HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20

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HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 IV. EINLESEN Das Gel mit einem Densitometer bei 570 nm oder mit einem Gelbfilter einlesen. Bei Verwendung von HYRYS oder DVSE Densitometern, die A 2 -Fraktion bei der 5 mm Markierung auf dem Scanfenster positionieren: die Nullstellung des Hintergrunds wird zwischen der A 2 - und der Carbo- Anhydrase-Fraktion beim niedrigsten Punkt durchgeführt. HINWEIS : Zur Erzielung bester Ergebnisse folgendes beachten: - Die Einleselänge einstellen um vollständige Elektrophoresemuster einzuschließen (≈ 30 mm). - Sicherstellen dass die Minima auf beiden Seiten der A 2 -Fraktion ganz am Fuß des A 2 –Peak positioniert sind. Es wird empfohlen das gefärbte Gel ohne Verzögerung einzulesen. Als Referenz für die Zukunft können sie in einer Schutzhülle an einem trocken dunklen Platz fern von Hitzequellen gelagert werden und innerhalb von mindestens 3 Monaten visuell interpretiert werden. ERGEBNISSE Qualitätskontrolle Es wird empfohlen bei jedem Lauf ein Kontrollblut oder ein bekanntes Blut, das die Hämoglobine A, F, C und S enthält, zur Kontrolle mitlaufenzulassen. Werte Durch das Einlesen von gefärbten Elektropherogrammen mit dem Densitometer werden relative Konzentrationen (Prozente) individueller Hämoglobinbanden erhalten. Normalwerte (Mittelwert ± 2 SD) wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur von einer gesunden Population von 200 Erwachsenen (Männer und Frauen) bestimmt: Hämoglobin A ≥ 96,5 % Hämoglobin F < 2,0 % (*) Hämoglobin A 2 ≤ 3,5 % (*) siehe Interferenz und Limitationen Jedem Labor wird empfohlen eigene Normalwerte festzulegen. Interpretation 1. Qualitative Abnormitäten: Hämoglobinopathien Die meisten Hämoglobinopathien werden durch Mutationen verursacht, die zu einzelnen Aminosäureaustauschen in einem Typ der vier Polypeptidketten führen. Die klinische Signifikanz eines solchen Austauschen hängt vom Typ der Aminosäure und von der betroffenen Stelle ab. Bei klinisch signifikanten Erkrankungen ist entweder die α-Kette oder die ß-Kette (sogar die γ-Ketten) betroffen. Mehr als 200 Varianten des adulten Hämoglobins sind bislang beschrieben worden. Die ersten untersuchten abnormalen Hämoglobine und die am häufigsten vorkommenden haben eine veränderte elektrische Nettoladung, wodurch sie mit Elektrophorese einfach nachweisbar sind. Es gibt vier abnormale Haupt-Hämoglobine, welche von besonderem klinischen Interesse sind: S, C, E und D. Die HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Kits werden für eine vorläufige Identifikation von Hämoglobinopathien und Thalassämien. Sobald ein abnormales Muster festgestellt wird, sollte seine Identität mit entsprechenden ausschließenden Tests bestätigt werden (z. B. mit Gelelektrophoresen auf sauren Agarose Gelen). Hämoglobin S Das Hämoglobin S kommt am häufigsten vor. Es entsteht durch den Austausch eines Glutaminsäurerestes (saure Aminosäure) der Beta-Kette durch Valin (eine neutrale Aminosäure). Seine elektrophoretische Mobilität wird dadurch verlangsamt. Auf alkalisch gepufferten Gelen wie HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 wandert das Hämoglobin S zwischen den Fraktionen A und A 2 . Hämoglobin C Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wurde durch einen Lysinrest ersetzt (basische Aminosäure): seine Mobilität ist stark verringert. Bei der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur überlagern sich die Fraktionen C, E, und A 2 . Wenn diese Fraktion > 15 % beträgt, müssen die Hämoglobine C und E vermutet werden. Hämoglobin E Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wird durch Lysin ersetzt. Bei der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur wandert das Hämoglobin E genau wie das Hämoglobin C. Aber im Unterschied zu Hämoglobin C, trennt es sich nicht vom Hämoglobin A in sauren Puffer [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Diese Eigenschaft erlaubt die Unterscheidung zwischen E und C. Hämoglobin D Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wird durch einen Glutaminrest ersetzt. Bei der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur wandert dieses Hämoglobin ganz genau wie das Hämoglobin S. Das Hämoglobin D trennt sich in sauren Puffer nicht vom Hämoglobin A [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Diese Eigenschaft erlaubt die Unterscheidung zwischen S und D. 2. Quantitative Abnormitäten: Thalassämien Thalassämien stellen eine sehr heterogene Gruppe von genetischen Störungen dar, die durch eine verminderte Synthese eines oder mehrerer Typen von Polypeptidketten gekennzeichnet sind. Der molekulare Mechanismus dieser Verminderung ist bis jetzt nicht vollständig beschrieben. Es gibt zwei Arten von Thalassämiesyndromen: Alpha-Thalassämien Sie werden durch eine verminderte Synthese der α-Ketten charakterisiert, was konsequenterweise die Synthese aller normalen Hämoglobine betrifft. Die überschüssige Synthese von ß-Ketten und γ-Ketten im Verhältnis zu α-Ketten induziert die Bildung von Tetrameren ohne jede α-Kette: • Hämoglobin Bart = γ 4, • Hämoglobin H = ß 4. - 19 -
Beta-Thalassämien Sie werden durch eine verminderte Synthese der Beta-Kette gekennzeichnet. Nur das Hämoglobin A ist betroffen. Dafür sind die Prozentanteile von Hämoglobin F und A 2 im Vergleich zu Hämoglobin A erhöht. 3. Migrationsmuster HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 Migration bei normalen Hämoglobinen A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) F S - D A 2 Anhydrase Auftragungspunkt A 2 - C - E Anhydrase Migration der wichtigsten anomalen Hämoglobine A 0 : Die nicht-glykolisierte Fraktion des normalen adulten Hämoglobin A. A 1 : Die glykolisierte Fraktion des normalen adulten Hämoglobin A. Im obigen Muster befindet sich unten die Anode und oben die Kathode. Interferenzen und Limitationen • Keine hämolysierten Blutproben verwenden. • Wenn ein abnormales Hämoglobin nachgewiesen wird, welches ein anderes Verhalten als die Haupthämoglobinvarianten S, C, D und E zeigt, sollten andere Eigenschaften für die Identifizierung herangezogen werden, (wie z.B.: Isoelektrische Fokussierung, Globinketten-Elektrophorese) oder ein spezialisiertes Labor konsultiert oder die Probe in ein spezialisiertes Labor gesendet werden. • Der densitometrische Assay von Hb F (oder irgend einem anderen geringem Hämoglobin, das in der Nähe der Hauphämoglobinfraktionen wandert) ist nur semiquantitative, da die Analyse bei Werten unterhalb von 2 % - 3 % vom Gesamthämoglobin ungenau wird. • Einige homozygote „S“ Patienten erhalten eine Behandlung mit Hydrea® (Hydroxyharnstoff), die zur Induktion der Synthese von fetalem Hämoglobin führen kann. In einigen Fällen wurde beobachtet, dass die Mobilität des induzierten Hämoglobin F auf HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) im Vergleich zu physiologischem Hämoglobin F leicht unterschiedlich ist. • Bei längerer Lagerung der Proben (über 7 Tage), kann sich der Hintergrund hinter der Hb A Fraktion als distinkte Fraktion darstellen. Interpretieren sie diese Fraktion nicht als Hämoglobin-Variante, z.B. als Hämoglobin H oder Bart. Fehlersuche Bitte rufen Sie den Technischen Service von SEBIA an, wenn der Test nicht richtig funktioniert, obwohl die Anweisungen zur Vorbereitung, Lagerung und zur Durchführung sorgfältig beachtet wurden. Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen. CHARAKTERISTISCHE DATEN Alle charateristischen Daten basieren auf einer Studie, die durch vergleichende Untersuchungen von SEBIA HYDRAGEL Materialien und Geräte mit einem anderen kommerziell erhältlichen Gelelektrophoresesystem erhalten wurden. Zusätzlich wurden Konkordanz-Untersuchungen durchgeführt, wenn die Identifizierung der Hämoglobine und die Werte durch andere anerkannte Methoden ermittelt wurden. Die Ergebnisse von repräsentativen Beispielen werden hier aufgeführt. Alle Elektropherogramme wurden visuell interpretiert. Für alle densitometrischen Messungen wurde das HYRYS Densitometer von SEBIA verwendet, um die visuellen Daten angemessen zu vervollständigen. Reproduzierbarkeit innerhalb eines Laufs Drei Blutproben wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur mit Gelen einer Charge untersucht. Jede Probe wurde auf sämtlichen Laufspuren eines Gels aufgetragen. Die folgende Tabelle zeigt die Mittelwerte, Standardabweichung und den Variationskoeffizient für jede individuelle Hämoglobinkomponente in den drei Proben, die mittels der densitometrischen Prozentwerte für jede einzelne Laufspur errechnet wurden. Weiterhin zeigten die Wiederholungen keine falsch positiven oder falsch negativen Werte. | KOMPONENTE | MITTELWERT | SD | CV (%) | Normales Blut Hb A 97,4 0,1 0,1 Hb A 2 | 2,6 | 0,1 | 5,3 Erhöhtes Hb A 2 Hb A 95,2 0,2 0,2 Hb A 2 | 4,8 | 0,2 | 4,4 Erhöhtes Hb C Hb A 56,7 0,4 0,8 | Hb C | 43,3 | 0,4 | 1,0 | Reproduzierbarkeit innerhalb verschiedener Läufe Blutproben wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur mit Gelen einer Charge elektrophoretisch getrennt. Unter den analysierten Proben befanden sich sieben Proben mit einem abnormalen Hämoglobin (Hb S, Hb F oder Hb C), zwei Proben mit erhöhtem Hb A 2 , die restlichen Proben waren normale Blutproben. Die Mittelwerte, Standardabweichung und die Variationskoeffizienten wurden aus den Daten für jede individuelle Hämoglobinkomponente aus jeder Probe berechnet. Der Wertebereich um die Mittelwerte, Standardabweichungen und um die Variationskoeffizienten und die Mittelwerte aus den Variationskoeffizienten, die die Gesamtheit der individuellen Komponenten repräsentieren sind unten in der Tabelle aufgeführt. Im übrigen zeigten die Wiederholungen keine falsch positiven oder falsch negativen Werte. - 20 -
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