Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.10.5 Stabilität der BAL und der BAL-Deletionsvarianten in Puffer
Puffer pH 8 (ohne DMSO):
Enzymstocklösung:
50 mM TEA 4-6 mg/ml BAL , HisBALΔ, BALΔHis in Puffer ohne DMSO
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
Puffer pH 8 mit (DMSO):
70 % Puffer (v/v)
30 % DMSO (v/v)
Die hochkonzentrierte Enzymstocklösungen wurden auf 20 µg/ml in Puffer mit und ohne
DMSO verdünnt, in 50 µl Aliquots aufgeteilt und bei 25 °C im Thermoschüttler (1000 Upm)
inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde 200 µl Substratlösung zugegeben und die
Reaktion nach 2 min (linearer Bereich) durch Zugabe von 500 µl Isopropanol (inkl. 0,7 vol%
Perchlorsäure) wieder gestoppt. Für jeden Zeitpunkt wurde eine Doppelbestimmung
durchgeführt. Nach Sedimentation des Enzyms mittels Zentrifugation (1-5 min, 13.000 Upm)
wurden die Proben mittels HPLC-Analytik (Kapitel 3.8.1) vermessen und die Konzentration
des gebildeten 4,4´-Dichlorbenzoin (Kapitel 3.8.1.1) ermittelt.
3.11 Reaktivierungsanalysen
Reaktionspuffer pH 8:
Enzymlösung:
50 mM TEA BAL in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP Aldehyd-Lösung:
30 % DMSO (v/v) 10-20 mM aromatischer Aldehyd in Reaktionspuffer
Elutionspuffer pH 8:
50 mM TEA
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP
Für die Inaktivierung wurde jeweils ein Ansatz von 4 ml mit 0,5 mg/ml BAL gewählt um
nach der Entsalzung eine ausreichend hohe Enzymkonzentration für die Aktivitätsmessungen
zu gewährleisten. Die Aldehydkonzentration im Inaktivierungsansatz betrug 2 mM. Je 2 ml
aus dem Ansatz wurden in 2 ml Reaktionsgefäße überführt und 2-24 Stunden bei 25 °C
(Thermoschüttler) inkubiert. Nach der Inkubation wurden 2-2,5 ml auf zuvor equilibrierte
PD-10 Säulen (GE Healthcare, Schweden) gegeben und in frischem Puffer nach Herstellerangaben
eluiert. Aufgrund der Porosität des Säulenmaterials müssen kleine Moleküle
(Aldehyde) einen längeren Weg durch das Gelbett nehmen, während die großen Enzymmoleküle
an den Sepharosepartikeln vorbei wandern. Dadurch ist ihre Durchtrittsgeschwindigkeit
höher und die Enzyme treten zuerst durch die Säule. Freie Aldehyde können so
von dem Enzym separiert werden. Die Enzymkonzentrationen wurden nach der Elution nach
89