Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.3.4 Hochzelldichtekultivierung
HZD-Batch: Spurenelementlösung: Vitaminlösung:
2 g/L NH 4 Cl 10 g/L CaCl 2 · 2 H 2 O 0,1 g/L Riboflavin
20 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 0,5 g/L ZnSO 4· 7 H 2 O 10 g/L Thiamin-HCl
130 g/L KH 2 PO 4 0,25 g/L CuSO 4· 2 H 2 O 0,5 g/L Nicotinsäure
100 g/L K 2 HPO 4 2,5 g/L MnSO 4· H 2 O 0,5 g/L Pyridoxin-HCl
60 g/L NaH 2 PO 4 · H2O 1,75 g/L CoCl 2· 6 H 2 O 0,5 g/L Ca-Phanthotenat
30 g/L Hefeextrakt 0,125 g/L H 3 BO 3 0,001 g/L Biotin
2,5 g/L AlCl 3 · 6 H 2 O 0,002 g/L Folsäure
0,5 g/L Na 2 MoO 4· 2 H 2 O 0,01 g/L Cyanocobalamin
10 g/L FeSO 4· 7 H 2 O
HZD-Feed: Antibiotika-Lösungen: Glucose-Batch:
500 ml HZD-Batch 200 g/L Ampicillin 400 g/L Glucose
+ 75 g/L Hefeextrakt 75 g/L Kanamycin
MgSO 4 -Lösung: Thiamin-Lösung: Glucose-Feed:
200 g/L MgSO 4 · 7 H 2 O 200 g/L Thiamin-HCl 717 g/L Glucose
IPTG-Lösung:
233 g/L IPTG
Die Lösungen HZD-Batch, HZD-Feed, MgSO 4 -Lsg., Glucose-Batch und Glucose-Feed
wurden getrennt voneinander autoklaviert. Durch ihren niedrigen pH-Wert war die
Spurenelemente-Lösung autosteril. Die übrigen Lösungen wurden mittels eines Membranfilters
(0,2 μm, Carl Roth) sterilisiert. Aus den aufgeführten Komponenten wurden
folgendermaßen ein Batch-Medium und eine HZD-Feed-Lösung zusammengestellt:
Batch-Medium:
HZD-Feed-Lösung:
1000 ml HZD-Batch 500 ml HZD-Feed
50 ml Glukose-Batch 4,18 L Glucose-Feed
50 ml MgSO 4 -Lsg. 250 ml MgSO 4 -Lsg.
40 ml Spurenelement-Lsg. 20 ml Spurenelement-Lsg.
50 ml Vitamin-Lsg. 25 ml Vitamin-Lsg.
5 ml Thiamin-Lsg. 25 ml Thiamin-Lsg.
3 ml Antischaum
(Antifoam, Sigma AF 289)
2 ml Antischaum
(Antifoam, Sigma AF 289)
8,7 L VE-Wasser
Die Hochzelldichte- (HZD)-Kultivierung pKK233_2_BALHis Plasmid tragender Bakterienkulturen
erfolgte im 15 L Maßstab in einem Techfors I-Fermenter (40 L) entsprechend dem
Protokoll von (Korz et al., 1995). 10 L Batch-Medium wurden mit 100 ml einer Vorkultur
inokuliert. Die Inkubation erfolgte bei 30 °C, der pH-Wert wurde konstant bei pH 7,0
gehalten und wenn nötig mit 25% (v/v) NH 3 oder 85% (v/v) H 3 PO 4 titriert. Über den
gesamten Zeitraum der Fermentation wurde kontinuierlich HZD-Feed-Lösung zugeführt. Der
Sauerstoffpartialdruck zwischen 30 und 40% wurde konstant eingehalten. Die Induktion der
43