Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
ist der Unterschied bei rechtwinkliger und Front Face Messung, stark absorbierender Proben
schematisch dargestellt.
Detektor
Detektor
Xenon Lampe
Xenon Lampe
Abb. 36: Vereinfachte Darstellung der „Right Angle“ und der „Front Face“ Messung. Links: Die Emission
wird im rechten Winkel zum Anregungslicht gemessen. Bei hoher Probenkonzentration, wird das Licht beim
Durchtritt durch die Probe absorbiert und die Quantenausbeute ist relativ gering. Rechts: Die Emission wird im
Winkel von 22,5° zum Anregungslicht gemessen, hier ist vor allem die Emission der direkt dem Anregungslicht
zugewandten Fluorophore (bzw. an der Oberfläche der Probe) für die gemessene Fluoreszenzintensität von
Bedeutung. Der Einfluss des inneren Filter Effektes ist somit geringer.
Beim Fluorolog 3-22 werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten nicht in relativen
Einheiten angegeben, wie beim LS50-B, sondern in gezählte Photonen pro Sekunde (counts
per second, cps). Zur Ermittlung der Fluoreszenzintensität von DMBA am Fluorolog 3-22
wurden je 800 µl Reaktionspuffer mit 200 µl Substratlösung gemischt und für ca. 5 min im
Photometer auf 25 °C temperiert.
Zuvor wurde gezeigt, dass mit 3 mM DMBA der innere Filtereffekt sehr stark ausgeprägt ist,
so dass das Anregungsmaximum in einen Bereich verschoben ist, bei dem DMBA kaum noch
absorbiert (Abb. 30). Des Weiteren ist der Intensitätsunterschied zu geringer konzentrierten
Proben nur minimal (Abb. 30) bzw. nicht gegeben (Abb. 34). Beim Vergleich der Proben mit
der SD von 10 mm im Anregungslicht, ist die absolute Intensität von 3 mM DMBA bei
360 nm mit der rechtwinkligen Messung höher als mit der Front Face Messung (Abb. 37).
Dies ist auf die geringe Oberfläche der Probe bei der Front Face Messung zurückzuführen.
Allerdings sind die Anregungsspektren verschoben: bei der rechtwinkligen Messung liegt das
Maximum bei 361 nm, bei der Front Face Messung bei etwa 357 nm. Unterhalb von 350 nm
ist die Anregung bei der Front Face Messung sogar höher als bei der rechtwinkligen
Messung. Die Verschiebung des Anregungsspektrums, in einen Wellenlängenbereich bei dem
DMBA eine höhere Absorption besitzt, zeigt, dass der innere Filtereffekt durch die Front
Face Option verringert ist. Bei Betrachtung der Proben mit der SD von 4 mm im
Anregungslicht (Abb. 37), ist die Fluoreszenzintensität mit der Front Face Option nicht
geringer als bei der rechtwinkligen Messung. Dies ist durch die größere Probenoberfläche für
die Front Face Messung begründet (vgl. Abb. 28 und Abb. 36). Die Intensität ist sogar um
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