HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 IV. SCANSIONE Effettuare la scansione usando un densitometro / scanner con filtro giallo o a 570 nm. Quando si utilizza uno dei densitometri HYRYS o DVSE, posizionare la frazione A 2 sul segno dei 5 mm della piastra di lettura: lo zero è effettuato, nel punto più basso, tra le frazioni A 2 e anidrasi carbonica. NOTA: Per assicurare i risultati più accurati e precisi, attenersi alla seguente procedura: - Regolare la lunghezza di scansione per includere l’intero quadro elettroforetico (30 mm). - Assicurarsi che i minimi, su ambedue i lati della frazione A 2 , siano posti ai piedi del picco. E’ buona prassi leggere i gels colorati senza ritardi. Per consultazioni successive, possono essere conservati in un astuccio protettivo, all’asciutto, protetti dalla luce e lontani da fonti di calore ed interpretati visivamente entro 3 mesi. RISULTATI Controllo Qualità Si consiglia di includere, in ogni gruppo di campioni processati, un sangue di controllo o un campione di sangue noto contenente emoglobine A, F, C e S. Valori La lettura densitometrica degli elettroforegrammi colorati, fornisce le concentrazioni relative (percentuali) delle singole zone proteiche. I valori normali (media ± 2 DS), utilizzando la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, sono stati determinati su una popolazione sana di 200 adulti (uomini e donne) : Emoglobina A ≥ 96,5 % Emoglobina F < 2,0 % (*) Emoglobina A 2 ≤ 3,5 % (*) vedi Interferenze e limitazioni Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori normali. Interpretazioni 1. Anomalie qualitative: Emoglobinopatie La maggior parte delle emoglobinopatie sono dovute alla sostituzione, per mutazione, di un singolo aminoacido in una dei quattro tipi di catene polipeptidiche. Il significato clinico della mutazione varia in funzione del tipo di aminoacido e della posizione coinvolti. Nelle malattie clinicamente significative, è affetta la catena α o la catena ß (talvolta la catena γ). Più di 200 varietà di emoglobine adulte sono già state descritte. Le prime emoglobine anomale studiate, nonché le più numerose, presentano un’alterata carica elettrica netta e ciò ne consente una semplice individuazione attraverso l’elettroforesi. Sono quattro le principali emoglobine anomale che presentano un particolare interesse clinico: S, C, E e D. Il kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, è rivolto alla identificazione preliminare delle emoglobinopatie e delle talassemie. Quando si evidenzia un quadro anormale, l’identificazione deve essere confermata da un test discriminatorio appropriato (es., elettroforesi su gel di agarosio acido). Emoglobina S L’emoglobina S è la più frequente. E’ dovuta alla sostituzione di un acido glutammico (aminoacido acido) della catena ß, con valina (aminoacido neutro). La sua mobilità elettroforetica è quindi rallentata. Su HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 tamponato in mezzo alcalino, l’emoglobina S migra fra le frazioni A e A 2 . Emoglobina C Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina (aminoacido basico): la sua mobilità è fortemente ridotta. Con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, le emoglobine C, E ed A 2 sono sovrapposte. Quando questa frazione è superiore al 15 % deve essere sospettata la presenza di emoglobine C ed E. Emoglobina E Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina: con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, l’emoglobina E migra esattamente come la C. Diversamente dalla C, non si separa dalla A in tampone acido (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20). Questa proprietà permette di differenziare la E e la C. Emoglobina D Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla glutammina: su HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, l’emoglobina D migra esattamente come la S. Diversamente dall’emoglobina S, la D non si separa dalla A in tampone acido (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20). Questa proprietà permette di differenziare la S e la D. 2. Anomalie quantitative: Talassemie Le talassemie costituiscono un gruppo pressoché eterogeneo di affezioni genetiche caratterizzate dalla riduzione del livello di sintesi di uno o più tipi di catena polipeptidica. Il meccanismo molecolare di questa riduzione non è stato ancora completamente descritto. Ci sono due tipi di sindromi talassemiche: Alfa-talassemie Sono caratterizzate da una ridotta sintesi delle catene α che, quindi, condiziona la sintesi di tutte le emoglobine normali. L’eccesso di sintesi delle catene ß e γ rispetto alla catena α, induce la formazione di tetrameri senza nessuna catena α: • Emoglobina Bart = γ 4, • Emoglobina H = ß 4. - 33 -
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Beta-talassemie Sono caratterizzate da una riduzione di sintesi delle catene ß. Solo la sintesi dell’emoglobina A è compromessa. Ne consegue che la percentuale delle emoglobine F ed A 2 risulta incrementata rispetto alla A. 3. Quadri di migrazione Migrazione di emoglobine normali A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) F S - D A 2 A 2 - C - E anidrasi anidrasi Migrazione delle principali emoglobine anormali punto di applicazione A 0 : la frazione non glicata dell’emoglobina adulta normale A. A 1 : la frazione glicata dell’emoglobina adulta normale A. Nei quadri riprodotti, il catodo è in basso e l’anodo in alto Interferenze e limitazioni • Non utilizzare campioni di sangue emolizzati. • Quando è rilevata un’emoglobina anomala, che migra differentemente dalle principali emoglobine varianti S, C, D ed E, utilizzare un metodo d’identificazione diverso (es., isoelettrofocalizzazione, elettroforesi delle catene globiniche), o consultare o inviare il campione ad un laboratorio specializzato. • Il dosaggio densitometrico della Hb F (o di qualunque altra emoglobina minore che migri in prossimità di una frazione maggiore) è semi-quantitativo, poiché il valore diventa inaccurato quando inferiore al 2 - 3 % dell’emoglobina totale. • I campioni di alcuni pazienti con emoglobina omozigote “S”, trattati con Hydrea® (idrossiurea), possono presentare una emoglobina F dovuta alla sintesi indotta dal trattamento. Su HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), in alcuni casi, è stata osservata una mobilità dell’emoglobina F indotta leggermente diversa da quella dell’emoglobina F fisiologica. • In campioni conservati per più di 7 giorni, può essere osservata una focalizzazione dell’addensamento localizzato dietro alla frazione Hb A, che non deve essere interpretato come una variante emoglobinica, es., emoglobine H o Bart. Eliminazione errori Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche. Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica SEBIA. DATI SULLE PRESTAZIONI Tutti i dati sulle prestazioni, sono basati su uno studio che comprende materiali e strumenti SEBIA HYDRAGEL, comparati ad un sistema in agarosio reperibile in commercio. Inoltre, sono stati eseguiti studi di correlazione quando l’identificazione delle emoglobine e dei loro valori erano stati stabiliti con altre metodiche validate. Di seguito sono presentati esempi rappresentativi degli studi sulle prestazioni. Tutti gli elettroforegrammi sono stati interpretati visivamente. Per le valutazioni densitometriche è stato utilizzato il densitometro SEBIA HYRYS. Riproducibilità nella serie Tre campioni di sangue sono stati processati con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 su gels dello stesso lotto. Ogni campione è stato processato in tutte le piste del singolo gel. La tabella seguente riporta media, SD e CV di ogni componente emoglobinica dei tre campioni, calcolati dai valori percentuali densitometrici. Inoltre, nessuna ripetizione ha fornito dati falsamente positivi o negativi. | COMPONENTE | MEDIA | SD | CV (%) | Campione normale Hb A 97.4 0.1 0.1 Hb A 2 | 2.6 | 0.1 | 5.3 Elevata Hb A 2 Hb A 95.2 0.2 0.2 Hb A 2 | 4.8 | 0.2 | 4.4 Elevata Hb C Hb A 56.7 0.4 0.8 | Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 | Riproducibilità tra serie Campioni di sangue sono stati processati elettroforeticamente con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, su gels di un singolo lotto. I campioni studiati ne includevano sette con emoglobine anormali (S, F o C), due con emoglobina A 2 elevata e i rimanenti normali. Le medie, SD e CV sono stati calcolati dai dati di ciascuna componente di ogni campione. Nella tabella seguente sono riportate le oscillazioni della media, della DS e del CV, oltre al CV medio, relative ai dati aggregati delle componenti. Inoltre, nessuna ripetizione ha fornito dati falsamente positivi o negativi - 34 -
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