Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Nach Trocknung der Platte wurde diese senkrecht in eine, mit Chloroform als Fließmittel
(mobile Phase) gesättigte, Chromatographiekammer gestellt. Das DMBA war nach 2 Stunden
Laufzeit deutlich vom TMBZ getrennt. Die Auftrennung konnte unter UV-Licht (254 nm)
überprüft werden. Der entsprechende Bereich wurde von der Platte entnommen und das
TMBZ mittels Ethylacetat aus dem Kieselgel gelöst. Trotz der Reinigung mittels DC, konnte
nach HPLC-Analyse (Kapitel 3.8.1) ein geringer Anteil (ca. 0,8%) DMBA identifiziert
werden. Das Ethylacetat wurde im Vakuum am Rotationsverdampfer entfernt. Das
gewonnene TMBZ wurde bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Spätere HPLC-Analysen
zeigten, dass TMBZ nicht vollständig stabil ist und etwa 5% innerhalb weniger Tage
autokatalytisch wieder zu DMBA zerfallen.
3.7.2 Synthese von 4,4´-Dichlorbenzoin
Reaktionspuffer pH 8:
Enzymlösung:
50 mM TEA 1 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP
30 % DMSO (v/v)
168 mg 4-Chlorbenzaldehyd (4-ClBA) wurden mit 10 ml Reaktionspuffer gemischt, 200 µl
Enzymlösung zugegeben und über Nacht gerührt (600 Upm, 25 °C). Anschließend wurde das
präzipitierte Produkt über eine Nutsche filtriert. Der Rückstand wurde zunächst mit kaltem
Wasser gewaschen und das 4,4´-Dichlorbenzoin (4,4´-ClBZ) in Diethylether gelöst. 4-ClBA
ist in Diethylether unlöslich und konnte so vollständig vom 4,4´-ClBZ getrennt werden, was
durch HPLC-Analyse (Kapitel 3.8.1) bestätigt wurde. Das gewonnene 4,4´-ClBZ wurde bis
zur Verwendung bei 4 °C gelagert.
3.8 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Mittels der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance/pressure liquid
chromatography, HPLC) können unter anderem chemische Komponenten voneinander
getrennt, sowie mit Hilfe eines Standards identifiziert und quantifiziert werden.
Normalerweise besteht das Säulenmaterial (stationäre Phase) aus druckresistenten Silica-
Partikeln. Die Partikel können unbeschichtet, polar (normale Phase), apolar (Umkehrphase
oder reversed phase, RP) oder mit einem Enantiomer (chirale Phase) beschichtet sein.
Umkehrphasen sind mit Alkylketten einer bestimmten Kettenlänge besetzt (z.B. C4, C8 oder
C18). Unbesetzte polare Si-OH Gruppen der Silica-Partikel werden gedeckelt, z.B. indem sie
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