Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
erfolgte bei konstanten 100 bzw. 200 V. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die
SDS-Gele gefärbt (Kapitel. 3.5.4) und dokumentiert.
3.5.4 Färbung von SDS-Gelen
3.5.4.1 Färben von SDS-Gelen mittels Coomassie
Coomassie-Färbelösung
Entfärbelösung
50 % Ethanol tech (v/v) 40 % Ethanol tech (v/v)
10 % Essigsäure 10 % Essigsäure (v/v)
0,1 % Coomassie Brilliant Blau G250 (w/v)
Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die SDS-Gele für entweder in „Simply Blue
safe stain“ (Invitrogen, Paisley, England) oder in Coomassie-Färbelösung (Merril, 1990) für
mind. 2 h geschwenkt. Anschließend wurde die Färbelösung gegen eine Entfärbelösung oder
bei „Simply Blue safe stain“ gefärbten Gelen gegen deionisiertes Wasser getauscht. In beiden
Fällen wurde die Entfärbelösung bzw. das deionisierte Wasser etwa alle 20–30 min
gewechselt, bis die proteinfreien Bereiche komplett entfärbt waren. Danach wurden die Gele
eingescannt und bei Bedarf zur Lagerung bei 4 °C in Folie eingeschweißt.
3.5.4.2 Färben von SDS Gelen mittels Silberfärbung
Die Silberfärbung sowie die anschließende Entfärbung der SDS-Gele, nach Auftrennung der
Proteine, erfolgten mittels des SilverXpress Staining Kit (Invitrogen, Paisley, England) gemäß
Herstellerangaben.
3.6 Reinigung und Lagerung rekombinanter Proteine
3.6.1 Reinigung mittels Immobilisierter Metallaffinitätschromatographie über eine
Ni 2+ -NTA-Matrix
Aufschlusspuffer pH 6,5-7: Äquilibrierungspuffer pH 7
50 mM Kpi 50 mM Kpi
2,5 mM MgSO 4 2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP 0,1 mM ThDP
Waschpuffer pH 7,2-7,5 Elutionspuffer pH 7,5-7,8
50 mM Kpi 50 mM Kpi
2,5 mM MgSO 4 2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP 0,1 mM ThDP
50 mM Imidazol 250 mM Imidazol
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