emballage en les manipulant par les languettes plastiques. Fixer les mèches sur le chariot porteélectrodes<br />
à l'aide des languettes perforées. La face de la mèche fixée sur la languette vient en contact avec l'électrode (Fig. 2).<br />
6. Sortir le gel de son emballage.<br />
- Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin.<br />
ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation.<br />
- Déposer 200 µl d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau de migration dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.<br />
- Placer le gel (face gel orientée vers le haut) sur le plateau contre la barrette, à l'intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 3).<br />
- Donner une forme concave au gel (Fig. 3) et le dérouler sur le plateau jusqu'au contact de la goutte d'eau qui doit se répartir sur toute la<br />
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d'air éventuellement piégées puis dérouler totalement le gel au contact du<br />
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.<br />
7. Abaisser l'ensemble des chariots jusqu'en butée. Dans cette position, les mèches ne touchent pas le gel. NE PAS FORCER LA DESCENTE<br />
DES CHARIOTS.<br />
8. Sortir les applicateurs de chaque chambre humide en les manipulant par la protection plastique.<br />
- Éliminer la protection des dents.<br />
Placer les applicateurs en positions N° 2, 6 et 10 sur le porte-applicateurs.<br />
IMPORTANT : Les numérotations de l'applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4).<br />
9. Fermer le capot du module de migration.<br />
10. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier).<br />
IMPORTANT : Ne rien placer à proximité immédiate de la grille de ventilation (à droite de l'appareil).<br />
MIGRATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES<br />
• Descente des chariots porte-électrodes et porte-applicateurs pour amener les mèches tamponnées et les applicateurs au contact du gel.<br />
• Remontée du chariot porte-applicateurs.<br />
• Migration à 20 W constants, à 20 °C, température contrôlée par effet Peltier, jusqu’à 24 Vh accumulés (pendant environ 5 minutes).<br />
• Déconnexion des électrodes par remontée du chariot porte-électrodes.<br />
• Séchage du film pendant 10 minutes à 65 °C, par montée en température du plateau.<br />
• Refroidissement du plateau, quand la température du plateau atteint 50 °C, un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de<br />
migration se débloque. Le plateau reste à 50 °C jusqu'à l'ouverture du capot. Après ouverture, la température baisse jusqu’à 20 °C (en moins de<br />
5 minutes). Une nouvelle migration peut alors être lancée.<br />
NOTE : Pendant toutes les séquences de migration, le capot du module de migration reste verrouillé.<br />
II. PRÉPARATION DES SÉQUENCES DE TRAITEMENT DU GEL<br />
1. Ouvrir le capot du module de migration.<br />
2. Retirer les applicateurs et les jeter.<br />
3. Relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes, retirer les mèches par les languettes et les jeter.<br />
4. Récupérer le film pour le traitement suivant.<br />
5. Nettoyer les électrodes et le plateau de migration avec un papier ouaté humide.<br />
6. Placer le film sur le porte-film, face gel vers l'opérateur, en procédant comme suit (Fig. 5) :<br />
- ouvrir le porte-film ;<br />
- le poser à plat sur la paillasse ;<br />
- positionner le gel dans les gorges des colonnettes ;<br />
- refermer le porte-film ;<br />
- s'assurer que le film soit bien enfoncé dans les gorges des deux colonnettes.<br />
7. Introduire le porte-film dans le module de traitement / coloration du gel.<br />
IMPORTANT : Avant de lancer un cycle de coloration, s'assurer que :<br />
- le flacon de colorant contienne 300 ml de colorant ;<br />
- le flacon de décolorant contienne 1 litre de décolorant minimum ;<br />
- le flacon de vidange soit vide.<br />
Pour le branchement des canaux réactifs : se référer aux instructions affichées sur l’écran de l’appareil (sélectionner la touche : VISU<br />
CANAUX).<br />
IMPORTANT : Ne pas oublier d’obturer les canaux non utilisés.<br />
8. Sélectionner le programme de coloration «PROT./B1-B2/Hb» dans le menu.<br />
- Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à droite du clavier).<br />
- 4 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Pendant toutes les séquences de coloration, décoloration et séchage, le système reste verrouillé.<br />
Après refroidissement de la cuve, un signal sonore (bip) retentit et le système se débloque (la ventilation se maintient jusqu’à la récupération<br />
du porte-film).<br />
III. FIN DU TRAITEMENT DU GEL<br />
1. Sortir le porte-film du compartiment ; ouvrir le porte-film et retirer le gel sec.<br />
NOTE : Si des taches bleues résiduelles sont observées sur le gel après coloration / décoloration, une étape de lavage supplémentaire avec<br />
le programme " LAV. ISOENZ/GEL " permet de les éliminer ou de les atténuer fortement (selon leur intensité) avant lecture au densitomètre /<br />
scanner.<br />
2. Si nécessaire, nettoyer le dos du gel (support plastique) avec un papier ouaté humide.<br />
3. Lire au densitomètre / scanner à 570 nm ou avec un filtre jaune.<br />
NOTE : Pour les gels à rangées multiples (2 ou 3), les longueurs de migration peuvent être sensiblement différentes, sans aucune conséquence<br />
sur les résultats.<br />
RÉSULTATS<br />
Contrôle Qualité<br />
Pour chaque série d’analyses, il est recommandé d’inclure un sérum de contrôle (tel que le Sérum de Contrôle SEBIA, référence N° 4785).<br />
Valeurs<br />
La lecture à 570 nm par densitométrie permet de définir les concentrations relatives (pourcentages) de chaque fraction.<br />
Les valeurs normales (moyenne ± 2 écarts types) pour chaque fraction sérique sur gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E), ont été établies à partir d’une<br />
population de 158 adultes (hommes et femmes), en bonne santé.<br />
La quantification des protéines en UV sur CAPILLARYS donne des valeurs similaires à la néphélémétrie (en particulier pour l’albumine). SEBIA<br />
propose donc une standardisation des valeurs obtenues sur <strong>HYDRAGEL</strong> en réalisant une calibration des systèmes de lecture.<br />
Valeurs sans standardisation Valeurs standardisées sur CAPILLARYS FRACTION HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumine 59,8 - 72,4 % 53,8 - 65,2 % Alpha-1 globulines 1,0 - 3,2 % 1,1 - 3,7 % Alpha-2 globulines 7,4 - 12,6 % 8,5 - 14,5 % Bêta globulines 7,5 - 12,9 % 8,6 - 14,8 %<br />
| Gamma globulines | 8,0 - 15,8 % | 9,2 - 18,2 % |<br />
Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir ses propres valeurs normales.<br />
Interprétation 1-16<br />
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils électrophorétiques obtenus, voir BIBLIOGRAPHIE.<br />
Interférences et limites<br />
Voir ÉCHANTILLONS À ANALYSER.<br />
Compte-tenu des principes analytiques des techniques actuelles (principes de l’électrophorèse de zone, résolution et sensibilité), aucune garantie ne<br />
peut être donnée quant à la détection totale de toutes les composantes monoclonales.<br />
Assistance technique<br />
Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux.<br />
Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès<br />
du Service Technique SEBIA.<br />
PERFORMANCES<br />
Analyse des sérums<br />
Reproductibilité intra-essai<br />
Migration de trois (3) échantillons différents de sérum en <strong>54</strong> pistes sur 3 lots différents de gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E). Les moyennes, écarts<br />
types et coefficients de variation (n = <strong>54</strong>) sont calculés pour chaque échantillon, chaque fraction et chaque lot (lecture par scanner).<br />
Le tableau suivant montre les résultats obtenus pour l’échantillon N° 1 sur les 3 lots testés.<br />
FRACTION MOYENNE (%) ET CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 68,9 70,2 70,7 0,66 0,91 0,97 1,0 1,3 1,4 Alpha-1 2,1 1,8 1,7 0,17 0,16 0,14 7,9 8,8 8,3 Alpha-2 9,4 9,1 9,0 0,23 0,30 0,34 2,4 3,3 3,7 Bêta 9,1 9,1 9,1 0,26 0,25 0,35 2,9 2,7 3,8<br />
| Gamma | 10,5 9,7 9,5 | 0,48 0,45 0,50 | 4,6 4,6 5,2 |<br />
- 5 -
Le tableau suivant montre les résultats obtenus pour l’échantillon N° 2 sur les 3 lots testés.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRACTION MOYENNE (%) ET CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 59,6 61,5 60,2 0,67 1,08 1,13 1,1 1,8 1,9 Alpha-1 5,2 4,9 5,0 0,23 0,24 0,22 4,5 5,0 4,3 Alpha-2 14,8 14,8 14,8 0,26 0,27 0,30 1,8 1,8 2,0 Bêta 13,6 13,3 14,0 0,30 0,33 0,41 2,2 2,5 3,0<br />
| Gamma | 6,8 5,5 6,1 | 0,37 0,56 0,56 | 5,5 10,1 9,2 |<br />
Le tableau suivant montre les résultats obtenus pour l’échantillon N° 3 sur les 3 lots testés.<br />
FRACTION MOYENNE (%) ET CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 53,8 <strong>54</strong>,1 55,2 0,58 0,76 0,80 1,1 1,4 1,4 Alpha-1 2,5 2,3 2,2 0,12 0,13 0,17 5,0 5,6 7,7 Alpha-2 8,0 7,9 7,8 0,21 0,16 0,29 2,6 2,1 3,7 Bêta 9,7 9,9 9,4 0,21 0,21 0,23 2,2 2,2 2,5<br />
| Gamma | 26,1 25,8 25,3 | 0,35 0,47 0,40 | 1,4 1,8 1,6 |<br />
Reproductibilité inter-essais<br />
Migration de dix-huit (18) échantillons différents de sérum sur 12 gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) de 3 lots différents. Les coefficients de variation<br />
moyens (CV), écarts types (ET) et coefficients de variation (n = 12) sont calculés pour chaque échantillon et chaque fraction. Les résultats sont<br />
sensiblement les mêmes pour tous les échantillons (lecture par scanner).<br />
Le tableau suivant montre les valeurs extrêmes d’écart type et de coefficient de variation représentant tous les échantillons et un coefficient de<br />
variation moyen calculé à partir de l’ensemble de tous les coefficients de variation de tous les échantillons (n = 18).<br />
FRACTION ET CV (%) CV MOYEN (%) Albumine 0,9 - 1,3 1,6 - 2,1 1,8 Alpha-1 0,2 - 0,3 5,3 - 12,3 8,4 Alpha-2 0,2 - 0,3 1,9 - 3,7 2,8 Bêta 0,3 - 0,4 3,0 - 3,3 3,2<br />
| Gamma | 0,5 - 0,7 | 2,0 - 11,9 | 6,7 |<br />
Exactitude<br />
Migration de cent-deux (102) échantillons différents (sérums normaux et pathologiques) sur gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) et sur gels <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30.<br />
Les paramètres de corrélation entre les deux systèmes de gel (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) pour chaque fraction sont, sur HYRYS :<br />
FRACTION Coefficient de corrélation Intersection-y Pente Limites des valeurs de %* Albumine 0,994 0,640 1,000 35,4 - 74,3 Alpha-1 0,994 -0,070 1,078 1,1 - 10,5 Alpha-2 0,992 -0,030 0,983 5,4 - 21,4 Bêta 0,985 0,320 0,958 5,0 - 16,5<br />
| Gamma | 0,996 | 0,050 | 0,966 | 6,6 - 52,5 |<br />
Les paramètres de corrélation entre les deux systèmes de gel (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) pour chaque fraction sont, sur scanner :<br />
FRACTION Coefficient de corrélation Intersection-y Pente Limites des valeurs de %* Albumine 0,964 3,407 0,973 34,5 - 74,1 Alpha-1 0,980 0,030 0,994 1,2 - 9,4 Alpha-2 0,972 0,070 0,949 5,3 - 19,8 Bêta 0,961 0,904 0,874 5,0 - 15,6<br />
| Gamma | 0,988 | 0,411 | 0,968 | 5,9 - 53,6 |<br />
* Les valeurs sont définies dans le système <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E).<br />
Sensibilité<br />
Trois (3) sérums pathologiques ayant chacun une protéine monoclonale sont dilués en série. Migration des dilutions sur gel <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) et sur gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Après comparaison à l’œil nu de chaque gel, la plus forte dilution permettant de voir la<br />
bande monoclonale est comprise entre 0,35 et 0,13 g/l. La plus faible concentration détectée, d’une bande monoclonale est donc de 0,13 g/l.<br />
NOTE : Selon la position de la bande monoclonale et le fond polyclonal de la zone des gammaglobulines, le seuil de détection d’une paraprotéine<br />
peut varier.<br />
Analyse des urines concentrées<br />
Les résultats obtenus après analyse quantitative et qualitative indiquent une très bonne répétabilité et reproductibilité pour tous les aspects testés.<br />
L’analyse qualitative d’échantillons différents par électrophorèse sur gel <strong>HYDRAGEL</strong> et sur un autre système en gel d’agarose disponible dans le<br />
commerce montre une parfaite corrélation entre les deux systèmes d’analyse. La sensibilité de la technique pour l’analyse d’urine concentrée est telle<br />
que la limite de détection d’une paraprotéine urinaire est de l’ordre de 0,48 g/l.<br />
- 6 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
BIBLIOGRAPHIE<br />
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(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
- 7 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
INTENDED USE<br />
The <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) kit is designed for separation of human serum proteins in human serum and urine by electrophoresis on alkaline<br />
buffered (pH 9.2) agarose gels. By design, the normal human serum proteins separate into five major fractions. The kit is used in conjunction with the<br />
semi-automated HYDRASYS instrument. The separated proteins are stained with amidoblack. The electrophoregrams are evaluated visually for<br />
pattern abnormalities. Densitometry provides accurate relative quantification of individual zones.<br />
Each agarose gel is intended to run <strong>54</strong> samples.<br />
For In Vitro Diagnostic Use.<br />
PRINCIPLE OF THE TEST 1-15<br />
Protein electrophoresis is a well established technique routinely used in clinical laboratories for screening of serum and some other fluids for protein<br />
abnormalities. It is based on the principles of zone electrophoresis performed on a suitable support medium. Agarose has been developed into a<br />
versatile and effective support medium. For routine diagnostic applications, serum proteins separate into five major fractions, primarily according to<br />
their charge at a given pH: albumin, alpha-1 globulins, alpha-2 globulins, beta globulins and gamma globulins. Each zone contains one or more serum<br />
proteins. The urine protein pattern resemble those of serum. However, the relative intensities of the fractions or their presence may vary greatly<br />
depending on the filtration capability of the kidney.<br />
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) KIT<br />
ITEMS PN 4145 PN 4260* Agarose Gels (ready to use) 10 gels 80 gels Buffered Strips (ready to use) 10 packs of 2 each 80 packs of 2 each Staining solution diluent (stock solution) 1 vial, 60 mL 8 vials, 60 mL Amidoblack Stain (stock solution) 1 vial, 20 mL 8 vials, 20 mL Applicators (ready to use) 3 packs of 10 (18 teeth) 24 packs of 10 (18 teeth)<br />
| Filter Papers | 1 pack of 10 | 8 packs of 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
FOR OPTIMAL RESULTS<br />
All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions.<br />
PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY.<br />
1. AGAROSE GELS<br />
Preparation<br />
Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; tris-barbital buffer pH 9,2 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations<br />
used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: Agarose gels contain 0.31 % barbital and 0.34 % sodium barbital. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately !<br />
Use<br />
Support medium for protein electrophoresis.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). They are stable until the<br />
expiration date indicated on the kit package and the gel package labels. (The arrow on the front of the kit box must be pointing upwards). Avoid storage<br />
close to a window or to a heat source. Avoid important variation of temperature during storage.<br />
DO NOT FREEZE.<br />
Discard when:<br />
(i) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel) ;<br />
(ii) bacterial or mold growth is indicated ;<br />
(iii) abnormal quantity of liquid is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions).<br />
2. BUFFERED STRIPS<br />
Preparation<br />
Buffered sponge strips are ready to use. Each contains: tris-barbital buffer pH 9,2 ± 0.3 ; sodium azide ; additives, nonhazardous at concentrations<br />
used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: The buffer in the strips contains 0.92 % barbital, 1.03 % sodium barbital and 0.30 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested<br />
consult physician immediately ! When disposing, prevent contact with acids, lead or copper, as these are known to form explosive or toxic<br />
compounds with sodium azide.<br />
Use<br />
Buffered strips function as electrophoresis buffer reservoir and ensure contact between the gel and electrodes.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the buffered strips horizontally in the original protective packaging at room temperature or refrigerated. (The arrow on the front of the kit box<br />
must be pointing upwards).<br />
They are stable until the expiration date indicated on the kit package or buffered strips package label.<br />
DO NOT FREEZE.<br />
Discard buffered strips if the package is opened and the strips dry out.<br />
- 8 -<br />
SEBIA INSTRUCTIONS - English
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. STAINING SOLUTION DILUENT<br />
Preparation<br />
The stock staining solution diluent must be used as described in paragraph " AMIDOBLACK STAIN ".<br />
It contains an acidic solution.<br />
Use<br />
For the preparation of the amidoblack staining solution.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining<br />
solution diluent vial labels. DO NOT FREEZE.<br />
Do not add any sodium azide.<br />
4. AMIDOBLACK STAIN<br />
Preparation<br />
The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in<br />
viscosity or solidification.<br />
In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure:<br />
1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial.<br />
2. Close carefully the vial.<br />
3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds.<br />
4. Pour this solution in the container for staining solution processing.<br />
5. Repeat this step twice, three times if necessary.<br />
6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water.<br />
7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes.<br />
The staining solution is ready to use.<br />
NOTE : An incomplete reconstitution of the stain will lead to an under-evaluation of albumin fraction (low percentage or white hole inside the fraction).<br />
After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at<br />
concentrations used, necessary for optimum performance.<br />
WARNING: Harmful if swallowed.<br />
Use<br />
For staining gels with electrophoretic protein separations.<br />
IMPORTANT : The staining solution is designed to stain only 10 gels. Change the solution after 10 staining steps.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution<br />
is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels.<br />
Working staining solution is stable for 1 month.<br />
Do not store the working staining solution close to a heat source.<br />
5. APPLICATORS<br />
Use<br />
Precut, single use applicators for sample application.<br />
Storage<br />
Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated.<br />
6. FILTER PAPERS<br />
Use<br />
Precut, single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application.<br />
Storage<br />
Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.<br />
REAGENTS REQUIRED<br />
1. DESTAINING SOLUTION<br />
Preparation<br />
Each vial of the stock Destaining Solution (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>0, 10 vials, 100 mL each) to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is<br />
convenient to dilute only 5 mL of the stock solution to 5 liters, the volume of the destaining solution container. After dilution, the working destaining<br />
solution contains: citric acid, 0.05 g/dL.<br />
Use<br />
For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels.<br />
For rinsing of the staining compartment after wash step.<br />
To neutralize the acidity of the destaining solution, pour 15 mL of a 50 % solution of Sodium Hydroxide, into the empty waste container.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining<br />
solution vial labels. DO NOT FREEZE. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. Do not add any<br />
sodium azide.<br />
Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.<br />
To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µL/dL of ProClin 300.<br />
Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on the<br />
kit package or destaining solution vial labels.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. HYDRASYS WASH SOLUTION<br />
Preparation<br />
Each vial of the stock HYDRASYS Wash Solution (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>1, 10 vials, 80 mL each) to be diluted up to 5 liters with distilled or deionized water.<br />
After dilution, the working wash solution contains: alkaline buffer pH 8.8 ± 0.3 ; sodium azide.<br />
WARNING: The stock wash solution contains 0.625 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately ! Sodium<br />
azide may lead to formation of explosive or toxic compounds when in contact with acids, lead or copper. Always flush with a large quantity<br />
of water when disposing.<br />
Use<br />
It serves for cleaning of the HYDRASYS Staining Compartment. Use periodically, e.g., if the instrument is used daily, wash the staining compartment<br />
weekly.<br />
See the package insert for directions to use.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store the stock and working wash solutions in closed containers at room temperature or refrigerated. They are stable until the expiration date indicated<br />
on the wash solution vial label.<br />
Discard working wash solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.<br />
3. FLUIDIL<br />
Preparation<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 5 mL) is ready to use.<br />
Use<br />
To dilute viscous or turbid samples, e.g., sera containing cryoglobulin or cryogel.<br />
Storage, stability and signs of deterioration<br />
Store at room temperature. It is stable until the expiration date indicated on the Fluidil vial label.<br />
Fluidil must be free of precipitate.<br />
EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 or PN 1211.<br />
2. Micropipettor, either manual or automated, such as HYDRAplus SEBIA, PN 1215, for an alternative way of loading the sample applicators.<br />
3. Wet Storage Chamber, PN 1270, supplied with HYDRASYS.<br />
4. Container Kit supplied with HYDRASYS.<br />
5. Pipettes: 10 µL and 200 µL.<br />
6. Densitometer / scanner capable of scanning 82 x 102 mm gels at 570 nm or with a yellow filter, e.g., HYRYS SEBIA or PHORESIS software for<br />
flat-bed scanner. Refer to manufacturer's instructions for operation and calibration procedures.<br />
SAMPLES FOR ANALYSIS<br />
Sample collection and storage<br />
Fresh samples are recommended for analysis. Serum and urine must be collected according to established procedures used in clinical laboratory<br />
testing. Refrigerate samples (2 to 8 °C) as soon as possible after collection for up to one week. For longer storage periods, keep samples frozen<br />
(stable at least one month).<br />
Freezing serum samples with soduim azide, 0.02 g/dL improves the storage stability.<br />
Freezing urine samples with HEPES 0.1 M (pH 6.75) and sodium azide, 0.02 g/dL improve the storage stability.<br />
IMPORTANT: Avoid boric acid as preservative.<br />
Thawed samples can give slight application marks due to protein or lipoprotein denaturation. Storage at 2 to 8 °C and freezing cause anodic shift of<br />
beta-lipoproteins from beta-zone to alpha-2 or alpha-1 zones ; the older the serum, the greater the shift.<br />
Sample preparation<br />
1. Sera<br />
Use undiluted serum samples.<br />
Upon storage at 2 to 8 °C or after freezing, some sera (particularly those containing cryoglobulin or cryogel) may become viscous or develope<br />
turbidity. Such sera might present application problems due to hindered diffusion through the sample applicator teeth. In such case, add<br />
25 µL Fluidil to 75 µL serum and vortex for 15 seconds. Then follow the standard procedure.<br />
2. Concentrated urines<br />
Analysis is performed on samples previously concentrated to a total protein concentration of about 1.5 - 2.0 g/dL (with an adapted device).<br />
IMPORTANT: Some urines have a salt content. This can cause a gel deformation during migration and consequently, distortion of the migration<br />
profiles. If such a distortion makes interpretation inacurate, the urine should be dialyzed to remove the salts.<br />
NOTE : Diffusion of urine samples into the applicator tips may be hindered when the urine (neat or concentrated) is turbid. It is recommended to<br />
remove the particulates by centrifugation (e.g., 10 minutes at 3,000 rpm) or filtration (e.g., 0.45 µm syringe filter).<br />
Sample to avoid<br />
• Do not use hemolysed serum samples. Hemolysis increases alpha-2 and beta-zones.<br />
• Avoid plasma samples. Fibrinogen gives a band close to the application point which might be taken for a monoclonal immunoglobulin and would<br />
offset percentage of corresponding zone.<br />
• Avoid aged, improperly stored urine samples where enzymatic degradation of proteins might occur.<br />
PROCEDURE<br />
The HYDRASYS system is a semi-automated multi-parameter instrument. The automated steps include processing of <strong>HYDRAGEL</strong> agarose gels in<br />
the following sequence: sample application, electrophoretic migration, drying, staining, destaining and final drying. The manual steps include handling<br />
samples and gels, and setting up the instrument for operation.<br />
READ CAREFULLY HYDRASYS INSTRUCTION MANUAL.<br />
- 10 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
I. MIGRATION SET UP<br />
1. Switch on HYDRASYS instrument.<br />
2. Place three applicators on a flat surface with the well numbers in the right-side-up position (Fig. 1).<br />
- Apply 10 µL of neat serum sample or concentrated urine in each well. Load each applicator within 2 minutes.<br />
- Place the applicators into two wet storage chambers with the teeth up [handle them by the plastic tooth protection frame]. Let the samples<br />
diffuse into the teeth for 5 minutes after the last sample application. For later use (up to 8 hours), keep the entire chambers under<br />
refrigeration.<br />
See wet chamber package insert for further details.<br />
3. Open the lid of the Migration Module and raise the electrode and applicator carriers.<br />
WARNING: Never close the lid while the carriers are raised !<br />
4. Select «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» migration program from the instrument menu (left side of the keyboard).<br />
5. Remove buffered strips from the package ; handle them by the plastic ends. Engage the punched ends of the strip's plastic backing to the pins<br />
on the electrode carrier ; the strip's plastic backing must face the carrier (Fig. 2).<br />
6. Unpack the <strong>HYDRAGEL</strong> plate.<br />
- Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately.<br />
WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration.<br />
- Pool 200 µL of distilled or deionized water, on the lower third of the frame printed on theTemperature Control Plate of the migration module.<br />
- Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 3).<br />
- Bend the gel and ease it down onto the water pool (Fig. 3). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire<br />
gel plate and the gel is lined up with the printed frame.<br />
7. Lower both carriers down. In this position the buffered strips do not touch the gel. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY DOWN.<br />
8. Remove the applicators from the wet chambers. Handle them by the protection frame.<br />
- Snap off the applicator teeth's protection frame.<br />
- Place the three applicators each into position n° 2, 6 and 10.<br />
IMPORTANT: The numbers printed on the applicators must face the operator (Fig. 4).<br />
9. Close the lid of the migration module.<br />
10. Start the procedure immediately by pressing the green arrow «START» key on the left side of the keyboard.<br />
IMPORTANT: Make sure that the ventilation air inlet on the right side of the instrument is not blocked.<br />
MIGRATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS<br />
• The two carriers are lowered so that buffered strips and applicators contact the gel surface.<br />
• Sample applicator carrier rises up.<br />
• Migration is carried out under 20 W constant at 20 °C controlled by Peltier effect, until 24 Vh have accumulated (for about 5 minutes).<br />
• The electrode carrier rises to disconnect the electrodes.<br />
• The temperature of the control plate rises to 65 °C for 10 minutes to dry the gel.<br />
• The control plate is cooled down ; when it reaches 50 °C, an audible beep signals that the migration module lid unlocks. The plate temperature<br />
remains at 50 °C until the lid is opened. Then, the temperature keeps decreasing until it reaches 20 °C (in less than 5 minutes) after which a new<br />
migration run may start.<br />
NOTE: The migration module lid remains closed during all migration steps.<br />
II. GEL PROCESSING SET-UP<br />
1. Open the lid.<br />
2. Remove the applicators and discard.<br />
3. Raise both carriers, remove the buffered strips by their plastic ends and discard.<br />
4. Remove the dried gel film for further processing.<br />
5. After each use, wipe the electrodes and the temperature control plate with a soft wet tissue.<br />
6. Open the Gel Holder. Lay it flat and position the dried gel (with gel side facing up) into the grooves of the two rods and close the holder. Make<br />
sure that the film is correctly positionned inside the holder (Fig. 5).<br />
7. Place the gel holder into the Gel Processing / Staining Module.<br />
IMPORTANT: Before starting the gel processing / staining program, check the following:<br />
- the staining container is filled with 300 mL of staining solution ;<br />
- the destaining container contains at least 1 liter of destaining solution ;<br />
- the waste container is empty.<br />
For reagent line connection: refer to the information displayed on the screen of the instrument (select key: REAGENT LINES).<br />
IMPORTANT: Do not forget to block up the unused lines.<br />
8. Select «PROT./B1-B2/Hb» staining program from the instrument menu and start the run by pressing the «START» key (green arrow on the<br />
right side of the keyboard).<br />
During staining, destaining and drying steps, the compartment remains locked.<br />
After cooling step, an audible beep signals that the compartment unlocks (the ventilation is maintained until the gel holder is removed).<br />
III. GEL PROCESSING COMPLETION<br />
1. Remove the gel holder from the compartment, open it and remove the dried gel.<br />
NOTE : After gel staining / destaining and before densitometry / scanning, a gel may be put through an additional wash step, if needed, to<br />
further clarify the gel background and to remove any residual stain that may appear as blue spots. Wash the gel using the " WASH<br />
ISOENZ/GEL " program.<br />
2. If needed, clean the back side (the plastic support side) of the dry film with a damp soft paper.<br />
3. Scan using a densitometer / scanner at 570 nm or with a yellow filter.<br />
NOTE : The lengths of electrophoretic migrations may be slightly different with gels containing 2 or 3 analysis rows, without any adverse effects<br />
on performance.<br />
- 11 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
RESULTS<br />
Quality control<br />
It is advised to include an assayed control serum (Control Serum, SEBIA PN 4785) into each run of samples.<br />
Values<br />
Densitometer scanning (at 570 nm) of stained electrophoregrams yields relative concentrations (percentages) of individual protein zones.<br />
Normal values (mean ± 2 SD) for individual major electrophoretic serum protein zones on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels have been established<br />
from a healthy population of 158 adults (men and women).<br />
The protein quantification in UV on CAPILLARYS gives similar values to nephelometric procedure (especially for albumin). SEBIA proposes a<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> - CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC Equivalency of values obtained on <strong>HYDRAGEL</strong> after calibration of scanning systems.<br />
Without <strong>HYDRAGEL</strong> With <strong>HYDRAGEL</strong> CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC Equivalency Values Equivalency Values FRACTION HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumin 59.8 - 72.4 % 53.8 - 65.2 % Alpha-1 globulins 1.0 - 3.2 % 1.1 - 3.7 % Alpha-2 globulins 7.4 - 12.6 % 8.5 - 14.5 % Beta globulins 7.5 - 12.9 % 8.6 - 14.8 %<br />
| Gamma globulins | 8.0 - 15.8 % | 9.2 - 18.2 % |<br />
It is recommended each laboratory establishes its own normal values.<br />
Interpretation 1-15<br />
As an aid in interpretation of serum and urine protein electrophoregrams, see BIBLIOGRAPHY.<br />
Interference and Limitations<br />
See SAMPLES ANALYSIS.<br />
Due to the resolution and sensitivity limits of zone electrophoresis, it is possible that some monoclonal components may not be detected with this<br />
method.<br />
Troubleshooting<br />
Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the procedure<br />
were carefully followed.<br />
Kit reagent Safety Data Sheets and informations on waste products elimination are available from the Technical Service of the supplier.<br />
PERFORMANCE DATA<br />
Serum analysis<br />
Reproducibility within run<br />
Three (3) different serum samples each were run in <strong>54</strong> tracks on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gel from the 3 lots tested. The means, SD and CV<br />
(n = <strong>54</strong>) were calculated for each serum sample, each zone and each lot (scanner).<br />
The following table shows ranges representing serum sample No 1 and the three lots tested.<br />
FRACTION MEAN (%) SD CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 Alpha-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 Alpha-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 Beta 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8<br />
| Gamma | 10.5 9.7 9.5 | 0.48 0.45 0.50 | 4.6 4.6 5.2 |<br />
The following table shows ranges representing serum sample No 2 and the three lots tested.<br />
FRACTION MEAN (%) SD CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 Alpha-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 Alpha-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 Beta 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0<br />
| Gamma | 6.8 5.5 6.1 | 0.37 0.56 0.56 | 5.5 10.1 9.2 |<br />
- 12 -
The following table shows ranges representing serum sample No 3 and the three lots tested.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRACTION MEAN (%) SD CV (%) Lot 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 53.8 <strong>54</strong>.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 Alpha-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 Alpha-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 Beta 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5<br />
| Gamma | 26.1 25.8 25.3 | 0.35 0.47 0.40 | 1.4 1.8 1.6 |<br />
Reproducibility between runs<br />
Eighteen (18) different serum samples were run on 12 different gels using 3 batches of <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels. The means, SD and CV<br />
(n = 12) were calculated for each serum sample and each zone. The results were essentially the same for all samples (scanner).<br />
The following table shows the ranges of SD and CV representing all samples and a mean CV calculated from the pooled CV’s for all samples (n = 18).<br />
FRACTION SD MEAN CV (%) Albumin 0.9 - 1.3 1.6 - 2.1 1.8 Alpha-1 0.2 - 0.3 5.3 - 12.3 8.4 Alpha-2 0.2 - 0.3 1.9 - 3.7 2.8 Beta 0.3 - 0.4 3.0 - 3.3 3.2<br />
| Gamma | 0.5 - 0.7 | 2.0 - 11.9 | 6.7 |<br />
Accuracy<br />
One hundred and two (102) different samples (pathological and normal sera) were run on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels and on <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 gels. The correlation parameters calculated for individual zones from the pooled data for <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels vs. the<br />
comparative gel systems (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) were (HYRYS):<br />
FRACTION Correlation Coefficient y-Intercept Slope Range of % Values* Albumin 0.994 0.640 1.000 35.4 - 74.3 Alpha-1 0.994 -0.070 1.078 1.1 - 10.5 Alpha-2 0.992 -0.030 0.983 5.4 - 21.4 Beta 0.985 0.320 0.958 5.0 - 16.5<br />
| Gamma | 0.996 | 0.050 | 0.966 | 6.6 - 52.5 |<br />
The correlation parameters calculated for individual zones from the pooled data for <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels vs. the comparative gel systems<br />
(y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) were (scanner):<br />
FRACTION Correlation Coefficient y-Intercept Slope Range of % Values* Albumin 0.964 3.407 0.973 34.5 - 74.1 Alpha-1 0.980 0.030 0.994 1.2 - 9.4 Alpha-2 0.972 0.070 0.949 5.3 - 19.8 Beta 0.961 0.904 0.874 5.0 - 15.6<br />
| Gamma | 0.988 | 0.411 | 0.968 | 5.9 - 53.6 |<br />
* The % values are as determined in the <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) system.<br />
Sensitivity<br />
Three pathological serum samples with each a monoclonal protein was serially diluted and the dilutions electrophoresed on <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels and on <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 gels. After visual inspection of the individual gels, the highest dilution with a discernible<br />
monoclonal band was comprised between 0.035 and 0.013 g/dL. Thus, the lowest detected concentration of a monoclonal protein was 0.013 g/dL.<br />
NOTE : According to the position of the monoclonal component and polyclonal background in the gamma zone, the detection limit may vary.<br />
Concentrated urines analysis<br />
Results obtained with <strong>HYDRAGEL</strong> gels indicate a very good reproducibility within and between runs for concentrated urines samples after quantitative<br />
and qualitative analysis. Twenty eight (28) different samples (pathological and normal urines) were run on <strong>HYDRAGEL</strong> gels and another commercially<br />
available agarose gel system. There were no visually detectable differences among the two systems. The sensitivity of detection was determined from<br />
the highest serial dilutions of a monoclonal urinary protein giving a discernible band at 0.048 g/dL.<br />
BIBLIOGRAPHY<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
- 13 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
- 14 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
ANWENDUNGSBEREICH<br />
Die gele <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) kit Client dient zum elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen in Humanserum und Urin auf Agarosegelen<br />
in alkalischem Puffer (pH-Wert 9,2). Die normalen Serumproteine werden in fünf Hauptfraktionen getrennt und mit Amidoschwarz gefärbt. Die Kits<br />
wurden für das halbautomatische Elektrophoresegerät HYDRASYS entwickelt.<br />
Die Auswertung der Elektropherogramme kann entweder qualitativ durch visuellen Vergleich oder für eine exakte relative Quantifizierung (%) der<br />
einzelnen Fraktionen durch Densitometrie erfolgen.<br />
Pro Agarosegel des <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Kits können <strong>54</strong> Proben analysiert werden.<br />
In-vitro-Diagnostikum.<br />
TESTPRINZIP 1-16<br />
Die Proteinelektrophorese ist eine weit verbreitete Technik, die in klinischen Labors routinemäßig für das Screening von Serum und anderen<br />
Körperflüssigkeiten auf Proteinanomalien verwendet wird. Sie basiert auf dem Prinzip der Zonenelektrophorese, die auf einem geeigneten<br />
Trägermedium durchgeführt wird. Agarose erwies sich als ein vielseitig einsetzbares und effektives Trägermaterial. Bei diagnostischen Anwendungen<br />
werden die Serumproteine vor allem entsprechend ihrer Ladung bei einem bekannten pH-Wert in die folgenden fünf Hauptfraktionen getrennt:<br />
Albumin, Alpha-1-Globuline, Alpha-2-Globuline, Betaglobuline und Gammaglobuline. Jede Fraktion besteht aus einem oder mehreren<br />
Serumproteinen. Die Urinproteinmuster ähneln den Serumproteinmustern. Dennoch kann die relative Intensität der Urinfraktionen beträchtlich<br />
variieren, weil sie jeweils von der Filtrationskapazität der Nieren abhängt.<br />
IM KIT <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) ENTHALTENE REAGENZIEN UND MATERIALIEN<br />
BEZEICHNUNG BESTELL-NR. 4145 BESTELL-NR. 4260* Agarosegele (gebrauchsfertig) 10 Gele 80 Gele Pufferstreifen (gebrauchsfertig) 10 Pack zu 2 Stück 80 Pack zu 2 Stück Verdünnungslösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 60 ml 8 Fläschchen, 60 ml Amidoschwarz-Färbelösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 20 ml 8 Fläschchen, 20 ml Applikatoren (gebrauchsfertig) 3 Pack zu 10 Stück (18 Zähnen) 24 Pack zu 10 Stück (18 Zähnen)<br />
| Filterpapier | 1 Pack zu 10 Stück | 8 Pack zu 10 Stück |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE<br />
Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden.<br />
BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN.<br />
1. AGAROSEGELE<br />
Vorbereitung<br />
Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 8 g/l ; Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,2 ± 0,1 ; Additiva zur Optimierung der Leistung,<br />
in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.<br />
WARNHINWEIS: Die Agarosegele enthalten 0,31 % Barbital und 0,34 % Natriumbarbital. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen<br />
Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen!<br />
Gebrauch<br />
Hilfsmedium für die Proteinelektrophorese.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Die Gele waagerecht in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 bis 30 °C) oder im Kühlschrank (2 bis 8 °C) aufbewahren. Sie bleiben bis<br />
zum Verfalldatum stabil, das auf dem Etikett der Kit- oder Gelverpackung angegeben ist. (Der Pfeil auf der Vorderseite der Kit-Schachtel muß nach<br />
oben zeigen.) Eine Lagerung in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle ist zu vermeiden. Starke Temperaturschwankungen sind zu vermeiden.<br />
NICHT EINFRIEREN.<br />
Das Gel ist zu verwerfen bei: (i) Kristallen oder Niederschlag auf der Geloberfläche oder sehr weicher Gelstruktur (was darauf hindeutet, daß das Gel<br />
gefroren war) ; (ii) Bakterien- oder Schimmelpilzbildung ; (iii) einer ungewöhnlich stark ausgeprägten Flüssigkeitsansammlung in der Gel-Box (was auf<br />
einen Austritt von Puffer aus dem Gel aufgrund unsachgemäßer Lagerung hindeutet).<br />
2. PUFFERSTREIFEN<br />
Vorbereitung<br />
Die als Streifen vorliegenden Pufferschwämme sind gebrauchsfertig. Jeder Pufferstreifen enthält: Tris-Barbital-Puffer, pH-Wert 9,2 ± 0,3 ; Natriumazid ;<br />
Additiva zur Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen ungefährlich.<br />
WARNHINWEIS: Der im Streifen enthaltene Puffer enthält 0,92 % Barbital, 1,03 % Natriumbarbital und 0,30 % Natriumazid. Nicht einnehmen!<br />
Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort den Arzt aufsuchen! Darf bei der Entsorgung nicht mit Säuren, Blei oder Kupfer in Kontakt<br />
kommen, da sich sonst explosive bzw. toxische Natriumazidverbindungen bilden können.<br />
Gebrauch<br />
Die Pufferstreifen fungieren als Elektrophoresepufferreservoir und gewährleisten den Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Bewahren Sie die Pufferstreifen waagerecht liegend in der Original-Schutzverpackung bei Zimmertemperatur oder gekühlt auf. (Der Pfeil auf der<br />
Verpackungsschachtel muss nach oben zeigen.) Die Pufferstreifen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Schachtel oder auf dem Etikett<br />
der Streifen stabil.<br />
NICHT EINFRIEREN!<br />
Verwerfen Sie die Pufferstreifen, wenn die Verpackung geöffnet ist und die Streifen ausgetrocknet sind.<br />
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SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. VERDÜNNUNGSLÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Die Amidoschwarz-Verdünnungslösung ist wie im Abschnitt “Amidoschwarz-Färbelösung” beschrieben zu verwenden.<br />
Die Lösung enthält Zitronensäure.<br />
Gebrauch<br />
Zum Herstellen der Amidoschwarz-Färbelösung.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte Verdünnungslösung im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahren. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem<br />
Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN!<br />
Geben Sie kein Natriumazid zu.<br />
4. AMIDOSCHWARZ FÄRBELÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des<br />
Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt.<br />
Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung :<br />
1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben.<br />
2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen.<br />
3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln.<br />
4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer des HYDRASYS überführen.<br />
5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen.<br />
6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen<br />
auffüllen.<br />
7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen.<br />
Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig.<br />
ACHTUNG: Eine unvollständige Lösung des Amidoschwarz Konzentrats kann zu einer Unterbestimmung der Albuminfraktion und/oder zu<br />
Auslöscheffekten der Albuminfraktion führen.<br />
Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2 ; 0,4 g/dl Amidoschwarz ; 6,7% Ethylenglycol ; zusätzliche Additive zur<br />
Optimierung (ungiftig in den verwendeten Konzentrationen).<br />
WARNUNG: Nicht verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen!<br />
Gebrauch<br />
Zum Färben der Agarose Gele nach elektrophoretischer Trennung.<br />
WICHTIG: Die Färbelösung ist für maximal 10 Färbungen konzipiert. Wechseln Sie deshalb die Färbelösung nach 10 Färbungen aus.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Amidoschwarz- Konzentrat und verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank verschlossen aufbewahren um Flüssigkeitsverlust<br />
durch Verdunstung zu vermeiden. Das Amidoschwarz-Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett)<br />
haltbar.<br />
Verdünnte Färbelösung ist einen Monat haltbar.<br />
Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren.<br />
5. APPLIKATOREN<br />
Gebrauch<br />
Einmalapplikatoren für den Probenauftrag.<br />
Lagerung<br />
Applikatoren vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.<br />
6. FILTERPAPIER<br />
Gebrauch<br />
Dünnes Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten überschüssiger Flüssigkeit von der Gel-oberfläche vor dem Probenauftrag.<br />
Lagerung<br />
dünnes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.<br />
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN<br />
1. ENTFÄRBELÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte Entfärbelösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4<strong>54</strong>0, 10 Fläschchen zu je 100 ml) mit destilliertem oder entionisiertem<br />
Wasser auf 100 Liter auffüllen. Es empfiehlt sich, nur 5 ml konzentrierte Lösung auf 5 Liter, dem Fassungsvermögen des Behälters für die<br />
Entfärbelösung, aufzufüllen. Verdünnte Entfärbelösung enthält: Zitronensäure, 0,5 g/l.<br />
Gebrauch<br />
Zum Entfärben, d.h. Auswaschen von überschüssiger Farbe und zur Entfernung der Gelhintergrundfärbung.<br />
Zum Spülen der Färbekammer nach dem Waschen.<br />
Zur Neutralisation der sauren Entfärbelösung können 15 ml einer 50 % Natronlauge (NaOH) in den leeren Abfallbehälter gefüllt werden.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit-<br />
Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett der Entfärbelösung angegeben ist. NICHT EINFRIEREN. Verdünnte Entfärbelösung bleibt bei<br />
Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter eine Woche stabil. Kein Natriumazid zugeben.<br />
Verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.<br />
Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung zu verhindern, wenn sie länger als 1 Woche aufgehoben wird, sollten 50 µl/l ProClin 300<br />
zugesetzt werden.<br />
Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum Verfallsdatum<br />
stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.<br />
- 16 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. HYDRASYS WASCHLÖSUNG<br />
Vorbereitung<br />
Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte HYDRASYS Waschlösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4<strong>54</strong>1, 10 Fläschchen zu je 80 ml) mit destilliertem oder<br />
entionisiertem Wasser auf 5 Liter auffüllen. Verdünnte Waschlösung enthält: alkalischen Puffer, pH-Wert 8,8 ± 0,3 ; Natriumazid.<br />
WARNHINWEIS: Konzentrierte Waschlösung enthält 0,625 % Natriumazid. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort<br />
den Arzt aufsuchen! Natriumazid kann bei Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer zu explosiven bzw. toxischen Verbindungen reagieren. Bei<br />
der Entsorgung stets mit reichlich Wasser nachspülen.<br />
Gebrauch<br />
Sie wird zum Reinigen des HYDRASYS Färbemoduls eingesetzt. Die Reinigung in regelmäßigen Abständen durchführen: Wird das Gerät zum Beispiel<br />
täglich genutzt, sollte das Färbemodul einmal pro Woche gereinigt werden.<br />
Hinweise zum Gebrauch finden Sie auf der Packungsbeilage.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Konzentrierte und verdünnte Waschlösung in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum<br />
Verfalldatum stabil, das auf dem Fläschchenetikett der Waschlösung angegeben ist.<br />
Verdünnte Waschlösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist.<br />
3. FLUIDIL<br />
Vorbereitung<br />
Fluidil (SEBIA, Bestell-Nr. 4587, 1 Fläschchen, 5 ml) ist gebrauchsfertig.<br />
Gebrauch<br />
Zum Verdünnen zähflüssiger oder trüber Proben, z.B. von Kryoglobulin- oder Kryogel-haltigen Seren.<br />
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall<br />
Bei Raumtemperatur aufbewahren. Es bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf Kit-Verpackung oder auf dem Fluidil-Fläschchenetikett<br />
angegeben ist.<br />
Fluidil darf kein Präzipitat aufweisen.<br />
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE AUSSTATTUNG (NICHT IM KIT ENTHALTEN)<br />
1. HYDRASYS System, SEBIA, Bestell-Nr. 1210 oder Nr. 1211.<br />
2. Für das Beladen der Applikatoren kann alternativ eine manuelle Mikropipette oder der Pipettierautomat HYDRAplus SEBIA, Bestell-Nr. 1215,<br />
verwendet werden.<br />
3. Feuchte Kammer, Bestell-Nr. 1270, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.<br />
4. Behälter-Kit, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten.<br />
5. Pipetten: 10 µl und 200 µl.<br />
6. Densitometer / Scanner für das Scannen von 82 x 102 mm großen Gelen bei 570 nm oder unter Verwendung eines Gelbfilters, z.B.: HYRYS,<br />
SEBIA oder PHORESIS Software für Flachbettscanner. Hinweise zur Bedienung und Kalibration entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitung<br />
des Herstellers.<br />
PROBEN FÜR DIE ANALYSE<br />
Probensammlung und -lagerung<br />
Für die Analyse wird frisches Probenmaterial empfohlen. Die Gewinnung von Serum und Urin nach einem gebräuchlichen Verfahren für klinische Tests<br />
durchführen. Die Proben sollten nach der Gewinnung umgehend bei 2 - 8 °C gekühlt und können bis zu eine Woche gelagert werden. Bei längerer<br />
Lagerung die Proben einfrieren. Durch einfaches Einfrieren bleiben die Proben für mindestens einen Monat.<br />
Die Lagerstabilität gefrorener Serum erhöht sich, wenn sie vor dem Einfrieren mit Natriumazid, 0,2 g/l, versetzt werden.<br />
Die Lagerstabilität gefrorener Urin erhöht sich, wenn sie vor dem Einfrieren mit HEPES, 0,1 M (pH-Wert 6,75), und Natriumazid, 0,2 g/l, versetzt werden.<br />
WICHTIG: Keine Borsäure als Konservierungsmittel verwenden.<br />
Nach dem Auftauen können diese Proben aufgrund der Protein- bzw. Lipoprotein-denaturierung leichte Trennspuren an der Auftragsstelle hinterlassen.<br />
Durch die Lagerung bei 2 - 8 °C und das Einfrieren der Proben kommt es zu einer anodischen Verschiebung der Beta-Lipoproteine von der<br />
Beta-1-Zone zur Alpha-2- bis hin zur Alpha-1-Zone ; je älter die Proben sind, desto größer ist die Verschiebung.<br />
Probenvorbereitung<br />
1. Serumproben<br />
Unverdünnte Serumproben verwenden. Nach der Lagerung im Kühl- oder Gefrierschrank können manche Serumproben (insbesondere<br />
Kryoglobulin- oder Kryogel-haltige Proben) zähflüssig oder trüb werden. Derartige Serumproben lassen sich mitunter schwer auftragen, da sie<br />
kaum durch die Zähne des Probenapplikators diffundieren. In diesen Fällen zu 75 µl Serum 25 µl Fluidil zugeben und für 15 Sekunden im<br />
Rotationsmischer mischen. Anschließend mit dem Standardverfahren fortfahren.<br />
2. Konzentrierte Urinproben<br />
Wird die Analyse an Urinproben durchgefürt, die (mit einen geeigneten Verfahren) bis zu einem Gehalt von 15 - 20 g/l konzentriert wurden.<br />
WICHTIG: Einige Urinproben sind stark salzhaltig. Dardurch kann es während der Migration zur einer Deformation des Gels und damit zur einer<br />
Verzerrung der Elektrophoresemuster kommen. Dies läßt sich durch Entfernen des Salzanteils mittels Dialyse vermeiden.<br />
ZU BEACHTEN: Die Diffusion der Urinproben in die Applikatorspitzen kann behindert sein, wenn der Urin (nativ oder konzentriert) trüb ist. Es wird<br />
empfohlen, die Partikel durch Zentrifugation (z.B. 10 Minuten bei 3.000 Upm) oder Filtration (z.B. 0,45 µm Filter) zu entfernen.<br />
Folgende Proben nicht verwenden<br />
• Keine hämolysierten Proben verwenden, weil durch die Hämolyse die Alpha-2- und Beta-Fraktionen erhöht werden.<br />
• Plasmaproben vermeiden. Das Fibrinogen ergibt eine Bande in der Nähe der Auftragstelle, die mit monoklonalem Immunglobulin verwechselt<br />
werden könnte und durch Überlagerung zu einer Verfälschung des prozentualen Anteils einer dort vorhandenen Fraktion führen würde.<br />
• Keine zu alten oder ungeeignet gelagerte Urinproben verwenden, weil ein enzymatischer Abbau der Proteine auftreten könnte.<br />
- 17 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
DURCHFÜHRUNG<br />
Das HYDRASYS System ist ein halbautomatisches Multiparameter-Gerät, das eine automatische Bearbeitung der <strong>HYDRAGEL</strong> Agarosegele in der<br />
nachstehenden Reihenfolge durchführt: Probenapplikation, elektrophoretische Migration, Trocknen, Färben, Entfärben und Endtrocknen. Zu den<br />
manuellen Schritten gehört die Handhabung der Proben und Gele sowie die Bedienung des Geräts.<br />
DIE BEDIENUNGSANLEITUNG ZUM HYDRASYS SYSTEM AUFMERKSAM DURCHLESEN.<br />
I. VORBEREITUNG DER MIGRATION<br />
1. HYDRASYS einschalten.<br />
2. Bei Verwendung drei Probenapplikatoren so auf eine ebene Unterlage legen, daß die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (siehe Abb. 1).<br />
- In jede Vertiefung des Applikators 10 µl unverdünntes Serum oder aufkonzentrierten Urin geben. Jeder Applikator sollte innerhalb von zwei<br />
Minuten beladen werden.<br />
- Die Applikatoren mit den Zähnen nach oben in zwei feuchte Kammeren legen (nur am Schutzrahmen für die Zähne anfassen). Die Proben<br />
nach dem Auftragen der letzten Probe 5 Minuten lang in die Zähne einziehen lassen. Erfolgt die Anwendung erst (bis zu 8 Stunden) später,<br />
die komplette Kammeren in den Kühlschrank stellen.<br />
Hinweise hierzu finden Sie in der Packungsbeilage zur feuchten Kammer.<br />
3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen, und die Elektroden-/Applikatoren-Halter nach oben klappen.<br />
WARNHINWEIS: Die Abdeckung bei hochgestelltem Elektroden-/Applikatoren-Halter nicht schliessen!<br />
4. Im Gerätemenü das Programm «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» wählen (an der Tastatur links).<br />
5. Die Pufferstreifen an den Kunststoffenden aus der Packung nehmen. Die Perforation des Plastikfilms in die Stifte des Elektroden-Halters<br />
einführen. Die Plastikfolie muß dabei zum Applikator-Halter zeigen (siehe Abb. 2).<br />
6. Das Gel aus der Verpackung nehmen.<br />
- Ein dünnes Filterpapier vorsichtig und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier<br />
sofort wieder entfernen.<br />
WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange auf dem Gel lassen, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.<br />
- 200 µl destilliertes oder entionisiertes Wasser in das untere Drittel des Rahmens geben, der auf der Peltier-Platte des Migrationsmoduls<br />
aufgedruckt ist.<br />
- Das Gel (mit der Gelseite nach oben) an die untere Kante des aufgedruckten Rahmens anlegen (siehe Abb. 3).<br />
- Das Gel biegen und auf dem Wasser abrollen (siehe Abb. 3). Darauf achten, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden, das Wasser<br />
unter der gesamten Gelplatte verteilt ist und das Gel am aufgedruckten Rahmen anliegt.<br />
7. Beide Halter nach unten klappen. In dieser Position dürfen die Pufferstreifen keinen Kontakt mit dem Gel haben. DIE HALTER NICHT MIT<br />
GEWALT BIS GANZ NACH UNTEN DRÜCKEN.<br />
8. Die Applikatoren aus die feuchten Kammeren nehmen. Dabei nur am Schutzrahmen anfassen.<br />
- Den Schutzrahmen für die Zähne entfernen.<br />
- Je einen Applikator an Position 2, 6 und 10 einsetzen.<br />
WICHTIG: Die auf dem Applikatoren aufgedruckten Ziffern müssen immer zum Bediener zeigen (siehe Abb. 4).<br />
9. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen.<br />
10. Die Migration sofort starten. Dazu die grüne Pfeiltaste «START» auf der linken Seite der Tastatur drücken.<br />
WICHTIG: Darauf achten, daß die Lüftungsschlitze an der rechten Geräteseite nicht verdeckt sind.<br />
MIGRATION - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE<br />
• Die beiden Halter werden soweit gesenkt, daß die Pufferstreifen und die Applikatoren in Kontakt mit der Geloberfläche kommen.<br />
• Der Probenapplikator-Halter wird angehoben.<br />
• Die Migration erfolgt unter Anlegen eines Gleichstroms von 20 W bei einer Temperatur von 20 °C, die durch den Peltier-Effekt aufrechterhalten wird,<br />
bis 24 Vh erreicht sind (nach etwa 5 Minuten).<br />
• Der Elektroden-Halter wird angehoben, wodurch der Kontakt zu den Elektroden unterbrochen wird.<br />
• Zum Trocknen des Gels wird die Temperatur der Peltier-Platte für 10 Minuten auf 65 °C erhöht.<br />
• Die Platte kühlt ab. Sobald 50 °C erreicht sind, ertönt ein akustisches Signal, um den Bediener darauf aufmerksam zu machen, daß sich die<br />
Abdeckung des Migrationsmoduls entriegelt. Bis zum Öffnen der Abdeckung wird die Temperatur der Platte auf 50 °C gehalten. Anschließend sinkt<br />
die Temperatur (in weniger als 5 Minuten) auf 20 °C. Nun kann eine weitere Migration durchgeführt werden.<br />
HINWEIS: Während der Migration bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert.<br />
II. VORBEREITUNG DER GELBEARBEITUNG<br />
1. Die Abdeckung öffnen.<br />
2. Die Applikatoren herausnehmen und verwerfen.<br />
3. Beide Halter anheben, die Pufferstreifen an den Plastikenden herausnehmen und verwerfen.<br />
4. Das Gel für die weitere Bearbeitung herausnehmen.<br />
5. Die Elektroden und die Peltier-Platte mit einem feuchten Papiertuch abwischen.<br />
6. Den Gel-Halter öffnen und flach hinlegen. Das getrocknete Gel (mit der Gelseite nach oben) in die Ausfräsung des Gel-Halters einsetzen, und<br />
den Gel-Halter schließen. Darauf achten, daß das Gel im Halter korrekt positioniert ist (siehe Abb. 5).<br />
7. Den Gel-Halter in das Gelbearbeitungs-/Färbemodul einsetzen.<br />
WICHTIG: Vor dem Start des Gelbearbeitungs-/Färbeprogramms überprüfen, daß:<br />
- der Färbelösungsbehälter 300 ml Färbelösung enthält ;<br />
- der Entfärbelösungsbehälter mindestens 1 Liter Entfärbelösung enthält ;<br />
- der Abfallbehälter leer ist.<br />
Hinweise zum Anschluß an die Reagenzkanäle werden am Monitor des Gerätes angezeigt (drücken Sie dazu die Taste KANAELE).<br />
WICHTIG: Nicht vergessen, die nicht benötigten Kanäle zu blockieren.<br />
8. Im Gerätemenü das Färbeprogramm «PROT./B1-B2/Hb» wählen, und den Vorgang durch Drücken der «START»-Taste (grüner Pfeil auf der<br />
rechten Seite der Tastatur) starten.<br />
Während der Färbe-, Entfärbe- und Trocknungsschritte bleibt das Färbemodul verriegelt.<br />
Nach einer Abkühlphase des Moduls ertönt ein akustisches Signal, und das Färbemodul entriegelt sich (die Luftkühlung erfolgt solange, bis<br />
der Gel-Halter entnommen wird).<br />
- 18 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
III. ABSCHLUSS DER GELBEARBEITUNG<br />
1. Den Gel-Halter aus dem Färbemodul nehmen, die Bügel nach oben klappen und das getrocknete Gel entnehmen.<br />
ZU BEACHTEN: Nach der Färbung / Entfärbung des Gels und vor der Densitometrie / dem Scannen kann mit dem Gel ein zusätzlicher<br />
Waschschritt durchgeführt werden, um den Hintergrund des Gels klarer zu machen und überschüssige Farbe, die als blaue Punkte erscheinen<br />
kann, zu entfernen. Zu diesem Zweck das Gel mit dem Programm " WASC. ISOENZ/GEL " waschen.<br />
2. Bei Bedarf die Rückseite (den Plastikfilm) der trockenen Folie mit einem weichen, feuchten Papiertuch reinigen.<br />
3. Mit einem Densitometer / Scanner bei einer Wellenlänge von 570 nm oder unter Verwendung eines Gelbfilters scannen.<br />
HINWEIS: Die Migrationslänge kann bei Gelen mit 2 oder 3 Analysereihen unterschiedlich sein, ohne jegliche Beeinträchtigung der Leistung.<br />
ERGEBNISSE<br />
Qualitätskontrolle<br />
Es empfiehlt sich, bei jeder Analysenserie ein getestetes Kontrollserum (z.B. SEBIA Kontrolle-Serum, Bestell-Nr. 4785) mitzuführen.<br />
Werte<br />
Das Lesen der gefärbten Elektropherogramme mit dem Densitometer (bei 570 nm) ergibt relative Konzentrationen (Prozentangaben) für die einzelnen<br />
Proteinfraktionen.<br />
Mit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gelen wurden auf dem HYDRASYS System bei einer Gruppe von 158 gesunden Erwachsenen (Frauen und Männer)<br />
für die einzelnen elektrophoretischen Serumprotein-Hauptfraktionen folgende Normalwerte (Mittelwert ± 2 SD) ermittelt.<br />
Die Protein Quantifizierung im UV-Licht mit CAPILLARYS ergibt die gleichen Werte, wie die nephelometrischen Methode (besonders für Albumin).<br />
SEBIA empfiehlt nach dem Einrichten des Scanner-Systems eine Standardisierung der über <strong>HYDRAGEL</strong> erhaltenen Werte.<br />
Werte ohne Standardisierung Werte mit CAPILLARYS Standardisierung FRAKTION HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumin 59,8 - 72,4 % 53,8 - 65,2 % Alpha-1-Globuline 1,0 - 3,2 % 1,1 - 3,7 % Alpha-2-Globuline 7,4 - 12,6 % 8,5 - 14,5 % Betaglobuline 7,5 - 12,9 % 8,6 - 14,8 %<br />
| Gammaglobuline | 8,0 - 15,8 % | 9,2 - 18,2 % |<br />
Jedes Labor sollte eigene Normalbereiche ermitteln.<br />
Interpretation 1-16<br />
Die angegebenen Literaturhinweise dienen als Hilfe für die Interpretation von Serum- und Urinelektropherogrammen siehe LITERATUR.<br />
Interferenzen und Einschränkungen<br />
Siehe PROBEN FÜR DIE ANALYSE.<br />
Es wird darauf hingewiesen, dass aufgrund der derzeitigen Kenntnis des zugrundeliegenden Analysenprinzips (Theorie der Zonenelektrophorese,<br />
Auflösungsvermögen und Sensitivität) keine Garantie für ein 100 % Erkennen aller monoklonalen Komponenten gewährt werden kann.<br />
Fehlersuche<br />
Kommt es trotz sachgerechter Lagerung und Vorbereitung der Materialien und Beachtung der Verfahrensbeschreibung zum Versagen des Tests,<br />
wenden Sie sich bitte an den SEBIA Kundendienst.<br />
Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen.<br />
LEISTUNGSDATEN<br />
Serumanalyse<br />
Intra-Assay-Reproduzierbarkeit<br />
Auf <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gel aus zwei verschiedenen Chargen wurden drei (3) verschiedene Serumproben jeweils auf <strong>54</strong> Spuren analysiert.<br />
Für jede Serumprobe, jede Fraktion und jede Charge wurden die Mittelwerte, die SD und der VK (n = <strong>54</strong>) berechnet (Lesen mit der Scanner).<br />
Die nachstehende Tabelle enthält die Wertebereiche, für Probe 1 getesteten Chargen.<br />
FRAKTION MITTELWERT (%) SD VK (%) Charge 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 68,9 70,2 70,7 0,66 0,91 0,97 1,0 1,3 1,4 Alpha-1 2,1 1,8 1,7 0,17 0,16 0,14 7,9 8,8 8,3 Alpha-2 9,4 9,1 9,0 0,23 0,30 0,34 2,4 3,3 3,7 Beta 9,1 9,1 9,1 0,26 0,25 0,35 2,9 2,7 3,8<br />
| Gamma | 10,5 9,7 9,5 | 0,48 0,45 0,50 | 4,6 4,6 5,2 |<br />
- 19 -
Die nachstehende Tabelle enthält die Wertebereiche, für Probe 2 getesteten Chargen.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRAKTION MITTELWERT (%) SD VK (%) Charge 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 59,6 61,5 60,2 0,67 1,08 1,13 1,1 1,8 1,9 Alpha-1 5,2 4,9 5,0 0,23 0,24 0,22 4,5 5,0 4,3 Alpha-2 14,8 14,8 14,8 0,26 0,27 0,30 1,8 1,8 2,0 Beta 13,6 13,3 14,0 0,30 0,33 0,41 2,2 2,5 3,0<br />
| Gamma | 6,8 5,5 6,1 | 0,37 0,56 0,56 | 5,5 10,1 9,2 |<br />
Die nachstehende Tabelle enthält die Wertebereiche, für Probe 3 getesteten Chargen.<br />
FRAKTION MITTELWERT (%) SD VK (%) Charge 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 53,8 <strong>54</strong>,1 55,2 0,58 0,76 0,80 1,1 1,4 1,4 Alpha-1 2,5 2,3 2,2 0,12 0,13 0,17 5,0 5,6 7,7 Alpha-2 8,0 7,9 7,8 0,21 0,16 0,29 2,6 2,1 3,7 Beta 9,7 9,9 9,4 0,21 0,21 0,23 2,2 2,2 2,5<br />
| Gamma | 26,1 25,8 25,3 | 0,35 0,47 0,40 | 1,4 1,8 1,6 |<br />
Inter-Assay-Reproduzierbarkeit<br />
Achtzehn (18) verschiedene Serumproben wurden jeweils an 12 verschiedenen <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gelserie analysiert. Für jede<br />
Serumprobe und jede Fraktion wurden die Mittelwerte, die SD und der VK (n = 12) berechnet (Lesen mit der Scanner).<br />
Die Ergebnisse waren bei allen Proben im wesentlichen gleich. Die nachstehende Tabelle enthält die SD und den VK aller Proben sowie den mittleren<br />
VK, der aus den gepoolten Variationskoeffizienten aller Proben errechnet wurde (n = 18).<br />
FRAKTION SD VK (%) MITTLERER VK (%) Albumin 0,9 - 1,3 1,6 - 2,1 1,8 Alpha-1 0,2 - 0,3 5,3 - 12,3 8,4 Alpha-2 0,2 - 0,3 1,9 - 3,7 2,8 Beta 0,3 - 0,4 3,0 - 3,3 3,2<br />
| Gamma | 0,5 - 0,7 | 2,0 - 11,9 | 6,7 |<br />
Richtigkeit<br />
Hundert zwei (102) verschiedene Proben (pathologische und normale Seren) wurden auf <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gelen und <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 Gelen analysiert. Für die einzelnen Fraktionen ergaben sich folgende Korrelationsparameter zwischen den gepoolten Daten der<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gele und dem Vergleichsgelsystem (y - <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) (HYRYS):<br />
FRAKTION Korrelationskoeffizient y-Schnittpunkt Anstieg Wertebereich in % der verwendeten Proben* Albumin 0,994 0,640 1,000 35,4 - 74,3 Alpha-1 0,994 -0,070 1,078 1,1 - 10,5 Alpha-2 0,992 -0,030 0,983 5,4 - 21,4 Beta 0,985 0,320 0,958 5,0 - 16,5<br />
| Gamma | 0,996 | 0,050 | 0,966 | 6,6 - 52,5 |<br />
Für die einzelnen Fraktionen ergaben sich folgende Korrelationsparameter zwischen den gepoolten Daten der <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gele und<br />
dem Vergleichsgelsystem (y - <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) (Scanner):<br />
FRAKTION Korrelationskoeffizient y-Schnittpunkt Anstieg Wertebereich in % der verwendeten Proben* Albumin 0,964 3,407 0,973 34,5 - 74,1 Alpha-1 0,980 0,030 0,994 1,2 - 9,4 Alpha-2 0,972 0,070 0,949 5,3 - 19,8 Beta 0,961 0,904 0,874 5,0 - 15,6<br />
| Gamma | 0,988 | 0,411 | 0,968 | 5,9 - 53,6 |<br />
* Die %-Werte wurden mit dem <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) System ermittelt.<br />
Empfindlichkeit<br />
Aus drei pathologischen Serumproben mit jeder einem monoklonalen Protein wurde eine Verdünnungsserie hergestellt. Die Elektrophorese der<br />
Verdünnungen erfolgte auf <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) Gelen und <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 Gelen. Die visuelle Überprüfung der einzelnen<br />
Gele ergab, daß die stärkste Verdünnung mit einer gerade noch erkennbaren monoklonalen Bande zwischen 0,35 und 0,13 g/l betrug. Die gerade<br />
noch nachweisbare Konzentration eines monoklonalen Proteins betrug 0,13 g/l.<br />
HINWEIS: Entsprechend der Position der monoklonalen Komponente und des polyklonalen Hintergrundes in der Gamma-Zone kann die<br />
Detektionsgrenze variieren.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Analyse von konzentrierten Urinen<br />
Die Ergebnisse, die auf den <strong>HYDRAGEL</strong> Gelen erzielt wurden, zeigen eine sehr gute Inter– und Intra-Assay-Reproduzierbarkeit für konzentrierte Urine<br />
nach quantitativer und qualitativer Analyse. Achtundzwanzig (28) verschiedene Proben (pathologische und normale Urine) wurden auf einem anderen<br />
handelsüblichen Agarosegelsystem aufgetrennt. Es waren keine visuellen Unterschiede zwischen den beiden Systemen erkennbar. Die<br />
Nachweisgrenze wurde von den höchsten seriellen Verdünnungen eines monoklonalen Urinproteins mit einer gerade noch erkennbaren Bande bei<br />
0,48 g/l (480 mg/l) nachgewiesen.<br />
LITERATUR<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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GEBRUIKSAANWIJZING<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
De <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) kit is ontwikkeld voor de scheiding van proteïnen in menselijk serum en urine door middel van elektroforese op<br />
alkalisch gebufferde agarose-gels (pH 9,2). De opzet is dat de normale menselijke serumproteïnen zich opsplitsen in vijf hoofdfracties. De kits worden<br />
gebruikt in combinatie met het halfautomatische HYDRASYS-instrument. De gescheiden proteïnen worden gekleurd met behulp van amidozwart. De<br />
electroferogrammen worden visueel geëvalueerd op patroonafwijkingen. Densitometrie levert vervolgens een nauwkeurige relatieve kwantificatie van<br />
de afzonderlijke zones.<br />
Iedere gel is bedoeld voor de analyse van <strong>54</strong> monsters.<br />
Voor gebruik bij in vitro diagnostiek.<br />
PRINCIPE VAN DE TEST 1-16<br />
Proteïne-elektroforese is een bekende techniek die inmiddels routinematig wordt gehanteerd in klinische laboratoria voor het screenen van serum en<br />
andere lichaamsvloeistoffen op proteïne-afwijkingen. Deze techniek is gebaseerd op de principes van zone-elektroforese, uitgevoerd op een geschikt<br />
ondersteuningsmedium. Agarose is ontwikkeld tot een veelzijdig en effectief ondersteuningsmedium. Voor wat betreft routinetoepassingen in de<br />
diagnostiek, splitsen serumproteïnen zich in vijf hoofdfracties. De splitsing hangt hoofdzakelijk af van hun lading bij een gegeven pH-waarde: albumine,<br />
alfa-1-globulinen, alfa-2-globulinen, bèta-globulinen en gamma-globulinen. Iedere zone bevat één of meer serumproteïnen. De patronen van proteïnen<br />
in urine lijken op die van serum. De relatieve intensiteit van de fracties of hun aanwezigheid kan echter zeer uiteenlopen, afhankelijk van de<br />
filtercapaciteit van de nier.<br />
DE <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) KIT BEVATTEN DE VOLGENDE REAGENTIA EN ANDERE MATERIALEN<br />
BESTANDDELEN PROD. NR. 4145 PROD. NR. 4260* Agarose-gels (klaar voor gebruik) 10 gels 80 gels Gebufferde strips (klaar voor gebruik) 10 pakjes van 2 elk 80 pakjes van 2 elk Verdunner voor de kleuroplossing (geconcentreerde oplossing) 1 flesje van 60 ml 8 flesjes van 60 ml Amidozwartkleurstof (geconcentreerde oplossing) 1 flesje van 20 ml 8 flesjes van 20 ml Applicators 3 paks van 10 stuks (18 strips) 24 paks van 10 stuks (18 strips)<br />
| Filterpapier | 1 pakje van 10 stuks | 8 pakjes van 10 stuks |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
VOOR OPTIMALE RESULTATEN<br />
Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter.<br />
LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR.<br />
1. AGAROSE-GELS<br />
Voorbereiding<br />
De agarose-gels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; tris-barbital buffer, pH 9,2 ± 0,1 ; in de gebruikte concentraties niet schadelijke<br />
toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: De agarose-gels bevatten 0,31 % barbital en 0,34 % natriumbarbital. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname<br />
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden!<br />
Gebruik<br />
Draagmedium voor proteïnen-elektroforese.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking en bij kamertemperatuur (15 tot 30 °C) of gekoeld<br />
(bij 2 tot 8 °C) bewaard worden. De gels zijn stabiel tot de houdbaarheidsdatum die op de verpakking, of op het verpakkingslabel van de gel, staat<br />
aangegeven. (De pijl op de voorzijde van de verpakking moet naar boven wijzen.) Vermijd opslag dicht bij een raam of een warmtebron. Vermijd<br />
belangrijke temperatuurwisselingen tijdens de opslag. NIET INVRIEZEN.<br />
Verwijder de gel wanneer er:<br />
(I)<br />
zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft<br />
aan dat de gel bevroren is geweest) ;<br />
(II) bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ;<br />
(III) een abnormale hoeveelheid vloeistof in de gelbox aanwezig is (wijst erop dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens<br />
onjuiste opslagomstandigheden).<br />
2. GEBUFFERDE STRIPS<br />
Voorbereiding<br />
Gebufferde sponsstrips zijn gereed voor gebruik. Elke strip bevat: tris-barbital buffer, pH 9,2 ± 0,3 ; natriumazide ; in de gebruikte concentraties niet<br />
schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: De gebufferde strips bevatten 0,92 % barbital, 1,03 % natriumbarbital en 0,30 % natriumazide. Niet voor inwendig<br />
gebruik! Bij abusievelijke inname dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Bij verwijdering contact met zuren, lood of koper<br />
vermijden aangezien deze explosieve of giftige verbindingen aangaan met natriumazide.<br />
Gebruik<br />
Gebufferde sponsstrips fungeren als bufferreservoir bij elektroforese en zorgen voor contact tussen de gel en de elektroden.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Bewaar de gebufferde strips horizontaal in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur of in de koeling. (De pijl aan de voorkant van<br />
de kitdoos dient omhoog te wijzen).<br />
De strips blijven stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of de etiketten van de verpakking van<br />
de gebufferde strips.<br />
NIET INVRIEZEN.<br />
Gooi de gebufferde strips weg als de verpakking geopend is en de strips uitdrogen.<br />
- 22 -<br />
SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. VERDUNNER VOOR DE KLEUROPLOSSING<br />
Bereiding<br />
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing moet toegepast worden volgens de beschrijving in de paragraaf "AMIDOZWART KLEUROPLOSSING".<br />
Het bevat een zure oplossing.<br />
Toepassing<br />
Bij de preparatie van de amidozwart kleuroplossing.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum<br />
zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET<br />
INVRIEZEN!<br />
Geen natriumazide toevoegen.<br />
4. AMIDOZWART KLEUROPLOSSING<br />
Bereiding<br />
De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed<br />
door de toename van de viscositeit of de hardwording.<br />
In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden:<br />
1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe.<br />
2. Sluit het flesje zorgvuldig.<br />
3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden.<br />
4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt.<br />
5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal.<br />
6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water.<br />
7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten.<br />
De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik.<br />
OPMERKING : Een onvolledige oplossing van de kleurstof zal een onvolledige kleuring van de albuminefractie opleveren (een laag percentage of een<br />
wit gat in de fractie).<br />
Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven,<br />
ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking.<br />
WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname.<br />
Toepassing<br />
Bij het kleuren van gels tijdens elektroforetische proteïneseparatie.<br />
BELANGRIJK : De kleuroplossing is ontwikkeld voor het kleuren van een maximum van 10 gels. Na het kleuren van 10 gels dient u de oplossing te<br />
vervangen.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping<br />
te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het<br />
label van de flesjes met kleuroplossing.<br />
De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel.<br />
De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren.<br />
5. APPLICATORS<br />
Gebruik<br />
Voorgesneden applicators, voor eenmalig gebruik, voor het aanbrengen van de monsters.<br />
Opslag<br />
De applicators op een droge plaats bij kamertemperatuur of gekoeld bewaren.<br />
6. FILTERPAPIER - DUN<br />
Gebruik<br />
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het absorberen van overtollige vloeistof van het oppervlak van de gel net voor het aanbrengen van<br />
de monsters.<br />
Opslag<br />
Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.<br />
BENODIGDE REAGENTIA<br />
1. ONTKLEURINGSOPLOSSING<br />
Voorbereiding<br />
Elk flesje ontkleuringsoplossing (SEBIA, prod. nr. 4<strong>54</strong>0, 10 flesjes, 100 ml elk) wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water.<br />
Het is praktisch om een verdunning van een klein deel van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 5 ml concentraat te verdunnen tot 5 liter, de<br />
inhoud van de tank voor de ontkleuringsoplossing. Na verdunning bevat de ontkleuringsoplossing: citroenzuur, 0,5 g/l.<br />
Gebruik<br />
Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleurstof van de gels.<br />
Voor het spoelen van het kleurcompartiment na de wasstap.<br />
Giet om de zuurgraad van de vlekkenoplosser te neutraliseren 15 mL van een 50 % Sodium Hydroxyde-oplossing in de lege afvalbak.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De concentraat-ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of<br />
de labels op de flesjes met ontkleuringsoplossing. NIET INVRIEZEN. De verdunde ontkleuringsoplossing is, in een afgesloten fles en bij<br />
kamertemperatuur, gedurende 1 maand stabiel. Geen natriumazide toevoegen.<br />
Verwijder de verdunde buffer zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Om te voorkomen dat micro-organismen zich kunnen verspreiden in de verdunde ontkleuringsoplossing wanneer deze langer dan een week bewaard<br />
moet worden, kunt u er 5 µL/dL ProClin 300 aan toevoegen.<br />
De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot<br />
aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing.<br />
2. HYDRASYS SPOELOPLOSSING<br />
Voorbereiding<br />
Ieder flesje geconcentreerde HYDRASYS Spoeloplossing (SEBIA, prod. nr. 4<strong>54</strong>1, 10 flesjes, 80 ml elk) wordt verdund tot 5 liter met gedestilleerd of<br />
gedeïoniseerd water.<br />
Na verdunning bevat de spoeloplossing: alkalische buffer, pH 8,8 ± 0,3 ; natriumazide.<br />
WAARSCHUWING: De geconcentreerde spoeloplossing bevat 0,625 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname<br />
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Bij verwijdering contact met zuren, lood of koper vermijden, aangezien deze<br />
explosieve of giftige verbindingen vormen met natriumazide, en spoelen met ruime hoeveelheden water.<br />
Gebruik<br />
Voor het spoelen van het HYDRASYS Kleuringscompartiment. Gebruik periodiek, d.w.z. als het instrument dagelijks wordt gebruikt, spoelt u het<br />
kleuringscompartiment wekelijks.<br />
Voor verdere instructies met betrekking tot het gebruik wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
De geconcentreerde oplossing en de verdunde oplossing in gesloten flessen bewaren, bij kamertemperatuur of gekoeld. De oplossingen blijven stabiel<br />
tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de kit of de labels op de flesjes met spoeloplossing. Ruim de verdunde spoeloplossing op zodra<br />
deze van aspect verandert, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben.<br />
3. FLUIDIL<br />
Voorbereiding<br />
Fluidil (SEBIA, prod. nr. 4587, 1 flesje, 5 ml) is gereed voor gebruik.<br />
Gebruik<br />
Voor de verdunning van viskeuze of troebele monsters, bijvoorbeeld sera die cryoglobuline of cryogel bevatten.<br />
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval<br />
Bewaren bij kamertemperatuur. Blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de labels op de flesjes met Fluidil.<br />
Het Fluidil moet vrij van neerslag zijn.<br />
BENODIGDE UITRUSTING EN ACCESSOIRES<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, prod. nr. 1210 of nr. 1211.<br />
2. Micro-pipet, voor handmatig dan wel automatisch gebruik, zoals bijvoorbeeld de HYDRAplus SEBIA, prod. nr. 1215, als extra keuzemogelijkheid<br />
voor het vullen van de monsterapplicators.<br />
3. Natte Opslagkamer, prod. nr. 1270, geleverd met HYDRASYS.<br />
4. Container Kit, geleverd met HYDRASYS.<br />
5. Pipetten: 10 µl en 200 µl.<br />
6. Densitometer / scanner in staat tot scannen van 82 x 102 mm gels bij 570 nm of met geel filter: HYRYS SEBIA of FORESE software voor de<br />
scanner met vlakke papier doorvoer. Voor gebruiks- en kalibratieprocedures wordt u verwezen naar de instructies van de fabrikant.<br />
MONSTERS VOOR ANALYSE<br />
Verzameling en opslag van monsters<br />
De aanbeveling geldt dat de analyse wordt uitgevoerd op verse monsters. Serum en urine dienen te worden verzameld volgens de vaste procedures<br />
die gelden voor het uitvoeren van testen in klinische laboratoria. Plaats de monsters zo snel mogelijk na verzameling in de koeling (bij 2 tot 8 °C), en<br />
laat ze daar maximaal gedurende één week staan. Voor langere opslagperioden kunt u de monsters invriezen (ze blijven dan ten minste een maand<br />
stabiel).<br />
Invriezing van sera met natriumazide, 0,2 g/l, komt de opslagstabiliteit ten goede.<br />
Invriezen urine met HEPES 0,1 M (pH 6,75) en natriumazide, 0,2 g/l bevordert de kwaliteit van de opslag.<br />
BELANGRIJK: Gebruik geen boorzuur als conserveermiddel.<br />
Ontdooide monsters kunnen lichte applicatiesporen vertonen vanwege denaturatie van de proteïne of de lipoproteïne. Opslag bij 2 tot 8 °C en invriezen<br />
veroorzaken een anodische verschuiving van de bèta-lipoproteïnen in serum uit de bèta-1-zone tot de alfa-2- of alfa-1-zones ; hoe ouder het serum,<br />
hoe groter de verschuiving.<br />
Voorbereiding van het monster<br />
1. Serummonsters<br />
Gebruik pure serummonsters. Nadat ze in de koeling zijn geplaatst bij 2 tot 8 °C of na invriezing kunnen sommige sera (met name die welke<br />
cryoglobuline of cryogel bevatten) stroperig worden of vertroebeling gaan vertonen. Dergelijke sera zouden problemen kunnen geven bij de<br />
applicatie door een belemmerde diffusie door de tandjes van de monsterapplicator. In dergelijke gevallen kunt u 25 µl Fluidil toevoegen aan 75 µl<br />
serum, en dit gedurende 15 seconden in de vortexmixer zetten. Volg daarna de standaard procedure.<br />
2. Geconcentreerde urinemonsters<br />
Wordt de analyse uitgevoerd op urinemonsters die geconcentreerd zijn tot 15 - 20 g/l (met een aangepast apparaat).<br />
BELANGRIJK: Sommige urinemonsters bevatten een hoge concentratie zout. Dit kan gel-deformatie veroorzaken tijdens de migratie en daardoor<br />
kunnen de migratieprofielen vertekend raken. Als door een dergelijke vertekening de interpretatie niet nauwkeurig is, dient de urine<br />
te wordengedialyseerd om de zouten te verwijderen.<br />
LET OP: Bij troebele urinemonsters (al dan niet geconcentreerd) wordt aanbevolen de hiervoor verantwoordelijke deeltjes te elimineren door<br />
middel van centrifugatie van de monsters (gedurende 10 minuten bij 3000 toeren per minuut) dan wel door middel van filtratie (op een filter<br />
van 0,45 µm) teneinde een goede verspreiding te realiseren op de applicators.<br />
- 24 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Te vermijden monsters<br />
• Gebruik geen gehemolyseerde serummonsters. Hemolyse zorgt voor een verhoging in alfa-2- en bèta-zones.<br />
• Vermijd het gebruik van plasmamonsters. Fibrinogeen geeft een band te zien dicht bij het applicatiepunt, die per abuis zou kunnen worden<br />
aangezien voor een monoclonale immunoglobuline, waardoor een vertekening zou ontstaan van het percentage van de bijbehorende b-zone.<br />
• Vermijd het gebruik van oude of onder verkeerde omstandigheden bewaarde urinemonsters waarbij zich enzymatische degradatie van de proteïnen<br />
zou kunnen voordoen.<br />
PROCEDURE<br />
Het HYDRASYS systeem is een semi-automatisch multiparameter-instrument. Tot de geautomatiseerde stappen behoort bewerking van <strong>HYDRAGEL</strong><br />
agarose-gels in de volgende volgorde: applicatie van het monster, elektroforetische migratie, drogen, kleuren, ontkleuren en een laatste droogfase.<br />
Tot de handmatige stappen behoren: het voorbereiden van de monsters en de gel, en het in werking stellen van het instrument.<br />
LEES HET HYDRASYS-INSTRUCTIEHANDBOEK NAUWKEURIG.<br />
I. MIGRATIE<br />
1. Schakel het HYDRASYS instrument in.<br />
2. Plaats drie applicators vlak op het tafelblad, met de genummerde applicatieholtes naar boven gericht (Fig. 1).<br />
- Breng 10 µl puur serummonster of geconcentreerde urine aan in iedere holte. Vul alle applicators binnen 2 minuten.<br />
- Plaats de applicators in twee natte opslagkamers, met de strips omhoog. Manipuleer deze aan het plastic beschermframe van de strips.<br />
Laat de monsters gedurende 5 minuten, na de applicatie van het laatste monster, in de strips trekken.<br />
Voor gebruik op een later tijdstip (maximaal 8 uur), dient de gehele kamers in de koeling gezet te worden.<br />
Voor instructies met betrekking tot het gebruik van de natte opslagkamer wordt u verwezen naar de instructies die bij dit apparaat meegeleverd<br />
worden.<br />
3. Open het deksel van de Migratiemodule en til de dragers van de elektroden en de applicators op.<br />
WAARSCHUWING: Sluit het deksel niet als de dragers nog omhoog staan!<br />
4. Selecteer het «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» migratieprogramma uit het menu op het instrument (linkerzijde van het bedieningspaneel).<br />
5. Neem de gebufferde strips uit de verpakking ; manipuleer deze aan de plastic uiteinden. Druk de geperforeerde uiteinden van de plastic<br />
achterzijde van de strips over de pinnen op de elektrodedrager ; de plastic achterzijde van de strip moet in de richting van de drager<br />
liggen (Fig. 2).<br />
6. Pak de <strong>HYDRAGEL</strong> agarose-gel uit.<br />
- Rol een dun filter voorzichtig en gelijkmatig over het oppervlak om zo het teveel aan vloeistof te absorberen. Verwijder het filterpapier direct.<br />
WAARSCHUWING : Laat het filtreerpapier niet te lang in contact met de gel om dehydratatie van de gel te vermijden.<br />
- Giet 200 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het migratieframe dat afgedrukt is op de temperatuurcontroleplaat van de<br />
migratiemodule.<br />
- Plaats de gelplaat (met de gelzijde omhoog) met de rand tegen de begrenzer aan de onderzijde van het afgedrukte frame (Fig. 2).<br />
- Buig de gel en breng deze naar beneden in het water (Fig. 3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingesloten, dat het water zich<br />
onder de gehele gelplaat verspreidt (Fig. 3) en dat de gel parallel met het afgedrukte frame ligt.<br />
7. Breng beide dragers omlaag. In deze positie raken de gebufferde strips de gel niet. FORCEER DE DRAGERS NIET HELEMAAL NAAR<br />
BENEDEN.<br />
8. Haal iedere applicator uit de natte opslagkamer. Manipuleer deze aan het plastic beschermframe.<br />
- Klik het beschermframe los van de tanden van de applicators.<br />
- Plaats de applicators respectievelijk in positie nr. 2, 6 en nr. 10.<br />
BELANGRIJK: De nummers die op de applicators zijn geprint moeten door de bediener gelezen kunnen worden (Fig. 4).<br />
9. Sluit het deksel van de migratiemodule.<br />
10. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de «START»-knop (groene pijl aan de linkerzijde van het bedieningspaneel).<br />
BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de ventilatieopening aan de rechterzijde van het instrument niet geblokkeerd is.<br />
MIGRATIE - BESCHRIJVING VAN DE AUTOMATISCHE STAPPEN<br />
• De beide dragers worden omlaag gebracht zodat de gebufferde strips en applicators in contact komen met de gel.<br />
• De drager van de monsterapplicator komt omhoog.<br />
• Migratie wordt uitgevoerd bij een constante stroom van 20 W, bij een temperatuur van 20 °C, gecontroleerd door het Peltier-effect, tot 24 Vh is<br />
opgebouwd (gedurende ongeveer 5 minuten).<br />
• De elektrodedrager komt omhoog zodat de elektroden uitgeschakeld worden.<br />
• De temperatuur van de controleplaat stijgt naar 65 °C, en de gel wordt gedurende 10 minuten gedroogd.<br />
• De controleplaat wordt afgekoeld ; als deze een temperatuur van 50 °C bereikt klinkt er een piepsignaal dat aangeeft dat het deksel van de module<br />
ontsloten wordt. De plaat behoudt deze temperatuur (50 °C) totdat het deksel geopend wordt. Na opening blijft de temperatuur afnemen tot<br />
deze 20 °C bereikt (in minder dan 5 minuten), waarna een nieuwe migratiecyclus kan beginnen.<br />
OPMERKING: Gedurende alle migratiestappen blijft het deksel van de migratiemodule vergrendeld.<br />
II. VOORBEREIDING VAN DE GELVERWERKINGSFASEN<br />
1. Open het deksel van de migratiemodule.<br />
2. Verwijder de monsterapplicators en doe deze weg.<br />
3. Breng beide dragers omhoog, verwijder de gebufferde strips aan hun plastic uiteinden en doe deze weg.<br />
4. Neem de gedroogde gelfilm eruit voor verdere bewerking.<br />
5. Maak de elektroden schoon met een vochtig doekje.<br />
6. Plaats de gel op de gelhouder, met de gelzijde naar de bediener gericht (Fig. 5). Ga daarbij als volgt te werk:<br />
- Open de gelhouder.<br />
- Leg deze vlak op het rooster.<br />
- Plaats de gedroogde gel (met de gelkant naar boven gericht) in de spleten van de beide stangen.<br />
- Sluit de houder.<br />
- Zorg ervoor dat de film op de juiste wijze in de houder geplaatst is (Fig. 5).<br />
- 25 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
7. Plaats de gelhouder in de gelverwerkings- / kleuringsmodule.<br />
BELANGRIJK: Voordat met het gelverwerkings-/kleuringsprogramma kan worden begonnen, moet het volgende gecontroleerd worden:<br />
- de kleuringscontainer is gevuld met 300 ml kleuringsoplossing ;<br />
- de ontkleuringscontainer bevat ten minste 1 liter ontkleuringsoplossing ;<br />
- de afvalcontainer is leeg.<br />
Voor de aansluiting van reagent lines: U wordt verwezen naar de informatie op het scherm op het instrument (keuzetoets: REAGENT LINES).<br />
BELANGRIJK: Vergeet niet de ongebruikte lijnen te blokkeren.<br />
8. Selecteer het «PROT./B1-B2/Hb» kleuringsprogramma uit het menu op het instrument. Stel de procedure in werking door het indrukken van<br />
de «START»-knop (groene pijl op de rechterzijde van het bedieningspaneel).<br />
Gedurende de kleur-, ontkleur- en droogstappen blijft het compartiment gesloten.<br />
Na de koelstap geeft een audiosignaal aan dat het compartiment ontsloten wordt (de ventilatie wordt doorgezet totdat de gelhouder<br />
verwijderd is).<br />
III. AFRONDING VAN DE GELVERWERKING<br />
1. Verwijder de gelhouder uit het compartiment ; open de gelhouder en haal de gedroogde gel eruit.<br />
LET OP: Na het kleuren of ontkleuren van gels en voorafgaand aan densitometrie of scannen, kunt u een extra spoelfase van de gel toevoegen<br />
om de achtergrond nog duidelijker te maken en eventueel resterende kleurstof in de vorm van blauwe vlekjes, te verwijderen. Spoel de gel<br />
met behulp van het ‘WASH ISOENZ/GEL’-programma.<br />
2. Indien nodig kunt u de achterzijde van de gel (plastic steun) met een vochtig doekje schoonmaken.<br />
3. Scan de droge gel met een densitometer / scanner met een geel filter of bij 570 nm.<br />
NOOT: Voor de gels met verschilende rijen (2 of 3) kunnen de migratielengtes aanzienlijk verschillen, zonder de resultaten te beïnvloeden.<br />
RESULTATEN<br />
Kwaliteitscontrole<br />
Het wordt aanbevolen een controleserum (Controleserum, SEBIA prod. nr. 4785) toe te voegen aan elke serie monsters.<br />
Waarden<br />
Scannen met de densitometer bij 570 nm van gekleurde elektroforegrammen levert de relatieve concentraties (percentages) van de afzonderlijke<br />
proteïnenzones op.Normale waarden (gemiddeld ± 2 SD) voor de afzonderlijke proteïnenzones in <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels zijn vastgesteld<br />
op basis van een gezonde populatie van 158 volwassenen (mannen en vrouwen).<br />
De proteïnekwantificering in UV op CAPILLARYS produceert waarden vergelijkbaar met die verkregen via de nefelometrische procedure (in het<br />
bijzonder bij albumine). SEBIA stelt daarom een standaardisatie van de waarden, zoals verkregen op <strong>HYDRAGEL</strong>, voor na kalibrering van de<br />
scanningsystemen.<br />
Zonder standaardisatie van waarden Met standaardisatie van waarden op CAPILLARYS FRACTIE HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumine 59,8 - 72,4 % 53,8 - 65,2 % Alfa-1 globulinen 1,0 - 3,2 % 1,1 - 3,7 % Alfa-2 globulinen 7,4 - 12,6 % 8,5 - 14,5 % Bèta globulinen 7,5 - 12,9 % 8,6 - 14,8 %<br />
| Gamma globulinen | 8,0 - 15,8 % | 9,2 - 18,2 % |<br />
Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen normaalwaarden vaststelt.<br />
Interpretatie 1-16<br />
Voor aanwijzingen voor de interpretatie van elektroforegrammen van serum- en urineproteïne, zie BIBLIOGRAFIE.<br />
Troubleshooting<br />
Bel de technische dienst van de leverancier als de test mislukt terwijl u de instructies voor voorbereiding en opslag van materialen, en voor de<br />
procedure, nauwkeurig hebt gevolgd.<br />
De veiligheidsbladen behorend bij de reagentia in de Kit als ook informatie over de verwerking van afval of restproducten kunt u verkrijgen bij de<br />
Technische Dienst van de leverancier.<br />
Interferentie en begrenzingen<br />
Zie MONSTERS TER ANALYSE.<br />
Met het oog op de resolutie- en gevoeligheidsbeperkingen van zone-elektroforese is het mogelijk dat niet alle monoclonale componenten met deze<br />
methode volledig worden gedetecteerd.<br />
UITSLAGEN<br />
Serum analyse<br />
Reproduceerbaarheid binnen een serie<br />
Drie (3) verschillende serummonsters werden elk in <strong>54</strong> tracks op 2 verschillende lotnummers <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels geanalyseerd.<br />
De gemiddelden, SD en CV (n = <strong>54</strong>) werden voor elk serum, elke zone en elk lotnummer berekend (scanner).<br />
- 26 -
De hierna volgende tabel toont het bereik van de waarden van de twee lotnummers die voor monster nr. 1 werden getest.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
ZONE GEMIDDELDE (%) SD CV (%) Lotnummer 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 68,9 70,2 70,7 0,66 0,91 0,97 1,0 1,3 1,4 Alfa-1 2,1 1,8 1,7 0,17 0,16 0,14 7,9 8,8 8,3 Alfa-2 9,4 9,1 9,0 0,23 0,30 0,34 2,4 3,3 3,7 Bèta 9,1 9,1 9,1 0,26 0,25 0,35 2,9 2,7 3,8<br />
| Gamma | 10,5 9,7 9,5 | 0,48 0,45 0,50 | 4,6 4,6 5,2 |<br />
De hierna volgende tabel toont het bereik van de waarden van de twee lotnummers die voor monster nr. 2 werden getest.<br />
ZONE GEMIDDELDE (%) SD CV (%) Lotnummer 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 59,6 61,5 60,2 0,67 1,08 1,13 1,1 1,8 1,9 Alfa-1 5,2 4,9 5,0 0,23 0,24 0,22 4,5 5,0 4,3 Alfa-2 14,8 14,8 14,8 0,26 0,27 0,30 1,8 1,8 2,0 Bèta 13,6 13,3 14,0 0,30 0,33 0,41 2,2 2,5 3,0<br />
| Gamma | 6,8 5,5 6,1 | 0,37 0,56 0,56 | 5,5 10,1 9,2 |<br />
De hierna volgende tabel toont het bereik van de waarden van de twee lotnummers die voor monster nr. 3 werden getest.<br />
ZONE GEMIDDELDE (%) SD CV (%) Lotnummer 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumine 53,8 <strong>54</strong>,1 55,2 0,58 0,76 0,80 1,1 1,4 1,4 Alfa-1 2,5 2,3 2,2 0,12 0,13 0,17 5,0 5,6 7,7 Alfa-2 8,0 7,9 7,8 0,21 0,16 0,29 2,6 2,1 3,7 Bèta 9,7 9,9 9,4 0,21 0,21 0,23 2,2 2,2 2,5<br />
| Gamma | 26,1 25,8 25,3 | 0,35 0,47 0,40 | 1,4 1,8 1,6 |<br />
Reproduceerbaarheid binnen een serie<br />
18 verschillende serummonsters werden elk, gedurende 12 opeenvolgende <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels van 3 verschillende lotnummers getest.<br />
De gemiddelden CV, SD en CV (n = 12) werden voor elk serummonster en elke zone berekend (scanner).<br />
De resultaten waren voor alle monsters goeddeels hetzelfde. De hierna volgende tabel laat het bereik zien van SD en CV die alle monsters<br />
vertegenwoordigen, en een gemiddelde CV waarde berekend uit de verzamelde CV's van alle monsters (n = 18).<br />
FRACTIE SD CV (%) GEM. CV (%) Albumine 0,9 - 1,3 1,6 - 2,1 1,8 Alfa-1 0,2 - 0,3 5,3 - 12,3 8,4 Alfa-2 0,2 - 0,3 1,9 - 3,7 2,8 Bèta 0,3 - 0,4 3,0 - 3,3 3,2<br />
| Gamma | 0,5 - 0,7 | 2,0 - 11,9 | 6,7 |<br />
Nauwkeurigheid<br />
102 verschillende monsters (pathologische en normale sera) werden elk getest op <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels en <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
15/30 gels. De correlatie-parameters berekend van de individuele zones van de verzamelde data voor <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels versus een<br />
vergelijkbaar gelsysteem (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - HYRYS) waren:<br />
FRACTIE Correlatie-coëfficiënt y-Intercept Gradiënt Bereik van % waarden van gebruikte monsters* Albumine 0,994 0,640 1,000 35,4 - 74,3 Alfa-1 0,994 -0,070 1,078 1,1 - 10,5 Alfa-2 0,992 -0,030 0,983 5,4 - 21,4 Bèta 0,985 0,320 0,958 5,0 - 16,5<br />
| Gamma | 0,996 | 0,050 | 0,966 | 6,6 - 52,5 |<br />
De correlatie-parameters berekend van de individuele zones van de verzamelde data voor <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels versus een vergelijkbaar<br />
gelsysteem (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - Scanner) waren:<br />
FRACTIE Correlatie-coëfficiënt y-Intercept Gradiënt Bereik van % waarden van gebruikte monsters* Albumine 0,964 3,407 0,973 34,5 - 74,1 Alfa-1 0,980 0,030 0,994 1,2 - 9,4 Alfa-2 0,972 0,070 0,949 5,3 - 19,8 Bèta 0,961 0,904 0,874 5,0 - 15,6<br />
| Gamma | 0,988 | 0,411 | 0,968 | 5,9 - 53,6 |<br />
* De % waarden zoals bepaald met het <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) systeem.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Gevoeligheid<br />
Drie pathologisch serummonsters met iedere een monoclonale proteïne werd in serie verdund, en op de verdunningen werd elektroforese uitgevoerd<br />
op <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) gels en op <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 gels. Na visuele controle van de afzonderlijke gels was de hoogste<br />
verdunning met een waarneembare monoclonale band tussen de 0,35 en 0,13 g/l. De laagste gemeten concentratie van monoclonale proteïne was<br />
derhalve 0,13 g/l.<br />
LET OP: Afhankelijk van de positie van de monoclonale band en de polyclonale achtergrond van de gammaglobulinenzone kan de<br />
detecteringsdrempel van een paraproteïne variëren.<br />
Geconcentreerde urineanalyse<br />
De resultaten die werden verkregen met <strong>HYDRAGEL</strong> gels laten een zeer goede reproduceerbaarheid zien, zowel binnen als tussen runs met<br />
geconcentreerde urinemonsters, na kwantitatieve en kwalitatieve analyse. Achtentwintig (28) verschillende monsters (van pathologische en normale<br />
urine) werden op de <strong>HYDRAGEL</strong> gels en op een andere commercieel beschikbaar agarose gelsysteem aangebracht. Er waren geen visueel<br />
herkenbare verschillen tussen de beide systemen. De gevoeligheid van de detectie werd afgeleid uit de hoogste seriële oplossingen van een<br />
monoklonaal urine proteïne dat een nog te onderscheiden band liet zien bij een verdunning van 0.48 g/L.<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
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(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
- 28 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
UTILIZZO<br />
Il kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) é stato progettato per la separazione delle proteine del siero umano e delle urine, mediante elettroforesi su gel di<br />
agarosio tamponato in mezzo alcalino (pH 9.2). Lo scopo è di separare le proteine normali del siero umano nelle cinque frazioni principali. I kits sono<br />
usati in combinazione con il sistema semi-automatico HYDRASYS.<br />
Le proteine separate, sono colorate con amidoschwarz. Gli elettroforegrammi possono essere valutati visivamente per l’interpretazione dei quadri<br />
anormali. La densitometria fornisce un’accurata quantificazione relativa delle singole zone.<br />
Ogni gel di agarosio permette di processare <strong>54</strong> campioni.<br />
Per uso diagnostico in vitro.<br />
PRINCIPIO DEL METODO 1-16<br />
L’elettroforesi delle proteine è una tecnica diffusissima, comunemente usata nei laboratori clinici per la ricerca nel siero ed in altri fluidi biologici di<br />
alterazioni proteiche. Tale tecnica è basata sul principio della elettroforesi zonale effettuata su di un adatto mezzo di supporto. L’agarosio è stato reso<br />
un versatile ed efficace mezzo di supporto. Per le applicazioni diagnostiche, le sieroproteine vengono separate, principalmente in base alla loro carica<br />
elettrica netta ad un determinato pH, nelle cinque frazioni principali: albumina, alfa-1 globuline, alfa-2 globuline, beta globuline e gamma globuline.<br />
Ogni zona contiene una o più sieroproteine. I quadri delle proteine urinarie assomigliano a quelli del siero. Comunque, l’intensità relativa delle frazioni<br />
o la loro presenza può variare fortemente in funzione della capacità di filtrazione dei reni.<br />
REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEI KIT <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
COMPONENTI PN 4145 PN 4260* Gels di Agarosio (pronti all’uso) 10 gels 80 gels Strisce tamponate (pronte all’uso) 10 confezioni da 2 80 confezioni da 2 Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 flacone da 60 ml 8 flaconi da 60 ml Colorante amidoschwarz (soluzione concentrata) 1 flacone da 20 ml 8 flaconi da 20 ml Applicatori (pronti all’uso) 3 confezioni da 10 (18 dentini) 24 confezioni da 10 (18 dentini)<br />
| Cartine da filtro sottili | 1 confezione da 10 | 8 confezioni da 10 |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
PER RISULTATI OTTIMALI<br />
I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit.<br />
LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO.<br />
1. GELS DI AGAROSIO<br />
Preparazione<br />
I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 8 g/l ; tampone tris-barbital pH 9.2 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle<br />
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.<br />
AVVERTENZA: I gels di agarosio contengono 0.31 % di barbital e 0.34 % di barbital sodico. Non ingerire! Se ingerito consultare<br />
immediatamente un medico !<br />
Utilizzo<br />
Mezzo di supporto per elettroforesi proteiche.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare i gels orizzontalmente nella confezione originale protettiva a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono stabili<br />
fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). Evitare<br />
la conservazione nelle seguenti condizioni : in prossimità di fenestre ; in prossimità di sorgenti di calore ; in presenza di brusche e/o significative<br />
variazioni di temperatura. NON CONGELARE.<br />
Non utilizzare il gel quando: (i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe<br />
conseguenze del congelamento del gel) (ii) sono presenti muffe o flora batterica o (iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità<br />
anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni di conservazione improprie).<br />
2. STRISCE TAMPONATE<br />
Preparazione<br />
Le strisce di spugna tamponate sono pronte all’uso. Ogni striscia contiene: tampone tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; sodio azide ; additivi, non rischiosi alle<br />
concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.<br />
AVVERTENZA: Il tampone nelle strisce contiene 0.92 % di barbital, 1.03 % di barbital sodico e 0.30 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerite<br />
consultare immediatamente un medico! Quando smaltite, evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono originare composti<br />
esplosivi o tossici con la sodio azide.<br />
Utilizzo<br />
Le strisce di spugna tamponate funzionano da riserva di tampone per l’elettroforesi ed assicurano il contatto tra il gel e gli elettrodi.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare le strisce tamponate orizzontalmente nella loro confezione protettiva, a temperatura ambiente o in frigorifero. (La freccia sulla scatola del<br />
kit deve essere rivolta verso l’alto).<br />
Le strisce sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta della confezione delle strisce.<br />
NON CONGELARE.<br />
Non utilizzare le strisce se la confezione è aperta e le strisce sono asciutte.<br />
- 29 -<br />
FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE<br />
Preparazione<br />
Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ".<br />
Contiene una soluzione acida.<br />
Utilizzo<br />
Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola<br />
del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE.<br />
Non aggiungere sodio azide.<br />
4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ<br />
Preparazione<br />
Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del<br />
suo potere colorante siano minimamente alterati.<br />
Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo.<br />
1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato.<br />
2. Chiudere accuratamente il flacone.<br />
3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi.<br />
4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.<br />
5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario.<br />
6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.<br />
7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata.<br />
8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti.<br />
Il colorante è pronto all’uso.<br />
NOTA : Una risospensione incompleta del colorante può causare una cattiva colorazione della frazione albumina (percentaule bassa di albumina o<br />
svuotamento al centro della frazione).<br />
Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi<br />
alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali.<br />
AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione.<br />
Utilizzo<br />
Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine.<br />
IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire<br />
l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante.<br />
Il colorante diluito è stabile 1 mese.<br />
Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore.<br />
5. APPLICATORI<br />
Utilizzo<br />
Applicatori monouso, pretagliati, per l’applicazione dei campioni.<br />
Conservazione<br />
Conservare gli applicatori lontano dall’umidità a temperatura ambiente o in frigorifero.<br />
6. CARTINE DA FILTRO<br />
Utilizzo<br />
Cartine sottili monouso, pretagliate, per l’eliminazione dell’eccesso di liquido dalla superficie del gel prima dell’applicazione dei campioni.<br />
Conservazione<br />
Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.<br />
REAGENTI RICHIESTI<br />
1. SOLUZIONE DECOLORANTE<br />
Preparazione<br />
Ogni flacone di soluzione decolorante concentrata (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>0, 10 flaconi da 100 ml ciascuno) deve essere diluito a 100 litri con acqua<br />
deionizzata o distillata. Per convenienza diluire solo 5 ml di soluzione concentrata a 5 litri, ossia al volume della tanica della soluzione decolorante.<br />
Dopo la diluizione la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.5 g/l.<br />
Utilizzo<br />
Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel.<br />
Per il risciacquo del compartimento di colorazione dopo la fase di lavaggio.<br />
Per neutralizzare l’acidità della soluzione decolorante versare, nella tanica vuota dei liquidi reflui, 15 mL di una soluzione al 50 % di Idrossido di Sodio.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza<br />
indicata sulla scatola del kit o sulla etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente<br />
in flacone chiuso. Non aggiungere sodio azide.<br />
Gettare la soluzione decolorante diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.<br />
Per prevenire le proliferazioni microbiche nella soluzione decolorante diluita, da conservare oltre una settimana, aggiungere 5 µL/dL di ProClin 300.<br />
La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data<br />
di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante.<br />
- 30 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. SOLUZIONE DI LAVAGGIO HYDRASYS<br />
Preparazione<br />
Ogni flacone di Soluzione di Lavaggio concentrata HYDRASYS (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>1, 10 flaconi da 80 ml ciascuno) deve essere diluito a 5 litri con acqua<br />
distillata o deionizzata. Dopo la diluizione la soluzione di lavaggio contiene: tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; sodio azide.<br />
AVVERTENZA: La soluzione di lavaggio concentrata contiene 0.625 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerita consultare immediatamente<br />
un medico! La sodio azide può portare alla formazione di composti tossici o esplosivi se posta a contatto con acidi, piombo o rame. Quando<br />
smaltita, fare scorrere un’abbondante quantità di acqua.<br />
Utilizzo<br />
Serve per lavare il compartimento di colorazione di HYDRASYS. Usare periodicamente ; per esempio, se lo strumento è usato giornalmente, lavare<br />
il compartimento di colorazione settimanalmente.<br />
Consultare l’inserto nella confezione per la procedura di utilizzo.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare sia la soluzione lavaggio concentrata che quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero in contenitore chiuso. Entrambe le soluzioni<br />
sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone della soluzione di lavaggio.<br />
Gettare la soluzione di lavaggio diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche.<br />
3. FLUIDIL<br />
Preparazione<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 5 ml) è pronto all’uso.<br />
Utilizzo<br />
Per diluire campioni viscosi o torbidi, per esempio, sieri contenenti crioglobuline o criogel.<br />
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento<br />
Conservare a temperatura ambiente. Fluidil è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone.<br />
Fluidil deve essere privo di precipitato.<br />
APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI<br />
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN 1210 o PN 1211.<br />
2. Dispensatore manuale, o in alternativa, per il caricamento degli applicatori dei campioni, campionatore automatico HYDRAplus SEBIA , PN 1215.<br />
3. Camera umida, PN 1270, fornita con HYDRASYS.<br />
4. Kit di taniche fornito con HYDRASYS.<br />
5. Pipette: 10 µl e 200 µl.<br />
6. Densitometro / scanner in grado di effettuare la scansione di gels 82 x 102 mm a 570 nm o con filtro giallo: HYRYS SEBIA o programma PHORESIS<br />
per Scanner a piano fisso. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per le procedure di lavoro e di calibrazione.<br />
CAMPIONI PER L’ANALISI<br />
Raccolta e conservazione del campione<br />
Per l’analisi sono raccomandati campioni freschi. I sieri e le urine devono essere prelevati seguendo le procedure convenzionali per i tests clinici di<br />
laboratorio. Refrigerare i campioni (2 - 8 °C) subito dopo il prelievo fino ad una settimana. Per periodi di conservazioni più lunghi, mantenere i campioni<br />
congelati (stabili almeno 1 mese).<br />
I sieri congelati con aggiunta di sodio azide, 0.2 g/l migliorano la stabilita’ di conservazione.<br />
I urine congelati con HEPES 0.1 M (pH 6.75) e sodio azide, 0.2 g/l si migliora la conservazione.<br />
IMPORTANTE: Non usare acido borico come conservante.<br />
I campioni scongelati possono dare luogo a leggeri segni nel punto di applicazione causati dalla denaturazione delle proteine o delle lipoproteine. La<br />
conservazione a 2 - 8 °C ed il congelamento causano, nel siero, lo spostamento anodico delle beta-lipoproteine dalla zona beta-1 alle zone alfa-1 o<br />
alfa-2 ; più vecchio è il siero, maggiore è tale spostamento.<br />
Preparazione del campione<br />
1. Sieri<br />
Utilizzare campioni di siero non diluiti. Dopo refrigerazione a 2 - 8 °C o congelamento, alcuni sieri (in particolare quelli contenenti crioglobuline o<br />
criogel), possono diventare viscosi o torbidi. Tali sieri possono presentare problemi di applicazione dovuti alla impedita diffusione nei dentini<br />
dell’applicatore. In tali casi, aggiungere 25 µl di Fluidil a 75 µl di campione ed agitare per 15 secondi. Seguire quindi la procedura standard.<br />
2. Urine concentrate<br />
L’analisi viene svolta con campione concentrato fino a 15 - 20 g/l (con idoneo mezzo).<br />
IMPORTANTE: Alcune urine hanno un alto contenuto di sali. Questo puo` produrre una deformazione del gel durante la migrazione e, quindi,<br />
distorsione del profilo elettroforetico. Per evitare questo problema e` necessario eliminare i sali con una dialisi.<br />
NOTA: La diffusione nei dentini degli applicatori di campioni di urina (intera o concentrata) torbidi, può essere ostacolata. Si raccomanda di<br />
rimuovere il particolato centrifugando i campioni (es., 10 minuti a 3000 rpm) o per filtrazione (es., filtri da siringa 0.45 µm).<br />
Campioni da evitare<br />
• Non utilizzare campioni di siero emolizzati. L’emolisi causa un aumento delle zone alfa-2 e beta.<br />
• Evitare campioni di plasma. Il fibrinogeno dà luogo ad una banda vicino al punto di applicazione che può essere scambiata per una immunoglobulina<br />
monoclonale ed alterare la quantificazione percentuale della zona beta corrispondente.<br />
• Evitare campioni di urina vecchi o conservati impropriamente nei quali può intervenire la degradazione enzimatica delle proteine.<br />
PROCEDURA<br />
Il sistema HYDRASYS è uno strumento semi-automatico multiparametrico. Le fasi automatiche includono il trattamento dei gels di agarosio<br />
<strong>HYDRAGEL</strong>, nella seguente sequenza: applicazione del campione, migrazione elettroforetica, essiccazione, colorazione, decolorazione ed<br />
essiccazione finale. Le fasi manuali includono la manipolazione dei campioni e dei gels e la preparazione dello strumento per l’uso.<br />
LEGGERE ATTENTAMENTE IL MANUALE DI ISTRUZIONE HYDRASYS.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
I. MIGRAZIONE<br />
1. Accendere lo strumento HYDRASYS.<br />
2. Posizionare tre applicatori su di una superficie piana con i numeri dei pozzetti correttamente orientati verso l’alto (Fig. 1).<br />
- Applicare in ogni pozzetto 10 µl di siero intero o di urina concentrata. Caricare ciascun applicatore entro 2 minuti.<br />
- Inserire ciascum applicatore nelle camere umida di conservazione con i dentini rivolti verso l’alto (maneggiare i depositori mediante la<br />
cornice protettiva in plastica). Lasciare che i campioni diffondano nei dentini per 5 minuti dall’applicazione dell’ultimo campione. Mantenere<br />
le camere così preparata in frigorifero se si intende usare gli applicatori più tardi (fino ad 8 ore).<br />
Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli.<br />
3. Aprire lo sportello del modulo di migrazione ed alzare le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori.<br />
AVVERTENZA: Non chiudere mai lo sportello se le cornici mobili sono alzate!<br />
4. Selezionare dal menù dello strumento (lato sinistro della tastiera) il programma di migrazione «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2»<br />
5. Estrarre le strisce tamponate dalla confezione ; maneggiarle mediante le estremità in plastica. Agganciare le estremità in plastica forate, sugli<br />
spinotti della cornice porta elettrodi ; le estremità in plastica della striscia devono essere rivolte verso la cornice mobile (Fig. 2).<br />
6. Estrarre il gel dalla confezione.<br />
- Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido dalla superficie del gel, facendo aderire sul gel una cartina da filtro sottile.<br />
AVVERTENZA: Non lasciare assolutamente la cartine da filtro in contatto prolungato con il gel in modo da evitare la sua disidratazione.<br />
- Dispensare sul terzo inferiore del riquadro stampato sulla Piastra di Controllo Temperatura del modulo di migrazione 200 µl di acqua distillata<br />
o deionizzata.<br />
- Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 3).<br />
- Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia di acqua (Fig. 3). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere<br />
uniformemente stratificata al di sotto della lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato.<br />
7. Abbassare entrambe le cornici mobili. In questa posizione le strisce tamponate non toccano il gel. NON FORZARE LE CORNICI MOBILI AD<br />
ABBASSARSI ULTERIORMENTE.<br />
8. Estrarre ciascum applicatore dalle camere di umidificazione. Maneggiare gli applicatori mediante la cornice di protezione.<br />
- Staccare la cornice di protezione dei dentini dell’applicatore.<br />
- Inserire i tre applicatori rispettivamente in posizione No. 2, 6 e 10.<br />
IMPORTANTE: I numeri stampati sugli applicatori devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4).<br />
9. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione.<br />
10. Avviare la procedura immediatamente premendo la freccia verde «START» sul lato sinistro della tastiera.<br />
IMPORTANTE: Assicurarsi che la griglia di ventilazione sul lato destro dello strumento non sia ostruita.<br />
MIGRAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE<br />
• Le due cornici mobili vengono abbassate in modo che le strisce tamponate e gli applicatori entrino in contatto con il gel.<br />
• La cornice mobile porta applicatori si alza.<br />
• Ha luogo la migrazione in condizioni di potenza costante 20 W a 20 °C controllati mediante effetto Peltier, fino ad accumulare 24 Vh (per circa 5 minuti).<br />
• La cornice mobile porta elettrodi si alza interrompendo il contatto.<br />
• La temperatura della piastra sale fino a 65 °C, tale temperatura è mantenuta 10 minuti per essiccare il gel.<br />
• La piastra viene raffreddata ; quando raggiunge 50 °C un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione è stato sbloccato. La<br />
temperatura della piastra rimane a 50 °C finchè lo sportello non viene alzato.<br />
NOTA: Lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato durante tutte le fasi della migrazione<br />
II.TRATTAMENTO DEL GEL<br />
1. Aprire lo sportello.<br />
2. Rimuovere e gettare gli applicatori.<br />
3. Alzare entrambe le cornici mobili, togliere le strisce tamponate mediante le estremità in plastica e gettarle.<br />
4. Estrarre il gel essiccato pronto per le fasi successive.<br />
5. Dopo ogni utilizzo, pulire gli elettrodi e la Piastra di Controllo Temperatura con della carta soffice inumidita.<br />
6. Aprire il telaio porta gel. Metterlo in posizione piana ed inserire la lastrina (con il gel rivolto verso l’operatore) nelle scanalature delle due guide,<br />
quindi chiudere il telaio. Assicurarsi che il gel sia correttamente posizionato all’interno del telaio (Fig. 5).<br />
7. Inserire il telaio porta gel nel Modulo di trattamento/colorazione del gel.<br />
IMPORTANTE: Prima di avviare il programma di trattamento/colorazione del gel controllare che:<br />
- la tanica del colorante contenga 300 ml di soluzione colorante.<br />
- la tanica del decolorante contenga almeno 1 litro di soluzione decolorante.<br />
- la tanica dei liquidi reflui sia vuota.<br />
Per la connessione dei reagenti: riferirsi alle informazioni mostrate sul visore dello strumento (premere il tasto: VISUAL CANALI).<br />
IMPORTANTE: Non dimenticare di chiudere gli ingressi dei reagenti non utilizzati.<br />
8. Selezionare il programma di colorazione «PROT./B1-B2/Hb» dal menù dello strumento ed avviare la procedura premendo il tasto «START»<br />
(freccia verde sul lato destro dello strumento).<br />
Durante i cicli di colorazione, decolorazione e asciugatura, il compartimento rimane bloccato.<br />
Dopo il ciclo di raffreddamento, un segnale acustico indica che il compartimento è sbloccato (la ventilazione è mantenuta fino a quando il<br />
supporto del gel viene rimosso)<br />
III. COMPLETAMENTO DEL TRATTAMENTO DEL GEL<br />
1. Rimuovere il telaio porta gel dal compartimento ; aprirlo e rimuovere il gel essiccato.<br />
NOTA: Se dopo la fase di colorazione/decolorazione sul gel sono visibili macchie blu residuali, una fase addizionale di lavaggio con il<br />
programma "LAV. ISOENZ/GEL", prima della lettura densitometrica, permette di eliminarle o di attenuarle fortemente.<br />
2. Se necessario pulire il retro della lastrina essiccata (la faccia con la plastica di supporto) con una carta soffice inumidita.<br />
3. Effettuare la scansione usando un densitometro / scanner a 570 nm o con filtro giallo.<br />
NOTA : Le lunghezze di migrazione dei gels con 2 o 3 righe analitiche possono essere sensibilmente differenti, senza alcuna conseguenza sui<br />
risultati.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
RISULTATI<br />
Controllo Qualità<br />
Si consiglia di includere, in ogni gruppo di campioni processati, un siero di controllo (Siero di Controllo, SEBIA PN 4785).<br />
Valori<br />
La lettura densitometrica (a 570 nm) del protidogramma fornisce le concentrazioni relative (percentuali) delle singole zone proteiche.<br />
I valori normali (media ± 2 DS) per le principali frazioni elettroforetiche sieroproteiche su <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E), sono stati determinati su una<br />
popolazione sana di 158 adulti (uomini e donne).<br />
La quantificazione delle proteine con gli UV su CAPILLARYS da’ dei valori simili alla nefelometria (in particolare per l’albumina). SEBIA propone<br />
dunque una standardizzazione dei valori ottenuti su <strong>HYDRAGEL</strong> effettuando una calibrazione dei sistemi di lettura.<br />
Valori senza standardizzazione Valori standardizzati su CAPILLARYS FRAZIONE HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumina 59.8 - 72.4 % 53.8 - 65.2 % Alfa-1 globuline 1.0 - 3.2 % 1.1 - 3.7 % Alfa-2 globuline 7.4 - 12.6 % 8.5 - 14.5 % Beta globuline 7.5 - 12.9 % 8.6 - 14.8 %<br />
| Gamma globuline | 8.0 - 15.8 % | 9.2 - 18.2 % |<br />
Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori normali.<br />
Interpretazione 1-16<br />
Per un aiuto nell’interpretazione degli elettroforegrammi delle sieroproteine o delle urine concentrate, vedi BIBLIOGRAFIA.<br />
Interferenze e limitazioni<br />
Vedi CAMPIONI PER L’ANALISI.<br />
Per i limiti di risoluzione e sensibilità dell’elettroforesi zonale, è possibile che alcune componenti monoclonali possano non essere rilevate con questo<br />
metodo.<br />
Eliminazione errori<br />
Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e<br />
conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche.<br />
Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica<br />
SEBIA.<br />
DATI SULLE PRESTAZIONI<br />
Analisi del siero<br />
Riproducibilità nella serie<br />
Tre (32) differenti campioni di siero sono stati processati ciascuno in <strong>54</strong> piste su gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) di 3 lotti testati. Le medie, DS e CV<br />
(n = <strong>54</strong>) sono stati calcolati per ciascun campione di siero, ciascuna frazione e ciascun lotto (scanner).<br />
La seguente tabella mostra gli intervalli relativi al campione di siero No. 1 e ai tre lotti provati.<br />
FRAZIONE MEDIA (%) DS CV % Lotto 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 Alfa-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 Alfa-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 Beta 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8<br />
| Gamma | 10.5 9.7 9.5 | 0.48 0.45 0.50 | 4.6 4.6 5.2 |<br />
La seguente tabella mostra gli intervalli relativi al campione di siero No. 2 e ai tre lotti provati.<br />
FRAZIONE MEDIA (%) DS CV % Lotto 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 Alfa-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 Alfa-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 Beta 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0<br />
| Gamma | 6.8 5.5 6.1 | 0.37 0.56 0.56 | 5.5 10.1 9.2 |<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
La seguente tabella mostra gli intervalli relativi al campione di siero No. 3 e ai tre lotti provati.<br />
FRAZIONE MEDIA (%) DS CV % Lotto 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 53.8 <strong>54</strong>.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 Alfa-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 Alfa-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 Beta 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5<br />
| Gamma | 26.1 25.8 25.3 | 0.35 0.47 0.40 | 1.4 1.8 1.6 |<br />
Riproducibilità tra serie<br />
Diciotto (18) diversi campioni di siero sono stati processati per 12 gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E). Le medie, DS e CV (n = 12) sono state calcolate<br />
per ogni campione di siero e per ciascuna frazione. I risultati sono essenzialmente gli stessi per tutti i campioni (scanner).<br />
La seguente tabella mostra gli intervalli di DS e CV relativi a tutti i campioni e il CV medio calcolato dai CV aggregati di tutti i campioni (n = 18).<br />
FRAZIONE CV (%) MEDIA CV (%) Albumina 0.9 - 1.3 1.6 - 2.1 1.8 Alfa-1 0.2 - 0.3 5.3 - 12.3 8.4 Alfa-2 0.2 - 0.3 1.9 - 3.7 2.8 Beta 0.3 - 0.4 3.0 - 3.3 3.2<br />
| Gamma | 0.5 - 0.7 | 2.0 - 11.9 | 6.7 |<br />
Accuratezza<br />
Cento due (102) diversi campioni (sieri patologici e normali) sono stati processati sui gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) e sui gels <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30<br />
I parametri di correlazione, calcolati dai dati aggregati delle singole zone, per i gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) vs il gel di comparazione<br />
(y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)), sono riportati nella tabella (HYRYS):<br />
FRAZIONE Coefficiente di y-Intercetta Pendenza Variazioni % correlazione dei campioni utilizzati* Albumina 0.994 0.640 1.000 35.4 - 74.3 Alfa-1 0.994 -0.070 1.078 1.1 - 10.5 Alfa-2 0.992 -0.030 0.983 5.4 - 21.4 Beta 0.985 0.320 0.958 5.0 - 16.5<br />
| Gamma | 0.996 | 0.050 | 0.966 | 6.6 - 52.5 |<br />
I parametri di correlazione, calcolati dai dati aggregati delle singole zone, per i gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) vs il gel di comparazione<br />
(y–<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)), sono riportati nella tabella (scanner):<br />
FRAZIONE Coefficiente di y-Intercetta Pendenza Variazioni % correlazione dei campioni utilizzati* Albumina 0.964 3.407 0.973 34.5 - 74.1 Alfa-1 0.980 0.030 0.994 1.2 - 9.4 Alfa-2 0.972 0.070 0.949 5.3 - 19.8 Beta 0.961 0.904 0.874 5.0 - 15.6<br />
| Gamma | 0.988 | 0.411 | 0.968 | 5.9 - 53.6 |<br />
* I valori % sono stati determinati con il sistema <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E).<br />
Sensibilità<br />
Tre campioni di siero patologico, con una componente monoclonale, è stato diluito scalarmente e le diluizioni sono state fatte migrare sui gels<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) e sui gels <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Dopo l’ispezione visiva dei singoli gels, la diluizione più alta con una<br />
componente monoclonale distinguibile è compreso tra 0,35 e 0,13 g/l. Pertanto la più bassa concentrazione di proteina monoclonale evidenziata è di<br />
0.13 g/l.<br />
NOTA: In funzione della posizione della banda monoclonale e del fondo policlonale della zona delle gammaglobuline, il limite di rilevamento di una<br />
paraproteina può variare.<br />
Analisi di urine concentrate<br />
Dopo l’analisi qualitativa e quantitativa dei campioni di urina concentrati, i risultati ottenuti con i gels <strong>HYDRAGEL</strong>, indicano una riproducibilità molto<br />
buona nella serie e tra serie. Ventotto (28) diversi campioni (urine normali e patologiche) sono stati processati su gels <strong>HYDRAGEL</strong> e su un diverso<br />
sistema su gels di agarosio reperibile in commercio. Tra i due sistemi non sono state rilevate differenze visibili. La sensibilità di rilevamento è stata<br />
determinata dalla più alta diluizione scalare di una proteina urinaria monoclonale in grado di fornire una banda distinguibile a 0,48 g/L.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
BIBLIOGRAFIA<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
ESPECIFICACIONES DE USO<br />
El kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) está diseóados para la separación de las proteínas del suero y orina humanas mediante electroforesis en geles<br />
de agarosa alcalinos (pH 9.2). Las proteínas del suero humano normal se separan en cinco fracciones principales adrede. Los kits se utilizan junto<br />
con el instrumento semiautomático HYDRASYS. Las proteínas separadas se tiñen con negro amido. Las separaciones electroforéticas son evaluadas<br />
visualmente para la detección de anormalidades en el patrón de migración. La densitometría proporciona una cuantificación relativa exacta de las<br />
fracciones individuales.<br />
Cada gel de agarosa está diseñado para analizar <strong>54</strong> muestras.<br />
Para Uso Diagnóstico In Vitro.<br />
PRINCIPIO DEL TEST 1-16<br />
La electroforesis de proteínas es una técnica arraigada que se utiliza rutinariamente en los laboratorios clÌnicos para investigar la presencia de<br />
anormalidades proteicas en el suero y en otros fluidos corporales. Está basada en los principios de la electroforesis de zona realizada en un medio<br />
de soporte adecuado. La agarosa se ha convertido en un medio de soporte versátil y efectivo. Para aplicaciones diagnósticas de rutina, las proteínas<br />
séricas se separan en cinco fracciones principales, de acuerdo con su carga a un pH dado: albúmina, alfa-1 globulinas, alfa-2 globulinas, beta<br />
globulinas y gamma globulinas. Cada fracción contiene una o más proteínas séricas. Los patrones proteicos de la orina se parecen a los del suero.<br />
Sin embargo, las intensidades relativas de las fracciones o su presencia pueden variar enormemente en función de la capacidad de filtración del riñón.<br />
REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN EL KIT <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
ARTÍCULO PN 4145 PN 4260* Geles de agarosa (listos para su uso) 10 geles 80 geles Esponjas tamponadas (listas para su uso) 10 bolsas de 2 80 bolsas de 2 Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 frasco, 60 ml 8 frascos, 60 ml Colorante Negro Amido (solución stock) 1 frasco, 20 ml 8 frascos, 20 ml Aplicadores (listos para su uso) 3 cajas de 10 (18 peine) 24 cajas de 10 (18 peine)<br />
| Papeles de filtro | 1 bolsa de 10 | 8 bolsas de 10 |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS<br />
Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas.<br />
LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES.<br />
1. GELES DE AGAROSA<br />
Preparación<br />
Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 8 g/l ; tampón tris-barbital pH 9.2 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un resultado óptimo.<br />
ATENCIÓN: Los geles de agarosa contienen barbital 0.31 % y barbital sódico 0.34 %. ¡No ingerir! ¡En caso de ingestión accidental, consultar<br />
inmediatamente al médico !<br />
Uso<br />
Medio de soporte para la electroforesis de proteínas.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C). Son<br />
estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores. (La flecha situada en la cara frontal de la caja del<br />
kit debe apuntar hacia arriba). Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evitar variaciones importantes de<br />
temperatura durante su almacenamiento. NO CONGELAR.<br />
Desechar cuando: (i) haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel) ; (ii)<br />
se observe crecimiento bacteriano o fúngico ; o (iii) se videncie una cantidad excesiva de líquido en el recipiente del gel (consecuencia de la exudación<br />
del tampón debida a un almacenamiento inadecuado).<br />
2. ESPONJAS TAMPONADAS<br />
Preparación<br />
Las esponjas tamponadas están listas para su uso. Contienen: tampón tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; azida sódica ; aditivos, inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.<br />
ATENCIÓN: El tampon de las esponjas contiene barbital 0.92 %, barbital sódico 1.03 % y azida sódica 0.30 %. ¡No ingerir! ¡En caso de<br />
ingestión accidental, consultar inmediatamente al médico! Al desechar, evitar el contacto con ácidos, plomo o cobre, ya que se conoce su<br />
tendencia a formar compuestos explosivos con la azida sódica.<br />
Uso<br />
Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio de tampón de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera.<br />
Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora (la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba).<br />
Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora. NO LAS CONGELE.<br />
Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa está abierta o si las esponjas están secas.<br />
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INSTRUCCIONES SEBIA - Español
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. DILUYENTE DEL COLORANTE<br />
Preparación<br />
El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el párrafo "COLORANTE NEGRO AMIDO". Contiene una solución<br />
ácida.<br />
Uso<br />
Para la preparación del colorante negro amido.<br />
Conservación, estabilidad y señales de deterioro<br />
El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada<br />
en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente. NO LO CONGELE.<br />
No le añada azida sódica.<br />
4. COLORANTE NEGRO AMIDO<br />
Preparación<br />
El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución<br />
final y su capacidad de coloración.<br />
Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación :<br />
1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado.<br />
2. Cierre el vial con cuidado.<br />
3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos.<br />
4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración.<br />
5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario.<br />
6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración.<br />
7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.<br />
8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos.<br />
El colorante está listo para usar.<br />
NOTA : Una reconstitución incompleta del colorante puede implicar una mala coloración de la fracción albúmina (disminución de su porcentaje o<br />
aparición de un agujero blanco en el centro de la fracción).<br />
Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las<br />
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.<br />
ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión.<br />
Uso<br />
Para la coloración de los geles después de la separación electroforética de las proteínas.<br />
IMPORTANTE: El colorante está destinado para colorear sólo 10 geles. Cambie el colorante después de 10 usos.<br />
Conservación, estabilidad y señales de deterioro<br />
Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera, en contenedores cerrados para evitar<br />
la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante.<br />
La solución diluida es estable durante 1 mes.<br />
No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor.<br />
5. APLICADORES<br />
Uso<br />
Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicación de la muestra.<br />
Almacenamiento<br />
Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados.<br />
6. PAPELES DE FILTRO<br />
Uso<br />
Papeles finos absorbentes precortados, de un solo uso, para secar el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de la muestra.<br />
Conservación<br />
Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.<br />
REACTIVOS NECESARIOS<br />
1. SOLUCIÓN DECOLORANTE<br />
Preparación<br />
Cada vial de Solución Decolorante stock (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>0, 10 viales de 100 ml) se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es<br />
conveniente diluir sólo 5 ml de la solución stock hasta 5 litros, volumen del contenedor de la solución decolorante. Después de la dilución, la solución<br />
decolorante de trabajo contiene: ácido cítrico, 0.5 g/l.<br />
Uso<br />
Para la destinción, ésto es, la eliminación del exceso de tinción y la coloración de fondo de los geles.<br />
Para el lavado del compartimento de coloración.<br />
Para neutralizar la acidez del decolorante, introduzca dentro del contenedor de desechos vacío 15 ml de sosa al 50 % (solución comercial).<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar la solución decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada. La solución stock de decolorante es estable hasta la fecha de<br />
caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial. NO CONGELAR. La solución decolorante de trabajo es estable una semana a<br />
temperatura ambiente en un contenedor cerrado. No añadir azida sódica.<br />
Desechar la solución decolorante de trabajo si cambia su apariencia, p. ej., si se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.<br />
Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µL/dL de<br />
ProClin 300.<br />
El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de<br />
caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. SOLUCIÓN DE LAVADO HYDRASYS<br />
Preparación<br />
Cada vial de la Solución stock de lavado HYDRASYS (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>1, 10 viales de 80 ml) se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada.<br />
Después de la dilución, la solución de trabajo de lavado contiene: tampón alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; azida sódica.<br />
ATENCIÓN: La solución stock de lavado contiene azida sódica 0.625 %. ¡No ingerir! ¡En caso de ingestión accidental, consultar<br />
inmediatamente al médico! Cuando sea posible, evitar el contacto con ácidos, plomo o cobre, ya que se conoce su tendencia a formar<br />
compuestos explosivos con la azida sódica. Lavar siempre con gran cantidad de agua al desechar.<br />
Uso<br />
Sirve para limpiar el Compartimento de Tinción del HYDRASYS. Usar periódicamente, p. ej., si el instrumento se usa a diario, lavar el compartimento<br />
de tinción semanalmente.<br />
Ver la hoja de instrucciones para las indicaciones de uso.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar ambas soluciones de lavado, stock y de trabajo, a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados. La solución stock de<br />
lavado es estable hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial.<br />
Desechar la solución de trabajo de lavado si cambia su apariencia, p. ej., si se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.<br />
3. FLUIDIL<br />
Preparación<br />
El Fluidil (SEBIA, PN 4587, 5 ml) está listo para su uso.<br />
Uso<br />
Para diluir muestras turbias o viscosas, p. ej., sueros que contienen crioglobulinas o criogeles.<br />
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro<br />
Almacenar a temperatura ambiente. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial de Fluidil.<br />
El Fluidil debe mostrar ausencia de precipitados.<br />
EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS<br />
1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN 1210 o PN 1211.<br />
2. Micropipeteador, manual o automatico, como el HYDRAplus SEBIA, PN 1215, para cargar los aplicadores de muestra de una forma alternativa.<br />
3. Cámara húmeda, PN 1270, suministrada con el HYDRASYS.<br />
4. Kit de Contenedores suministrado con el HYDRASYS.<br />
5. Pipetas: 10 µl y 200 µl.<br />
6. Densitómetro / escáner capaz de leer geles de 82 x 102 mm a 570 nm o con un filtro amarillo, p. ej., HYRYS SEBIA o el programa PHORESIS<br />
para escáner de sobremesa. Consultar las indicaciones del fabricante para los procedimientos de operación y calibración.<br />
MUESTRAS PARA ANALISIS<br />
Extracción y almacenamiento de las muestras<br />
Se recomienda analizar muestras frescas. El suero y la orina deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en los<br />
laboratorios clínicos. Refrigere las muestras (2 a 8 °C) tan pronto como sea posible después de su obtención, durante una semana. Para períodos<br />
de almacenamiento más prolongados, almacene las muestras congeladas (son estables durante un mes al menos).<br />
Congelar los sueros con azida sódica, 0.2 g/l, mejora la estabilidad del almacenaje.<br />
Congelar orina con HEPES 0.1 M (pH 6.75) y azida sódica, 0.2 g/l, mejora la estabilidad del almacenaje.<br />
IMPORTANTE: No utilizar ácido bórico como conservante.<br />
Las muestras descongeladas pueden dar lugar a ligeras marcas de aplicación debidas a la desnaturalización de proteínas o lipoproteínas. El<br />
almacenamiento entre 2 y 8 °C y la congelación causan un desplazamiento anódico de las beta-lipoproteínas del suero, desde la fracción beta-1 hasta<br />
las fracciones alfa-2 o alfa-1 ; cuanto más antiguo sea el suero mayor será el desplazamiento.<br />
Preparación de las muestras<br />
1. Suero<br />
Use muestras de suero no diluidas. Al almacenarlos entre 2 y 8 °C o congelarlos, algunos sueros, especialmente aquellos que contengan<br />
crioglobulinas o criogeles, pueden volverse viscosos o desarrollar turbidez. Tales sueros podrían presentar problemas de aplicación debidos a la<br />
difusión dificultada a través de los dientes del aplicador de muestras. En tal caso, añada 25 µl de Fluidil a 75 µl de suero y agite la mezcla en el<br />
vórtex durante 15 segundos. Siga entonces con el procedimiento habitual.<br />
2. Orinas concentradas<br />
El análisis se lleva a cabo con orinas concentradas hasta 15 - 20 g/l (con un mecanismo adaptado).<br />
IMPORTANTE: Algunas orinas presentan un alto contenido de sales. Esto puede provocar que el gel se deforme durante la migración y, por lo<br />
tanto, distorsión de los perfiles electroforéticos. Para evitar este problema es necesario eliminar las sales con una diálisis.<br />
NOTA : En caso de orinas turbias (concentradas o no), se recomienda eliminar las partículas, centrifugando las muestras (durante 10 minutos a<br />
3000 rpm) o por filtración (en un filtro de 0,45 µm) para obtener una buena difusión en los aplicadores.<br />
Muestras a descartar<br />
• No utilice muestras de suero hemolizadas. La hemólisis incrementa las fracciones alfa-2 y beta.<br />
• No utilice muestras de plasma. El fibrinógeno da lugar a una banda cerca del punto de aplicación que puede ser confundida con una<br />
inmunoglobulina monoclonal y afectaría al porcentaje de la fracción beta correspondiente.<br />
• No utilice muestras de orina muy antiguas o almacenadas incorrectamente en las que pueda haber tenido lugar degradación enzimática de las<br />
proteínas.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
PROCEDIMIENTO<br />
El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautomático multiparamétrico. Las etapas automáticas incluyen el procesamiento de los geles de<br />
agarosa <strong>HYDRAGEL</strong> en la siguiente secuencia: aplicación de la muestra, migración electroforética, secado, tinción, decoloración y secado final. Las<br />
etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles, y la puesta en marcha del instrumento para la operación.<br />
LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS.<br />
I. PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACIÓN<br />
1. Encender el HYDRASYS.<br />
2. Colocar tres aplicadores en una superficie plana con los números de los pocillos en la cara superior (Fig. 1).<br />
- Aplique 10 µl de muestra de suero sin diluir o de orina concentrada en cada pocillo. Cargue cada aplicador en menos de 2 minutos.<br />
- Colocar los aplicadores en dos cámaras húmedas con el peine hacia arriba [asirlos por el plástico protector del peine]. Dejar difundir las<br />
muestras a través de los papeles del peine durante 5 minutos, después de la aplicación de la última muestra. Para uso posterior (hasta<br />
8 horas), guardar todo el conjunto en refrigeración.<br />
Ver la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles.<br />
3. Abrir la puerta del Módulo de migración y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador.<br />
ATENCIÓN: ¡Nunca cerrar la puerta cuando los soportes están elevados!<br />
4. Seleccionar el programa de migración «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» en el menú del instrumento (mitad izquierda del teclado).<br />
5. Extraer las esponjas tamponadas de su envoltorio ; asirlas por los extremos de plástico. Engarzar los extremos de plástico agujereados con<br />
las puntas metálicas del soporte de los electrodos ; los extremos de plástico deben quedar encarados al soporte (Fig. 2).<br />
6. Abrir el contenedor del <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel<br />
inmediatamente.<br />
ADVERTENCIA: No deje que el papel de filtro contacte demasiado rato con el gel para evitar que se deshidrate.<br />
- Dispensar 200 µl de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Superficie de Control de Temperatura<br />
del módulo de migración.<br />
- Colocar el gel (la cara de agarosa hacia arriba) con su lado inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado (Fig. 3).<br />
- Aplicar el gel en la superficie, haciéndolo contactar con el agua (Fig. 3). Asegurarse que no queden burbujas, que el agua esté extendida<br />
bajo toda la superficie del gel y que éste esté alineado con el marco serigrafiado.<br />
7. Devolver ambos soportes a su posición original. En esta posición, las esponjas tamponadas no deben tocar el gel. NO FORZAR LOS<br />
SOPORTES HACIA ABAJO.<br />
8. Extraer los aplicadores dos cámaras húmedas. Asirlos por el plástico protector.<br />
- Romper el plástico protector precortado del peine.<br />
- Colocar los dos aplicadores en las posiciones No 2, 6 y 10.<br />
IMPORTANTE: Los números impresos en los aplicadores deben quedar de cara al usuario (Fig. 4).<br />
9. Cerrar la puerta del módulo de migración.<br />
10. Iniciar el procedimiento inmediatamente, presionando la tecla «START» (flecha verde)en el lado izquierdo del teclado.<br />
IMPORTANTE: Asegurarse que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no está bloqueada.<br />
MIGRACIÓN - DESCRIPCIÓN DE LAS ETAPAS AUTOMÁTICAS<br />
• Los dos soportes descienden, con lo cual esponjas tamponadas y aplicadores entran en contacto con la superficie del gel.<br />
• El soporte del aplicador se eleva.<br />
• La migración se realiza a una corriente constante de 20 W a una temperatura controlada por efecto Peltier de 20 °C, con un acumulado de 24 Vh<br />
(para 5 minutos).<br />
• El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos.<br />
• La temperatura de la Superficie de Control de Temperatura se eleva a 65 °C durante 10 minutos para el secado del gel.<br />
• La Superficie de Control de Temperatura se enfría ; cuando alcanza los 50 °C, un pitido audible indica que la puerta del módulo de migración queda<br />
desbloqueada. La temperatura permanece a 50 °C hasta que se abre la puerta. Luego, la temperatura desciende hasta los 20 °C (en menos de<br />
5 minutos) después de lo cual puede iniciarse una nueva migración.<br />
NOTA: La puerta del módulo de migración permanece bloqueada durante todas las etapas de la migración.<br />
II. PUESTA EN MARCHA DEL PROCESADO DEL GEL<br />
1. Abrir la puerta del módulo de migración.<br />
2. Extraer los aplicadores y desechar.<br />
3. Elevar ambos soportes, extraer las esponjas tamponadas por sus extremos de plástico y desechar.<br />
4. Extraer el gel seco para el procesamiento posterior.<br />
5. Después de cada uso, limpiar los electrodos y la Superficie de Control de Temperatura con un pañuelo de papel suave humedecido.<br />
6. Extraer el Soporte del Gel. Dejarlo en una superficie plana y encajar el gel seco (con la superficie de agarosa de cara arriba) en las muescas<br />
de los dos cilindros. Cerrar el Soporte del Gel. Asegurarse que el gel está posicionado correctamente en su soporte (Fig. 5).<br />
7. Colocar el soporte del gel en el Módulo de Tinción y Procesamiento.<br />
IMPORTANTE: Antes de iniciar el programa de tinción y procesado del gel, comprobar lo siguiente:<br />
- el contenedor de colorante contiene 300 ml de solución de tinción ;<br />
- el contenedor de decolorante contiene al menos 1 litro de solución decolorante ;<br />
- el contenedor de desechos está vacío.<br />
Para conocer en qué posiciones conectar los reactivos : consultar la información que aparece en la pantalla del instrumento (seleccionar la<br />
tecla : VER CANALES).<br />
IMPORTANTE: No olvidar bloquear los canales no utilizados.<br />
8. Seleccionar el programa de tinción «PROT./B1-B2/Hb» en el menú del instrumento e iniciar el ciclo presionando la tecla «START» (flecha<br />
verde de la parte derecha del teclado).<br />
Durante todas las secuencias de coloración, decoloración y secado, el sistema permanece bloqueado.<br />
Después del enfriamiento de la cubeta, una señal sonora (bip) suena y el sistema se desbloquea (la ventilación se mantiene hasta la<br />
recuperación del porta-films).<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
III. FINALIZACIÓN DEL PROCESADO DEL GEL<br />
1. Extraer el Soporte del Gel de su compartimento, abrirlo y extraer el gel seco.<br />
NOTA : Si se observan manchas azules residuales en los geles después de la coloración / decoloración, una etapa de lavado suplementario<br />
con el programa "LAV. ISOENZ/GEL" permite eliminarlas o atenuarlas (según su intensidad) antes de su lectura en densitómetro o escáner.<br />
2. Si es necesario, limpiar la superficie trasera (la cara del soporte plástico) de del gel seco con un paño suave humedecido.<br />
3. Realizar la densitometría / escáner a 570 nm o con un filtro amarillo.<br />
NOTA: En los geles con varias filas de muestras (2 ó 3), las longitudes de migración pueden ser ligeramente diferentes, sin ninguna repercusión<br />
en los resultados.<br />
RESULTADOS<br />
Control de calidad<br />
Se aconseja incluir un suero control valorado (Suero Control, SEBIA PN 4785) en cada análisis de muestras.<br />
Valores<br />
El barrido densitométrico (a 570 nm) de los geles teñidos proporciona las concentraciones relativas (porcentajes) de las fracciones individuales de<br />
proteína.<br />
Los valores normales (media ± 2 SD) para las fracciones electroforéticas principales de proteínas séricas en los geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
han sido establecidos a partir de una población sana de 158 adultos (hombres y mujeres).<br />
La cuantificación de las proteínas en UV en el CAPILLARYS proporciona valores similares a los de la nefelometría (en especial para la albúmina).<br />
SEBIA propone una estandarización de los valores obtenidos en <strong>HYDRAGEL</strong> realizando una calibración de los sistemas de lectura.<br />
Valores sin estandarización Valores estandarizados en el CAPILLARYS FRACCIÓN HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albúmina 59.8 - 72.4 % 53.8 - 65.2 % Alfa-1 globulinas 1.0 - 3.2 % 1.1 - 3.7 % Alfa-2 globulinas 7.4 - 12.6 % 8.5 - 14.5 % Beta globulinas 7.5 - 12.9 % 8.6 - 14.8 %<br />
| Gamma globulinas | 8.0 - 15.8 % | 9.2 - 18.2 % |<br />
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de normalidad.<br />
Interpretación 1-16<br />
Para consultas sobre la interpretación de las separaciones electroforéticas de proteínas séricas y urinarias, vea la BIBLIOGRAFÍA.<br />
Interferencias y limitaciones<br />
Vea MUESTRAS PARA ANILISIS.<br />
Teniendo en cuenta los principios analíticos de las técnicas actuales (principios de la electroforesis de zona, resolución y sensibilidad), no puede darse<br />
ninguna garantía respecto a la detección de la totalidad de todos los componente monoclonales.<br />
Resolución de problemas<br />
Avisar al Servicio de Atención Técnica del distribuidor cuando el test no funcione, pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la<br />
preparación y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir.<br />
Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles<br />
en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor.<br />
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS<br />
Análisis de suero<br />
Reproducibilidad intra-ensayo<br />
Tres (3) muestras diferentes de suero fueron analizadas, cada una, en <strong>54</strong> carriles de un gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) de cada uno de los 3 lotes<br />
evaluados. Las medias, SD y CV (n = <strong>54</strong>) se calcularon para cada muestra de suero, cada fracción y cada lote (scanner).<br />
La tabla siguiente muestra los rangos correspondientes para la muestra de suero N° 1 y los tres lotes evaluados.<br />
FRACCIÓN MEDIA (%) SD CV % Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albúmina 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 Alfa-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 Alfa-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 Beta 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8<br />
| Gamma | 10.5 9.7 9.5 | 0.48 0.45 0.50 | 4.6 4.6 5.2 |<br />
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La tabla siguiente muestra los rangos correspondientes para la muestra de suero N° 2 y los tres lotes evaluados.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRACCIÓN MEDIA (%) SD CV % Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albúmina 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 Alfa-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 Alfa-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 Beta 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0<br />
| Gamma | 6.8 5.5 6.1 | 0.37 0.56 0.56 | 5.5 10.1 9.2 |<br />
La tabla siguiente muestra los rangos correspondientes para la muestra de suero N° 3 y los tres lotes evaluados.<br />
FRACCIÓN MEDIA (%) SD CV % Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albúmina 53.8 <strong>54</strong>.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 Alfa-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 Alfa-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 Beta 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5<br />
| Gamma | 26.1 25.8 25.3 | 0.35 0.47 0.40 | 1.4 1.8 1.6 |<br />
Reproducibilidad inter-ensayo<br />
Dieciocho (18) muestras diferentes de suero fueron analizadas durante 12 geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) de cada uno de los 3 lotes evaluados.<br />
Las medias, SD y CV (n = 12) se calcularon para cada muestra de suero y cada fracción (scanner).<br />
Los resultados fueron prácticamente los mismos para todas las muestras. La tabla siguiente muestra los rangos de SD y CV de las muestras<br />
analizadas y el CV medio, calculado a partir de los CV de todas las muestras (n = 18).<br />
FRACCIÓN SD CV (%) CV MEDIO (%) Albúmina 0.9 - 1.3 1.6 - 2.1 1.8 Alfa-1 0.2 - 0.3 5.3 - 12.3 8.4 Alfa-2 0.2 - 0.3 1.9 - 3.7 2.8 Beta 0.3 - 0.4 3.0 - 3.3 3.2<br />
| Gamma | 0.5 - 0.7 | 2.0 - 11.9 | 6.7 |<br />
Exactitud<br />
Ciento dos (102) muestras distintas (sueros patológicos y normales) se analizaron en geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) y en geles <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30.<br />
Los parámetros de correlación calculados para las fracciones individuales a partir de los datos obtenidos en los kits <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
frente a los otros sistemas comerciales (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) fueron (HYRYS):<br />
FRACCIÓN Coeficiente de Intersección eje y Pendiente Rango de valores % Correlación de las muestras usadas* Albúmina 0.994 0.640 1.000 35.4 - 74.3 Alfa-1 0.994 -0.070 1.078 1.1 - 10.5 Alfa-2 0.992 -0.030 0.983 5.4 - 21.4 Beta 0.985 0.320 0.958 5.0 - 16.5<br />
| Gamma | 0.996 | 0.050 | 0.966 | 6.6 - 52.5 |<br />
Los parámetros de correlación calculados para las fracciones individuales a partir de los datos obtenidos en los kits <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
frente a los otros sistemas comerciales (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) fueron (scanner):<br />
FRACCIÓN Coeficiente de Intersección eje y Pendiente Rango de valores % Correlación de las muestras usadas* Albúmina 0.964 3.407 0.973 34.5 - 74.1 Alfa-1 0.980 0.030 0.994 1.2 - 9.4 Alfa-2 0.972 0.070 0.949 5.3 - 19.8 Beta 0.961 0.904 0.874 5.0 - 15.6<br />
| Gamma | 0.988 | 0.411 | 0.968 | 5.9 - 53.6 |<br />
* Los valores de % son los determinados con el sistema <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E).<br />
Sensibilidad<br />
Tres muestras patológicas de suero con una proteína monoclonal se diluyó serialmente y las diluciones fueron analizadas con el<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) y con el <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Después de una inspección visual de los geles, la dilución más alta con una<br />
banda monoclonal discernible fue comprendido entre 0,35 y 0,13 g/l. Así, la concentración más baja detectada de una proteína monoclonal fue<br />
0.13 g/l.<br />
NOTA: El límite de detección puede variar en función de la posición de la banda monoclonal y el fondo policlonal de la fracción de las<br />
gammaglobulinas.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Análisis de orinas concentradas<br />
Los resultados obtenidos con los geles <strong>HYDRAGEL</strong> indican una muy buena reproducibilidad intra e interseriales para muestras de orina concentradas<br />
después de un análisis cuantitativo y cualitativo. Veintiocho (28) muestras distintas (orinas normales y patológicas) fueron analizadas en geles<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> y otro sistema comercial de geles de agarosa. No hubieron diferencias detectables visualmente entre los dos sistemas. La sensibilidad<br />
de detección se determinó a partir de la mayor dilución seriada de una proteína monoclonal urinaria, que proporcionó una banda distinguible a<br />
0.48 g/L.<br />
BIBLIOGRAFÍA<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
UTILIZAÇÃO<br />
O kit <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) destina-se à separação em meio alcalino (pH 9,2), das proteínas humanas no soro e urina em cinco fracções<br />
principais, por electroforese em geles de agarose no aparelho semi-automático HYDRASYS.<br />
O sistema HYDRASYS permite realizar todas as sequências até à obtenção do gel, pronto a analisar qualitativa e quantitativamente. As proteínas<br />
separadas são coradas com negro de amido e o excesso de corante eliminado em meio ácido. As electroforeses resultantes podem ser analisadas<br />
visualmente para determinar alterações do perfil ou ser avaliadas por densitómetria, o que dá uma quantificação relativa e precisa de cada zona<br />
individual.<br />
Cada gel de agarose poderá analisar <strong>54</strong> amostras.<br />
Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED.<br />
PRINCÍPIO DO TESTE 1-16<br />
A electroforese das proteínas séricas e de outros líquidos biológicos humanos é uma análise muito útil, usada em rotina nos laboratórios de análises<br />
clínicas, com vista à detecção de anomalias no perfil proteico. Baseia-se nos princípios da electroforese de zona executada num suporte adequado.<br />
A agarose tem sido utilizada por ser um meio de suporte versátil e eficaz. Para determinação em rotina as proteínas são separadas apenas em cinco<br />
fracções de mobilidade diferente, de acordo com a sua carga a um determinado pH: albumina, alfa-1 globulinas, alfa-2 globulinas, beta globulinas e<br />
gama globulinas. Cada zona contém uma ou mais proteínas do soro. Os perfis das proteínas na urina são semelhantes aos do soro. No entanto, as<br />
intensidades relativas das fracções ou a sua presença podem variar de acordo com a capacidade de filtração do rim.<br />
REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS NO KIT <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
ITEM REF. N° 4145 REF. N° 4260* Geles de agarose (prontos a usar) 10 geles 80 geles Tiras de tampão (prontas a usar) 10 pacotes de 2 80 pacotes de 2 Diluente da solução corante (solução concentrada) 1 frasco de 60 ml 8 frascos de 60 ml Corante negro de amido (solução concentrada) 1 frasco de 20 ml 8 frascos de 20 ml Aplicadores (prontos a usar) 3 caixa de 10 (18 dentes) 24 caixa de 10 (18 dentes)<br />
| Papéis de filtro finos | 1 pacote de 10 | 8 pacotes de 10 |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
PARA OPTIMIZAÇÃO DOS RESULTADOS<br />
Os elementos de um mesmo kit devem ser utilizados em conjunto, e de acordo com as instruções de utilização.<br />
LER ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO.<br />
1. GELES DE AGAROSE<br />
Preparação<br />
Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão tris-barbital pH 9,2 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas<br />
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: Os geles contêm 0,31 % de barbital e 0,34 % de barbital sódico. Não ingerir! Se ingerido, consultar imediatamente um médico!<br />
Utilização<br />
Suporte para electroforese das proteínas.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar os geles horizontalmente, na embalagem protectora de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 °C) ou no frigorífico (2 - 8 °C) (a seta<br />
existente na parte da frente da caixa do kit deve ficar voltada para cima). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit e nos rótulos<br />
das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de uma fonte de<br />
calor).<br />
NÃO CONGELAR!<br />
Deitar fora o gel quando:<br />
(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo for muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ;<br />
(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ;<br />
(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de<br />
armazenamento inadequadas).<br />
2. TIRAS DE TAMPÃO<br />
Preparação<br />
As tiras de esponja com tampão estão prontas a usar. Cada uma contém: tampão tris-barbital, pH 9,2 ± 0,3 ; azida de sódio ; aditivos, não perigosos<br />
nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: As tiras de tampão contêm 0,92 % de barbital, 1,03 % de barbital sódico e 0,30 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerido,<br />
consultar imediatamente um médico! A azida de sódio pode formar complexos explosivos ou tóxicos em caso de contacto com ácidos,<br />
chumbo, ou cobre.<br />
Utilização<br />
As tiras funcionam como reservatório do tampão usado na electroforese e asseguram o contacto entre o gel e os eléctrodos.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
As tiras de tampão podem ser conservadas à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C).<br />
As tiras de tampão devem ser conservadas horizontalmente dentro da embalagem protectora (a seta na parte da frente da caixa deve permanecer<br />
apontada para cima).<br />
As tiras são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou na embalagem protectora das tiras. NÃO CONGELAR.<br />
- 43 -<br />
INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. DILUENTE DA SOLUÇÃO CORANTE<br />
Preparação<br />
O diluente da solução corante deverá ser utilizado como está descrito no parágrafo " SOLUÇÃO CORANTE NEGRO DE AMIDO ".<br />
Contém uma solução ácida.<br />
Utilização<br />
Para a preparação das soluções de corante negro de amido.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. NÃO<br />
CONGELAR.<br />
Não adicionar azida de sódio.<br />
4. CORANTE NEGRO DE AMIDO<br />
Preparação<br />
O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final<br />
e o seu poder de coloração.<br />
Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte:<br />
1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado.<br />
2. Fechar cuidadosamente o frasco.<br />
3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos.<br />
4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração.<br />
5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes.<br />
6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração.<br />
7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada.<br />
8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos.<br />
A solução corante está pronta a utilizar.<br />
NOTA : Uma reconstituição incompleta do corante pode provocar uma má coloração da fracção de albumina (baixa da percentagem ou lacuna dentro<br />
da fracção).<br />
Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/l ; etilenoglicol, 6,7% ; aditivos, não perigosos nas<br />
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.<br />
AVISO: Nocivo em caso de ingestão.<br />
Utilização<br />
Para corar geles depois da electroforese das proteínas.<br />
IMPORTANTE : A solução corante é unicamente destinada à coloração de 10 geles. Recomenda-se a renovação da solução após as 10 utilizações.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a<br />
evaporação.<br />
A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos.<br />
A solução diluída de corante é estável por um mês.<br />
Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor.<br />
5. APLICADORES<br />
Utilização<br />
Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.<br />
6. PAPEL DE FILTRO FINO<br />
Utilização<br />
De utilização única, estes finos papéis absorventes destinam-se à absorção do excesso de líquido da superfície do gel antes da aplicação da amostra.<br />
Armanezamento<br />
Armazenar os papéis de filtro finos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.<br />
REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS<br />
1. SOLUÇÃO DESCORANTE<br />
Preparação<br />
Cada frasco de solução descorante concentrada (SEBIA, ref. n° 4<strong>54</strong>0, 10 frascos de 100 ml cada) deve ser diluída a 1/1000 com água destilada ou<br />
desionisada e permite obter 100 litros de solução total. É conveniente diluir apenas 5 ml da solução concentrada de cada vez, para o volume final de<br />
5 litros (a capacidade do recipiente onde se vai colocar a solução descorante). Após diluição, a solução descorante contem: ácido cítrico ; 0,5 g/l.<br />
Utilização<br />
Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel.<br />
No enxaguamento da câmara de coloração, após lavagem.<br />
Para neutralizar a acidez da solução descorante, adicionar ao frasco de despejo 15 ml de soda a 50 % (solução disponível no mercado).<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou<br />
nos rótulos dos frascos da solução descorante. NÃO CONGELAR. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente,<br />
quando conservada em recipiente fechado.<br />
Deitar fora a solução diluída se houver alterações no seu aspecto, por exemplo, se ficar turva devido a contaminação microbiana.<br />
Não adicionar azida de sódio.<br />
Em caso de conservação prolongada (mais de uma semana) da solução diluída, adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar a proliferação bacteriana.<br />
A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao<br />
fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante.<br />
- 44 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. SOLUÇÃO DE LAVAGEM HYDRASYS<br />
Preparação<br />
Cada frasco de solução de lavagem concentrada HYDRASYS (SEBIA, ref. n° 4<strong>54</strong>1, 10 frascos de 80 ml cada) deve ser diluído para a obtenção do<br />
volume final de 5 litros com água destilada ou desionisada.<br />
Após diluição, a solução de lavagem contém: tampão alcalino pH 8,8 ± 0,3 ; azida de sódio.<br />
AVISO: A solução de lavagem contém 0,625 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerida, consultar imediatamente um médico! Quando em<br />
contacto com ácidos, chumbo ou cobre a azida de sódio pode levar à formação de compostos explosivos ou tóxicos. Quando deitar fora,<br />
lavar abundantemente com grandes quantidades de água.<br />
Utilização<br />
Para a lavagem da câmara de coloração do HYDRASYS. Utilizar periodicamente. Por exemplo, se o aparelho for utilizado diariamente, fazer a<br />
lavagem da câmara de coloração uma vez por semana.<br />
Ver as instruções de utilização incluídas na embalagem.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar a solução concentrada e a solução diluída em recipientes fechados à temperatura ambiente ou no frigorífico. A solução concentrada é<br />
estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco da solução de lavagem.<br />
Deitar fora a solução de lavagem diluída se houver alterações no seu aspecto, por exemplo, se ficar turva devido a contaminação microbiana.<br />
3. FLUIDIL<br />
Preparação<br />
O Fluidil (SEBIA ref. n° 4587, 5 ml) vem pronto a ser usado.<br />
Utilização<br />
Destina-se a diluir amostras viscosas ou turvas, por exemplo, soro contendo uma crioglobulina ou um criogel.<br />
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração<br />
Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco de Fluidil.<br />
O Fluidil não deve conter quaisquer precipitados.<br />
EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS<br />
1. Sistema HYDRASYS, ref. n° 1210 ou ref. n° 1211.<br />
2. HYDRAplus SEBIA, ref. n° 1215, micropipetador, manual ou automático, como alternativa na pipetagem das amostras para os aplicadores<br />
respectivos.<br />
3. Câmara húmida, ref. n° 1270, fornecida com o HYDRASYS.<br />
4. Frascos de plástico fornecidos com o HYDRASYS.<br />
5. Pipetas: 10 µl e 200 µl.<br />
6. Densitómetro / scanner capaz de ler geles de 82 x 102 mm a 570 nm (filtro amarelo), por exemplo, HYRYS SEBIA, ou Scanner equipado do<br />
software PHORESIS SEBIA. Para a sua utilização e calibração seguir as instruções de cada aparelho.<br />
AMOSTRAS<br />
Colheita e conservação das amostras<br />
É recomendada a utilização de amostras frescas. Os soros e as urinas devem ser colhidos de acordo com os métodos utilizados nos laboratórios de<br />
análises clínicas.<br />
As amostras podem ser conservadas uma semana no frigorífico (2 - 8 °C). Para conservações prolongadas, congelar as amostras. As amostras<br />
congeladas são estáveis durante pelo menos um mês. O congelamento das urinas com azida de sódio a 0,2 g/l e HEPES 0,1 M (pH 6,75) e dos soros<br />
com azida de sódio a 0,2 g/l aumenta a estabilidade do armazenamento.<br />
IMPORTANTE: Não usar ácido bórico como conservante.<br />
As amostras descongeladas podem levar ao aparecimento de ligeiras bandas no ponto de aplicação, devido à desnaturação das proteínas ou<br />
lipoproteínas.<br />
Quanto mais velhas forem as amostras, mais as beta lipoproteínas são anódicas. Do mesmo modo, após congelamento, as beta lipoproteínas são<br />
muito mais anódicas do que no soro fresco: a sua migração varia da zona beta até às zonas alfa-2 ou alfa-1.<br />
Preparação das amostras<br />
1. Soro<br />
Utilizar directamente amostras de soro puras. Após conservação a 2 - 8 °C ou congelamento, alguns soros (especialmente os que contêm uma<br />
crioglobulina ou um criogel) podem tornar-se viscosos ou turvos. Estes soros podem apresentar problemas na aplicação porque difundem com<br />
muita dificuldade pelos dentes do aplicador de amostras. Neste caso, adicionar 25 µl de Fluidil a 75 µl de soro e agitar no vortex durante<br />
15 segundos. Depois, seguir a técnica normal.<br />
2. Urinas concentradas<br />
A urina deve ser concentrada até 15 - 20 g/l de proteínas totais (com um dispositivo adaptado).<br />
IMPORTANTE: Algumas urinas contêm um elevado teor em sais. Isso pode provocar uma deformação do gel durante a migração e,<br />
consequentemente, uma distorção do perfil electroforético. Para evitar este problema é necessário eliminar os sais por meio de<br />
diálise.<br />
NOTA: No caso de urinas turvas (concentradas ou não), recomenda-se a eliminação das partículas por centrifugação das amostras (durante<br />
10 minutos a 3000 rpm) ou por filtração (com filtro de 0,45 µm), de modo a obter uma boa difusão nos aplicadores.<br />
Amostras a evitar<br />
• Não utilizar amostras hemolisadas: a hemólise aumenta as zonas alfa-2 e beta.<br />
• Não utilizar amostras de plasma. O fibrinogénio leva ao aparecimento de uma banda perto do ponto de aplicação que pode ser confundida com<br />
uma gamapatia monoclonal e aumentar a percentagem da zona correspondente.<br />
• Evitar amostras de urina armazenadas à muito tempo ou mal armazenadas, uma vez que pode ocorrer a degradação enzimática das proteínas.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
TÉCNICA<br />
O sistema HYDRASYS é um aparelho semi-automático multi-paramétrico. Os passos automáticos incluem o tratamento dos geles de agarose<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> segundo as etapas seguintes: aplicação da amostra, migração electroforética, secagem, coloração, descoloração e secagem final. Os<br />
passos manuais são os seguintes: preparação das amostras e dos geles e lançamento das sequências automáticas.<br />
LER ATENTAMENTE O MANUAL DE INSTRUÇÕES DO HYDRASYS.<br />
I. PREPARAÇÃO DA MIGRAÇÃO<br />
1. Ligar o aparelho HYDRASYS.<br />
2. Colocar três aplicadores numa superfície plana com os números dos poços virados para cima (Fig. 1).<br />
- Aplicar 10 µl de soro puro ou urina concentrada em cada poço. A pipetagem das amostras em cada aplicador não deve ultrapassar o tempo<br />
de dois minutos.<br />
- Colocar os aplicadores em duas câmaras húmidas com os dentes voltados para cima. (Segure-o(s) pela protecção de plástico). Deixar as<br />
amostras difundirem-se pelos dentes durante cinco minutos após a aplicação da última amostra. Para uma conservação prolongada<br />
(8 horas no máximo), colocar as câmaras húmidas no frigorífico.<br />
Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes.<br />
3. Abrir a tampa da câmara de migração e levantar os suportes do aplicador e dos eléctrodos.<br />
AVISO: Nunca fechar a tampa quando os suportes estão levantados!<br />
4. Seleccionar o programa de migração "<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2" no menu apresentado pelo aparelho (lado esquerdo do teclado).<br />
5. Retirar as tiras de tampão da embalagem ; colocar as tiras de tampão sobre os eléctrodos fixando as extremidades de plástico perfuradas<br />
aos pinos do suporte dos eléctrodos. A face das tiras de tampão onde estão fixadas as partes de plástico fica em contacto com os eléctrodos<br />
(Fig. 2).<br />
6. Desempacotar a placa <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino.<br />
ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação.<br />
- Aplicar 200 µl de água destilada ou desionisada no terço inferior do quadro impresso na placa de migração.<br />
- Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso na placa de migração (Fig. 3).<br />
- Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 3) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura<br />
do gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal.<br />
7. Baixar os dois suportes. Nesta posição as tiras de tampão não tocam no gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA DOS SUPORTES MANUALMENTE.<br />
8. Retirar os aplicadores da câmara húmida. Segurá-los pela estrutura de protecção plástica.<br />
- Quebrar e retirar a protecção dos dentes.<br />
- Colocar os aplicadores nas posições n° 2, 6 e 10 do suporte.<br />
IMPORTANTE: Os números impressos nos aplicadores devem ficar virados para o operador (Fig. 4).<br />
9. Fechar a tampa da câmara de migração.<br />
10. Dar início imediatamente ao processo apoiando em "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado).<br />
IMPORTANTE: Assegure-se de que a grelha de ventilação não está tapada (à direita do aparelho).<br />
MIGRAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS<br />
• Descida dos suportes do aplicador e dos eléctrodos de forma a que as tiras de tampão e os aplicadores contactem com a superfície do gel.<br />
• Subida dos aplicadores de amostras.<br />
• A migração é feita à potência constante de 20 W, a 20 °C, controlada por efeito de Peltier, até que tenham sido atingidos 24 Vh, durante cerca de<br />
5 minutos.<br />
• Os eléctrodos são desligados com a subida do suporte.<br />
• Secagem do gel a 65 °C durante cerca de 10 minutos.<br />
• A placa de migração é arrefecida ; quando chega aos 50 °C ouve-se um sinal sonoro que indica que a tampa da câmara de migração foi<br />
desbloqueada. A temperatura da placa permanece a 50 °C até que a tampa seja aberta. Depois, a temperatura continua a decrescer até chegar<br />
aos 20 °C (em menos de 5 minutos). Pode dar-se início a um novo processo de migração.<br />
NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante todos os passos da migração.<br />
II. PREPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE TRATAMENTO DO GEL<br />
1. Abrir a tampa.<br />
2. Retirar os aplicadores e deitá-los fora.<br />
3. Levantar os suportes, retirar as tiras de tampão pegando-lhes pelas suas extremidades de plástico e deitá-las fora.<br />
4. Retirar o gel para tratamento posterior.<br />
5. Depois de cada utilização, limpar os eléctrodos e a placa de migração com um pano macio e húmido.<br />
6. Colocar o gel no suporte da câmara de coloração (gel virado para cima) da seguinte maneira (Fig. 5):<br />
- Abrir o suporte.<br />
- Colocá-lo na bancada.<br />
- Encaixar o gel nas ranhuras existentes.<br />
- Fechar o suporte.<br />
- Verificar se o gel está bem encaixado.<br />
7. Colocar o suporte do gel na câmara de coloração.<br />
IMPORTANTE: Antes de dar início ao programa de coloração do gel, verificar o seguinte:<br />
- se o frasco do corante está cheio com 300 ml de solução corante ;<br />
- se o frasco de descorante contem pelo menos 1 litro de solução descorante ;<br />
- se o frasco de despejo está vazio.<br />
Para seleccionar os canais de entrada dos reagentes: consultar a informação indicada no ecrã do aparelho (premir a tecla: "VER CANAIS").<br />
IMPORTANTE: Não esquecer de tapar os canais não utilizados.<br />
8. Seleccionar o programa de coloração "PROT./B1-B2/Hb" no menu do aparelho.<br />
- Iniciar a operação premindo a tecla "START" (flecha verde no lado direito do teclado).<br />
Durante todas as sequências de coloração, descoloração e secagem a câmara permanece fechada. Após arrefecimento da câmara ouve-se<br />
um sinal sonoro que indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada. A ventilação é mantida até que o suporte seja retirado.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
III. FINALIZAÇÃO DO TRATAMENTO DO GEL<br />
1. Retirar o suporte da câmara, abrir e remover o gel seco.<br />
NOTA: Caso se observem manchas azuis residuais no gel após coloração / descoloração, pode-se realizar uma etapa de lavagem<br />
suplementar com o programa " LAV. ISOENZ/GEL ", que permite eliminar ou atenuar grandemente as manchas (em termos de intensidade)<br />
antes da leitura com o densitómetro / scanner.<br />
2. Se necessário, limpar a parte de trás (suporte plástico) do gel seco com um papel macio e húmido.<br />
3. Ler num densitómetro / scanner a 570 nm ou com filtro amarelo.<br />
NOTA : Para os geles com linhas de migração múltiplas (2 ou 3), as extensões da migração podem ser sensivelmente diferentes, sem qualquer<br />
consequência negativa nos resultados.<br />
RESULTADOS<br />
Controlo de qualidade<br />
Recomenda-se, para cada série de análises, incluir um soro de controlo (ex: Soro de Control SEBIA, ref. n° 4785).<br />
Valores<br />
A leitura por densitómetria (a 570 nm ou com filtro amarelo) permite definir as concentrações relativas (percentagens) de cada fracção.<br />
Os valores normais (média ± 2 DP) para cada fracção, obtidos no gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E), foram estabelecidos a partir de uma população<br />
de 158 adultos saudáveis (homens e mulheres).<br />
A quantificação das proteínas por UV no CAPILLARYS dá valores semelhantes ao procedimento por nefelometria (principalmente para a albumina).<br />
A SEBIA propõe uma padronização dos valores obtidos com <strong>HYDRAGEL</strong> após calibração dos sistemas de leitura.<br />
Valores sem padronização Valores padronizados no CAPILLARYS FRACÇÃO HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumina 59,8 - 72,4 % 53,8 - 65,2 % α-1 globulinas 1,0 - 3,2 % 1,1 - 3,7 % α-2 globulinas 7,4 - 12,6 % 8,5 - 14,5 % ß globulinas 7,5 - 12,9 % 8,6 - 14,8 %<br />
| γ globulinas | 8,0 - 15,8 % | 9,2 - 18,2 % |<br />
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores normais.<br />
Interpretação 1-15<br />
Para informações complementares sobre a interpretação dos perfis electroforéticos obtidos, ver BIBLIOGRAFIA.<br />
Limitações<br />
Ver AMOSTRAS PARA ANÁLISE.<br />
De acordo com os princípios analíticos das técnicas actuais (princípios de electroforese de zona, resolução e sensibilidade), não pode ser dada<br />
qualquer garantia quanto à detecção total de todos os compostos monoclonais.<br />
Assistência técnica<br />
Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor ainda que tenham sido seguidas, escrupulosamente, as instruções para<br />
a preparação e armazenamento dos reagentes, assim como as instruções de utilização da técnica.<br />
Estão disponíveis nos Serviços Técnicos da SEBIA fichas de dados de segurança dos diversos reagentes do kit, bem como informação relativa à<br />
eliminação dos desperdícios.<br />
CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO<br />
Análise de soros<br />
Reprodutibilidade intra-ensaio<br />
Efectuou-se a migração de três (3) amostras diferentes de soro em <strong>54</strong> pistas de 3 geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) de lotes diferentes. As médias,<br />
desvio padrão (DP) e coeficientes de variação (CV) (n = <strong>54</strong>) foram calculados para cada amostra e cada fracção (leitura por scanner).<br />
A tabela seguinte apresenta os resultados obtidos para a amostra n° 1 nos três lotes testados:<br />
FRACÇÃO MÉDIA (%) DP CV (%) Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 68,9 70,2 70,7 0,66 0,91 0,97 1,0 1,3 1,4 Alfa-1 2,1 1,8 1,7 0,17 0,16 0,14 7,9 8,8 8,3 Alfa-2 9,4 9,1 9,0 0,23 0,30 0,34 2,4 3,3 3,7 Beta 9,1 9,1 9,1 0,26 0,25 0,35 2,9 2,7 3,8<br />
| Gama | 10,5 9,7 9,5 | 0,48 0,45 0,50 | 4,6 4,6 5,2 |<br />
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A tabela seguinte apresenta os resultados obtidos para a amostra n° 2 nos três lotes testados:<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRACÇÃO MÉDIA (%) DP CV (%) Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 59,6 61,5 60,2 0,67 1,08 1,13 1,1 1,8 1,9 Alfa-1 5,2 4,9 5,0 0,23 0,24 0,22 4,5 5,0 4,3 Alfa-2 14,8 14,8 14,8 0,26 0,27 0,30 1,8 1,8 2,0 Beta 13,6 13,3 14,0 0,30 0,33 0,41 2,2 2,5 3,0<br />
| Gama | 6,8 5,5 6,1 | 0,37 0,56 0,56 | 5,5 10,1 9,2 |<br />
A tabela seguinte apresenta os resultados obtidos para a amostra n° 3 nos três lotes testados:<br />
FRACÇÃO MÉDIA (%) DP CV (%) Lote 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumina 53,8 <strong>54</strong>,1 55,2 0,58 0,76 0,80 1,1 1,4 1,4 Alfa-1 2,5 2,3 2,2 0,12 0,13 0,17 5,0 5,6 7,7 Alfa-2 8,0 7,9 7,8 0,21 0,16 0,29 2,6 2,1 3,7 Beta 9,7 9,9 9,4 0,21 0,21 0,23 2,2 2,2 2,5<br />
| Gama | 26,1 25,8 25,3 | 0,35 0,47 0,40 | 1,4 1,8 1,6 |<br />
Reprodutibilidade inter-ensaio<br />
Efectuou-se a migração de 18 amostras diferentes de soro em 12 geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) de três lotes diferentes. Os coeficientes de<br />
variação médios (CV), desvio padrão (DP) e coeficientes de variação (CV) (n = 12) foram calculados para cada amostra e cada fracção. Os resultados<br />
são sensivelmente os mesmos para todas as amostras (leitura por scanner).<br />
A tabela seguinte apresenta os valores de desvio padrão e de coeficiente de variação representando todas as amostras e um coeficiente de variação<br />
médio obtido a partir do conjunto de todos os coeficientes de variação de todas as amostras (n = 18).<br />
FRACÇÃO DP CV (%) CV MEDIO (%) Albumina 0,9 - 1,3 1,6 - 2,1 1,8 Alfa-1 0,2 - 0,3 5,3 - 12,3 8,4 Alfa-2 0,2 - 0,3 1,9 - 3,7 2,8 Beta 0,3 - 0,4 3,0 - 3,3 3,2<br />
| Gama | 0,5 - 0,7 | 2,0 - 11,9 | 6,7 |<br />
Exactidão<br />
Efectuou-se a migração de 102 amostras diferentes de soro (soros normais e patológicos) em geles <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) e em geles<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30.<br />
Os parâmetros de correlacção entre os dois sistemas de gel (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) para cada fracção são, no HYRYS:<br />
FRACÇÃO Coeficiente de correlação Intercepção - y Declive Limites de valores %* Albumina 0,994 0,640 1,000 35,4 - 74,3 Alfa-1 0,994 -0,070 1,078 1,1 - 10,5 Alfa-2 0,992 -0,030 0,983 5,4 - 21,4 Beta 0,985 0,320 0,958 5,0 - 16,5<br />
| Gama | 0,996 | 0,050 | 0,966 | 6,6 - 52,5 |<br />
Os parâmetros de correlacção entre os dois sistemas de gel (y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) para cada fracção são, no scanner:<br />
FRACÇÃO Coeficiente de correlação Intercepção - y Declive Limites de valores %* Albumina 0,964 3,407 0,973 34,5 - 74,1 Alfa-1 0,980 0,030 0,994 1,2 - 9,4 Alfa-2 0,972 0,070 0,949 5,3 - 19,8 Beta 0,961 0,904 0,874 5,0 - 15,6<br />
| Gama | 0,988 | 0,411 | 0,968 | 5,9 - 53,6 |<br />
* Os valores foram definidos no sistema <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E).<br />
Sensibilidade<br />
Diluiram-se em série três soros patológicos, cada um com uma proteína monoclonal. Realiza-se a migração das diluições no gel <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) e no gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Após comparação a olho nú de cada gel, a maior diluição que permite ver a banda<br />
monoclonal está compreendida entre 0,35 e 0,13 g/l. A concentração mais baixa detectada de uma banda monoclonal é de 0,13 g/l.<br />
NOTA: Consoante a posição da banda monoclonal e do fundo policlonal na zona das gamaglobulinas, o limite de detecção de uma paraproteína pode<br />
variar.<br />
Análise das urinas concentradas<br />
Os resultados obtidos após análise quantitativa e qualitativa indicam uma repetibilidade e reprodutibilidade muito boas em todos os aspectos testados.<br />
A análise qualitativa de amostras diferentes por electroforese no gel <strong>HYDRAGEL</strong> e noutro sistema em gel de agarose disponível comercialmente<br />
mostra uma correlação perfeita entre os dois sistemas de análise. A sensibilidade da técnica para a análise de urina concentrada é tal que permite<br />
detectar uma paraproteína urinária na ordem de 0,48 g/l.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
BIBLIOGRAFIA<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.<br />
Impact-Internat, Septembre 1986.<br />
(16) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
ANVÄNDNINGSOMRÅDE<br />
Kitet <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) är avsedd för separation av proteiner i humant serum och urin genom elektrofores på alkaliskt buffrade (pH 9.2)<br />
agaros geler. De normala serumproteinerna separerars i fem huvudfraktioner. Kitet används tillsammans med det semi-automatiska instrumentet<br />
HYDRASYS. Separerade proteiner infärgas med amidosvart. De elektroforetiska separationerna utvärderas visuellt för abnormala mönster.<br />
Densitometri ger noggrann relativ kvantifiering av inviduella zoner.<br />
Varje agarosgel är avsedd för körning av <strong>54</strong> prov.<br />
Endast för in vitro diagnostik.<br />
TESTPRINCIPER 1-15<br />
Elektrofores av proteiner är en väletablerad teknik som används rutinmässigt vid kliniska laboratorier för screening av serum och andra biologiska<br />
vätskor för proteinabnormaliteter. Den är baserad på principen hos zonelektrofores som utförs på ett lämpligt hjälpmedium. Agaros har utvecklats till<br />
ett mångsidigt och användbart hjälpmedium. Vid rutinmässiga diagostiska applikationer, separeras serumproteiner in i fem huvudfraktioner,<br />
huvudsakligen enligt deras laddning vid ett givet pH: albumin, alfa-1 globuliner, alfa-2 globuliner, betaglobuliner och gammaglobuliner. Varje zon<br />
innehåller en eller flera serumproteiner. Proteinmönstren för urin liknar dem för serum. Dock kan de relativa intensiteterna hos fraktionerna eller deras<br />
närvaro variera mycket beroende på njurarnas filteringskapacitet.<br />
MEDFÖLJANDE REAGENSER OCH MATERIAL I KITET <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
OBJEKT PN 4145 PN 4260* Agaros geler (färdiga att anv.) 10 geler 80 geler Buffrade strips (färdiga att anv.) 10 förp. 2 i varje 80 förp. 2 i varje Färgningslösning diluent (stamlösning) 1 flaska, 60 mL 8 flaskor 60 mL Amidosvart färg (stamlösning) 1 flaska, 20 mL 8 flaskor, 20 mL Applikatorer (färdiga att anv.) 3 förp. 10 i var (18 tänder) 24 förp. 10 i var (18 tänder)<br />
| Filterpapper | 1 förp. med 10 | 8 förp. med 10 |<br />
* <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
FÖR OPTIMALA RESULTAT<br />
Reagenser från samma kit måste användas tillsammans och enligt de instruktioner som anges på förpackningens insticksblad.<br />
LÄS NOGGRANNT FÖRPACKNINGENS INSTICKSBLAD.<br />
1. AGAROS GELER<br />
Förberedelse<br />
Agaros geler är färdiga att använda. Varje gel innehåller: agaros, 0.8 g/dL ; Tris-barbital buffert pH pH 9,2 ± 0.1 ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda.<br />
VARNING: Agaros geler innehåller 0.31 % barbital and 0.34 % natrium-barbital. Förtär inte ! Om så sker, kontakta läkare omedelbart.<br />
Användning<br />
Hjälpmedium för proteinelektrofores.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara gelerna upprätt, i originalförpackningen och vid rumstemperatur (15 till 30 °C) eller i kylskåp (2 till 8 °C). Gelerna är hållbara fram till angivet<br />
utgångsdatum på förpackningen. (Pilen på förpackningens framsida måste peka uppåt). Undvik förvaring nära fönster eller värmekälla. Undvik<br />
temperaturväxlingar under förvaringen.<br />
FRYS INTE IN GELEN.<br />
Släng gelen om:<br />
(i) kristaller eller fällning bildats på gelytan eller gelkonsistensen blivit väldigt mjuk (inträffar när gelen varit fryst),<br />
(ii) bakteriell tillväxt eller mögeltillväxt påvisas,<br />
(iii) onormal mängd vätska är närvarande i påsförpckningen (som ett resultat av buffertutsöndring från gelen på grund av felaktiga<br />
lagringsförhållanden).<br />
2. BUFFRADE STRIPS<br />
Förberedelse<br />
Buffrade strips är färdiga att använda. Varje strip innehåller: Tris-barbital buffert pH 9,2 ± 0.3 ; natriumazid ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer, men nödvändiga för optimala prestanda.<br />
VARNING: Bufferten i stripsen innehåller 0.92 % barbital, 1.03 % natrium-barbital och 0.30 % natriumazid. Förtär inte ! Vid förtäring kontakta<br />
läkare omedelbart ! Vid avyttring, undvik kontakt med syra, bly eller koppar, då dessa kan bilda explosiva eller giftiga föreningar med<br />
natriumazid.<br />
Användning<br />
Buffrade strips fungerar som en elektroforetisk buffertreservoar och säkerställer kontakt mellan gelen och elektroderna.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara de buffrade stripsen horisontellt och i originalförpackningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. (Pilen för förpackningens framsida måste peka<br />
uppåt). De är hållbara fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på stripsens förpackningsetikett.<br />
FRYS INTE STRIPSEN.<br />
Kasta om förpackningen är öppen eller om stripsen är uttorkade.<br />
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SEBIA INSTRUKTIONER - Svenska
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
3. FÄRGNINGSLÖSNINGS DILUENT<br />
Förberedelse<br />
Stamfärglösnings diluent måste användas enligt vad som beskrivits i paragraf « AMIDOSVART FÄRG ».<br />
Den innehåller en sur lösning.<br />
Användning<br />
För förberedelse av amidosvart färglösning.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Lagra stamfärglösnings diluent vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på kitförpackningen eller på<br />
stamfärglösningens flasketiketter.<br />
FRYS INTE IN.<br />
Tillsätt inte natriumazid.<br />
4. AMIDOSVART FÄRG<br />
Förberedelse<br />
Amidosvart koncentratet är visköst och kan bli trögflytande. Egenskaperna hos stamlösningen påverkas ej av ökad viskositet eller löslighet.<br />
För att uppnå en perfekt rekonstituering av färgen, vänligen respektera nedansående procedur:<br />
1. Tillsätt 15 ml färgdiluent till vialen amidosvartkoncentrat.<br />
2. Stäng vialen omsorgsfullt.<br />
3. Skaka vialen kraftigt i c:a 5 sekunder.<br />
4. Häll lösningen i behållaren för färgprocessning.<br />
5. Repetera dessa steg 2 eller 3 gånger om nödvändigt.<br />
6. Överför återstående diluent till behållaren och fyll upp till 300 ml med destillerat eller avjoniserat vatten.<br />
7. Blanda innehållet i behållaren noga 5 till 10 minuter. Färglösningen är nu redo att användas.<br />
NOTERA: En icke komplett reconstituerad färglösning kan leda till en undervärdering av albuminfraktionen (lågt procenttal eller vita hål i fraktionen).<br />
Efter spädning innehåller arbetsfärglösningen : sur lösning pH ≈ 2 ; amidosvart, 0.4 g/dL ; etylen-glykol, 6.7 % ; tillsatser, ofarliga vid använda<br />
koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda.<br />
VARNING: Farligt att svälja.<br />
Användning<br />
För färgning av geler efter elektroforetisk proteinseprering.<br />
VIKTIGT : Färgningslösningen är avsedd för infärgning av endast 10 geler. Byt lösning efter färgning av 10 geler.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Lagra både stam- och brukslösningar vid rumstemperatur eller i kylskåp i stängda behållare för att förhindra avdunstning. Stamfärglösningen är hållbar<br />
fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på färgflaskornas etiketter.<br />
Färdigspädd färglösning är hållbar i 1 månad.<br />
Förvara inte arbetsfärglösningen i närheten av en värmekälla.<br />
5. APPLIKATORER<br />
Användning<br />
Tillskurna applikatorer för engångsbruk. För provapplicering.<br />
Förvaring<br />
Förvara applikatorerna på en torr plats, rumstempererat eller i kylskåp.<br />
6. FILTERPAPPER<br />
Användning<br />
Tunnt tillskurna och absorberande pappersbitar för engångsbruk. Används för borttagning av fukt på gelytan innan provapplicering.<br />
Förvaring<br />
Förvara filterpappren på ett torrt ställe i rumstemperatur eller i kylskåp.<br />
ERFORDERLIGA REAGENSER<br />
1. AVFÄRGNINGSLÖSNING<br />
Förberedelse<br />
Varje flaska med stamlösning av avfärgningslösningen (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>0, 10 flaskor 100 mL i varje) skall spädas upp till 100 liter med destillerat eller<br />
avjoniserat vatten. Lämpligt att endast späda 5 mL av stamlösningen till 5 liter, som är volymen hos behållaren för avfärgningslösning. Efter spädning<br />
innehåller brukslösningen: citronsyra, 0.05 g/dL.<br />
Användning<br />
För avfärgning, vilket innebär borttagning av överflödig färg, samt bakgrundsfärg från gelerna.<br />
För avsköljning av färgfacket efter rengöring med tvättsteget.<br />
För att neutralisera den sura avfärgningslösningen, häll 15 mL av en 50 % Natriumhydroxidlösning, in i den tomma avfallsbehållaren.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara stamlösning vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar till angivet utgångsdatum på avfärgningslösningens förpackning eller på<br />
flasketiketterna. FRYS INTE AVFÄRGNINGSLÖSNINGEN. Den färdigspädda avfärgningsslösningen är hållbar i en vecka under förutsättning att den<br />
förvaras i en stängd flaska vid rumstemperatur. Tillsätt ej natriumazid.<br />
Kassera den färdigspädda avfärgningslösningen om den förändras i utseende t.ex., blir grumlig p.g.a. mikrobiell kontaminering.<br />
För att förhindra mikrobiell tillväxt i den spädda avfärgningslösningen (vid lagring mer än 1 vecka) tillsätt 5 µl/dL av ProClin 300.<br />
Bruksavfärgningslösning tillsatt med Pro Clin är hållbar i stängd flaska vid rumstemperatur eller i kylskåp till angivet utgångsdatum på<br />
avfärgningslösningens förpackning eller på flasketiketterna.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. HYDRASYS TVÄTTLÖSNING<br />
Förberedelse<br />
Varje flaska av HYDRASYS stamtvättlösning (SEBIA PN 4<strong>54</strong>1, 10 flaskor, 80 mL i varje) skall spädas upp till 5 liter med destillerat eller avjoniserat<br />
vatten. Efter spädning innehåller den färdiga tvättlösningen : alkalisk buffert pH 8.8 ± 0.3 ; natriumazid.<br />
VARNING : Brukstvättlösning innehåller 0,625 % natriumazid. Farligt att förtära, kontakta läkare omedelbart. Natriumazid kan leda till<br />
bildning av explosiva eller giftiga ämnen vid kontakt med syror, bly eller koppar. Spola alltid med en stor mängd vatten efter det att<br />
lösningen hällts ut.<br />
Användning<br />
Lösningen används för rengöring av HYDRASYS färgfack. Används regelbundet t.ex. om instrumentet används dagligen, tvätta färgfacket varje vecka.<br />
Se insticksbladet för användarinstruktioner.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara stam- och arbetstvättlösningarna i stängda behållare vid rumstemperatur eller i kylskåp. Lösningarna är hållbara fram till angivet<br />
utgångsdatum på tvättlösningflaskornas etiketter. Kassera brukstvättlösningen om den förändras i utseende, t.ex. blir grumlig på grund av mikrobiell<br />
kontaminering.<br />
3. FLUIDIL<br />
Förberedelse<br />
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 5 mL) är färdig att använda.<br />
Användning<br />
För spädning av viskösa eller grumliga prov, t.ex. serum som innehåller kryoglobulin eller kryogel.<br />
Lagring, stabilitet och tecken på förändring<br />
Förvara vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar till angivet utgångsdatum på Fluidilflaskans etikett.<br />
Fluidil måste vara fri från fällning.<br />
UTRUSTNING OCH NÖDVÄNDIGA TILLBEHÖR MEN INTE MEDLEVERERADE<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 eller PN 1211.<br />
2. Mikropipett, manuell eller automatisk, som t.ex. HYDRAplus SEBIA, PN 1215, ett alternativt sätt att ladda provapplikatorerna.<br />
3. Fuktkammare, PN 1270, levererad med HYDRASYS.<br />
4. Behållarsats levererad med HYDRASYS.<br />
5. Pipetter: 10 µL och 200 µL.<br />
6. Densitometer / scanner kapabel att scanna 82 x 102 mm geler vid 570 nm eller med ett gult filter, t.ex., HYRYS SEBIA eller PHORESIS mjukvara<br />
anpassat för en flat-bed scanner. Se tillverkarens instruktioner för åtgärder och kalibreringsrutiner.<br />
PROV FÖR ANALYS<br />
Provinsamling och lagring<br />
Färska prov rekommenderas för analys. Serum och urin måste insamlas enligt etablerade rutiner som används vid kliniska laboratorier. Förvara proven<br />
i kylskåp (2 till 8 °C) så fort som möjligt efter provtagning och upp till en vecka. För längre lagring, förvara proven frysta (hållbara minst en månad).<br />
Infrysning av serumprov med natriumazid 0,02 g/dL ökar hållbarheten.<br />
Infrysning av urinprov med HEPES 0.1 M (pH 6.75) och natriumazid, 0,02 g/dL, ökar hållbarheten.<br />
VIKTIGT: Undvik borsyra som konserveringsmedel.<br />
Tinade prover kan ge lätta appliceringsmärken på grund av protein- eller lipoproteindenaturering.<br />
Förvaring vid 2 till 8 °C och frysning orsakar anodisk förskjutning av beta-lipoproteiner från betazonen till alfa-2 eller alfa-1 zonerna ; ju äldre serumet<br />
är, desto större förskjutning.<br />
Provförberedelse<br />
1. Sera<br />
Använd outspädda serumprov. Efter kyl- eller frysförvaring kan vissa sera (särskilt de som innehåller kryoglobulin eller kryogel) bli viskösa eller<br />
utveckla grumlighet. Sådana sera kan ge appliceringsproblem på grund av att diffusionen genom tänderna i provapplikatorn förhindras. I sådant<br />
fall, tillsätt 25 µl Fluidil till 75 µl serum och vortexa i 15 sekunder. Följ därefter normalt förfaringssätt.<br />
2. Koncentrerade urinprov<br />
Analys utförs på prover som tidigare koncentrerats till en total proteinkoncentration på 1.5 - 2.0 g/dL (med en lämplig apparat).<br />
VIKTIGT: En del urinprover innehåller hög saltkoncentration Detta kan ge upphov till geldeformering under migrering och som en konsekvens,<br />
distortion av migrationsprofilerna. Om en sådan störning gör tolkningen felaktig, måste urinprovet dialyseras för bortagning av salterna.<br />
NOTERA : Diffusion av urinprover in i applikatorspetsarna kan förhindras när urinen (ren eller koncentrerad) är grumlig. Det rekommenderas att<br />
avlägsna partiklar med centrifugering (t.ex. 10 minuter vid 3,000 rpm) eller filtrering (t.ex., 0.45 µm filter för sterilfiltrering).<br />
Prov att undvika<br />
• Använd inte hemolyserade serumprov. Hemolys ökar alfa-2 och betazonerna.<br />
• Undvik plasmaprov. Fibrinogen ger ett band i närheten av appliceringspunkten som kan tas för monoklonalt immunoglobulin och ger felaktigt<br />
procenttal för motsvarande zon.<br />
• Undvik gamla, felaktigt lagrade urinprover där enzymatisk nedbrytning av proteiner kan ha förekommit.<br />
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT<br />
HYDRASYS systemet är ett halvautomatiskt multi-parameter instrument. De automatiska stegen inkluderar bearbetning av <strong>HYDRAGEL</strong> agarosgeler<br />
i följande ordning: provapplicering, elektroforetisk migrering, torkning, färgning, avfärgning och slutlig torkning. De manuella stegen inkluderar<br />
hantering av prov och geler samt att förbereda instrumentet för arbete.<br />
LÄS NOGGRANNT HYDRASYS BRUKSANVISNINGAR.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
I. MIGRERING<br />
1. Starta HYDRASYS instrumentet.<br />
2. Placera tre applikatorer på en slät yta med brunnarnas nummer i upprätt läge (Fig. 1).<br />
- Applicera 10 µL ospätt serum eller koncentrerat urinprov i varje brunn. Ladda varje applikator inom 2 minuter.<br />
- Placera applikatorerna i två fuktkammare med tänderna uppåt [håll i den skyddande plast ramen]. Låt proverna diffusera in i tänderna under<br />
5 minuter efter den sista provappliceringen. För senare användning (upp till 8 timmar), förvara kammrarna i kylskåp.<br />
Se förpackningsbilagan för fuktkammaren för ytterligare detaljer.<br />
3. Öppna luckan till Migrationsmodulen, lyft upp elektrod- och applikatorhållaren.<br />
VARNING: Stäng aldrig luckan när hållarna är i höjt läge.<br />
4. Välj «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» migrationsprogram på instrumentmenyn (tangentbordets vänstra sida).<br />
5. Ta ur de buffrade stripsen ur förpackningen; ta dem i plaständarna. Sätt de hålstansade ändarna på stripsens plaststöd på elektrodhållarens<br />
pinnar ; stripsens plaststöd måste vara vända mot elektrodhållaren (Fig. 2).<br />
6. Ta ut <strong>HYDRAGEL</strong> plattan.<br />
- Rulla snabbt och jämt med ett tunt filterpapper på gelytan för bortagning av överflödig vätska. Ta direkt bort pappret.<br />
VARNING: För att undvika uttorkning : låt inte filterpappret vara i kontakt med gelen under längre tid.<br />
- Pipettera 200 µL destillerat eller avjoniserat vatten, på den nedre tredjedelen av ramen som är tryckt på migrationsmodulens<br />
temperaturkontrollplatta.<br />
- Placera gelplattan (gelsidan uppåt) med kanten mot upphöjningen på den tryckta ramens nederkant (Fig. 3).<br />
- Böj gelen och släpp den försiktigt ned i vattendroppen (Fig. 3). Förvissa dig om att inga luftbubblor finns kvar, att vattnet fördelar sig under<br />
hela gelplattan och att gelen är i linje med den tryckta ramen.<br />
7. Sänk / tryck ned båda hållarna. I detta läge berör inte de buffrade stripsen gelen. TRYCK INTE NED HÅLLARNA HELT.<br />
8. Avlägsna applikatorerna från fuktkammaren. Håll i den skyddande plastramen.<br />
- Avlägsna applikatorns tandskyddsram.<br />
- Placera var och en av applikatorerna i position 2, 6 och 10 i applikatorhållaren.<br />
VIKTIGT: Det tryckta numret på applikatorn måste vara vänt mot operatören (Fig. 4).<br />
9. Stäng luckan till migrationsmodulen.<br />
10. Starta proceduren direkt genom att trycka på den gröna piltangenten «START» på tangentbordets vänstra sida.<br />
VIKTIGT: Förvissa dig om att ventilationsintaget på instrumentets högra sida inte är blockerat.<br />
MIGRERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISERADE STEG<br />
• De två hållarna sänker sig så att de buffrade stripsen och applikatorerna får kontakt med gelytan.<br />
• Provapplikatorn höjer sig.<br />
• Migrering sker vid 20 W konstant strömstyrka vid 20 °C kontrollerat av Peltiereffekten, tills 24 Vh har ackumulerats (under ca. 5 minuter).<br />
• Elektrodhållaren höjer sig för att koppla ur elektroderna.<br />
• Kontrollplattans temperatur ökar till 65 °C under 10 minuter för att torka gelen.<br />
• Kontrollplattan kyls ner; när temperaturen når 50 °C, hörs en ljudsignal som aviserar att migrationmodulens lucka låses upp. Plattans temperatur<br />
hålls vid 50 °C tills luckan öppnas. Därefter sjunker temperaturen ner till 20 °C (på under 5 minuter). Därefter kan en ny migrationskörning startas.<br />
NOTERA: Locket till migrationsmodulen förblir stängt under alla migrationsstegen.<br />
II. GELBEARBETNING<br />
1. Öppna locket.<br />
2. Avlägsna och släng applikatorerna.<br />
3. Fäll upp båda hållarna, avlägsna och kasta de buffrade stripsen.<br />
4. Avlägsna den torkade gelfilmen för vidare bearbetning.<br />
5. Efter varje användning, torka av elektroderna och temperaturkontrollplattan med en fuktad mjuk servett.<br />
6. För färgning öppna gelhållaren. Lägg den platt på ett bord och placera den torkade gelen med gelsidan vänd uppåt i skåran på de två listerna<br />
och stäng hållaren. Förvissa dig om att filmen är korrekt placerad inuti hållaren (Fig. 5).<br />
7. Placera gelhållaren i modulen för gelbearbetning/färgning.<br />
VIKTIGT: Innan start av programmet gelbearbetning- / färgning, kontrollera följande :<br />
- att färgningsbehållaren är fylld med 300 mL färgningslösning ;<br />
- att behållaren för avfärgning innehåller minst 1 liter avfärgningslösning ;<br />
- att avfallsbehållaren är tom.<br />
För reagenslinjeförbindelse: Hänvisas till visad information på instrumentets skärm (välj tangent: REAGENT LINES).<br />
VIKTIGT: Glöm inte att spärra oanvända linjer.<br />
8. Välj «PROT./B1-B2/Hb» färgningsprogram på instrumentmenyn och starta körningen genom att trycka på knappen «START» (grön pil på<br />
tangentbordets högra sida).<br />
Under färgning-, avfärgning- och torkningsstegen, förblir facket låst.<br />
Efter kylningssteget, hörs en ljudsignal när facket öppnas (ventilation upprätthålls tills gelhållaren avlägsnas).<br />
III. SLUTFÖRANDE AV GELBEARBETNING<br />
1. Avlägsna gelhållaren från facket, öppna och avlägsna den torkade gelen.<br />
NOTERA : Efter gelfärgning/avfärgning och innan densitometri/scanning, kan en gel genomgå ett ytterligare tvättsteg, om nödvändigt, för att<br />
ytterligare klargöra gelbakgrunden och avlägsna färgrester som kan framträda som blåa fläckar. Tvätta gelen med användning av programmet<br />
“ WASH ISOENZ/GEL”.<br />
2. Om nödvändigt, rengör den torra filmens baksida (stödsidan av plast) med ett fuktat mjukt papper.<br />
3. Scanna med användning av en densitometer / scanner vid 570 nm eller med ett gult filter.<br />
ANMÄRKNING : Längden hos de elektroforetiska migreringarna kan vara något olika för geler innehållande 2 eller 3 analysspår, utan några<br />
ofördelaktiga effekter på utförandet.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
RESULTAT<br />
Kvalitetskontroll<br />
Det rekommenderas att inkludera ett analyserat kontrollserum (Control Serum, SEBIA PN 4785) i varje provkörning.<br />
Värden<br />
Scanning med densitometer (vid 570 nm) på färgade elektroforetogram ger relativa koncentrationer (i procent) för invididuella proteinzoner.<br />
Normalvärden (medel ± 2 SD) för individuella betydande elektroforetiska serumproteinzoner hos <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler har fastställts för<br />
en frisk population på 158 vuxna (män och kvinnor).<br />
UV-proteinkvantifiering med CAPILLARYS ger liknande värden som med ett nefelometrisk metod (speciellt för albumin). SEBIA föreslår en<br />
standardisering av erhållna värden hos <strong>HYDRAGEL</strong> efter kalibrering av scanningssystemen.<br />
Utan standardiseringsvärden Med CAPILLARYS standardiseringsvärden FRAKTION HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Albumin 59.8 - 72.4 % 53.8 - 65.2 % Alfa-1 globuliner 1.0 - 3.2 % 1.1 - 3.7 % Alfa-2 globuliner 7.4 - 12.6 % 8.5 - 14.5 % Beta globuliner 7.5 - 12.9 % 8.6 - 14.8 %<br />
| Gamma globuliner | 8.0 - 15.8 % | 9.2 - 18.2 % |<br />
Det rekommenderas att varje laboratorium fastställer sina egna normalvärden.<br />
Tolkning 1-15<br />
Som ett hjälpmedel vid tolkning av serum- och urinproteinelektroforetogram se BIBLIOGRAFI.<br />
Interferens och begränsningar<br />
Se PROV FÖR ANALYS.<br />
På grund av begränsningar när det gäller upplösning och känslighet hos zonelektrofores, är det möjligt att vissa monoklonala komponenter inte<br />
detekteras med denna metod.<br />
Felsökning<br />
Ring leverantörens tekniska support om testet misslyckas trots att manualen och att givna instruktioner för materialförvaring och förberedelse av test<br />
följts.<br />
Säkerhetsinformation för reagenserna i satsen och information för avfallshantering finns tillgängliga hos leverantörens tekniska serviceavdelning.<br />
PRESTANDADATA<br />
Serumanalys<br />
Reproducerbarhet inom en körning<br />
Tre (3) olika serumprov kördes i <strong>54</strong> spår på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler, härrörande från 3 testade batcher. Medelvärden, SD och CV (n = <strong>54</strong>)<br />
beräknades för varje serumprov, för varje zon och för varje lot. (scanner).<br />
Följande tabell visar resultaten för serumprov nr. 1 från tre testade lots.<br />
FRAKTION MEDEL (%) SD CV (%) LOT 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 Alfa-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 Alfa-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 Beta 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8<br />
| Gamma | 10.5 9.7 9.5 | 0.48 0.45 0.50 | 4.6 4.6 5.2 |<br />
Följande tabell visar resultaten för serumprov nr. 2 från de tre testade lots.<br />
FRAKTION MEDEL (%) SD CV (%) LOT 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 Alfa-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 Alfa-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 Beta 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0<br />
| Gamma | 6.8 5.5 6.1 | 0.37 0.56 0.56 | 5.5 10.1 9.2 |<br />
- <strong>54</strong> -
Följande tabell visar resultaten för serumprov no. 3 från de tre testade lots.<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
FRAKTION MEDEL (%) SD CV (%) LOT 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 53.8 <strong>54</strong>.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 Alfa-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 Alfa-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 Beta 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5<br />
| Gamma | 26.1 25.8 25.3 | 0.35 0.47 0.40 | 1.4 1.8 1.6 |<br />
Reproducerbarhet mellan körningar<br />
Arton (18) olika serumprov kördes på 12 olika geler från 3 batcher <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler. Medelvärden, SD (standardavvikelse) och<br />
CV (n = 12) beräknades för varje serumprov och för varje zon. Erhållna resultat var i stort sett samma för alla prov (scanner).<br />
Följande tabell visar områden för SD (standardavvikelse) och CV, de representerar alla prov och ett medel CV beräknat från sammanslagna CV’s för<br />
alla proven (n = 18).<br />
FRAKTION SD MEDEL CV (%) Albumin 0.9 - 1.3 1.6 - 2.1 1.8 Alfa-1 0.2 - 0.3 5.3 - 12.3 8.4 Alfa-2 0.2 - 0.3 1.9 - 3.7 2.8 Beta 0.3 - 0.4 3.0 - 3.3 3.2<br />
| Gamma | 0.5 - 0.7 | 2.0 - 11.9 | 6.7 |<br />
Noggrannhet<br />
Ett hundratvå (102) olika prov (patologiska och normala sera) kördes på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler och på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30<br />
geler. Beräknade korrelationsparametrar för inviduella zoner från sammanslagna data för <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler vs. jämförbara gelsystem<br />
(y-<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) var (HYRYS):<br />
FRAKTION Korrelations koefficient y-brytpunkt Kurva Område för % värden* Albumin 0.994 0.640 1.000 35.4 - 74.3 Alfa-1 0.994 -0.070 1.078 1.1 - 10.5 Alfa-2 0.992 -0.030 0.983 5.4 - 21.4 Beta 0.985 0.320 0.958 5.0 - 16.5<br />
| Gamma | 0.996 | 0.050 | 0.966 | 6.6 - 52.5 |<br />
Korrelationsparametrar beräknades för inviduella zoner från samlade data för <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler vs. Jämförbara gelsystem<br />
(y–<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) var (scanner):<br />
FRAKTION Korrelations koefficient y-brytpunkt Kurva Område för % värden* Albumin 0.964 3.407 0.973 34.5 - 74.1 Alfa-1 0.980 0.030 0.994 1.2 - 9.4 Alfa-2 0.972 0.070 0.949 5.3 - 19.8 Beta 0.961 0.904 0.874 5.0 - 15.6<br />
| Gamma | 0.988 | 0.411 | 0.968 | 5.9 - 53.6 |<br />
* Värden i % är som fastställda i <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) systemet.<br />
Sensitivitet<br />
Tre patologiska serumprov vart och ett med en monoklonal protein späddes seriellt. Spädningarna genomgick sedan elektrofores på <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) geler och på <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30 geler. Efter visuell granskning av de inviduella gelerna, var den högsta spädningen med<br />
ett urskiljbart monoklonalt band mellan 0.035 och 0.013 g/dL. Detektionskänsligheten bestämdes därför 0.013 g/dL.<br />
NOTERA : Beroende på de monklonala komponeneternas läge och polyklonala bakgrund i gammazonen, kan detektionsgränsen variera.<br />
Analys av koncentrerade urinprov<br />
Erhållna resultat med <strong>HYDRAGEL</strong> geler indikerade en mycket god reproducerbarhet inom och mellan körningar gällande för koncentrerade urinprov<br />
efter kvantitativ och kvalitativ analys. Tjugoåtta (28) olika prov (patologiska- och normala urinprov) kördes på <strong>HYDRAGEL</strong> geler och på andra<br />
kommersiellt tillgängliga agaros gelsystem. Det fanns inga visuellt detekterbara skillnader mellan systemen. Detektionskänsligheten 0.048 g/dL,<br />
fastställdes från de högsta seriella spädningarna med ett monoklonalt urinprotein som visade ett urskiljbart band.<br />
BIBLIOGRAFI<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
- 55 -
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ<br />
Το κιτ <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) είναι σχεδιασµένο για το διαχωρισµό πρωτεϊνών του ανθρώπινου ορού και ούρων µε ηλεκτροφόρηση σε<br />
αλκαλική (pH 9.2) γέλη αγαρόζης. Εκ του σχεδιασµού του, οι φυσιολογικές πρωτεΐνες του ορού διαχωρίζονται σε πέντε κύρια κλάσµατα.<br />
Τα κιτ χρησιµοποιούνται µε την ηµι-αυτοµατοποιηµένη συσκευή ηλεκτροφόρησης HYDRASYS. Οι διαχωρισµένες πρωτεΐνες υφίστανται<br />
χρώση µε amidoblack. Τα προκύπτοντα ηλεκτροφορήµατα αξιολογούνται οπτικά. Η πυκνοµέτρηση προσφέρει ακριβή, σχετική<br />
ποσοτικοποίηση των επιµέρους ζωνών.<br />
Κάθε gel αγαρόζης προορίζεται για την ανάλυση <strong>54</strong> δειγµάτων.<br />
Για in vitro διαγνωστική χρήση.<br />
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ 1-15<br />
Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών είναι µια καθιερωµένη τεχνική η οποία χρησιµοποιείται καθηµερινά στα κλινικά εργαστήρια για την εξέταση<br />
ορού και άλλων σωµατικών υγρών. Βασίζεται στις αρχές της ηλεκτροφόρησης ζώνης πραγµατοποιούµενης σε κατάλληλο υποστηρικτικό<br />
µέσο. Η αγαρόζη έχει αναπτυχθεί σε ένα πολυχρηστικό και αποτελεσµατικό υποστηρικτικό µέσο. Στις καθηµερινές διαγνωστικές<br />
εφαρµογές, οι πρωτεΐνες του ορού διαχωρίζονται σε πέντε κύρια κλάσµατα, ανάλογα κυρίως µε το φορτίο τους σε δεδοµένο pH :<br />
αλβουµίνη, άλφα-1 σφαιρίνες, άλφα-2 σφαιρίνες, βήτα σφαιρίνες, και γάµµα σφαιρίνες. Κάθε ζώνη περιέχει µία ή περισσότερες πρωτεΐνες<br />
του ορού. Τα προφίλ των πρωτεϊνών των ούρων οµοιάζουν µε αυτά του ορού. Ωστόσο, οι σχετικές εντάσεις των κλασµάτων ή η παρουσία<br />
τους µπορεί να ποικίλλουν ευρέως ανάλογα µε τη διηθητική επάρκεια του νεφρού.<br />
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΑ ΚΙΤ <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)<br />
ΕΙ∆ΟΣ PN 4145 PN 4260* Gel αγαρόζης (έτοιµα προς χρήση) 10 gel 80 gel Ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος (έτοιµες προς χρήση) 10 συσκ. των 2 80 συσκ. των 2 Μέσο αραίωσης διαλύµατος χρώσης (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 60 mL 8 φιαλίδια, 60 mL Χρωστική amidoblack (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 20 mL 8 φιαλίδια, 20 mL Εφαρµογείς (έτοιµοι προς χρήση) 3 συσκ. των 10 (18 δόντια) 24 συσκ. των 10 (18 δόντια)<br />
| ∆ιηθητικά χαρτιά | 1 συσκ. των 10 | 8 συσκ. των 10 |<br />
(*) <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) MAXI-KIT<br />
ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ<br />
Όλα τα αντιδραστήρια από ίδιο κιτ πρέπει να χρησιµοποιούνται πάντα µαζί και σύµφωνα µε τις οδηγίες χρήσης.<br />
ΠΑΡΑΚΑΛΟΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ.<br />
1. GEL ΑΓΑΡΟΖΗΣ<br />
Προετοιµασία<br />
Τα gel αγαρόζης είναι έτοιµα προς χρήση. Κάθε gel περιέχει: αγαρόζη, 0.8 g/dL, ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.2 ± 0.1, πρόσθετα,<br />
µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Τα gel αγαρόζης περιέχουν 0.31 % βαρβιτάλη και 0.34 % νατριούχο βαρβιτάλη. Μην το καταπίνετε! Αν το καταπιείτε,<br />
συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό !<br />
Χρήση<br />
Μέσο για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τα gel οριζόντια εντός της συσκευασίας τους σε θερµοκρασία δωµατίου (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). (Το βέλος<br />
στην πρόσθια επιφάνεια του κουτιού του κιτ πρέπει να δείχνει προς τα άνω). Αποφύγετε την αποθήκευση κοντά σε παράθυρο ή σε πηγή<br />
θερµότητας. Αποφύγετε τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµοκρασίας κατά τη φύλαξη.<br />
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Πετάξτε τα gel όταν:<br />
(i) σχηµατιστούν κρύσταλλοι ή ίζηµα στην επιφάνεια του gel ή αν η υφή του gel γίνει πολύ µαλακή (όλα αυτά προκύπτουν αν το gel<br />
καταψυχθεί),<br />
(ii) αναπτυχθούν βακτήρια ή µούχλα,<br />
(iii) υπάρχει µεγαλύτερη από το φυσιολογικό ποσότητα στο κουτί του gel (αποτέλεσµα της εξίδρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος από το<br />
gel λόγω ακατάλληλων συνθηκών φύλαξης).<br />
2. ΤΑΙΝΙΕΣ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ<br />
Προετοιµασία<br />
Σπογγώδεις ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα έτοιµες προς χρήση. Καθεµιά περιέχει: ρυθµιστικό διάλυµα tris-βαρβιτάλη pH 9.2 ± 0.3, αζίδιο<br />
του νατρίου, πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το ρυθµιστικό διάλυµα στις ταινίες περιέχει 0.92 % βαρβιτάλη, 1.03 % νατριούχο βαρβιτάλη και 0.30 % αζίδιο του<br />
νατρίου. Μην το καταπίνετε! Αν το καταπιείτε, συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό ! Όταν το πετάτε αποφύγετε επαφή µε οξέα, µόλυβδο ή<br />
χαλκό, καθώς µπορεί να σχηµατιστούν εκρηκτικές ή τοξικές ενώσεις µε το αζίδιο του νατρίου.<br />
Χρήση<br />
Οι ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα λειτουργούν ως δεξαµενή ρυθµιστικού διαλύµατος για την ηλεκτροφόρηση και εξασφαλίζουν επαφή<br />
µεταξύ του gel και των ηλεκτροδίων.<br />
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Ο∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τις ταινίες σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Παραµένουν σταθερές µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται<br />
στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και της συσκευασίας των ταινιών.<br />
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Πετάξτε τις ταινίες αν η συσκευασία τους έχει ανοιχθεί και οι ταινίες έχουν στεγνώσει.<br />
3. ΜΕΣΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΧΡΩΣΗΣ<br />
Προετοιµασία<br />
Το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής πρέπει να χρησιµοποιείται όπως περιγράφεται στην παράγραφο “ΧΡΩΣΤΙΚΗ<br />
AMIDOBLACK“.<br />
Περιέχει όξινο διάλυµα.<br />
Χρήση<br />
Για την παρασκευή του διαλύµατος χρωστικής amidoblack.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής σε θερµοκρασία δωµατίου ή στοψυγείο. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία<br />
λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ.<br />
Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου.<br />
4. ΧΡΩΣΤΙΚΗ AMIDOBLACK<br />
Προετοιµασία<br />
Η πυκνή χρωστική amidoblack είναι ένα ιξώδες διάλυµα το οποίο ενδέχεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλότητα του πυκνού<br />
διαλύµατος χρωστικής δεν επηρεάζεται από την αύξηση της γλοιότητάς του ή τη στερεοποίησή του.<br />
Σε όλες τις περιπτώσεις, για να επιτύχετε τέλεια ανασύσταση της χρωστικής, σας συνιστούµε να ακολουθήσετε την εξής διαδικασία :<br />
1. Προσθέστε 15 mL του µέσου αραίωσης χρωστικής στο φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος.<br />
2. Κλείστε προσεκτικά το φιαλίδιο.<br />
3. Ανακινήστε έντονα το φιαλίδιο για περίπου 5 δευτερόλεπτα.<br />
4. Αδειάστε αυτό το διάλυµα στο δοχείο που προορίζεται για την επεξεργασία του διαλύµατος χρωστικής.<br />
5. Επαναλάβετε αυτό το βήµα δύο φορές, ή τρεις αν χρειάζεται.<br />
6. Αδειάστε το υπόλοιπο µέσο αραίωσης στο δοχείο και συµπληρώστε µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ έως όγκου 300 ml.<br />
7. Ανακινήστε καλά τα περιεχόµενα του δοχείου για 5 - 10 λεπτά.<br />
Το διάλυµα χρωστικής είναι έτοιµο προς χρήση.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ατελής ανασύσταση της χρωστικής θα οδηγήσει σε υποεκτίµηση του κλάσµατος της αλβουµίνης.<br />
Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας της χρωστικής περιέχει: όξινο διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενογλυκόλη, 6.7 %,<br />
πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Επιβλαβές αν καταποθεί.<br />
Χρήση<br />
Για τη χρώση των gel µετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό πρωτεϊνών.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το διάλυµα χρωστικής είναι σχεδιασµένο για χρώση µόνο 10 gel. Αλλάξτε το διάλυµα µετά από 10 διαδικασίες χρώσης.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε τα διαλύµατα προ και µετά την αραίωση σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο σε κλειστούς περιέκτες για να αποτραπεί η<br />
εξάτµιση. Το πυκνό διάλυµα χρωστικής είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας<br />
του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
Το διάλυµα εργασίας είναι σταθερό για 1 µήνα.<br />
Μην αποθηκεύετε το διάλυµα χρώσης κοντά σε πηγή θερµότητας.<br />
5. ΕΦΑΡΜΟΓΕΙΣ<br />
Χρήση<br />
Έτοιµοι, εφαρµογείς µιας χρήσης για τοποθέτηση των δειγµάτων.<br />
Φύλαξη<br />
Φυλάσσετε τους εφαρµογείς σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο.<br />
6. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ<br />
Χρήση<br />
Μιας χρήσης απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα της υγρασίας από την επιφάνεια του gel πριν την τοποθέτηση των δειγµάτων.<br />
Αποθήκευση<br />
Τα λεπτά διηθητικά χαρτιά αποθηκεύονται σε στεγνό µέρος, σε θερµοκρασία δωµατίου ή σε ψύξη.<br />
ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ<br />
1. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ<br />
Προετοιµασία<br />
Κάθε φιαλίδιο ∆ιαλύµατος Αποχρωµατισµού (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>0, 10 φιαλίδια, 100 mL το καθένα) αραιώνεται έως τα 100 λίτρα µε απεσταγµένο<br />
ύδωρ. Είναι ευχερές να αραιώνονται µόνο 5 mL του διαλύµατος στα 5 λίτρα, τον όγκο του περιέκτη του διαλύµατος αποχρωµατισµού.<br />
Μετά την αραίωση το διάλυµα αποχρωµατισµού περιέχει: κιτρικό οξύ 0.05 g/dL.<br />
Χρήση<br />
Για αποχρωµατισµό, δηλαδή αφαίρεση της περίσσειας χρωστικής από τη γέλη.<br />
Για καθαρισµό του τµήµατος χρώσης.<br />
Για την εξουδετέρωση της οξύτητας του διαλύµατος αποχρωµατισµού, προσθέστε 15 mL διαλύµατος 50 % υδροξειδίου του νατρίου, στο<br />
κενό δοχείο αχρήστων.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το διάλυµα προ της αραίωσης σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία<br />
λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων του διαλύµατος.<br />
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. Το αραιωµένο διάλυµα είναι σταθερό για µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου σε κλειστό δοχείο. Μην προσθέτετε<br />
αζίδιο του νατρίου.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.<br />
Για να αποτρέψετε πολλαπλασιασµό µικροβίων στο αραιωµένο διάλυµα αποχρωµατισµού αν πρόκειται να το φυλάξετε για περισσότερο<br />
από µια εβδοµάδα, προσθέστε 5 µL/dL ProClin 300.<br />
Το διάλυµα εργασίας στο οποίο έχει προστεθεί ProClin είναι σταθερό σε κλειστό δοχείο σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο µέχρι την<br />
ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων.<br />
2. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΝΣΗΣ HYDRASYS<br />
Προετοιµασία<br />
Κάθε φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος έκπλυνσης HYDRASYS (SEBIA, PN 4<strong>54</strong>1, 10 φιαλίδια, 80 mL το καθένα) αραιώνεται στα 5 λίτρα, µε<br />
απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. Μετά την αραίωση το διάλυµα εργασίας περιέχει: αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 8.8 ± 0.3, αζίδιο του<br />
νατρίου.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το πυκνό διάλυµα περιέχει 0.625 % αζίδιο του νατρίου. Μην το πίνετε! Αν το πιείτε, συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό! Το<br />
αζίδιο του νατρίου µπορεί να οδηγήσει σε σχηµατισµό εκρηκτικών ή τοξικών ουσιών όταν έρχεται σε επαφή µε οξέα, µόλυβδο ή χαλκό.<br />
Πάντοτε ξεπλένετε µε άφθονο νερό όταν το πετάτε.<br />
Χρήση<br />
Το διάλυµα έκπλυνσης χρησιµεύει για την αποµάκρυνση των µη κακατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από τα gel. Χρησιµεύει επίσης για<br />
καθαρισµό του θαλάµου χρώσης του HYDRASYS. Χρησιµοποιείτε το περιοδικά, π.χ. αν το όργανο λειτουργεί καθηµερινά, πλένετε το<br />
θάλαµο χρώσης κάθε εβδοµάδα.<br />
∆είτε το φύλλο οδηγιών για οδηγίες χρήσης.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η<br />
οποία σηµειώνεται στις ετικέττες των φιαλιδίων του διαλύµατος.<br />
Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης.<br />
3. FLUIDIL<br />
Προετοιµασία<br />
Το Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 φιαλίδιο, 5 mL) είναι έτοιµο προς χρήση.<br />
Χρήση<br />
Για τη διάλυση ιξωδών ή θολών δειγµάτων, π.χ. οροί µε κρυοσφαιρίνες.<br />
Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης<br />
Φυλάσσεται σε θερµοκρασία δωµατίου. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου του<br />
Fluidil.<br />
Το Fluidil πρέπει να είναι ελεύθερο ιζήµατος.<br />
ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΞΑΡΤΗΜΑΤΑ<br />
1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 ή PN 1211.<br />
2. Σύστηµα µικροπιπεττών, χειροκίνητο ή αυτόµατο, όπως το HYDRAplus SEBIA, PN 1215, ως εναλλακτικός τρόπος φόρτωσης των<br />
εφαρµογέων δειγµάτων.<br />
3. Θάλαµος Υγρής Φύλαξης, PN 1270, παρεχόµενος µε το HYDRASYS.<br />
4. Κιτ περιεκτών παρεχόµενο µε το HYDRASYS.<br />
5. Πιπέττες: 10 µL και 200 µL.<br />
6. Πυκνόµετρο / σαρωτής µε δυνατότητα σάρωσης gel 82 x 102 mm στα 570 nm ή µε κίτρινο φίλτρο, π.χ. HYRYS SEBIA ή PHORESIS.<br />
Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης και βαθµονόµησης του κατασκευαστή.<br />
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ<br />
Λήψη και διατήρηση δειγµάτων<br />
Η ανάλυση συνιστάται να γίνεται σε φρέσκα δείγµατα. Ο ορός και τα ούρα πρέπει να συλλέγονται σύµφωνα µε τις καθιερωµένες<br />
διαδικασίες κλινικής εργαστηριακής πρακτικής. ∆ιατηρήστε τα δείγµατα στο ψυγείο στους 2 ως 8 °C για έως µια εβδοµάδα. Για µακρότερη<br />
διατήρηση, διατηρήστε τα κατεψυγµένα (σταθερά για τουλάχιστον ένα µήνα).<br />
Κατεψυγµένα δείγµατα ορού µε αζίδιο του νατρίου, 0.02 g/dL, ή κατεψυγµένα δείγµατα ούρων µε HEPES 0.1 M (pH 6.75) και αζίδιο του<br />
νατρίου, 0.02 g/dL διατηρούνται περισσότερο.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Αποφύγετε το βορικό οξύ ως συντηρητικό.<br />
Τα αποψυγµένα δείγµατα µπορεί να δώσουν ελαφρά σηµάδια στο σηµείο εφαρµογής οφειλόµενα σε µετουσίωση πρωτεϊνών ή<br />
λιποπρωτεϊνών. Η διατήρηση στους 2 ως 8 °C και η κατάψυξη µπορούν να προκαλέσουν µετακίνηση προς την άνοδο των βήταλιποπρωτεϊνών<br />
από τη βήτα-ζώνη στην άλφα-2 ή άλφα-1. Όσο πιο παλιός ο ορός, τόσο µεγαλύτερη η µετακίνηση.<br />
Προετοιµασία των δειγµάτων<br />
1. Οροί<br />
Χρησιµοποιείτε µη αραιωµένα δείγµατα ορού.<br />
Μετά από ψύξη ή κατάψυξη, µερικοί οροί (ιδιαίτερα εκείνοι που περιέχουν κρυοσφαιρίνες) µπορεί να γίνουν ιξώδεις ή να αναπτύξουν<br />
θολερότητα. Τέτοιοι οροί µπορεί να παρουσιάσουν προβλήµατα εφαρµογής λόγω παρακώλυσης της διάχυσης στα δόντια του<br />
εφαρµογέα δείγµατος. Σε αυτήν την περίπτωση, προσθέστε 25 µL Fluidil σε 75 µL ορού και περιδινήστε (vortex) για 15 sec. Στη<br />
συνέχεια ακολουθήστε την τυπική διαδικασία.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
2. Συµπυκνωµένα ούρα<br />
Η ανάλυση γίνεται σε δείγµατα συµπυκνωµένα σε συνολική πρωτεϊνική συγκέντρωση περίπου 1.5 - 2.0 g/dL (µε κατάλληλη συσκευή).<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Μερικές φορές τα ούρα περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων. Αυτό µπορεί να προκαλέσει παραµόρφωση του gel<br />
κατά την ηλεκτροφόρηση και συνεπώς αλλοίωση των προφίλ ηλεκτροφόρησης. Αν η αλλοίωση αυτή καθιστά την ερµηνεία των<br />
αποτελεσµάτων ανακριβή, τα ούρα πρέπει να απαλλαγούν από τα άλατα.<br />
Η διάχυση των δειγµάτων ούρων στις υποδοχές του εφαρµογέα µπορεί να παρακωλύεται όταν τα ούρα είναι θολά. Συνιστάται η<br />
αποµάκρυνση των σωµατιδίων µε φυγοκέντρηση (π.χ. 10 min στις 3,000 rpm) ή διήθηση (π.χ. ηθµός 0.45 µm).<br />
∆είγµατα προς αποφυγή<br />
• Αποφύγετε αιµολυµένα δείγµατα. Η αιµόλυση αυξάνει τις ζώνες άλφα-2 και βήτα.<br />
• Αποφύγετε δείγµατα πλάσµατος. Το ινωδογόνο δίνει µια ζώνη στο ίχνος αναφοράς κοντά στο σηµείο εφαρµογής η οποία θα µπορούσε<br />
να εκληφθεί ως µονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη και επηρεάζει τη µέτρηση της σχετικής συγκέντρωσης της ζώνης.<br />
• Αποφύγετε παλαιά, πληµµελώς διατηρηµένα δείγµατα ούρων, στα οποία µπορεί να έχει συµβεί ενζυµατική διάσπαση των πρωτεϊνών.<br />
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ<br />
Το σύστηµα HYDRASYS είναι ένα ηµι-αυτοµατοποιηµένο πολυπαραµετρικό όργανο. Τα αυτοµατοποιηµένα στάδια λειτουργίας<br />
περιλαµβάνουν την επεξεργασία των gel αγαρόζης <strong>HYDRAGEL</strong> µε την ακόλουθη σειρά: εφαρµογή δειγµάτων, ηλεκτροφόρηση, στέγνωµα,<br />
χρώση, αποχρωµατισµός και τελικό στέγνωµα. Τα χειροκίνητα στάδια περιλαµβάνουν το χειρισµό των δειγµάτων και των gel καθώς και την<br />
προετοιµασία του οργάνου για λειτουργία. ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΕΓΧΕΙΡΙ∆ΙΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ ΤΟΥ HYDRASYS.<br />
I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ<br />
1. Θέστε το HYDRASYS σε λειτουργία.<br />
2. Τοποθετήστε τρεις εφαρµογείς σε µια επίπεδη επιφάνεια µε τους αριθµούς των βοθρίων στη δεξιά πλευρά (Εικ. 1).<br />
- Τοποθετήστε 10 µL από τα δείγµατα στα βοθρία του εφαρµογέα. Φορτώστε κάθε εφαρµογέα εντός 2 min.<br />
- Τοποθετήστε τους εφαρµογείς στο θάλαµο υγρής φύλαξης µε τα δόντια προς τα άνω (κρατήστε τον από το πλαστικό<br />
προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών).<br />
- Αφήστε τα δείγµατα να διαχυθούν στα δόντια για 5 min µετά την τοποθέτηση του τελευταίου δείγµατος.<br />
- Για ύστερη χρήση (ως 8 ώρες) τοποθετήστε ολόκληρο το θάλαµο στο ψυγείο.<br />
Βλέπε το φύλλο οδηγιών του θαλάµου υγρής φύλαξης για περισσότερες λεπτοµέρειες.<br />
3. Ανοίξτε το καπάκι της Μονάδας Ηλεκτροφόρησης και σηκώστε τους φορείς των ηλεκτροδίων και του εφαρµογέα.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ποτέ µην κλείνετε το καπάκι ενώ οι φορείς είναι σηκωµένοι!<br />
4. Επιλέξτε το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>&B1-B2» από το µενού του οργάνου (αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου).<br />
5. Αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από τη συσκευασία τους. Κρατήστε τις από την πλαστική άκρη τους. Προσαρµόστε<br />
τη σηµαδεµένη άκρη των ταινιών στις ακίδες του φορέα ηλεκτροδίων, το πλαστικό κάλυµµα της ταινίας πρέπει να είναι στραµµένο<br />
προς το φορέα (Εικ. 2).<br />
6. Ανοίξτε τη συσκευασία του <strong>HYDRAGEL</strong>.<br />
- Περάστε γρήγορα και οµοιόµορφα ένα διηθητικό χαρτί στην επιφάνεια του gel για να απορροφήσει την περίσσεια υγρού.<br />
Αφαιρέστε το χαρτί αµέσως.<br />
ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Μην αφήνετε το διηθητικό χαρτί σε επαφή µε το gel επί µακρόν για να µην αφυδατωθεί.<br />
- Εισαγάγετε 200 µL απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ µέχρι το κατώτερο τρίτο της κλίµακας που είναι τυπωµένη στην Πλάκα<br />
Ελέγχου Θερµοκρασίας της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
- Τοποθετήστε την πλακέτα του gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) µε το άκρο της να αγγίζει το stop στο κάτω τµήµα της<br />
τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 3).<br />
- Λυγίστε το gel και χαµηλώστε το επί της επιφάνειας του νερού. (Εικ. 3). Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα,<br />
ότι το νερό έχει απλωθεί κάτω από ολόκληρη την πλακέτα του gel και το gel είναι ευθυγραµµισµένο µε την τυπωµένη κλίµακα.<br />
7. Κατεβάστε και τους δύο φορείς. Σε αυτήν τη θέση, οι ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος δεν αγγίζουν το gel. ΜΗΝ ΠΙΕΖΕΤΕ ΤΟΥΣ<br />
ΦΟΡΕΙΣ ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΟΣ ΤΑ ΚΑΤΩ.<br />
8. Αφαιρέστε τον εφαρµογέα από τον υγρό θάλαµο. Κρατήστε τον από το προστατευτικό κάλυµµα.<br />
- Αποσπάστε το προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών του εφαρµογέα.<br />
- Τοποθετήστε τους εφαρµογείς στις θέσεις N° 2, 6 και 10.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Οι τυπωµένοι αριθµοί στον εφαρµογέα πρέπει να είναι στραµµένοι προς τον χειριστή (Εικ. 4).<br />
9. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης.<br />
10. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Βεβαιωθείτε ότι η είσοδος αερισµού στη δεξιά πλευρά του οργάνου είναι ελεύθερη.<br />
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ<br />
• Οι δύο φορείς χαµηλώνουν ώστε οι ταινίες µε το ρυθµιστικό διάλυµα και ο εφαρµογέας να είναι σε επαφή µε την επιφάνεια του gel.<br />
• Ο φορέας του εφαρµογέα σηκώνεται.<br />
• Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό συνεχές ρεύµα 20 W, στους 20 °C, µέχρι να συµπληρωθούν 24 Vh, για περίπου 5 min.<br />
• Ο φορέας ηλεκτροδίων ανυψώνεται για να αποσυνδεθούν τα ηλεκτρόδια.<br />
• Η θερµοκρασία της πλακέτας ελέγχου αυξάνεται στους 65 °C για 10 min για να στεγνώσει το gel.<br />
• Η πλακέτα ελέγχου κρυώνει. Όταν φτάσει τους 50 °C, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας ηλεκτροφόρησης. Η<br />
θερµοκρασία της πλακέτας ελέγχου παραµένει στους 50 °C µέχρι να ανοιχθεί το καπάκι. Στη συνέχεια η θερµοκρασία συνεχίζει να<br />
πέφτει µέχρι τους 20 °C (σε λιγότερο από 5 min) και στη συνέχεια µπορεί να ακολουθήσει νέα ηλεκτροφόρηση.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει κλειστό κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της ηλεκτροφόρησης.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
II. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL<br />
1. Ανοίξτε το καπάκι.<br />
2. Αφαιρέστε τους εφαρµογείς και πετάξτε τον.<br />
3. Σηκώστε και τους δύο φορείς, αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από την πλαστική άκρη τους και πετάξτε τις.<br />
4. Αφαιρέστε το στεγνωµένο gel για περαιτέρω επεξεργασία.<br />
5. Μετά από κάθε χρήση, σκουπίστε τα ηλεκτρόδια και την πλάκα ελέγχου θερµοκρασίας µε µαλακό υγρό απορροφητικό χαρτί.<br />
6. Ανοίξτε τον στατήρα των gel. Τοποθετήστε το στεγνό gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) στις αύλακες και κλείστε τον<br />
στατήρα. Βεβαιωθείτε ότι το film είναι σωστά τοποθετηµένο µέσα στον στατήρα (Εικ. 5).<br />
7. Τοποθετήστε τον στατήρα στη Μονάδα Επεξεργασίας / Χρώσης των gel.<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Πριν την έναρξη της επεξεργασίας / χρώσης των gel, ελέγξτε τα ακόλουθα:<br />
- ο περιέκτης χρώσης είναι γεµάτος µε 300 mL χρωστικού διαλύµατος,<br />
- ο περιέκτης διαλύµατος αποχρωµατισµού περιέχει τουλάχιστον 1 λίτρο διαλύµατος αποχρωµατισµού,<br />
- ο περιέκτης αχρήστων είναι κενός.<br />
Για τη σύνδεση των γραµµών των αντιδραστηρίων: ανατρέξτε στις πληροφορίες που εµφανίζονται στην οθόνη του οργάνου<br />
(επιλέξτε: REAGENT LINES).<br />
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Μην ξεχνάτε να αποφράσσετε τις µη χρησιµοποιούµενες γραµµές.<br />
8. Επιλέξτε το πρόγραµµα χρώσης «PROT./B1-B2/Hb» από το µενού του οργάνου και αρχίστε τη διαδικασία πατώντας το πλήκτρο<br />
«START» (πράσινο βέλος στη δεξιά πλευρά του πληκτρολογίου).<br />
Κατά τα στάδια χρώσης, αποχρωµατισµού και στεγνώµατος, η µονάδα παραµένει κλειδωµένη.<br />
Μετά το στάδιο ψύξης, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας (ο αερισµός διατηρείται µέχρι την αφαίρεση του<br />
στατήρα των gel).<br />
III. ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL<br />
1. Αφαιρέστε τον στατήρα των gel από τη µονάδα, ανοίξτε τον και αφαιρέστε το στεγνό gel.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μετά τη χρώση / αποχρωµατισµό και πριν την πυκνοµέτρηση / σάρωση, το gel µπορεί να περάσει από ένα ακόµη στάδιο<br />
έκπλυνσης, αν χρειάζεται, για τον περαιτέρω καθαρισµό του background και την αποµάκρυνση υπολειπόµενης χρώσης η οποία<br />
µπορεί να εµφανίζεται µε τη µορφή µπλε κηλίδων. Πλύνετε το gel µε το πρόγραµµα “ WASH ISOENZ/GEL “.<br />
2. Αν χρειαστεί, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιφάνεια του στεγνού φιλµ µε υγρό χαρτί.<br />
3. Σαρώστε µε πυκνόµετρο / σαρωτή στα 570 nm ή µε κίτρινο φίλτρο.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Τα µήκη των ηλεκτροφορηµάτων ενδέχεται να είναι ελαφρώς διαφορετικά στα gel µε 2 ή 3 σειρές ανάλυσης, χωρίς<br />
δυσµενή επίδραση στην απόδοση.<br />
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ<br />
Ποιοτικός έλεγχος<br />
Συνιστάται να περιλαµβάνεται ένας ορός ελέγχου (Ορός Ελέγχου, SEBIA PN 4785) σε κάθε σειρά δειγµάτων.<br />
Τιµές<br />
Η σάρωση (στα 570 nm ή µε κίτρινο φίλτρο) των χρωσµένων ηλεκτροφορηµάτων παρέχει σχετικές συγκεντρώσεις (ποσοστά) των<br />
επιµέρους πρωτεϊνικών ζωνών.<br />
Οι φυσιολογικές τιµές (µ.ο. ± 2 SD) για τις επιµέρους κύριες ηλεκτροφορητικές ζώνες των πρωτεϊνών του ορού στα gel ΗYDRAGEL<br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) στο σύστηµα HYDRASYS έχουν εξαχθεί από ένα υγιή πληθυσµό 158 ενηλίκων (ανδρών και γυναικών).<br />
Η ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών σε UV στο σύστηµα CAPILLARYS αποδίδει παρόµοιες τιµές µε τη νεφελοµετρική µέθοδο (ειδικά για την<br />
αλβουµίνη). Η SEBIA προτείνει τυποποίηση των λαµβανόµενων τιµών µε το <strong>HYDRAGEL</strong> µετά από βαθµονόµηση των συστηµάτων<br />
σάρωσης.<br />
Χωρίς τιµές τυποποίησης Με τιµές τυποποίησης CAPILLARYS KΛAΣMA HYRYS - PHORESIS HYRYS - PHORESIS Αλβουµίνη 59.8 - 72.4 % 53.8 - 65.2 % α-1 σφαιρίνες 1.0 - 3.2 % 1.1 - 3.7 % α-2 σφαιρίνες 7.4 - 12.6 % 8.5 - 14.5 % β σφαιρίνες 7.5 - 12.9 % 8.6 - 14.8 %<br />
| γ σφαιρίνες | 8.0 - 15.8 % | 9.2 - 18.2 % |<br />
Συνιστάται κάθε εργαστήριο να διαµορφώνει τις δικές του φυσιολογικές τιµές.<br />
Ερµηνεία 1-15<br />
Επικουρικά για την ερµηνεία των ηλεκτροφορηµάτων πρωτεϊνών του ορού και των ούρων βλ. τη ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.<br />
Παρεµβολές και περιορισµοί<br />
Βλέπε ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ.<br />
Λόγω των ορίων διακριτικής ικανότητας και ευαισθησίας της ηλεκτροφόρησης, είναι πιθανό κάποια µονοκλωνικά στοιχεία να µην<br />
ανιχνεύονται µε αυτήν τη µέθοδο.<br />
Αντιµετώπιση προβληµάτων<br />
Καλέστε την Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτουργεί παρόλο που οι οδηγίες προετοιµασίας και φύλαξης των<br />
υλικών και οι οδηγίες λειτουργίας τηρούνται προσεκτικά.<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Τα Φύλλα ∆εδοµένων Ασφαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληροφορίες για την ασφαλή απόρριψή τους διατίθενται επίσης από την<br />
Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή.<br />
∆Ε∆ΟΜΕΝΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ<br />
Ανάλυση ορού<br />
Αναπαραγωγιµότητα εντός σειράς ανάλυσης<br />
Τρία (3) διαφορετικά δείγµατα ορού έτρεξαν το καθένα στα <strong>54</strong> ίχνη gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) από 3 παρτίδες. Η µέση τιµή, η SD και<br />
ο CV (n = <strong>54</strong>) υπολογίστηκαν για κάθε δείγµα, κάθε ζώνη και κάθε παρτίδα.<br />
Ο πίνακας δείχνει τα αποτελέσµατα για το δείγµα Νο 1 και τις τρεις παρτίδες.<br />
ΚΛΑΣΜΑ Μέση τιµή (%) SD CV (%) Παρτίδα 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Αλβουµίνη 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 α-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 α-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 β 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8<br />
| γ | 10.5 9.7 9.5 | 0.48 0.45 0.50 | 4.6 4.6 5.2 |<br />
Ο ακόλουθος πίνακας δείχνει τα αποτελέσµατα για το δείγµα Νο 2 και τις τρεις παρτίδες.<br />
ΚΛΑΣΜΑ Μέση τιµή (%) SD CV (%) Παρτίδα 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Αλβουµίνη 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 α-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 α-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 β 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0<br />
| γ | 6.8 5.5 6.1 | 0.37 0.56 0.56 | 5.5 10.1 9.2 |<br />
Ο ακόλουθος πίνακας δείχνει τα αποτελέσµατα για το δείγµα Νο 3 και τις τρεις παρτίδες.<br />
ΚΛΑΣΜΑ Μέση τιµή (%) SD CV (%) Παρτίδα 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Αλβουµίνη 53.8 <strong>54</strong>.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 α-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 α-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 β 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5<br />
| γ | 26.1 25.8 25.3 | 0.35 0.47 0.40 | 1.4 1.8 1.6 |<br />
Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των σειρών<br />
∆εκαοκτώ (18) διαφορετικά δείγµατα ορού έτρεξαν σε 12 gel από 3 παρτίδες <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E). Η µέση τιµή, η SD και ο CV<br />
(n = 12) υπολογίστηκαν για κάθε δείγµα και κάθε ζώνη. Τα αποτελέσµατα ήταν ουσιαστικά όµοια για όλα τα δείγµατα. Ο ακόλουθος πίνακας<br />
παρουσιάζει το εύρος της SD και του CV για όλα τα δείγµατα και τον µέσο CV από τους συγκεντρωµένους CV για όλα τα δείγµατα (n = 18).<br />
ΚΛΑΣΜΑ SD Μέση τιµή CV (%) Αλβουµίνη 0.9 - 1.3 1.6 - 2.1 1.8 α-1 0.2 - 0.3 5.3 - 12.3 8.4 α-2 0.2 - 0.3 1.9 - 3.7 2.8 β 0.3 - 0.4 3.0 - 3.3 3.2<br />
| γ | 0.5 - 0.7 | 2.0 - 11.9 | 6.7 |<br />
Ακρίβεια<br />
Παθολογικά και φυσιολογικά δείγµατα ορού (n = 102) έτρεξαν σε gel <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) και σε <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Οι<br />
παράµετροι συσχέτισης για τις µεµονωµένες ζώνες από τα συγκεντρωµένα δεδοµένα για τα συγκρινόµενα συστήµατα gel (y = <strong>HYDRAGEL</strong><br />
<strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) ήταν (HYRYS) :<br />
ΚΛΑΣΜΑ Συντελεστής συσχέτισης Τοµή του y Κλίση Εύρος % τιµών* Αλβουµίνη 0.994 0.640 1.000 35.4 - 74.3 α-1 0.994 -0.070 1.078 1.1 - 10.5 α-2 0.992 -0.030 0.983 5.4 - 21.4 β 0.985 0.320 0.958 5.0 - 16.5<br />
| γ | 0.996 | 0.050 | 0.966 | 6.6 - 52.5 |<br />
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<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
Οι παράµετροι συσχέτισης για τις µεµονωµένες ζώνες από τα συγκεντρωµένα δεδοµένα για τα συγκρινόµενα συστήµατα gel<br />
(y = <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E)) ήταν (scanner):<br />
ΚΛΑΣΜΑ Συντελεστής συσχέτισης Τοµή του y Κλίση Εύρος % τιµών* Αλβουµίνη 0.964 3.407 0.973 34.5 - 74.1 α-1 0.980 0.030 0.994 1.2 - 9.4 α-2 0.972 0.070 0.949 5.3 - 19.8 β 0.961 0.904 0.874 5.0 - 15.6<br />
| γ | 0.988 | 0.411 | 0.968 | 5.9 - 53.6 |<br />
* Οι % τιµές προσδιορίστηκαν στο σύστηµα <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E).<br />
Ευαισθησία<br />
Τρία παθολογικά δείγµατα ορού, µε µια µονοκλωνική πρωτεΐνη αραιώθηκαν σειριακά και οι αραιώσεις ηλεκτροφορήθηκαν σε gel<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) και <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30. Η µεγαλύτερη αραίωση µε διακριτή µονοκλωνική ζώνη αντιστοιχούσε σε<br />
0.035 - 0.013 g/dL µονοκλωνικής πρωτεΐνης. Έτσι, η χαµηλότερη ανιχνευόµενη συγκέντρωση µονοκλωνικής πρωτεΐνης ήταν 0.013 g/dL.<br />
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανάλογα µε τη θέση του µονοκλωνικού κλάσµατος και του πολυκλωνικού υποβάθρου, το όριο ανίχνευσης ενδέχεται να<br />
ποικίλλει.<br />
Ανάλυση συµπυκνωµένων ούρων<br />
Τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται µε τα gel <strong>HYDRAGEL</strong> δείχνουν πολύ καλή αναπαραγωγιµότητα εντός και µεταξύ σειρών για τα<br />
δείγµατα συµπυκνωµένων ούρων µετά από ποσοτική και ποιοτική ανάλυση. Είκοσι οκτώ (28) διαφορετικά δείγµατα (παθολογικά και<br />
φυσιολογικά) έτρεξαν σε gel <strong>HYDRAGEL</strong> και σε συγκρίσιµο σύστηµα gel αγαρόζης. ∆εν υπήρχαν οπτικά εµφανείς διαφορές µεταξύ των<br />
συστηµάτων. Η ευαισθησία ανίχνευσης προσδιορίστηκε, από τις υψηλότερες αραιώσεις µονοκλωνικής πρωτεΐνης που έδωσαν ορατή ζώνη,<br />
στα 0.048 g/dL.<br />
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ<br />
(1) Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996.<br />
(2) Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9,<br />
21/03/91, p. 782 à 785.<br />
(3) Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas<br />
d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278.<br />
(4) Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory.<br />
Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41.<br />
(5) Keren D. F., “High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,<br />
2nd ed., 1994, 397 pp.<br />
(6) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de<br />
diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212.<br />
(7) Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic<br />
protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, 1991,<br />
Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285.<br />
(8) Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993.<br />
(9) Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier<br />
- Paris.<br />
(10) Le Carrer D. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33.<br />
(11) North M.L. Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n° 203, p. <strong>54</strong> à 58.<br />
(12) Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23.<br />
(13) Sicard D. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515.<br />
(14) Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351.<br />
(15) Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139.<br />
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SEBIA INSTRUKTION - Dansk
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>54</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) - 2005/02<br />
SCHÉMAS / FIGURES<br />
Figure 1 Figure 2<br />
1 2 3 4 567 8 9 10 11 121314 15<br />
Figure 3 Figure 4<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12<br />
sebia<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15<br />
Figure 5<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30<br />
sebia<br />
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15<br />
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>PROTEIN</strong>(E) 15/30<br />
sebia<br />
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15<br />
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