Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Ergebnisse & Diskussion<br />
Substrate auch einen unterschiedlichen Einfluss auf die BAL besitzen (Kocot, 2010). Dieser<br />
Aspekt sollte im Laufe der vorliegenden Arbeit weiter untersucht werden (Kapitel 4.2.1).<br />
4.1.5 Umstellung des Test- und des Puffersystems zur Ermittlung der Stabilität der<br />
BAL gegenüber aromatischen Aldehyden<br />
Aufgrund der Inkubation des Enzyms mit einem Substrat und der Ermittlung der Restaktivität<br />
mit einem anderen Substrat (3,5-Dimethoxybenzaldehyd), ist das beschriebene Testsystem<br />
nicht optimal für Bestimmung der tatsächlichen Restaktivität. Die Anwesenheit von<br />
verschiedenen Aldehyden kann zur Synthese von gemischten Benzoinen führen, was<br />
wiederum die gemessenen Aktivitäten verfälscht. Des Weiteren können die Mischprodukte<br />
einen unvorhersehbaren Einfluss auf die Fluoreszenz des 3,5-Dimethoxybenzaldehyds haben,<br />
was ebenfalls zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen würde. Deshalb wurde ein HPLCbasierter<br />
Test entwickelt, bei dem die BAL mit einer geringen Konzentration eines<br />
aromatischen Aldehyds inkubiert wird und die Restaktivität durch den Einsatz höherer<br />
Konzentrationen desselben Aldehyds ermittelt wird (Abb. 55 und Kapitel 3.10.3).<br />
Des Weiteren ergaben sich Probleme bei der Verwendung des Kaliumphosphat-(Kpi) Puffers.<br />
Neben einer pH-Verschiebung in den alkalischen Bereich durch DMSO Zugabe, wurde bei<br />
Anwesenheit von 10-30 vol% DMSO eine Präzipitation von Magnesiumphosphat beobachtet.<br />
Magnesiumsulfat wird dem Puffer zugesetzt, weil es, neben ThDP, ein wichtiger Kofaktor der<br />
BAL ist. Bei höheren pH-Werten, z.B. pH 7,5-8 konnte teilweise sofort, spätestens nach 2<br />
Tagen eine sichtbare Präzipitation nachgewiesen werden. Aber auch bei niedrigeren pH-<br />
Werten fand in vielen Fällen sofort nach Zugabe der aromatischen Substrate (v. a. den<br />
flüssigen wie 2-Chlor- und 3-Methoxybenzaldehyd) eine Präzipitation von Magnesiumphosphat<br />
statt. Eine Verringerung der MgSO 4 -Konzentration führte nur bedingt zu einer<br />
Verzögerung der Präzipitation. Außerdem zeigten Aktivitätsmessungen mit 3,5-Dimethoxybenzaldehyd,<br />
das der Einsatz des essentiellen Kofaktors unterhalb von 1 mM zwar nicht zu<br />
einer verringerten Stabilität aber zu einer verringerten Aktivität der BAL führt. Bei der<br />
Bildung und Spaltung des unsubstituierten Benzoins wurde in vorangegangenen Arbeiten<br />
zwar kein Unterschied in der Aktivität bei Magnesiumkonzentrationen von 0,025-5 mM<br />
beobachtet (Janzen et al., 2006, Stillger, 2004), jedoch scheint dies nicht für alle BAL<br />
katalysierten Reaktionen zu gelten. Deshalb wurden bei weiteren Versuchen in dieser Arbeit<br />
insgesamt hohe Kofaktorkonzentrationen (0,5 mM ThDP; 2,5mM MgSO 4 ) gewählt, um eine<br />
Limitierung der unterschiedlichen Reaktionen durch die Kofaktoren auszuschließen.<br />
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