Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
In Abb. 33 ist das Anregungsspektrum abhängig von verschiedenen Emissionsspaltbreiten
dargestellt. Hier zeigt sich, wie zu erwarten, dass die Fluoreszenzintensität bei größeren
Spaltbreiten zunimmt, da natürlich mehr Licht auf den Photodetektor fällt. Ebenfalls war zu
erwarten, dass der Emissionsspalt keinen Einfluss auf das Anregungsspektrum besitzt.
Ein Vergleich der Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Anregungsspalten und DMBA-
Konzentrationen zeigt, dass die Fluoreszenzintensität besonders bei hoch konzentrierten
Proben (> 1 mM DMBA), mit sinkenden Spaltbreiten zunimmt. Eine entscheidende Verbesserung
bezüglich der Steigung kann aber nicht beobachtet werden (Abb. 34). Die Verringerung
des Anregungsspaltes hätte also kaum Auswirkungen auf den Aktivitätstest.
400
2,5 nm
5,0 nm
7,5 nm
12,5 nm
300
Intensität
200
100
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
DMBA (mM)
Abb. 34: Fluoreszenzintensität von 0-3 mM DMBA bei verschiedenen Anregungsspalten. 50 mM Kpi-
Puffer, pH 8; 2,5 mM MgSO 4 ; 0,1 mM ThDP; 20 vol% DMSO. Halbmikroküvette (SD: 4x10 mm), Anregung:
360 nm, Emission: 470 nm, Anregungsspalt: ± 2,5-12,5 nm, Emissionsspalt: ± 7,5 nm T=25 °C.
Aufgrund der beobachteten Ergebnisse wurde für den Aktivitätstest mit 10 vol% DMSO eine
möglichst geringe DMSO-Konzentration gewählt. Aufgrund der geringen Löslichkeit von
DMBA und besonders des Ligationsprodukts TMBZ kann nicht ganz auf DMSO verzichtet
werden. Des Weiteren ist DMSO für die Ligationsreaktion ThDP-abhängiger Enzyme
förderlich (Kapitel 1.5.1). Die Reaktion wurde in Halbmikroküvetten durchgeführt, wobei die
Schichtdicke von 4 mm im Anregungslicht positioniert wurde, um den inneren Filtereffekt zu
minimieren. Für die Messung bei DMBA-Konzentrationen oberhalb von 1 mM wäre zwar die
Mikroküvette mit nur 2 mm Schichtdicke vorteilhafter, aber ein gründliches Mischen der
Probe wäre mit handelsüblichen Rührspateln nicht möglich. Obwohl das Anregungsmaximum
bei der gewählten Küvettengeometrie eigentlich bei 354 nm liegt, wurde 360 nm für die
70