Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Material & Methoden<br />
Mit Hilfe der exponentiellen Formel konnte der Umsatz von DMBA durch die BAL über die<br />
Zeit ermittelt werden. Wobei eine Ausgangskonzentration von 3 mM DMBA für die Messung<br />
als sinnvoll erachtet wurde. Die genaue Durchführung, sowie Puffer und Lösungen, werden<br />
im Folgenden beschrieben.<br />
Durchführung am Fluorolog 3-22:<br />
Reaktionspuffer pH 8:<br />
Substratlösung:<br />
50 mM TEA 15 mM DMBA in DMSO<br />
2,5 mM MgSO 4<br />
0,5 mM ThDP<br />
Enzymlösung:<br />
Lyophilisat oder Rohextrakt in Reaktionspuffer<br />
Einstellungen:<br />
Anregung: 350 nm Emission: 460 nm<br />
Anregungsspalt: ± 1,3 nm Emissionsspalt: ± 1,3 nm<br />
Messung: 90 sek Messpunkte: 5 sek<br />
Temperatur: 25 °C Küvettengeometrie: 4x10 mm<br />
Integration: 0,1 sek<br />
Die Substratlösung wurde frisch zubereitet und mit Argon überschichtet, um eine Oxidation<br />
des DMBA weitestgehend zu vermeiden. Vor Beginn der Messung wurden 750 µl Reaktionspuffer<br />
mit 200 µl Substratlösung direkt in die Küvette gegeben, gründlich gemischt und für<br />
ca. 5 min im Photometer auf 25 °C temperiert. Die Reaktion wurde anschließend durch<br />
Zugabe von 50 µl Enzymlösung gestartet. Hierbei sollte nur sehr vorsichtig mit einem<br />
Plastikspatel gerührt werden, da bei der Vermengung viele kleine Luftblasen entstehen<br />
können, welche zu Lichtstreuung führen und so das Resultat verfälschen. Die Enzymlösung<br />
wurde so eingestellt, dass die Abnahme der Fluoreszenzintensität innerhalb der 1,5 min ca.<br />
20.000-40.000 cps entsprach, also einem Umsatz von etwa 0,15-0,33 mM DMBA. Die<br />
Abnahme der Fluoreszenz wurde über einen Zeitraum von 1,5 min verfolgt und anhand der<br />
zuvor erstellten Kalibrierkurve (Gleichung, Abb. 41) der Substratumsatz berechnet. Bei<br />
bekannter Enzymkonzentration konnte so die spezifische Aktivität in Units pro mg Enzym<br />
berechnet werden. Wobei 1 Unit als die Enzymmenge definiert ist, welche 1 µmol Substrat<br />
pro Minute umsetzt.<br />
Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmessungen, werden normalerweise bis zu einem Substratumsatz<br />
von bis zu 10% verfolgt. So sollen Effekte, welche eine Minderung der Reaktionsrate,<br />
wie z.B. Verlangsamung der Reaktion durch Verringerung der Substratkonzentration,<br />
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