Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
In dieser Arbeit sollte der Test nicht genutzt werden, um Reaktionsverläufe zu ermitteln,
sondern Anfangsaktivitäten zu ermitteln. Hierfür war eine Anpassung des Testes notwendig.
Des Weiteren ist die Fluoreszenz sehr komplex und kann von vielen Faktoren beeinflusst
werden. So sind gerätespezifische Faktoren und die Küvettengeometrie von großer
Bedeutung, Puffer und pH-Wert, sowie die Zugabe von Kosolventien können ebenfalls
Einfluss auf die fluoreszierenden Eigenschaften einer Substanz haben. So genannte
„Quenching-“ (Fluoreszenzlöschung) Prozesse können auftreten, welche z.B. durch den
Zusammenstoß zweier Teilchen miteinander hervorgerufen werden. Die Wahrscheinlichkeit
eines solchen dynamischen „Quenchings“ wird durch erhöhte Temperaturen, was
gleichbedeutend mit einer höheren Teilchenbewegung ist, vergrößert. Aber auch eine hohe
Teilchenzahl, z.B. des Fluorophors selbst, führt zu einer Erhöhung der Stoßzahl und damit zu
einer Verringerung der Fluoreszenz. Des Weiteren ist besonders bei hohen Fluorophorkonzentrationen
zu berücksichtigen, dass durch die Absorption des Anregungslichtes nur ein
bestimmter Anteil an Molekülen, die dem Anregungslicht direkt ausgesetzt sind, angeregt
wird. Dies kann ebenfalls einen entscheidenden Einfluss auf die Gesamtfluoreszenz haben.
Für die Etablierung des Aktivitätsstest musste also eine große Zahl an Faktoren berücksichtigt
werden. Der Test wurde zunächst am LS-50B von Perkin Elmer evaluiert (Kapitel 3.9.1.3.1),
im Laufe dieser Arbeit stand das komplexere und sensitivere Fluoreszenzphotometer
Fluorolog 3-22 von Horiba Jobin Yvon zur Verfügung und der Test wurde an dieses Gerät
angepasst (Kapitel 3.9.1.3.2).
3.9.1.3.1 Etablierung des fluoreszenzphotometrischen Aktivitätstests am LS-50B
Reaktionspuffer pH 6,5 und pH 8:
Substratlösung:
50 mM Kpi x mM DMBA in DMSO
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
Bei Zavrel et al. 2008 wird der Test in 50 mM Kpi-Puffer, pH 8,5 mit 30 vol% DMSO und
3 mM DMBA bei 25 °C durchgeführt. Die Fluoreszenz wird bei einer Wellenlänge von
360 nm angeregt und die Emission von DMBA bei 470 nm gemessen. Bis auf den pH-Wert
wurden diese Parameter übernommen und die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der
DMBA-Konzentration ermittelt. Hierfür wurden 700 µl Reaktionspuffer, pH 8 mit 300 µl
Substratlösung (0,33-10 mM DMBA in DMSO) in einer Halbmikroküvette aus Quarzglas
(SD: 10x4 mm) gemischt, auf 25 °C temperiert und die Fluoreszenz ermittelt (Abb. 22). Die
61