Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Expression erfolgte nach ca. 27 h mit 2 mM IPTG. Die Zellernte erfolgte ca. 14 h nach
Induktion.
3.3.5 Bestimmung der Zelldichte
Zur Messung des Zellwachstums wurde die optische Dichte (OD) einer Kultur in einem
Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm relativ zum jeweiligen Medium
bestimmt. Eine OD 600 von 1 entsprach etwa 10 9 Zellen/ml.
3.3.6 Proteinexpression der BAL-Varianten
Die bei Sloning Biotechnologie mit Sitz in München in Auftrag gegebenen Varianten wurden
als lyophylisierte Plasmid-DNA (ca. 1,5-3 µg) geliefert. Die DNA wurde in 10-20 µl
Nuklease freiem Wasser aufgenommen und ein Teil 1:10 verdünnt (ca. 15 ng/µl). Je 200 µl
transformationskompetente E. coli SG13009 Zellen wurden mit 1 µl der Plasmid DNA
transformiert (Kapitel 3.4.5) und die BAL-Varianten anschließend überexprimiert (Kapitel
3.3.3) und gereinigt (Kapitel 3.6).
3.4 Molekularbiologische Methoden
3.4.1 Präparation von Plasmid-DNA
Die Präparation von Plasmid-DNA in geringen Mengen wurde aus 1,5 – 5 ml E. coli-Kulturen
(Kap. 3.2.2) gemäß den Herstellerangaben mit dem „Gene JET Plasmid Miniprep Kit“
(Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) durchgeführt. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte
in Millipore-H 2 O. Wurden größere Mengen an DNA benötigt, so wurde die Präparation aus
einer 50-100 ml Kultur mit dem „Qiagen High speed Plasmid Midi Kit“ (Qiagen, Hilden,
Deutschland) oder dem „NucleoBond Xtra Midi“-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte auch hier in
Millipore-H 2 O.
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3.4.2 Agarose-Gelelektrophorese
TBE-Puffer (5x):
Probenpuffer (5x):
89 mM Tris/HCl 100 mM Na 2 -EDTA
89 mM Borsäure 43 % (v/v) Glycerin
0,5 mM Na 2 -EDTA 0,05 % (w/v) Bromphenolblau