HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Utilização Para hemolisar os glóbulos vermelhos do sangue. Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração Armazenar a solução hemolisante à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco da solução hemolisante. Deitar fora a solução hemolisante se o seu aspecto se alterar, isto é, se ficar turva devido a contaminação microbiana. 7. APLICADORES Utilização Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras. Armazenamento Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. 8. PAPEIS DE FILTRO FINOS Utilização Pré-cortados, de utilização única, estes finos papéis absorventes destinam-se à absorção do excesso de líquido da superfície do gel antes da aplicação da amostra. Armazenamento Armazenar os papéis de filtro finos num local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. SORO FISIOLÓGICO Preparação Preparar uma solução a 0,15 M (9 g/l) de NaCl em água destilada ou desmineralizada. Utilização Para lavar os glóbulos vermelhos. Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. Deitar fora após 3 meses ou se notar alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva devido a contaminação microbiana. Para conservar por períodos de tempo mais alargado, adicionar azida de sódio (1 g/l). 2. FIXADOR (facultativo) Preparação Pelo menos 15 minutos antes da utilização, preparar o fixador (v/v): 60 % de etanol ; 10 % de ácido acético ; 30 % de água destilada ou desmineralizada. Misturar bem. Utilização Fixação das proteínas separadas por electroforese em geles de agarose. Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração Armazenar à temperatura ambiente em frasco bem rolhado para evitar a evaporação. Deitar fora passados 3 meses. Não fixar mais que 4 geles em cada 150 ml de fixador. EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Fonte de alimentação, ex: GD 61 D SEBIA, ref. n° 1300 ; GD 251 D SEBIA, ref. n° 1301 ; MG 300 SEBIA, ref. n° 1302 ou MG 500 SEBIA, ref. n° 1303. 2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, ref. n° 1409, que contém o suporte-aplicador HYDRAGEL K20. 3. Câmara húmida, ref. n° 1270. 4. Câmara de electroforese: K20 SEBIA, ref. n° 1400. 5. Tinas e suportes para o tratamento de geles de 7 amostras: kit de acessórios HYDRAGEL K20 SEBIA ref. n° 1420. 6. Pipetas: 5 µl, 10 µl e 200 µl. 7. Incubador-secador: IS 80 SEBIA, ref. n° 1430. 8. Densitómetro/scanner capaz de ler geles de 82 x 51 mm a 570 nm (filtro amarelo): HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou scanner equipado com logiciel PHORESIS SEBIA. Seguir as instruções de cada aparelho na sua utilização e calibração. AMOSTRAS A ANALIZAR Colheita e conservação das amostras É recomendada a utilização de amostras de sangue frescas colhidas com anticoagulante. Podem ser usados tubos de colheita contendo como anticoagulante EDTA, citratos ou heparina ; evitar os que contenham iodoacetato. O sangue deve ser colhido de acordo com os métodos utilizados nos laboratórios de análises clínicas. Se necessário, armazenar o sangue entre 2 - 8 °C até cinco dias. Preparação das amostras • Homogeneize o tubo de colheita antes de retirar o sangue total a preparar. • Centrifugar o sangue com anticoagulante a 5000 rpm durante 5 minutos. • Deitar fora o plasma. • Lavar as glóbulos vermelhos 2 vezes com 10 volumes de soro fisiológico: deve ser tomado o maior cuidado quando se estiver a manipular volumes de glóbulos vermelhos inferiores a 10 µl. - 45 -
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 • Elimine o excesso de solução salina que se encontra como sobrenadante dos glóbulos vermelhos e agite-os no vórtex antes de extrair 10 µL para hemólise. • Hemolisar 10 µl de glóbulos vermelhos com 130 µl de solução hemolisante. • Agitar no vortex durante 10 segundos e incubar 5 minutos à temperatura ambiente. NOTAS: - Para preparar um hemolisado de indivíduos anémicos o volume de glóbulos vermelhos (obtidos após centrifugação), pode ser aumentado : - 15 µl para indivíduos levemente anémicos (aproximadamente 0,1 g/ml de Hb) - 20 µl para indivíduos muito anémicos (< 0,07 g/ml de Hb), e 130 µl de solução hemolisante. Como consequência, a intensidade da coloração vai aumentar sem modificar a proporção de cada fracção. - Não é necessário filtrar ou centrifugar o hemolisado. - A solução hemolisante SEBIA não afecta a hemoglobina instável de Bart. TÉCNICA I. MIGRAÇÃO 1. Colocar o suporte-aplicador HYDRAGEL K20 sobre a bancada (Fig. 1) e erguer a parte móvel do mesmo (suporte dos aplicadores). 2. Colocar 120 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso no suporte-aplicador. 3. Retirar o gel da embalagem. 4. Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino. ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação. 5. Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso no suporte-aplicador (Fig. 2). 6. Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 2) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura do gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal. A gota de água deve-se repartir sobre toda a superfície do gel. 7. Baixar o suporte dos aplicadores até uma posição intermédia, com o botão, situado lateralmente, voltado para cima. 8. Colocar um aplicador numa superfície plana, com os números dos poços virados para cima. 9. Aplicar 10 µl de amostra hemolisada em cada poço. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar os 2 minutos. O aplicador deve ser utilizado imediatamente após a colocação das amostras. Para uma utilização posterior (8 horas no máximo), colocar o aplicador na câmara húmida com os dentes voltados para cima (segure-o pela protecção de plástico), pôr a câmara húmida no frigorífico e só colocar o gel no suporte-aplicador HYDRAGEL K20 no momento da sua utilização. Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes. 10. Quebrar e retirar a protecção dos dentes. 11. Colocar o aplicador na posição n° 4 do suporte-aplicador. IMPORTANTE: Os números impressos no aplicador devem ficar virados para o operador (Fig. 4). 12. Baixar o suporte do aplicador rodando o botão lateral de modo a que o aplicador fique em contacto com o gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA DO SUPORTE DOS APLICADORES. 13. Após 1 minuto de aplicação, rodar o botão lateral para levantar o aplicador. Retirar o aplicador e deitar fora. 14. Colocar o gel na câmara de electroforese, segundo a polaridade indicada no gel,com as amostras no lado do cátodo. Posicionar o HYDRAGEL no suporte da tina K20 com o lado do gel voltado para baixo ; o gel deve mergulhar cerca de 1cm no tampão, de cada lado. Ver instruções da câmara K20 para mais pormenores. 15. Ligar a tina à fonte de alimentação. CONDIÇÕES DE MIGRAÇÃO SEBIA K20 Volume de tampão por compartimento 150 mL Volume total de tampão 300 mL Tempo de migração 15 minutes Voltagem constante 165 V | Corrente inicial (por gel) | 7 ± 2 mA | 16. Após migração, desligar a tina e retirar o gel. II. FIXAÇÃO DAS PROTEÍNAS Pode-se fazer de duas maneiras : fixação pelo calor ou com solução de fixação. Fixação pelo calor (só com o incubador-secador IS 80 SEBIA) : Secar o gel sob ar quente a 80 °C no incubador-secador IS 80 até secagem completa (durante 10 minutes mínimo). Fixação com solução de fixação: 1. Colocar o gel num suporte para geles (fornecido com o kit de acessórios SEBIA HYDRAGEL K20). 2. Encher uma tina (fornecida com o kit de acessórios SEBIA HYDRAGEL K20) com 150 ml de solução de fixação. 3. Imergir o gel verticalmente no fixador durante 15 minutos. 4. Retirar o gel e secá-lo sob ar quente a 80 °C no incubador-secador IS 80. IMPORTANTE : O gel deve estar perfeitamente seco. - 46 -
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