HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - Sebia Electrophoresis
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - Sebia Electrophoresis
- No tags were found...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>HYDRAGEL</strong> <strong>HEMOGLOBIN</strong>(E) <strong>K20</strong> - 2005/03<br />
Préparation des échantillons<br />
• Agiter le tube primaire avant de prélever le volume de sang total à traiter.<br />
• Centrifuger le sang total, pendant 5 minutes à 5 000 tr/min.<br />
• Éliminer le plasma.<br />
• Laver 2 fois les globules rouges par 10 volumes d’eau physiologique. Les volumes de globules rouges inférieurs à 10 µL doivent être manipulés<br />
avec précaution.<br />
• Éliminer l’excès d’eau physiologique à la surface du culot globulaire lavé, les agiter au vortex avant de prélever les 10 µL à hémolyser.<br />
• Hémolyser 10 µL de globules rouges par 130 µL de solution hémolysante.<br />
• Agiter au vortex pendant 10 secondes puis incuber 5 minutes à température ambiante.<br />
NOTES :<br />
- Pour des sujets anémiés, la quantité de globules rouges hémolysés peut-être augmentée :<br />
- 15 µL pour des sujets moyennement anémiés (environ 0,1 g/mL Hb) ;<br />
- 20 µL pour des sujets fortement anémiés (moins de 0,07 g/mL Hb) ; et 130 µL de solution hémolysante.<br />
L’intensité des fractions sera augmentée sans modifier la proportion de chaque fraction.<br />
- Il n’est pas nécessaire de filtrer ni de centrifuger les hémolysats.<br />
- La solution hémolysante n’affecte pas l’hémoglobine instable Bart.<br />
- En cas de suspicion d’hémoglobine H, il est conseillé de préparer un hémolysat plus concentré, par exemple 10 µL de globules rouges et 30 µL<br />
de solution hémolysante.<br />
TECHNIQUE<br />
I. MIGRATION<br />
1. Poser le porte-applicateur <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>K20</strong> à plat sur la paillasse (Fig. 1) et relever le chariot porte-applicateur.<br />
2. Déposer 120 µL d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau du porte-applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.<br />
3. Sortir le gel de son emballage.<br />
4. Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin.<br />
ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation.<br />
5. Placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte-applicateur contre la barrette, à l’intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 2).<br />
6. Donner une forme concave au gel (Fig. 2) et le dérouler sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la<br />
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d’air éventuellement piégées, puis dérouler totalement le gel au contact du<br />
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.<br />
7. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en position intermédiaire, la manette située sur le côté du porte-applicateur en position haute.<br />
8. Poser un applicateur à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 3).<br />
9. Déposer 10 µL d’échantillon hémolysé dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 minutes.<br />
L’applicateur doit être utilisé immédiatement après le chargement.<br />
Pour un dépôt différé (8 heures maximum), placer l’applicateur dans la chambre humide dents vers le haut (en manipulant l’applicateur par la<br />
protection en plastique), placer la chambre humide au réfrigérateur et ne placer le gel sur le porte-applicateur <strong>HYDRAGEL</strong> <strong>K20</strong> qu’au moment<br />
de l’utilisation.<br />
Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation.<br />
10. Éliminer la protection des dents de l’applicateur.<br />
11. Placer l'applicateur en position n° 4 sur le porte-applicateur.<br />
IMPORTANT : Les numérotations de l’applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4).<br />
12. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en butée, à l’aide de la manette du porte-applicateur pour amener l’applicateur au contact du gel.<br />
NE PAS FORCER LA DESCENTE DU CHARIOT.<br />
13. Après 1 minute d’application, tourner la manette du porte-applicateur pour relever l’applicateur et le jeter.<br />
14. Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse, selon la polarité indiquée sur le gel, bas du gel côté cathodique.<br />
Positionner l’<strong>HYDRAGEL</strong> sur le portoir de la cuve <strong>K20</strong>. La face gel est orientée vers le bas et le gel plonge dans le tampon sur une distance<br />
de 1 cm de chaque côté.<br />
Voir la notice de la cuve <strong>K20</strong> pour les instructions d’utilisation.<br />
15. Brancher la cuve au générateur.<br />
CONDITIONS DE MIGRATION SEBIA <strong>K20</strong> Volume de tampon par compartiment 150 mL Volume total de tampon 300 mL Temps de migration 15 minutes Voltage constant 165 V<br />
| Ampérage de départ (par gel) | 7 ± 2 mA |<br />
16. Après migration, débrancher la cuve et sortir le gel.<br />
II. FIXATION<br />
Elle peut se faire de deux façons : fixation à la chaleur ou à l’aide de la solution de fixation.<br />
Fixation à la chaleur (uniquement avec l’incubateur-sécheur IS 80 SEBIA) :<br />
Sécher le gel sous air chaud à 80 °C dans l’incubateur-sécheur IS 80 jusqu'à séchage complet (pendant 10 minutes minimum).<br />
- 4 -