Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Abb. 55: Prinzip des HPLC-basierten Tests zur Ermittlung der Stabilität der BAL gegenüber
aromatischen Aldehyden. Ein Inaktivierungsansatz mit 0,02 mg/ml BAL in Puffer mit 30 vol% DMSO und
2 mM eines Benzaldehyd-Derivats wird in 50 μl Aliquots aufgeteilt und bei 25 °C für 1-2 h inkubiert. Innerhalb
dieser Zeit wird die relative Aktivität ermittelt, indem zu einem Aliquot 200 μl einer frischen Substratlösung mit
20-60 mM (abhängig von der Löslichkeit) desselben Aldehydes in Puffer mit 30 vol% DMSO zugegeben wird
(BAL: 0,004 mg/ml). Nach zwei Minuten (innerhalb des linear verlaufenden Reaktionsbereichs) wird die
Reaktion durch Zugabe von angesäuertem Isopropanol gestoppt und die Konzentration des entstandenen
Produkts mittels HPLC-Analyse detektiert. Parallel wird der Anteil des Produkts im Inaktivierungsansatz
ermittelt und bei der Berechnung der Aktivität berücksichtigt. Anhand der Produktbildung, kann die relative
Aktivität zu den verschiedenen Zeitpunkten ermittelt und die Desaktivierungskonstante berechnet werden.
Der Kpi-Puffer selbst scheint hier nur ein metastabiles System darzustellen, welches durch
Varianz in der Pufferzusammensetzung, wie Enzymzugabe und v. a. DMSO sowie Substratzugabe
zu einer schnellen Präzipitation des Magnesiumphophats führt. Hierdurch wird
reproduzierbares Arbeiten unmöglich. Da bereits mit der BAL in Triethanolaminpuffer (TEA-
Puffer) gearbeitet wurde (Stillger, 2004) und keine pH-Verschiebung durch den Zusatz von
DMSO (Kapitel 3.2.2) beobachtet wurde und sich weder ein nennenswerter Unterschied in
der Aktivität noch in der Stabilität innerhalb eines Messzeitraums von 4 Tagen gezeigt hatte,
wurden die folgenden Messungen nur noch in TEA-Puffer durchgeführt.
4.1.6 Ermittlung des Einfluss von Benzaldehyd auf die Stabilität der BAL mittels des
HPLC-basierten Testsystems
Mit einer Enzymkonzentration von 4 μg/ml BAL in 50 mM TEA-Puffer mit 30 vol% DMSO
und 50 mM Benzaldehyd verlief die Reaktion innerhalb von 4 Minuten linear. Auch bei den
zuvor mit 2 mM Benzaldehyd für 3-60 Minuten inkubierten und anschließend mit 200 μl
einer 50 mM Benzaldehyd-Lösung versetzten Proben, verlief die Reaktion innerhalb der
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