HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03
Voorbereiding van het monster
• Het primaire buisje schudden voor u de totale hoeveelheid te behandelen bloed afneemt ;
• Centrifugeer bloed met anticoaguleermiddel gedurende 5 minuten bij 5000 rpm ;
• Verwijder het plasma ;
• Spoel de rode bloedcellen 2 maal met 10 volumedelen fysiologische zoutoplossing ; zeer omzichtig dient men te werk te gaan bij de verwerking van
volumedelen met rode bloedcellen kleiner dan 10 µl ;
• Verwijder het surplus aan saline (fysiologische zoutoplossing) over de rode bloedcellen pellet en vortex deze alvorens 10 µL te nemen voor de
hemolyse ;
• Hemolyseer 10 µl rode bloedcellen met 130 µl hemolyserende oplossing ;
• Meng dit gedurende 10 seconden in de vortexmixer, en laat het dan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten incuberen.
OPMERKINGEN:
- Om hemolysaat te prepareren van proefpersonen die licht anemisch (ongeveer 10 g/dl Hb) of ernstig anemisch ( < 7 g/dl Hb), kan het volume van
verpakte RBC verhoogd worden tot respectievelijk 15 µl en 20 µl. De keuringsintensiteit zal zodoende toenemen, maar de relatieve concentraties
van de afzonderlijke fracties zal niet veranderen ;
- Het hemolysaat hoeft niet gefilterd of gecentrifugeerd te worden.
- De hemolyserende oplossing van SEBIA heeft geen invloed op het onstabiele hemoglobine van Bart.
PROCEDURE
I. MIGRATIE
1. Plaats de HYDRAGEL K20 applicatordrager op een plat oppervlak (Fig. 1) en til het gedeelte van de applicatordrager op dat genummerde
uitsparingen heeft.
2. Giet 120 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het onderste 1/3 deel van het frame dat op de HYDRAGEL K20 applicatordrager is gedrukt.
3. Neem de HYDRAGEL agarose gel uit de verpakking.
4. Rol een dun filter voorzichtig en gelijkmatig over het oppervlak om zo het teveel aan vloeistof te absorberen. Verwijder het filterpapier direct.
WAARSCHUWING: Laat het filterpapier niet te lang in contact met de gel om uitdroging te vermijden.
5. Plaats de gelplaat (met de gelzijde naar boven) met een zijde tegen de rand aan de onderzijde van het gedrukte frame (Fig. 2).
6. Buig de gel en breng deze naar beneden in het eerder uitgegoten water (Fig. 2). Zorg er voor dat er geen luchtbellen onder de gel gevangen
worden, dat het water onder de gehele gelplaat wordt verdeeld en dat de gel gepositioneerd is conform het frame.
7. Breng de applicatordrager met de genummerde uitsparingen in de tussenpositie waarbij de schakelaar in de hoogste stand staat.
8. Plaats een applicator op een plat oppervlak zodat de putnummers zich in de ‘rechterzijde omhoog’ positie bevinden (Fig. 3)
9. Breng 10 µl op correcte wijze verdund serummonster aan in elke spleet. Laad de applicator binnen 2 minuten.
- Gebruik de applicator zonder vertraging
- Voor later gebruik (tot 8 uur later) plaatst u de applicator in een natte opslagruimte, met de ‘tanden’ omhoog (alleen aan het plastic frame
dat de tanden beschermd vastpakken). Zorg er voor dat de opslagruimte gekoeld is en plaats de gelplaat direct voorafgaand aan gebruik
op de HYDRAGEL K20 applicatiedrager.
Voor verdere informatie wordt u naar de bijsluiter van de natte opslagruimte verwezen.
10. Breek het beschermende plastic frame van de tanden af.
11. Plaats de monsterapplicator in positie nr. 4 op de applicatiedrager.
BELANGRIJK: De nummers die op de monsterapplicator zijn gedrukt moeten voor u zichtbaar zijn (Fig. 4).
12. Breng de applicatordrager naar beneden zodat de applicator in contact komt met het oppervlak van de gel. FORCEER DE CARRIERS NIET
HELEMAAL NAAR BENEDEN!
13. Na 1 minuut draait u de schakelaar om zodat de applicator omhoog gebracht kan worden. Verwijder de applicator.
14. Plaats de gel in een geschikte elektroforesekamer, in overeenstemming met de polariteit die op de gel staat aangegeven, de onderzijde van
de gel aan de kant van de kathode. Bij gebruik van de SEBIA K20 kamer, plaatst u de HYDRAGEL op de brug, waarbij de gelkant naar
beneden gericht wordt ; de gel moet op een afstand van ongeveer 1 cm van elke zijde in de buffer zakken.
Voor meer details wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking van de K20 kamer.
15. Sluit de kamer aan op de stroomvoorziening.
MIGRATIECONDITIES SEBIA K20 Volume buffer per compartiment 150 ml Totaal buffervolume 300 ml Migratietijd 15 minuten Constant voltage 165 V
| Initiële stroom (per gel) | 7 ± 2 mA |
16. Na migratie de kamer ontkoppelen en de gelplaat verwijderen.
II. FIXATIE
Bewerk de gels volgens een van de hierna beschreven methoden.
Fixatie doormiddel van hete lucht (bijvoorkeur alleen in combinatie met de SEBIA IS 80 Incubatordroger) :
Droog de gel volledig in de incubatordroger bij een temperatuur van 80 °C (gedurende tenminste 10 minuten).
Fixatie doormiddel van een fixeeroplossing :
1. Plaats de gelplaat in een gelhouder (geleverd als onderdeel van de SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) voor verdere verwerking.
2. Vul een container (geleverd als onderdeel van de SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) met 150 ml fixeeroplossing.
3. Dompel de gedroogde en gekoelde gel gedurende precies 15 minuten onder in de fixeeroplossing.
4. Verwijder de gel en droog deze met een hete luchtstroom in de incubatordroger type IS-80, bij een temperatuur van 80 °C.
BELANGRIJK: De gel moet volledig droog zijn!
- 25 -