Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Ethidiumbromid-Lösung:
0,1-0,5 µg/ml Gel Ethidiumbromid
Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Fragmente ist abhängig von ihrem Molekulargewicht,
ihrer Konformation, der Konzentration des Agarosegels und der Stärke des
elektrischen Feldes. Je nach Größe der zu trennenden DNA-Fragmente erfolgte die
Auftrennung in 1% – 2%igen Agarosegelen. Hierfür wurde die entsprechende Menge Agarose
(w/v) in 0,5x TBE-Puffer aufgekocht und mit Ethidiumbromid-Lösung versetzt. Die DNA-
Proben wurden mit 20% 5x DNA-Probenpuffer versetzt und anschließend in die Taschen
eines horizontalen Agarosegels pipettiert. Die Elektrophorese fand in Gelkammern bei einer
auf 60 mA limitierter Stromstärke sowie konstanten Spannungen zwischen 8 und 12 V/cm,
bezogen auf die Länge des Gels statt. Als Laufpuffer diente 0,5x TBE-Puffer. Bei jedem Gel
wurde der Längenstandard „Gene Ruler 1kb DNA ladder” (Fermentas, St. Leon Rot,
Deutschland) mitgeführt.
3.4.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentrationen von DNA-Proben wurden mittels
analytischer Agarose-Gelelektrophorese (Kapitel 3.4.2)
anhand des Längenstandards „Gene Ruler 1kb DNA
ladder” (Fermentas, St. Leon Rot, Deutschland),
welcher distinkte Mengen an DNA beinhaltet,
abgeschätzt.
Abb. 15: Gene Ruler 1 kb DNA
ladder.
Quelle: http://www.fermentas.com
3.4.4 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen
TMF-Puffer:
Mg 2+ -Mix:
100 mM CaCl 2 500 mM MgCl 2
50 mM RbCl 500 mM MgSO 4
40 mM MnCl 2
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