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Motivation & Zielsetzung 2 Motivation und Zielsetzung Die Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens stellt aufgrund ihrer hohen Ligaseaktivität und ihres breiten Substratspektrums ein besonderes Enzym in der Klasse der Thiamindiphosphat (ThDP)- abhängigen Enzyme dar (Müller et al., 2009). In den letzten Jahren wurden mit der BAL eine Reihe von Analysen in wässrig-organischen Zweiphasensystemen durchgeführt (Kapitel 1.5.2). Dies ermöglichte das Arbeiten bei höheren Substratund Produktkonzentration, im Vergleich zum einphasigen System mit DMSO und MTBE als Kosolventien. Allerdings wurde in ein- sowie zweiphasigen Systemen unter Prozessbedingungen eine um ein Vielfaches verminderte Stabilität gegenüber den entsprechenden Lagerstabilitäten ohne Substratzugabe beobachtet (Kapitel 1.4.4.3 und 1.5.2). Die Angaben für die Inaktivierung unter Prozessbedingungen variieren zwischen einer um das 4-50-fach beschleunigten Inaktivierung. Insgesamt weichen die Stabilitätsangaben in reinem Puffer, bei Verwendung von Kosolventien, organischen Lösungsmitteln als zweiter Phase oder unter Prozessbedingungen von Studie zu Studie stark voneinander ab. Außerdem wurden die einzelnen Faktoren, welche die Enzymstabilität in gerührten Emulsionssystemen beeinflussen können, nie getrennt voneinander untersucht. Um qualitative und quantitative Aussagen über den Einfluss der verschiedenen Faktoren, insbesondere der aromatischen aldehydischen Substrate, in einem emulgierten Zweiphasensystem auf die Stabilität der BAL treffen zu können, sollten diese getrennt voneinander analysiert werden. Hierbei sollte besonders die Inaktivierung durch den Rührvorgang selbst, die molekulare Toxizität sowie Grenzflächentoxizität eines geeigneten organischen Lösungsmittels untersucht und anschließend mit der Substratstabilität gegenüber aromatischen Aldehyden verglichen werden. Bei Bestätigung der bisherigen Beobachtung, dass die Aldehyde das Hauptproblem der Inaktivierung der BAL darstellen, sollte dieser Aspekt hinsichtlich der molekularen Ursachen analysiert werden. Verschiedene Parameter, wie die Substitutionen am aromatischen Ring, pH oder die potentielle Reaktivierbarkeit sollten betrachtet werden, um so Hinweise auf mögliche Inaktivierungsprozesse zu erhalten. Darüber hinaus sollte die der BAL strukturell sehr ähnliche Benzoylformiatdecarboxylase- Variante BFDH281A in die Untersuchungen mit einbezogen werden, um mittels möglicher Parallelen oder Unterschiede in der Inaktivierung Rückschlüsse auf potentielle strukturelle Merkmale, welche maßgeblich für die Inaktivierung sein könnten, ziehen zu können. 37
Material & Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien und Enzyme Tabelle 2: Chemikalien und Enzyme Chemikalien Bezugsquelle Acetonitril (HPLC grade) Biosolv Graz, Österreich Bovines Serum Albumin (BSA) Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland Bradford-Lösung AppliChem Darmstadt, Deutschland Sigma St. Louis, USA Ethidiumbromid Biorad München, Deutschland Methanol (HPLC grade) Biosolv Graz, Österreich Nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) biomol Hamburg, Deutschland Ni 2+ -Nitrilotriessigsäure (Ni 2+ -NTA) Qiagen Hilden, Deutschland Polyethylenglykol (PEG) 400 Hüls AG Marl, Deutschland Triethanolamin Riedel-de Haën Hannover, Deutschland Enzyme Bezugsquelle Lysozym aus Hühnereiweiß Sigma-Aldrich St. Louis, USA Alkoholdehydrogenase (aus Pferdeleber) Sigma-Aldrich St. Louis, USA Längenstandards Bezugsquelle Gene Ruler 1kb DNA ladder (ready-to-use) Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland Page Ruler Plus Prestained Protein ladder Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, in p.A.- Qualität von folgenden Firmen bezogen: Fluka (Sternheim, Deutschland), Gerbu (Gaiberg, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland) und Sigma- Aldrich (St. Louis, USA). 3.1.2 Geräte Tabelle 3: Geräte. Alle nicht aufgeführten Geräte entsprachen den allgemeinen Laborstandards Gerät Hersteller Bezeichnung Agarosegelelektrophorese Consert EV243/E143 Pharmacia LKB GPS 200/400 Advance Mupid-exu Autoklaven Systec DX65 H+P Varioklav V1500 Bilddokumentation Stratagene Eagle Eye II Dünnschicht Chromatographie Merk Kieselgel 60 F254 Externes Thermometer Amarell ama-digit ad 15 th Externe Pumpe Divac 24l Feinwaage Sartorius CP 224-S Sartorius BP 211-D 38
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