Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
wird durch ein Hilfsenzym, die Alkoholdehydrogenase aus der Pferdeleber (HL-ADH) unter
NADH-Verbrauch zu Benzalkohol reduziert. Da NADH ein Absorptionsmaximum bei
340 nm besitzt, während NAD + hier nicht absorbiert, kann zur Ermittlung der Aktivität die
Abnahme des NADH photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt werden.
BFD
-CO 2
HL-ADH
Benzoylformiat
Benzaldehyd
NADH NAD +
Benzalkohol
Abb. 17: Gekoppelter Decarboxylase Test. Die BFD sowie die BFDH281A spaltet 1 Benzoylformiat-Molekül
zu CO 2 und Benzaldehyd. Der gebildete Benzaldehyd wird von der HL-ADH unter NADH-Verbrauch zu
Benzalkohol reduziert.
Zu 700 μl Reaktionspuffer wurden 100 μl Substrat-, 100 μl NADH- und 50 μl ADH-Lösung
in eine 1,5 ml Kunstoffküvette gegeben, mit einem Spatel gemischt und im Spektrophotometer
ca. 5 min auf 30 °C erwärmt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl
BFDH281A-Lösung gestartet und alle 10 Sek über einen Gesamtzeitraum von 90 Sek
verfolgt. Die Messung ergibt eine Gerade mit fallender Steigung -ΔA/min. Über folgenden
Zusammenhang kann die volumetrische Aktivität berechnet werden:
ΔA/min⋅
V
Aktivität[ U/ml] = ⋅ f = ΔA/min⋅
F⋅
f
Gleichung 2
ε⋅
v⋅
d
ΔA/min Änderung der Absorption pro min
V
gesamtes Testvolumen (hier 1000 μl)
ε molarer Extinktionskoeffizient (für NADH 6,22 L * mmol -1 * cm -1 )
v
Probenvolumen der Enzymlösung (hier 50 μl)
d
Schichtdicke der Küvette (1 cm)
f
Verdünnungsfaktor der Enzymlösung
F Umrechnungsfaktor: 3,2154
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität in U/mg Enzym wurde die Proteinkonzentration
ermittelt.
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