Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Schleicher & Schuell) filtriert und in einer lichtgeschützten Flasche gelagert. Neben der selbst
hergestellten Bradford-Lösung wurden ebenfalls käuflich erworbene Bradford-Lösungen
genutzt (AppliChem, Darmstadt, Deutschland oder Sigma, St. Louis, USA).
3.5.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Trenngel 12% (2 für Minigele):
4 ml
Rotiphorese ® Gel 30
(30% Acrylamid, 0,8% N,N’-Methylenbisacrylamid)
2,5 ml 1,5 M Tris/HCl pH 8,8
3,4 ml Millipore H 2 O
100 µl 10% SDS (w/v)
100 µl 10% APS (w/v)
10 µl TEMED
Sammelgel 5% (für 2 Minigele):
0,83 ml
Rotiphorese ® Gel 30
(30% Acrylamid, 0,8% N,N’-Methylenbisacrylamid)
1,3 ml 0,5 M Tris/HCl pH 6,8
2,8 ml Millipore H 2 O
50 µl 10% SDS (w/v)
50 µl 10% APS (w/v)
10 µl TEMED
Elektrophorese-Puffer:
250 mM Tris Ultra
1,92 M Glycin
1 % SDS (w/v)
SDS-Probenpuffer (5x):
0,5 M Tris/HCl pH 6,8
10 % Glycerin (v/v)
4 % SDS (w/v)
2 % β-Mercaptoethanol
0,03 % Bromphenolblau
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinproben erfolgte unter denaturierenden
Bedingungen in einem diskontinuierlichen Gelsystem. Tris-Glycin Gele nach dem Laemmli-
System (Laemmli 1970) wurden selbst hergestellt. Hierfür wurden die einzelnen
Komponenten miteinander vermischt, wobei die Zugabe von APS und TEMED erst kurz vor
Befüllung der Gelkammern erfolgte. Die Gele wurden in der vertikalen Gelapparatur „Mini
Protean II Dual Slap Cell“ (Biorad, München, Deutschland) verwendet. Die Protein-Proben
wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt, 5–10 min bei 98 °C vollständig denatuiert und
anschließend elektrophoretisch getrennt oder bei -20 °C gelagert.
Kommerziell erworbene „NuPAGE® Novex“ 4-12% Bis-Tris-Gradienten Gele (Invitrogen,
Paisley, England) wurden gemäß Herstellerangaben, mit den zugehörigen Puffern und der
vertikalen Gelapparatur „XCell SureLock Mini-Cell“ verwendet. Die Elektrophorese
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