Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Für die Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen wurde eine 5 ml Vorkultur (Kapitel
3.3.2) des entsprechenden Bakterienstammes über Nacht angezogen. Anschließend wurden
50 ml LB-Medium (Kapitel 3.3.1) mit 0,5 ml der Vorkultur inokuliert, mit 1 ml Mg 2+ -Mix
versetzt und bis zu einer OD 600 von 0,5–0,7 bei 37 °C inkubiert. Nach Sedimentation der
Zellen mittels Zentrifugation (15 min, 5000 Upm, 4 °C), wurde das Sediment in 50 ml
eiskaltem TMF-Puffer vorsichtig resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Nach einem
weiteren Zentrifugationsschritt (15 min, 4000 Upm, 4 °C) wurde das Zell-Sediment in 4 ml
eiskaltem TMF-Puffer aufgenommen und mit 1 ml sterilem Glycerin versetzt. Aus der Zell-
Glycerin-Suspension wurden 200 μl Aliquots pipettiert, welche bei -80°C gelagert wurden
3.4.5 Transformation kompetenter E. coli-Zellen
Für eine chemische Transformation wurden 1–5 μl Plasmid-DNA mit 200 μl kompetenten
E. coli-Zellen (Kapitel 3.4.4) gemischt (Hanahan, 1983). Nach 30 minütiger Inkubation auf
Eis erfolgte ein Hitzeschock von 90 Sek bei 42 °C. Im Anschluss wurden die Transformationsansätze
5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 700 μl LB-Medium (Kapitel 3.3.1)
erfolgte die phänische Expression für 1–2 h bei 37 °C auf einem Brutroller. Die Transformationsansätze
wurden mit einem Drigalski-Spatel zu 1/10 und zu 9/10 auf selektiven LB-
Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C aerob inkubiert.
3.4.6 Sequenzierung von DNA
Alle Sequenzierungen wurden als Auftragsarbeiten von der Firma Sequiserve (Vaterstetten,
Deutschland) durchgeführt.
3.5 Proteinchemische Methoden
3.5.1 Zellaufschluss mittels Sonifikation
Der Aufschluss von Zellmaterial zur Freisetzung intrazellulärer, rekombinanter Proteine aus
Proteinexpressionskulturen (Kapitel 3.3.3) oder Hochzelldichte-Kultivierung (Kapitel 3.3.4)
erfolgte mittels Ultraschallbehandlung oder in Kombination mit einem enzymatischen
Zellaufschluss mittels Lysozym und anschließender Ultraschallbehandlung. Hierzu wurden
20% (w/v) der bei -20 °C gelagerten Zellen in 50 mM Kpi-Puffer pH 6,5 -7,0 (mit 2,5 mM
MgSO 4 und 0,1 mM ThDP) resuspendiert. Lysozym wurde in einer Konzentration von 1
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