Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Alle Puffer wurden sterilfiltriert und entgast.
Säulenvolumen: 12 ml (5 L Kulturen, Kapitel 3.3.3) und 61 ml (Hochzelldichtekultivierung, Kapitel 3.3.4)
Flussrate: 1-3 ml/min
Die Reinigung rekombinanter C- oder N-terminaler Hexahistidin-Fusionsproteine erfolgte
unter nativen Bedingungen mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC;
(Porath et al., 1975). Das Prinzip der IMAC beruht auf einer stabilen Interaktion von Ni 2+ -
Ionen und Nitrilotriessigsäure- (NTA)-Liganden, welche auf einer Agarosematrix
immobilisiert sind. Die Ni 2+ -Ionen können im Austausch gegen Wasser mit zwei
Histidinresten interagieren und so zwei Fusionsproteine binden (Hochuli, 1988, Janknecht et
al., 1991). Gebundene Proteine können durch die Protonierung der interagierenden
Aminosäureketten oder durch Metall-bindende Liganden, wie Imidazol (Teil der Histidin-
Seitenkette), eluiert werden. Zu Beginn einer Reinigung wurde eine Ni 2+ -NTA-Säule mit dem
2-3 fachen Volumen Äquilibrierungspuffer gespült. Anschließend wurde der Rohextrakt
aufgetragen. Nach Bindung des Zielproteins an die Ni 2+ -NTA-Matrix wurden ungebundene
Proteine mit Äquilibrierungspuffer von der Säule gespült (Durchlauf). Durch die
anschließende Waschpufferspülung mit geringer Imidazolkonzentration wurden unspezifisch
gebundene Proteine von der Ni 2+ -NTA-Matrix eluiert. Die gebundenen Proteine wurden mit
Elutionspuffer und dem darin enthaltenen Imidazol von der Matrix verdrängt. An diese
Reinigung schloss sich direkt eine Entsalzung durch Größenauschlusschromatographie
(Kapitel 3.6.2) an, um das Imidazol aus der Proteinfraktion zu entfernen. Anschließend
wurden die einzelnen Fraktionen mittels Bradford auf ihren Proteingehalt (Kapitel 3.5.2) und
auf ihre Aktivität (Kapitel 3.9.1) hin untersucht.
3.6.2 Größenausschlusschromatographie mittels Sephadex G-25 Matrix
Entsalzungspuffer pH 6,5-7:
10 mM Kpi
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
Alle Puffer wurden sterilfiltriert und entgast.
Säulenvolumen: 1 L
Flussrate: 5-15 ml/min
Probenvolumen: 20-100 ml
Die zuvor gereinigten Enzyme (Kapitel 3.6.1) wurden direkt im Anschluss mit Hilfe einer
G-25 Matrix (GE Healthcare, München, Deutschland) entsalzt. Die Säule wurde mit dem 1,5-
50