Helmholtz-Gemeinschaft

Motivation & Zielsetzung
2 Motivation und Zielsetzung
Die Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens stellt aufgrund ihrer hohen
Ligaseaktivität und ihres breiten Substratspektrums ein besonderes Enzym in der Klasse der
Thiamindiphosphat (ThDP)- abhängigen Enzyme dar (Müller et al., 2009). In den letzten
Jahren wurden mit der BAL eine Reihe von Analysen in wässrig-organischen Zweiphasensystemen
durchgeführt (Kapitel 1.5.2). Dies ermöglichte das Arbeiten bei höheren Substratund
Produktkonzentration, im Vergleich zum einphasigen System mit DMSO und MTBE als
Kosolventien. Allerdings wurde in ein- sowie zweiphasigen Systemen unter Prozessbedingungen
eine um ein Vielfaches verminderte Stabilität gegenüber den entsprechenden
Lagerstabilitäten ohne Substratzugabe beobachtet (Kapitel 1.4.4.3 und 1.5.2). Die Angaben
für die Inaktivierung unter Prozessbedingungen variieren zwischen einer um das 4-50-fach
beschleunigten Inaktivierung. Insgesamt weichen die Stabilitätsangaben in reinem Puffer, bei
Verwendung von Kosolventien, organischen Lösungsmitteln als zweiter Phase oder unter
Prozessbedingungen von Studie zu Studie stark voneinander ab. Außerdem wurden die
einzelnen Faktoren, welche die Enzymstabilität in gerührten Emulsionssystemen beeinflussen
können, nie getrennt voneinander untersucht. Um qualitative und quantitative Aussagen über
den Einfluss der verschiedenen Faktoren, insbesondere der aromatischen aldehydischen
Substrate, in einem emulgierten Zweiphasensystem auf die Stabilität der BAL treffen zu
können, sollten diese getrennt voneinander analysiert werden.
Hierbei sollte besonders die Inaktivierung durch den Rührvorgang selbst, die molekulare
Toxizität sowie Grenzflächentoxizität eines geeigneten organischen Lösungsmittels
untersucht und anschließend mit der Substratstabilität gegenüber aromatischen Aldehyden
verglichen werden. Bei Bestätigung der bisherigen Beobachtung, dass die Aldehyde das
Hauptproblem der Inaktivierung der BAL darstellen, sollte dieser Aspekt hinsichtlich der
molekularen Ursachen analysiert werden. Verschiedene Parameter, wie die Substitutionen am
aromatischen Ring, pH oder die potentielle Reaktivierbarkeit sollten betrachtet werden, um so
Hinweise auf mögliche Inaktivierungsprozesse zu erhalten.
Darüber hinaus sollte die der BAL strukturell sehr ähnliche Benzoylformiatdecarboxylase-
Variante BFDH281A in die Untersuchungen mit einbezogen werden, um mittels möglicher
Parallelen oder Unterschiede in der Inaktivierung Rückschlüsse auf potentielle strukturelle
Merkmale, welche maßgeblich für die Inaktivierung sein könnten, ziehen zu können.
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