Helmholtz-Gemeinschaft

Zusammenfassung & Ausblick
Molekulare Ursachen der Inaktivierung durch aromatische Aldehyde:
In allen Arbeiten, bei denen eine Inaktivierung der BAL durch die Aldehyde beschrieben
wurde, wurde eine Schiffbasenbildung über eine kovalente, reversible Bindung der Aldehyde
an Lysinreste der BAL als Ursache vermutet. Schiffbasen können nur ausgebildet werden,
wenn freie Aminogruppen insbesondere auf der Enzymoberfläche (N-Terminus und ε-Aminogruppen
eines Lysinrestes) deprotoniert vorliegen. Deshalb sollte ihre Dissoziationskonstante
(pK S -Werte) unterhalb des Umgebungs-pH-Werts liegen. Strukturvergleiche mit der,
gegenüber den aromatischen Aldehyden wesentlich stabileren BFDH281A (Kocot, 2010)
sowie PROPKA-Berechnungen der pK S -Werte der Lysinreste ergaben als einzigen möglichen
Angriffspunkt für eine solche Schiffbasenbildung das Lys127 in der BAL. Dieser Lysinrest
befindet sich im Zentrum der tetrameren Struktur. Aminosäureaustausche in diesem Bereich
führten aber zu keiner Stabilisierung gegenüber den aromatischen Aldehyden, so dass eine
signifikante Inaktivierung durch die Bildung von Schiffbasen ausgeschlossen werden konnte.
Vielversprechend waren jedoch Untersuchungen mit C-terminal verkürzten BAL-Varianten,
die in diesem Bereich der BFDH281A angepasst wurde. Diese BAL-Varianten zeigten
zumindest gegenüber zweien der drei Standardaldehyde eine signifikante Stabilisierung (BA
t 1/2 : ca. 2,5-2,8 h; DMBA t 1/2 : 4,7-5 h; 4-ClBA t 1/2 : 0,4-0,5 h). Gegenüber Benzaldehyd und
3,5-Dimethoxybenzaldehyd konnte also eine Stabilisierung um etwa das 5-10-fache im
Vergleich zur Wildtyp-BAL beobachtet werden, während gegenüber 4-Chlorbenzaldehyd
keine Stabilisierung gefunden wurde. In den Varianten ist der C-terminale Bereich um 13
Aminosäuren verkürzt, so wurde der Zugang zum aktiven Zentrum erweitert. Bei einer der
Varianten wurde der für die Reinigung über Ni 2+ NTA fusionierte His-Tag an den N-Terminus
verlegt (HisBALΔ), während er bei der anderen Variante C-terminal erhalten blieb
(BALΔHis). Neben der nachgewiesenen Bedeutung des C-Terminus für die Katalyse der
BAL (Kocot, 2010), ist dieser also auch an der durch die aromatischen Aldehyde hervorgerufenen
Inaktivierung beteiligt. Ein Einschluss der aromatischen Aldehyde und/oder
Produkte im Reaktionsraum durch den hydrophoben C-Terminus, welcher zu einer lokal
erhöhten Konzentration der Aldehyde führt, könnte hydrophobe Wechselwirkungen mit
katalytisch wichtigen Positionen oder dem C-Terminus selbst bewirken. Letztendlich könnten
durch die hydrophoben Wechselwirkungen reversible oder irreversible Konformationsänderungen
induziert werden, welche in der irreversiblen Inaktivierung der BAL resultieren. Die
Unterschiede in der Inaktivierung sowie der Reaktivierbarkeit deuteten bereits auf wenigstens
zwei verschiedene Inaktivierungsprozesse hin, welche abhängig vom Substrat und pH
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