Helmholtz-Gemeinschaft
Einflussfaktoren auf die Stabilität und Aktivität der ... - JuSER
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Material & Methoden<br />
Inaktivierung in Abhängigkeit von der Substratkonzentration:<br />
Für die Inaktivierungsansätze wurden Substratkonzentrationen zwischen 0,05 mM und<br />
20 mM gewählt. Ansonsten wurden die Inaktivierungsanalysen wie oben beschrieben<br />
durchgeführt.<br />
Inaktivierungsanalysen mit 4-ClBA in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration:<br />
Für die Inaktivierungsansätze wurden Enzymkonzentrationen zwischen 0,004 mg/ml BAL<br />
und 2 mg/ml gewählt. Grundsätzlich ist der Versuchsaufbau wie oben beschrieben; die<br />
4-Chlorbenzaldehydkonzentration betrug immer 2 mM. Für die Ermittlung der Restaktivität<br />
relativ zur Anfangsaktivität wurde zu distinkten Zeitpunkten 200 µl einer 22 mM 4-ClBA-<br />
Lösung zugegeben und die Reaktion nach 2 min wieder gestoppt. Aufgrund des sehr<br />
unterschiedlichen Umsatzes bei den verschiedenen Enzymkonzentrationen mussten die<br />
Inaktivierungsansätze aber zum Teil abweichend behandelt werden. Bei sehr geringen<br />
Enzymkonzentrationen wurde das Probenvolumen zur Ermittlung der Aktivität vergrößert, bei<br />
höheren Enzymkonzentrationen mussten die Proben vor Ermittlung der relativen Aktivität<br />
verdünnt werden. Wie die entsprechenden Proben abhängig von der Enzymkonzentration für<br />
die Ermittlung der relativen Aktivität eingesetzt wurden, ist in Tabelle 8 zusammengefasst.<br />
Tabelle 8: Probenvolumina und Verdünnung der Inaktivierungsansätze<br />
Enzymkonz.<br />
[mg/ml]<br />
Inaktivierungsansatz<br />
[µl]<br />
0,004 200 -<br />
0,008 100 -<br />
0,04 25 -<br />
0,08 12,5 -<br />
0,2 50 1:10<br />
0,5 50 1:25<br />
2 50 1:100<br />
Verdünnung in Reaktionspuffer<br />
pH 8<br />
3.10.4 Ermittlung der Desaktivierungskonstanten k des und der Halbwertszeit<br />
Durch die Enzyminaktivierung, nimmt die Konzentration an aktivem Enzym (E)<br />
kontinuierlich ab, durch die Desaktivierungskonstante k des kann die Rate der Inaktivierung<br />
beschrieben werden:<br />
dE<br />
= −k<br />
des<br />
⋅ E<br />
Gleichung 4<br />
dt<br />
Die Enzyminaktivierung kann durch Integration der Gleichung, als exponentielle Abnahme<br />
der Aktivität erster Ordnung in Abhängigkeit von der Zeit beschrieben werden:<br />
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