Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Material & Methoden<br />
3.9.1.2 Gekoppelter photometrischer Test zur Bestimmung der Lyaseaktivität<br />
(BAL)<br />
Reaktionspuffer pH 8:<br />
Benzoin-Stammlösung:<br />
50 mM Kpi 31,8 mg Benzoin in PEG 400<br />
2,5 mM MgSO 4<br />
0,1 mM ThDP<br />
NADH-Lösung<br />
Benzoin-Lösung 1,76 mM:<br />
3,5-7 mM NADH in Reaktionspuffer 1,5 ml Benzoin-Stammlösung<br />
7 ml Reaktionspuffer<br />
HL-ADH-Lösung:<br />
2,5-5 U/ml HL-ADH in Reaktionspuffer<br />
Die Lyaseaktivität der BAL wurde unter anderem in einem gekoppelten photometrischen Test<br />
bestimmt. In diesem Test wird die Spaltung von einem Benzoin-Molekül zu zwei<br />
Benzaldehyd-Molekülen, welche die Alkoholdehydrogenase aus der Pferdeleber (HL-ADH)<br />
unter NADH-Verbrauch zu Benzalkohol reduziert, nachgewiesen. Die Messung der Aktivität<br />
erfolgte über die Messung der NADH-Abnahme bei 340 nm (Abb. 18).<br />
BAL<br />
2 HL-ADH 2<br />
Benzoin<br />
Benzaldehyd<br />
NADH NAD +<br />
Benzalkohol<br />
Abb. 18: Gekoppelter Benzoin-Lyase Test. 1 Benzoin-Molekül wird zu zwei Benzaldehyd-Molekülen durch<br />
die BAL gespalten. Der entstandene Benzaldehyd wird wiederum durch die HL-ADH unter NADH-Verbrauch<br />
zu Benzalkohol reduziert.<br />
Zu 800 µl Benzoin-Lösung werden 100 µl NADH- und 50 µl HL-ADH Lösung direkt in eine<br />
1,5 ml Kunstoff-Küvette gegeben und mit einem Spatel gemischt. In der Benzoin-Lösung war<br />
stets ein geringer Anteil Benzaldehyd enthalten, welcher durch autokatalytischen Zerfall des<br />
Benzoins entstanden ist. Dieser wurde sofort nach Zugabe der HL-ADH reduziert und hatte<br />
bereits einen hohen NADH-Verbrauch zur Folge. Der Ansatz wurde für 5-10 min bei 30 °C<br />
im Spektrophotometer inkubiert um eine möglichst vollständige Reduktion des Benzaldehyds<br />
zu gewährleisten. Die NADH-Konzentration wurde so hoch gewählt, dass nach dieser Zeit die<br />
Absorption bei 340 nm noch 2-2,2 betrug. Durch Zugabe von 50 µl BAL-Lösung wurde die<br />
Zielreaktion gestartet und alle 10 Sek die Absorption über einen Messzeitraum von 90 Sek<br />
verfolgt. Die volumetrische und spezifische Aktivität wurde wie in Kapitel 3.9.1.1<br />
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