Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
basischen TTC-Lösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatten gegeben, wodurch die
Enzymreaktion gestoppt und das entstandene 2-Hydroxyketon oxidiert wurde.
Entsprechend der Menge an entstandenem Produkt zeigt sich eine schwache bis intensive
Rotfärbung. Die Platten wurden zur Dokumentation nach distinkten Zeitpunkten (max.
10 min) gescannt oder fotografiert. Der TTC-Test stellt eine Endpunktbestimmung dar, durch
die eine Produktbildung nachgewiesen werden kann. Quantitative Aussagen sind nach einer
vorangegangenen Kalibrierung möglich (Breuer et al., 2002). In dieser Arbeit wurde der
TTC-Test nur für qualitative Analysen verwendet.
3.10 Bestimmung der Enzymstabilitäten
3.10.1 Stabilität gegenüber Rühreffekten
3.10.1.1 Bestimmung der Stabilität gegenüber magnetischem Rühren
Puffer pH 6,5-8:
Enzymlösung:
50 mM Kpi 0,5 mg/ml BAL oder BFDH281A in Puffer
2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP
Für die Analyse einer hohen Probenzahl wurde ein Mehrfachmagnetrührer (Variomag
Telesystem 60, Thermo Scientific, Deutschland) mit 60 gleichgeschalteten Stellplätzen
gewählt. Laut Hersteller sollen die Abweichungen in der Rührgeschwindigkeit maximal 1%
betragen, die maximale Drehzahl beträgt 1400 Upm. Dabei ist die Wärmeentwicklung des
Gerätes sehr gering, so dass eine zusätzliche thermische Inaktivierung der Enzyme
weitestgehend vernachlässigt werden konnte. Gerade bei Analysen in viskosen Flüssigkeiten
bietet der gewählte Mehrfachmagnetrührer noch weitere Vorteile. Und zwar kann durch eine
programmierbare Intervallschaltung der Rührvorgang kurzzeitig unterbrochen werden, so
wird der Rührfisch in regelmäßigen Abständen neu zentriert und ein gleichmäßiges Mischen
der Proben über lange Zeiträume gewährleistet. Zusätzlich kann die Beschleunigung bis zum
Erreichen der Endgeschwindigkeit variiert werden, so dass ein unkontrolliertes Springen des
Rührfisches durch zu schnelle Drehzahlerhöhung verhindert werden kann. Weiterhin ist das
Gerät vollständig wasserdicht und kann direkt in ein Wasserbad zur Temperierung der Proben
versenkt werden.
Analysen zur Stabilität der BAL oder BFDH281A gegenüber magnetischem Rühren wurden
in 1,5 ml HPLC-Glasgefäßen mit Schraubdeckeln durchgeführt. Die Gefäße wurden nur
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