Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Material & Methoden<br />
Anregung gewählt, da die Differenz in der Fluoreszenzintensität hier größer ist (siehe Abb.<br />
30). Die Emission wurde bei 470 nm gemessen. Für die Anregung wurde die Spaltbreite von<br />
± 5 nm und für die Emission von ± 7,5 nm gewählt. Nachdem die Bedingungen für den<br />
Fluoreszenztest festgelegt wurden, wurde eine Kalibrierung durchgeführt. DMBA-Konzentrationen<br />
von 0-2 mM wurden dreimal vermessen und eine Kalibrierkurve erstellt (Abb. 35).<br />
250<br />
2,0<br />
Intensität<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0<br />
DMBA (mM)<br />
DMBA (mM)<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
<br />
<br />
0,0<br />
<br />
0 50 100 150 200 250<br />
Intensität<br />
Abb. 35: Kalibrierung und Ermittlung einer Kalibrierkurve zur Quantifizierung der DMBA-<br />
Konzentration mit 0-2 mM DMBA. 50 mM Kpi-Puffer, pH 8; 2,5 mM MgSO 4 ; 0,1 mM ThDP; 10 vol%<br />
DMSO. Halbmikroküvette (SD: 4x10 mm), Anregung: 360 nm, Emission: 470 nm, Anregungsspalt: ± 5 nm,<br />
Emissionsspalt: ± 7,5 nm T=25 °C. Links: gemessene Intensität abhängig von der DMBA-Konzentration, n = 3.<br />
Rechts: DMBA-Konzentration in Abhängigkeit von der gemessenen Intensität. Die Anpassung der Daten<br />
erfolgte polynomisch (kubisch).<br />
Mit Hilfe der polynomischen Formel, konnte der Umsatz von DMBA durch die BAL über die<br />
Zeit ermittelt werden. Wobei eine Ausgangskonzentration von 1,2-1,5 mM DMBA für die<br />
Messung als sinnvoll erachtet wurde. Die genaue Durchführung, sowie Puffer und Lösungen,<br />
sind im Folgenden beschrieben.<br />
Durchführung des Aktivitätstests am Perkin Elmer LS50-B:<br />
Reaktionspuffer pH 8:<br />
Substratlösung:<br />
50 mM Kpi 15 mM DMBA in DMSO<br />
2,5 mM MgSO 4<br />
0,1 mM ThDP<br />
Enzymlösung:<br />
Lyophilisat oder Rohextrakt in Reaktionspuffer<br />
Einstellungen:<br />
Anregung: 360 nm Emission: 470 nm<br />
Anregungsspalt: ± 5 nm Emissionsspalt: ± 7,5 nm<br />
Messung: 1,5 min Messpunkte: 0,1 min<br />
Temperatur: 25 °C Küvettengeometrie: 4x10 mm<br />
Integration 0,1 sek<br />
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