Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.9.2.3 Ermittlung der Lyaseaktivität abhängig von der 4,4´-Dichlorbenzoinkonzentration
Reaktionspuffer pH 8:
Substratlösungen:
50 mM TEA 0,08-0,91 mM 4,4´-Dichlorbenzoin in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP Enzymlösung:
30 % DMSO (v/v) 0,02 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
Je 290 µl Substratlösung werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen für 5 min bei 25 °C inkubiert,
anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 10 µl Enzymlösung gestartet. Nach exakt
1 min wurde wird die Reaktion durch Zugabe und Mischen mit 50 µl Isopropanol (inklusive
7 vol% Perchlorsäure) gestoppt. Die Proben wurden unverdünnt mittels HPLC-Analytik
(Kapitel 3.8.1) analysiert, die Bildung des 4-Chlorbenzaldehyds bestimmt (Kapitel 3.8.1.1)
und die spezifische Aktivität berechnet.
3.9.3 Bestimmung der kinetischen Parameter (V max und K M )
Die Bestimmung der kinetischen Parameter V max und K M erfolgte durch die Messung der
Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten bei verschiedenen Substratkonzentrationen in einem
diskontinuierlichen Aktivitätstest (Kapitel 3.9.2). Die Reaktionsgeschwindigkeit v wurde
über eine Doppelbestimmung bei 25°C bestimmt. V max und K M können durch eine einfache
Michaelis-Menten-Kinetik bestimmt werden (Michaelis & Menten, 1913). Die Abhängigkeit
der Anfangsrektionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration kann durch folgende
Gleichung beschrieben werden:
[S]
v = Vmax
Gleichung 3
K + [S]
M
v Anfangsreaktionsgeschwindigkeit [μM min -1 mg -1 ]
V max maximale Reaktionsgeschwindigkeit [μM min -1 mg -1 ]
[S] Substratkonzentration [mg ml -1 ]
K M
Michaelis-Menten-Konstante [mM]
Die Bestimmung von V max - und K M erfolgte, unter Verwendung der gemessenen spezifischen
Aktivitäten, durch nicht linearer Regression mittels der Computersoftware Origin 8.
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