HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 UTILIZZO Il kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 è stato progettato per la separazione delle emoglobine normali (A e A 2 ) e per la rivelazione delle maggiori varianti dell’emoglobina: S o D e C o E mediante elettroforesi su gel di agarosio tamponato in mezzo alcalino. Gli elettroforegrammi risultanti sono interpretati visivamente per la valutazione dei quadri anormali. La densitometria trova applicazione pratica nell’aiuto all’interpretazione dei quadri elettroforetici, fornendo la quantificazione relativa delle singole frazioni. Per confermare l’identificazione delle emoglobine varianti, in particolare per differenziare l’emoglobina S dalla D e la E dalla C, dovrebbe essere eseguita l’elettroforesi su gel acido, utilizzando la metodica HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20. Ogni gel di agarosio del kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, permette di processare 7 campioni. Per uso diagnostico in vitro. PRINCIPIO DEL METODO L’emoglobina è una molecola complessa composta da due coppie di catene polipeptidiche. Ogni catena è collegata all’eme, un nucleo tetrapirrolico (porfirina) chelato ad un atomo di ferro. L’eme è comune a tutte le emoglobine e alle loro varianti. Il tipo di emoglobina è determinato dalla parte proteica chiamata globina. Le catene polipeptidiche α, ß, δ e γ costituiscono le emoglobine umane normali: • emoglobina A....................... = α 2 ß 2 • emoglobina A 2 ..................... = α 2 δ 2 • emoglobina fetale F............. = α 2 γ 2 La catena α è comune a queste tre emoglobine. La struttura spaziale e le altre proprietà molecolari dell’emoglobina (come quelle di tutte le proteine), dipendono dalla natura e dalla sequenza degli aminoacidi che formano le catene. La sostituzione di un aminoacido per mutazione è responsabile della formazione di emoglobine varianti che hanno differenti cariche superficiali e quindi diversa mobilità elettroforetica, in funzione anche del pH e della forza ionica del tampone. Le risultanti anomalie qualitative (o strutturali) sono chiamate emoglobinopatie. La diminuzione di sintesi di una delle catene emoglobiniche, comporta anormalità di tipo quantitativo (o di regolazione), denominate talassemie. L’analisi è eseguita con emolisato di globuli rossi lavati. Le emoglobine sono separate elettroforeticamente su gels alcalini e le frazioni sono colorate con una soluzione di amidoschwarz. I gels essiccati sono pronti per l’interpretazione. REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEL KIT HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 COMPONENTI PN 3010 Gels di Agarosio (pronti all’uso) 10 gels Tampone tris-barbital (soluzione concentrata) 3 flaconi da 75 mL Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 flacone da 60 mL Colorante Amidoschwarz (soluzione concentrata) 1 flacone da 20 mL Soluzione decolorante (soluzione concentrata) 1 flacone da 100 mL Soluzione emolizzante (pronta all’uso) 1 flacone da 20 mL Applicatori a 7 dentini (pronti all’uso) 1 confezione da 10 | Cartine da filtro – Sottili | 1 confezione da 10 | PER RISULTATI OTTIMALI I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit. LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO. 1. GELS DI AGAROSIO Preparazione I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 0.8 g/dL ; tampone alcalino pH 8.5 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi. Utilizzo Mezzo di supporto per elettroforesi delle emoglobine. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare i gels orizzontalmente, nella confezione originale protettiva, a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). Evitare, durante la conservazione, significative variazioni di temperatura (es., non conservare in prossimità di finestre o di sorgenti di calore). NON CONGELARE. Non utilizzare il gel quando: (i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del congelamento del gel), (ii) è presente muffa o flora batterica, (iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni di conservazione improprie). 2. TAMPONE TRIS-BARBITAL Preparazione Ogni flacone di soluzione tampone concentrata deve essere diluito ad 1 litro con acqua distillata o deionizzata. Dopo la diluizione, la soluzione di utilizzo contiene: tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; sodio azide. - 29 - FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano
HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 AVVERTENZA: Ogni flacone di tampone in soluzione concentrata contiene 2.45 % di barbital, 13.73 % di barbital sodico e 0.13 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerito consultare immediatamente un medico! Evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono originare composti esplosivi o tossici con la sodio azide. Quando smaltito, fare scorrere un’abbondante quantità d’acqua. Utilizzo Tampone per elettroforesi. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare la soluzione concentrata a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta del flacone di tampone. La soluzione tampone diluita è stabile per un anno se conservata a temperatura ambiente in un flacone chiuso. Eliminare la soluzione tampone diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche. 3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE Preparazione Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ". Contiene una soluzione acida. Utilizzo Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE. Non aggiungere sodio azide. 4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ Preparazione Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del suo potere colorante siano minimamente alterati. Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo. 1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato. 2. Chiudere accuratamente il flacone. 3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi. 4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario. 6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata. 8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti. Il colorante è pronto all’uso. Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali. AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione. Utilizzo Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine. IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante. Il colorante diluito è stabile 1 mese. Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore. 5. SOLUZIONE DECOLORANTE Preparazione Il flacone di soluzione decolorante deve essere diluito a 100 litri con acqua deionizzata o distillata. Per convenienza diluire 1 mL di soluzione concentrata ad un litro. Dopo la diluizione, la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.05 g/dL. Utilizzo Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel. Conservazione, stabilità e segni di deterioramento Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente in flacone chiuso. Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta d’aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche. Non aggiungere sodio azide. Per periodi di conservazione superiori ad una settimana, prevenire i fenomeni di proliferazione microbica aggiungendo, nella soluzione decolorante diluita, 5 µL/dL di ProClin 300. La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante. 6. SOLUZIONE EMOLIZZANTE Preparazione La soluzione emolizzante è pronta all’uso. Costituita da tampone con additivi, non rischiosi alle concentrazioni utilizzate, necessari per ottimizzare l’analisi. Utilizzo Per emolizzare i globuli rossi. - 30 -
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