Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Detektor
Detektor
Xenon Lampe
Xenon Lampe
Abb. 28: Schematische Darstellung des Einfluss der Küvettenorientierung auf die Emission. Mit der
größeren SD im Anregungslicht, wird ein Großteil der Photonen beim Durchtritt durch die höhere Molekülzahl
im durchstrahlten Probenvolumen bereits an der Probenoberfläche absorbiert und eine Anregung der Moleküle
im inneren der Probe Bereich wird immer geringer. Die relative Quantenausbeute (emittierte
Photonen/absorbierte Photonen) sinkt bei zunehmender Fluorophorkonzentration. Mit der geringeren SD im
Anregungslicht, kann eine größere Photonenzahl die gesamte Probe erreichen, die relative Quantenausbeute ist
somit größer.
Ein Vergleich des Absorptions- und Anregungsspektrums bei verschiedenen DMBA-Konzentrationen
verdeutlicht den Einfluss des inneren Filtereffektes (Abb. 29).
2,0
0,2 mM DMBA
0,5 mM DMBA
1,0 mM DMBA
350
0,5 mM DMBA
3,0 mM DMBA
1,5
300
250
Absorption
1,0
0,5
Intensität
200
150
100
0,0
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge (nm)
50
0
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge (nm)
Abb. 29: Vergleich Absorptions- (links) und Anregungsspektrum (rechts) von DMBA. 50 mM Kpi-Puffer,
pH 8; 2,5 mM MgSO 4 ; 0,1 mM ThDP; 20 vol% DMSO. Halbmikroküvette (SD: 4x10 mm), Anregung: 300-400
nm, Emission: 470 nm, Anregungsspalt: ± 5 nm, Emissionsspalt: ± 7,5 nm T=25 °C
Das Absorptionsmaximum von DMBA liegt bei 327 nm, die optische Dichte (OD) beträgt
hier bei 0,5 mM bereits 0,95. Die Absorption ist hier bereits so groß, dass kaum noch Licht
mit der Wellenlänge von 327 nm durch die gesamte Probe treten kann. Mit 1 mM DMBA
beträgt die OD 327nm sogar 2, mit 3 mM DMBA liegt sie außerhalb des messbaren Bereichs. Da
die Fluoreszenzintensität proportional zur Lichtintensität in der Probe abnimmt, wird das
Fluoreszenzsignal in diesem Bereich mit steigender DMBA-Konzentration immer geringer.
Aufgrund des inneren Filtereffektes verschiebt sich das Anregungsmaximum mit steigender
DMBA-Konzentration in den längerwelligen Bereich. Mit 0,5 mM DMBA liegt das Anregungsmaximum
bei 336 nm, mit 3 mM DMBA sogar bei 356 nm. Die Überlagerung von
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