Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
wobei eine typische Substratüberschussinhibierung ausgeschlossen werden kann, da diese
bisher nie beobachtet wurde (Janzen, 2002, Kühl, 2009, Stillger, 2004). Eine stabile kovalente
Bindung des Aldehyds am Enzym, z.B. direkt im aktiven Zentrum könnte zu einer
Blockierung der Reaktion oder an anderen Positionen zu strukturellen Veränderungen und
damit zur Inaktivierung führen. Sollte die beobachtete Inaktivierung durch eine kovalente
Bindung der Substrate am Enzym hervorgerufen werden, könnten diese Verbindungen nicht
durch Umpufferung wieder gelöst und eine Reaktivierung erreicht werden.
Reaktivierungsversuche könnten also Aufschluss darüber geben, ob es sich um einen
reversiblen Prozess handelt oder ob eine irreversible Inaktivierung über stabile kovalente
Bindung am Enzym vorliegt. Zusätzlich zu den gewählten Standardaldehyden, wurde auch
die Reaktivierung mit zwei ortho-substituierten Benzaldehyden untersucht. Dem 2-Chlorbenzaldehyd
(k des : 4,1% min -1 ), mit welchem die BAL eine ähnlich Inaktivierungsrate wie mit
4-Chlorbenzaldehyd (k des :3,5% ± 0,6 min -1 ) aufweist und dem 2-Methoxybenzaldehyd (k des :
10% min -1 ), welcher zu einer erhöhten Inaktivierungsrate der BAL führt (Abb. 58).
Nach Inkubation mit 2 mM der Substrate erfolgte die Abtrennung des Enzyms von den
Aldehyden mittels Gelfiltration über PD-10 Säulen (GE-Healthcare, Schweden). Für die
Inaktivierung wurde ein Ansatz mit 0,5 mg/ml BAL gewählt, um nach der Elution von der
Säule eine ausreichend hohe Enzymkonzentration für die anschließenden Aktivitätsmessungen
zu gewährleisten. Die HPLC-Analyse der eluierten Proben ergab keine
nachweisbaren Mengen der Aldehyde oder Benzoine, die Trennung war also erfolgreich
(Kapitel 3.11). Die in Tabelle 12 angegebenen relativen Aktivitäten sind anhand der
Ausgangsaktivität vor der Inaktivierung ermittelt worden. Eine mitgeführte Kontrolle der
BAL ohne Substratzugabe zeigte keine Inaktivierung im Messzeitraum oder durch die
Gelfiltration.
Mit den ortho-substituierten Benzaldehyden ist nach zwei Stunden eine fast vollständige
Inaktivierung erreicht. Während die Inaktivierung mit Benzaldehyd, 3,5-Dimethoxybenzaldehyd
und 4-Chlorbenzaldehyd in diesem Zeitraum nicht vollständig war. Dessen
ungeachtet konnte nach der Entfernung von allen untersuchten Aldehyden zumindest eine
partielle Reaktivierung der BAL beobachtet werden (Tabelle 12).
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