Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Ergebnisse & Diskussion<br />
Abstoßungseffekte zwischen Protein und Adsorptionsoberfläche führt. Für die BAL wurde<br />
ein pI von 4,6 mittels isoelektrischer Fokussierung ermittelt (Janzen et al., 2006), während der<br />
pI für die BFD bei pH 6,5 liegt (Hasson et al., 1995). Da bei der Variante BFDH281A nur<br />
eine Aminosäure ausgetauscht wurde ist keine nennenswerte Änderung im pI zu erwarten.<br />
Aufgrund der höheren Nettoladung der BAL bei pH 6,5 gegenüber der BFDH281A ist also<br />
eine geringere Adsorption an die Teflonoberfläche sehr wahrscheinlich. Die ungleiche<br />
Adsorptionsrate wiederum könnte zu den unterschiedlich ausgeprägten Inaktivierungseffekten<br />
führen. Bei pH 6,5 ist bei der BAL eine höhere Inaktivierung in der Probe mit dem kleineren<br />
Volumen (0,6 ml) zu beobachten als bei den anderen Proben. Dies könnte auf die erhöhte<br />
Zugänglichkeit des Enzyms für die Rührfischoberfläche zurückzuführen sein, so wirkt sich<br />
der destabilisierende Effekt verstärkt aus.<br />
Eine SDS-PAGE-Analyse der BFDH281A weist auf einen weiteren Effekt durch den<br />
magnetischen Rührprozess hin. Eine 24 Stunden gerührte und vollständig inaktivierte<br />
Enzymprobe wurde vergleichend zu einer nicht gerührten Kontrolle elektrophoretisch<br />
aufgetrennt.<br />
Abb. 53: Vergleichende SDS-PAGE Analyse der nativen BFDH281A (K) und einer vollständig<br />
inaktivierten Probe (P). Links: schematische Darstellung der intermolekularen kovalenten Verknüpfung von<br />
zwei Monomeren mittels Oxidation und die Spaltung der Disulfidbrücken durch ein Reduktionsmittel. Rechts:<br />
ca. 30-35 μg gereinigtes Enzym wurden nach 24 h Inkubation auf dem Magnetrührer gelelektrophoretisch auf<br />
einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant-Blau gefärbt. K: ungerührte Kontrolle; P:<br />
gerührte Probe; Magnetrührer 1400 Upm; 1 mg/ml BFDH281A in 50 mM Kpi-Puffer, pH 6,5; 0,1 mM ThDP;<br />
2,5 mM MgSO 4 . -Mercaptoethanol (Inkubation ca. 7 min bei 98 °C), M: Marker (Page<br />
Ruler TM Unstained Protein Ladder, Fermentas).<br />
Durch den denaturierenden Charakter von SDS werden Proteinaggregate, die nicht kovalent<br />
miteinander verknüpft sind, wieder voneinander getrennt, so dass einzelne Proteinketten nach<br />
Coomassie-Färbung als eine distinkte Bande zu erkennen sind. Die Oxidation von Proteinen<br />
kann über Cysteinreste zu intra- und intermolekulaten Disulfidbrücken führen. Diese<br />
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