Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
mg/ml zugegeben und die Lösung 30 min auf Eis unter Rühren inkubiert. Lysozym spaltet die
β-(1→4)-glykosidische Bindung zweier Peptidoglycanmoleküle im Mureinnetz der
Bakterienzellwand, wodurch die Zellwand ihre Stabilität verliert. Die Ultraschallbehandlung
erfolgte mit einer Beschallung von 4 x 1–5 min auf Eis und analogen Pausen (Ultraschallprozessor
UP 200S und Sonotroden S1, S3, SD14, Dr. Hielscher GmbH, Telthof,
Deutschland). Der Desintegrator wurde auf 70% der Maximalamplitude und einen Zyklus von
0,5 eingestellt. Anschließend wurden unlösliche Zellbestandteile mittels Zentrifugation
sedimentiert (45 min, 18.000 Upm, 4 °C). Der Überstand, welcher die löslichen
Zellbestandteile inklusive des rekombinanten Enzyms enthält, wurde entweder direkt als
Rohextrakt für Proteinreinigungen (Kap. 3.6.1) eingesetzt oder für die spätere Verwendung
bei -20 °C gelagert, wobei die Lagerung nie länger als 1 Woche betrug.
3.5.2 Quantitative Proteinbestimmung nach Bradford
Bradford-Lösung:
100 mg/ml Coomassie Brilliant Blau G250
50 ml/L Ethanol abs.
100 ml/L ortho-Phosphorsäure (85%)
Die Bestimmung der quantitativen Proteinkonzentration nach Bradford ist ein
kolorimetrisches Verfahren und beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums von
Coomassie-Brilliant Blau G250, einem Triphenylmethan-Farbstoff, in saurer Lösung von
465 nm nach 595 nm. Die Bindung des Farbstoffes erfolgt unspezifisch an kationische und
nichtpolare, hydrophobe Seitenketten von Proteinen, wobei die Intensität des Farbkomplexes
direkt vom Proteingehalt abhängig ist. Bei dieser Methode wird die Proteinkonzentration
einer unbekannten Probe relativ zu einem Protein (bovines Serum Albumin, BSA) bekannter
Konzentration bestimmt. 100 μl Protein-Probe wurde mit 900 μl Bradford-Lösung versetzt,
vermischt und für 10 min abgedunkelt bei Raumtemperatur inkubiert. Als Referenz dienten
900 μl Bradford-Lösung mit 100 μl des jeweiligen Puffers. Die Absorption des entstandenen
Proteinkomplexes wurde bei 595 nm gemessen. Anhand der Kalibriergeraden von BSA
konnte die Proteinkonzentration der Probe berechnet werden.
Für die Herstellung eigener Bradford-Lösung wurde Coomassie Brilliant Blau G250 in
Ethanolabs. gelöst und anschließend mit ortho-Phosphorsäure versetzt. Die Lösung wurde für
eine Stunde gerührt, anschließend mit Millipore-H 2 O auf einen Liter aufgefüllt und über
Nacht gerührt. Am folgenden Tag wurde die Lösung durch einen Faltenfilter (240 mm,
47