Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
geführt. Aufgrund der Interaktion der Bradford-Lösung mit dem hydrophoben MIBK, war
eine Quantifizierung des löslichen Proteinanteils nicht möglich.
3.10.3 Bestimmung der Stabilität gegenüber aromatischen Aldehyd Substraten
Reaktionspuffer pH 6,5-9:
Enzymlösung:
50 mM TEA 1 mg/ml BAL in Reaktionspuffer
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP Aldehyd-Lösung:
30 % DMSO Aromatischer Aldehyd in Reaktionspuffer
Der Einfluss einer Vielzahl aromatischer Aldehyde auf die Stabilität der BAL wurde
untersucht. Für den Großteil der Untersuchungen wurde aus Gründen der Vergleichbarkeit,
wenn möglich, immer identisch vorgegangen (Tabelle 7). 2 mM des zu untersuchenden
Benzaldehyds wurden in Reaktionspuffer vorgelegt, anschließend wurde die Enzymlösung
zugegeben (Endkonzentration: 0,02 mg/ml) und vorsichtig gemischt. Der Inaktivierungsansatz
wurde schnellstmöglich in 50 µl Aliquots in vorbereitete und bei 25 °C vorinkubierte
1,5 ml Reaktionsgefäße gegeben. Anschließend wurde für 1-2 h bei 25 °C und 1000 Upm im
Thermoschüttler inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde die Restaktivität relativ zur
Anfangsaktivität ermittelt, indem 200 µl einer frischen Substratlösung mit einer höheren
Konzentration desselben Benzaldehyd (Tabelle 7) zugegeben und die Reaktion nach 2 min
(linearer Bereich) durch Zugabe von Isopropanol (inkl. Perchlorsäure) wieder gestoppt wurde.
Durch die Verwendung des selben Benzaldehyds für die Inaktivierung, wie für die Ermittlung
der Aktivität konnte die Bildung von Kreuzprodukten und Mischeffekten vermieden werden.
Für jeden Zeitpunkt wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Nach Sedimentation des
Enzyms mittels Zentrifugation (1-5 min, 13.000 Upm) wurden die Proben mittels HPLC-
Analytik vermessen und die Peakfläche des gebildeten Produktes ermittelt. Gleichzeitig
wurde der Benzoin Anteil in der Inaktivierungsprobe ermittelt und bei der Bestimmung der
Aktivität einbezogen.
Die Substratkonzentration in der Aldehydlösung zur Ermittlung der Anfangsaktivität wurde
möglichst hoch gewählt, wobei darauf geachtet wurde, dass die Konzentration unterhalb der
Löslichkeitsgrenze lag. Die Löslichkeit von 3,5-Dibrombenzaldehyd lag unterhalb von 2 mM,
deshalb konnte hier nur mit einer geringen Konzentration inaktiviert und die Aktivität
ermittelt werden. Lag die Löslichkeit eines Substrates zwischen 2 mM und 10 mM wurde eine
gesättigte Substratlösung für die Ermittlung der Aktivität verwendet, um eine höchstmögliche
Substratkonzentration zu gewährleisten. In manchen Fällen, war die Aktivität der BAL zu
85