HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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6. SOLUTION HÉMOLYSANTE HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Préparation La solution hémolysante est prête à l’emploi. C’est un tampon avec des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. Utilisation Pour l’hémolyse des globules rouges. Conservation, stabilité et signes de détérioration La solution hémolysante peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. Elle est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de solution hémolysante. Éliminer la solution hémolysante s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 7. APPLICATEURS Utilisation Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons. Conservation Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. 8. PAPIERS-FILTRES FINS Utilisation Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons. Conservation Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS 1. EAU PHYSIOLOGIQUE Préparation Solution de NaCl 0,15 M (9 g/L) dans l’eau distillée ou déminéralisée. Utilisation Pour le lavage des globules rouges. Conservation, stabilité et signes de détérioration La solution d’eau physiologique peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. Éliminer la solution après 3 mois ou s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. Pour une conservation prolongée, ajouter 1 g/L d’azoture de sodium. 2. SOLUTION DE FIXATION (facultatif) Préparation Au minimum 15 minutes avant l’utilisation, préparer une solution contenant (vol./vol.) : 60 % d’éthanol, 10 % d’acide acétique et 30 % d’eau distillée ou déminéralisée. Bien mélanger. Utilisation Pour la fixation des hémoglobines séparées par électrophorèse en gel d’agarose. Conservation, stabilité et signes de détérioration La solution de fixation doit être conservée à température ambiante dans un récipient hermétiquement fermé pour éviter l’évaporation. Éliminer la solution après 3 mois. Ne pas fixer plus de 4 gels dans 150 mL de solution de fixation. ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES 1. Générateur de courant : GD 61 D SEBIA, référence N° 1300 ; GD 251 D SEBIA, référence N° 1301 ; MG 300 SEBIA, référence N° 1302 ou MG 500 SEBIA, référence N° 1303. 2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, référence N° 1409, contenant le porte-applicateur HYDRAGEL K20. 3. Chambre humide, référence N° 1270. 4. Cuve d’électrophorèse : K20 SEBIA, référence N° 1400. 5. Bacs et portoirs pour le traitement des demi-gels : kit accessoires HYDRAGEL K20 SEBIA, référence N° 1420. 6. Pipettes de 5 µL, 10 µL et 200 µL. 7. Incubateur-sécheur : IS 80 SEBIA, référence N° 1430. 8. Densitomètre / scanner capable de lire un film de 82 x 51 mm à 570 nm (filtre jaune) : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou scanner équipé du logiciel PHORESIS SEBIA. Se reporter aux instructions de chaque appareil pour son utilisation et sa calibration. ÉCHANTILLONS À ANALYSER Prélèvement et conservation des échantillons L’analyse se fait sur sangs frais, prélevés sur anticoagulant (EDTA, citrate ou héparine). Éviter les anticoagulants contenant de l'iodoacétate. Les sangs doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques. Les sangs peuvent être conservés moins de cinq jours au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). - 3 -
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Préparation des échantillons • Agiter le tube primaire avant de prélever le volume de sang total à traiter. • Centrifuger le sang total, pendant 5 minutes à 5 000 tr/min. • Éliminer le plasma. • Laver 2 fois les globules rouges par 10 volumes d’eau physiologique. Les volumes de globules rouges inférieurs à 10 µL doivent être manipulés avec précaution. • Éliminer l’excès d’eau physiologique à la surface du culot globulaire lavé, les agiter au vortex avant de prélever les 10 µL à hémolyser. • Hémolyser 10 µL de globules rouges par 130 µL de solution hémolysante. • Agiter au vortex pendant 10 secondes puis incuber 5 minutes à température ambiante. NOTES : - Pour des sujets anémiés, la quantité de globules rouges hémolysés peut-être augmentée : - 15 µL pour des sujets moyennement anémiés (environ 0,1 g/mL Hb) ; - 20 µL pour des sujets fortement anémiés (moins de 0,07 g/mL Hb) ; et 130 µL de solution hémolysante. L’intensité des fractions sera augmentée sans modifier la proportion de chaque fraction. - Il n’est pas nécessaire de filtrer ni de centrifuger les hémolysats. - La solution hémolysante n’affecte pas l’hémoglobine instable Bart. - En cas de suspicion d’hémoglobine H, il est conseillé de préparer un hémolysat plus concentré, par exemple 10 µL de globules rouges et 30 µL de solution hémolysante. TECHNIQUE I. MIGRATION 1. Poser le porte-applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse (Fig. 1) et relever le chariot porte-applicateur. 2. Déposer 120 µL d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau du porte-applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié. 3. Sortir le gel de son emballage. 4. Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin. ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation. 5. Placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte-applicateur contre la barrette, à l’intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 2). 6. Donner une forme concave au gel (Fig. 2) et le dérouler sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d’air éventuellement piégées, puis dérouler totalement le gel au contact du plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film. 7. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en position intermédiaire, la manette située sur le côté du porte-applicateur en position haute. 8. Poser un applicateur à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 3). 9. Déposer 10 µL d’échantillon hémolysé dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 minutes. L’applicateur doit être utilisé immédiatement après le chargement. Pour un dépôt différé (8 heures maximum), placer l’applicateur dans la chambre humide dents vers le haut (en manipulant l’applicateur par la protection en plastique), placer la chambre humide au réfrigérateur et ne placer le gel sur le porte-applicateur HYDRAGEL K20 qu’au moment de l’utilisation. Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation. 10. Éliminer la protection des dents de l’applicateur. 11. Placer l'applicateur en position n° 4 sur le porte-applicateur. IMPORTANT : Les numérotations de l’applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4). 12. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en butée, à l’aide de la manette du porte-applicateur pour amener l’applicateur au contact du gel. NE PAS FORCER LA DESCENTE DU CHARIOT. 13. Après 1 minute d’application, tourner la manette du porte-applicateur pour relever l’applicateur et le jeter. 14. Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse, selon la polarité indiquée sur le gel, bas du gel côté cathodique. Positionner l’HYDRAGEL sur le portoir de la cuve K20. La face gel est orientée vers le bas et le gel plonge dans le tampon sur une distance de 1 cm de chaque côté. Voir la notice de la cuve K20 pour les instructions d’utilisation. 15. Brancher la cuve au générateur. CONDITIONS DE MIGRATION SEBIA K20 Volume de tampon par compartiment 150 mL Volume total de tampon 300 mL Temps de migration 15 minutes Voltage constant 165 V | Ampérage de départ (par gel) | 7 ± 2 mA | 16. Après migration, débrancher la cuve et sortir le gel. II. FIXATION Elle peut se faire de deux façons : fixation à la chaleur ou à l’aide de la solution de fixation. Fixation à la chaleur (uniquement avec l’incubateur-sécheur IS 80 SEBIA) : Sécher le gel sous air chaud à 80 °C dans l’incubateur-sécheur IS 80 jusqu'à séchage complet (pendant 10 minutes minimum). - 4 -
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