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Helmholtz-Gemeinschaft

Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER

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Material & Methoden<br />

Anregung gewählt, da die Differenz in der Fluoreszenzintensität hier größer ist (siehe Abb.<br />

30). Die Emission wurde bei 470 nm gemessen. Für die Anregung wurde die Spaltbreite von<br />

± 5 nm und für die Emission von ± 7,5 nm gewählt. Nachdem die Bedingungen für den<br />

Fluoreszenztest festgelegt wurden, wurde eine Kalibrierung durchgeführt. DMBA-Konzentrationen<br />

von 0-2 mM wurden dreimal vermessen und eine Kalibrierkurve erstellt (Abb. 35).<br />

250<br />

2,0<br />

Intensität<br />

200<br />

150<br />

100<br />

50<br />

0<br />

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0<br />

DMBA (mM)<br />

DMBA (mM)<br />

1,5<br />

1,0<br />

0,5<br />

<br />

<br />

0,0<br />

<br />

0 50 100 150 200 250<br />

Intensität<br />

Abb. 35: Kalibrierung und Ermittlung einer Kalibrierkurve zur Quantifizierung der DMBA-<br />

Konzentration mit 0-2 mM DMBA. 50 mM Kpi-Puffer, pH 8; 2,5 mM MgSO 4 ; 0,1 mM ThDP; 10 vol%<br />

DMSO. Halbmikroküvette (SD: 4x10 mm), Anregung: 360 nm, Emission: 470 nm, Anregungsspalt: ± 5 nm,<br />

Emissionsspalt: ± 7,5 nm T=25 °C. Links: gemessene Intensität abhängig von der DMBA-Konzentration, n = 3.<br />

Rechts: DMBA-Konzentration in Abhängigkeit von der gemessenen Intensität. Die Anpassung der Daten<br />

erfolgte polynomisch (kubisch).<br />

Mit Hilfe der polynomischen Formel, konnte der Umsatz von DMBA durch die BAL über die<br />

Zeit ermittelt werden. Wobei eine Ausgangskonzentration von 1,2-1,5 mM DMBA für die<br />

Messung als sinnvoll erachtet wurde. Die genaue Durchführung, sowie Puffer und Lösungen,<br />

sind im Folgenden beschrieben.<br />

Durchführung des Aktivitätstests am Perkin Elmer LS50-B:<br />

Reaktionspuffer pH 8:<br />

Substratlösung:<br />

50 mM Kpi 15 mM DMBA in DMSO<br />

2,5 mM MgSO 4<br />

0,1 mM ThDP<br />

Enzymlösung:<br />

Lyophilisat oder Rohextrakt in Reaktionspuffer<br />

Einstellungen:<br />

Anregung: 360 nm Emission: 470 nm<br />

Anregungsspalt: ± 5 nm Emissionsspalt: ± 7,5 nm<br />

Messung: 1,5 min Messpunkte: 0,1 min<br />

Temperatur: 25 °C Küvettengeometrie: 4x10 mm<br />

Integration 0,1 sek<br />

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