Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.9.2.1 Ermittlung der Ligaseaktivität abhängig von der 4-Chlorbenzaldehydkonzentration
Reaktionspuffer pH 8:
Substratlösungen:
50 mM TEA 0,5-25 mM 4-Chlorbenzaldehyd in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP Enzymlösung:
30 % DMSO (v/v) 0,02 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
Je 180 µl Substratlösung werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen für 5 min bei 25 °C inkubiert,
anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 20 µl Enzymlösung gestartet. Nach exakt
2 min wird die Reaktion durch Zugabe und Mischen mit 200 µl Isopropanol (inklusive
0,7 vol% Perchlorsäure) gestoppt. Die Proben wurden unverdünnt oder 1:2 mit Isopropanol
(inkl. 0,7 vol% Perchlorsäure) verdünnt mittels HPLC-Analytik (Kapitel 3.8.1) analysiert, die
Bildung des 4,4´-Dichlorbenzoins bestimmt (Kapitel 3.8.1.1) und die spezifische Aktivität der
BAL berechnet.
3.9.2.2 Ermittlung der Ligaseaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert
Reaktionspuffer pH 6-9: Substratlösungen pH 6-9:
50 mM TEA 50 mM Benzaldehyd (BA) in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP 15 mM 4-Chlorbenzaldehyd (4ClBA) in Reaktionspuffer
30 % DMSO (v/v)
10 mM 3,5-Dimethoxybenzaldehyd (DMBA) in Reaktionspuffer
Enzymlösung pH 6-9:
0,1 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
290 µl bzw. für Benzaldehyd 295 µl Substratlösungen in den Puffern mit verschiedenen pH-
Werten, wurden vorgelegt und die Reaktion anschließend durch Zugabe von 10 µl bzw. 5 µl
Enzymlösung gestartet (BA: 1,67 µg/ml; 4ClBA und DMBA 3,33 µg/ml). Nach 2 min wurde
die Reaktion durch Zugabe von 600 µl Isopropanol (inkl. 0,7 vol% Perchlorsäure) gestoppt,
die Proben mittels HPLC-Analytik (Kapitel 3.8.1) analysiert und die Bildung des Produktes
bestimmt (Kapitel 3.8.1.1). Die relativen Aktivitäten bei den verschiedenen pH-Werten
wurden aus der Produktbildung nach 2 min berechnet.
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