Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
teilweise (0,5-0,6 ml) oder vollständig (1,9 ml) mit Enzymlösung gefüllt. Für jede
entnommene Probe wurde ein eigener Ansatz gewählt. Die Proben wurden auf dem
Mehrfachmagnetrührer Variomag Telesystem 60 (Thermo Scientific, Deutschland) bei 25 °C
mit 1400 Upm und Intervallschaltung gerührt. Die Intervallschaltung wurde so eingestellt,
dass alle 60 min eine Pause von 30 sek eingelegt wurde, damit der Rührfisch (zylindrisch,
Mikro, 8 mm Länge Ø 1,5 mm, PFTE ummantelt) neu zentriert werden konnte. Die Aktivität
wurde mittels Lyasetests (Kapitel 3.9.1.2) für die BAL und für die BFDH281A mittels
Decarboxylasetest (Kapitel 3.9.1.1) relativ zu einer ungerührten Kontrolle ermittelt. Je Probe
wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Gleichzeitig wurde der lösliche Proteinanteil
bestimmt. Aggregiertes und damit unlösliches Enzym wurde mittels Zentrifugation (5 min,
13.000 Upm) sedimentiert. Der im Überstand gelöste Proteinanteil wurde dann mittels
Bradford ermittelt (Kapitel 3.5.2).
3.10.1.2 Bestimmung der Stabilität mittels Schaufelrührer
Puffer pH 6,5-8:
Enzymlösung:
50 mM Kpi 0,5 mg/ml BAL oder BFDH281A in Puffer
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
Der Schaufelrührer wurde in der Arbeitsgruppe von Dr. Antje Spieß (RWTH-Aachen)
speziell als Über-Kopf-Rührer für kleine Volumina entwickelt. Das Steckmodul kann
passgenau auf eine Makroküvette (3 ml) gesteckt werden und ist mit einem Motor verbunden.
Über ein verstellbares Netzgerät, kann die Stromzufuhr und damit die Drehzahl reguliert
werden (Abb. 44). Die entsprechende Drehzahl in Abhängigkeit von der gewählten
Einstellung wurde mittels eines Lasertachometers bestimmt (Pohlmann, 2007).
2,5 ml der Enzymlösung wurde in eine Makroküvette aus Glas gegeben und bei 2400-6700
Upm für 24 h bei RT gerührt. Die Aktivität wurde mittels Lyasetests (Kapitel 3.9.1.2) für die
BAL oder mittels Decarboxylasetests (Kapitel 3.9.1.1) für die BFDH281A relativ zu einer
ungerührten Kontrolle ermittelt. Je Probe wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt.
Gleichzeitig wurde der lösliche Proteinanteil bestimmt. Denaturiertes und damit unlösliches
Enzym wurde mittels Zentrifugation (5 min, 13.000 Upm) sedimentiert. Der im Überstand
gelöste Proteinanteil wurde dann mittels Bradford ermittelt (Kapitel 3.5.2).
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