HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Conservazione Conservare la soluzione emolizzante a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del flacone. Eliminare la soluzione emolizzante se muta d’aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche. 7. APPLICATORI Utilizzo Applicatori monouso pretagliati, per l’applicazione dei campioni sul gel. Conservazione Conservare gli applicatori in un luogo asciutto, a temperatura ambiente o in frigorifero. 8. CARTINE DA FILTRO - SOTTILI Utilizzo Cartine assorbenti, monouso, per eliminare l’eccesso di liquido dalla superficie del gel, prima dell’applicazione del campione. Conservazione Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o in frigorifero. REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI 1. SOLUZIONE FISIOLOGICA Preparazione Preparare una soluzione 0.15 M (0.9 g/dL) di NaCl in acqua distillata o deionizzata. Utilizzo Per il lavaggio dei globuli rossi. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare a temperatura ambiente o refrigerata. Eliminare comunque dopo 3 mesi oppure se muta di aspetto, es., diviene torbida a causa di contaminazione microbica. Per una conservazione più lunga aggiungere sodio azide, 0.1 g/dL. 2. SOLUZIONE FISSATIVA (facoltativa) Preparazione Almeno 15 minuti prima dell’utilizzo preparare una soluzione contenente (vol./vol.): 60 % etanolo, 10 % acido acetico, e 30 % acqua distillata o deionizzata. Agitare bene. Utilizzo Per fissare le emoglobine separate elettroforeticamente su gel di agarosio. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare a temperatura ambiente in flacone chiuso, per evitare l’evaporazione. Non fissare più di quattro gel con i medesimi 150 mL di fissativo. Eliminare dopo tre mesi. APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI 1. Alimentatore: GD61D SEBIA, PN 1300 ; GD251D SEBIA, PN 1301 ; MG300 SEBIA, PN 1302 o MG500 SEBIA, PN 1303. 2. APPLICATORE HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, contenente il porta applicatori HYDRAGEL K20. 3. Camera umida di conservazione, PN 1270. 4. Camera elettroforetica: K20 SEBIA, PN 1400. 5. Vaschette e telai porta gel per processare le lastrine di gel: Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420. 6. Pipette: 5 µL, 10 µL e 200 µL. 7. Essiccatore-incubatore: IS 80 SEBIA, PN 1430. 8. Densitometro / Scanner in grado di effettuare la scansione di gels 82 x 51 mm a 570 nm (filtro giallo): HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA o programma PHORESIS per Scanner a piano fisso. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per le procedure di lavoro e di calibrazione. CAMPIONI PER L’ANALISI Raccolta e conservazione del campione Per l’analisi sono consigliati campioni di sangue freschi trattati con anticoagulante. Sono utilizzabili i comuni anticoagulanti, come quelli contenenti EDTA, citrato o eparina ; evitare gli anticoagulanti con iodoacetato. I campioni di sangue devono essere prelevati seguendo la procedura convenzionale per i tests clinici di laboratorio. Se necessario conservare i campioni a 2 - 8 °C fino ad un massimo di 5 giorni. Preparazione del campione • Agitare la provetta primaria prima di prelevare il volume di sangue totale da trattare. • Centrifugare il sangue con anticoagulante a 5000 rpm per 5 minuti. • Eliminare il plasma. • Lavare i globuli rossi 2 volte con 10 volumi di soluzione fisiologica ; grande cura deve essere posta quando si trattano volumi di globuli rossi inferiori a 10 µl. • Eliminare l’eccesso di soluzione fisiologica sovranatante ai globuli rossi impaccati, quindi agitare con vortex prima di prelevare i 10 µL da emolisare. • Emolizzare 10 µl di globuli rossi impaccati con 130 µl di soluzione emolizzante. • Agitare per 10 secondi ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. - 31 -
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 NOTA: - Per preparare emolisati di soggetti lievemente anemici (Hb di circa 10 g/dL) o gravemente anemici (Hb < 7 g/dL), il volume di globuli rossi impaccati deve essere incrementato rispettivamente a 15 µl e a 20 µl. L’intensità della colorazione risulterà aumentata, ma le concentrazioni relative delle singole frazioni non cambieranno. - L’emolisato non deve essere filtrato o centrifugato. - La Soluzione Emolizzante SEBIA non ha effetti sulla stabilità dell’emoglobina Bart’s. PROCEDURA I. MIGRAZIONE 1. Posizionare il porta applicatore HYDRAGEL K20 su una superficie piana (Fig. 1) ed alzare la cornice porta applicatore (quella con le fessure numerate). 2. Dispensare 120 µL di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sul porta applicatore HYDRAGEL K20. 3. Estrarre il gel HYDRAGEL dalla confezione. 4. Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido in superficie, tamponando il gel con una carta assorbente sottile ATTENZIONE : Fate attenzione a non lasciare la carta da filtro troppo a lungo a contatto con il gel per evitarne la disidratazione. 5. Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 2) 6. Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia d’acqua (Fig. 2). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere uniformemente stratificata sotto la lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato. 7. Abbassare la cornice porta applicatore fino alla posizione intermedia, con la manopola ruotata in alto. 8. Posizionare un applicatore su di una superficie piana con i numeri dei pozzetti orientati correttamente verso l’alto (Fig. 3). 9. Applicare in ogni pozzetto 10 µL di campione emolizzato. Caricare l’applicatore entro 2 minuti. - Utilizzare l’applicatore senza alcun ritardo. - Per un utilizzo successivo (fino ad 8 ore), inserire l’applicatore nella camera umida di conservazione, con i dentini rivolti verso l’alto (maneggiare il depositore mediante la cornice protettiva in plastica), mantenendo l’intera camera in frigorifero e preparando la lastrina di gel, sul porta applicatore HYDRAGEL K20, appena prima dell’uso. Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli. 10. Staccare la cornice protettiva dei dentini dell’applicatore. 11. Inserire l’applicatore sulla cornice mobile in posizione No. 4. IMPORTANTE: I numeri stampati sull’applicatore devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4). 12. Abbassare la cornice porta applicatore in modo che l’applicatore entri in contatto con la superficie del gel. NON FORZARE LA CORNICE AD ABBASSARSI ULTERIORMENTE. 13. Dopo 1 minuto, ruotare la manopola per sollevare l’applicatore, rimuovere l’applicatore ed eliminarlo. 14. Mettere il gel in un’appropriata camera elettroforetica, in accordo alla polarità indicata sul gel. Quando è utilizzata la camera SEBIA K20, posizionare il gel sul ponte in modo che la superficie del gel sia rivolta verso il basso ; il gel deve essere immerso per circa 1 cm nel tampone su entrambi i lati. Per ulteriori dettagli consultare l’inserto contenuto nella camera K20. 15. Collegare la camera all’alimentatore. CONDIZIONI DI MIGRAZIONE SEBIA K20 Volume di tampone per compartimento 150 mL Volume totale di tampone 300 mL Tempo di migrazione 15 minuti Voltaggio costante 165 V | Amperaggio iniziale (un gel) | 7 ± 2 mA | 16. Dopo la migrazione, scollegare la camera e rimuovere la lastrina di gel. II. FISSAZIONE Trattare i gels con una delle seguenti procedure. Fissazione con aria calda (raccomandata solo con essiccatore-incubatore SEBIA IS 80): Essiccare completamente il gel nell’incubatore-essiccatore ad 80 °C (per un minimo di 10 min.). Fissazione con soluzione fissativa 1. Posizionare il gel nel telaio porta gel (fornito con il Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA) per i trattamenti successivi. 2. Riempire una vaschetta (fornita con il Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA) con 150 mL di soluzione fissativa. 3. Immergere verticalmente il gel nella soluzione fissativa per 15 minuti. 4. Rimuovere il gel ed essiccarlo con un flusso di aria calda ad 80 °C nell’incubatore-essiccatore IS 80. IMPORTANTE: Il gel deve essere perfettamente essiccato. III. COLORAZIONE - DECOLORAZIONE 1. Dopo l’essiccazione immergere verticalmente il gel asciugato e raffreddato nella soluzione colorante per 5 minuti. 2. Decolorare in tre successivi bagni di soluzione decolorante fino a quando il gel è privo di colorazione di fondo. 3. Rimuovere l’eccesso di liquido sulla superficie del gel con una cartina assorbente ed essiccare il gel con aria calda ad 80 °C. Se necessario pulire il retro della lastrina (faccia di supporto) con carta morbida inumidita. - 32 -
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