Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
3.9.4 Kolorimetrischer Test
Reaktionspuffer pH 6,5-8: oder: Reaktionspuffer pH 8:
50 mM Kpi 50 mM TEA
2,5 mM MgSO 4 2,5 mM MgSO 4
0,1 mM ThDP 0,5 mM ThDP
30 % DMSO (v/v)
TTC-Lösung (40 ml)
Substratlösung:
40 mg TTC 36 mM Aromatischer Aldehyd in Reaktionspuffer
10 ml 70% Ethanol abs.
30 ml 1 M NaOH
Der 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Test (Breuer et al., 2002, Müller et al., 2009)
ist ein Schnelltest zur Untersuchung der Carboligaseaktivität. Das farblose TTC wird in
alkalischen pH-Bereichen in Anwesenheit von 2-Hydroxyketonen reduziert, wobei die
2-Hydroxyketone zu Diketonen oxidiert werden. Die Reduktion des TTC resultiert in einer
Öffnung des Tetrazoliumrings, was mit einem Farbumschlag von farblos zu rosa bis rot
verbunden ist (Abb. 43).
Abb. 43: Reaktionsschema des TTC-Tests. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid wird in Anwesenheit von
2-Hydroxyketonen zu 1,3,5-Triphenylformazan reduziert. Die 2-Hydroxyketone selbst werden zu Diketonen
oxidiert.
Der Test wurde in Mikrotiterplatten (96-well, Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland)
durchgeführt. In jede Vertiefung wurden 50 μl Substratlösung (Endkonzentration im Test:
18 mM) vorgelegt. Anschließend wurde die Reaktion mit 50 μl Enzymlösung (Endkonzentration
im Test: 0,3 mg/ml) oder 50 μl frisch hergestelltem Rohextrakt gestartet. Die
DMSO-Endkonzentration im Test betrug 20 vol%. Als Negativkontrolle diente Reaktionspuffer,
als Positivkontrolle wurde die BAL aus Pseudomonas fluorescens verwendet. Die
Inkubation der Mikrotiterplatten erfolgte bei 30 °C für 1-18 h. Anschließend wurden 40 μl der
81