蛋白質體學 - 國立陽明大學

PARTІ 

蛋白質體學簡介 

1 

PARTІ、蛋白質體學簡介

第一章 

蛋白質體學與生物醫學 

Proteomics and Biomedicine 

國立台灣大學醫學院生物化學暨分子生物學研究所 

林榮耀 

內容 

壹、蛋白質體學(Proteomics) 

2 

第一章、蛋白質體學與生物醫學 

2001 年 2 月美國 Celera 生技公司之 Craig Ventor 完成人類基因 30 億個鹼基序列分析,目 

前已進入後基因時代。其所衍生之新興科技學門為基因體學(Genomics),蛋白質體學 

(Proteomics)。早在 1925 年 Engels 氏於「自然之辨正法」(Naturdialektik)主張「生命為蛋 

白質體之存在與表現」,故有【Proteome】之學門,即為於蛋白質層次討論生命全體之現象; 

包括特定之細胞、組織、臟器等中的基因經轉錄及轉譯產生全部蛋白質。蛋白質體會受發生 

分化,生活環境,疾病或老化等影響而變化。這些蛋白質用二維膠電泳法分離,並分析個別 

蛋白質之結構、量及轉譯後修飾等稱為蛋白質體學。 

蛋白質體學為探討基因體學最終目標,可了解基因表現,可供疾病診斷,動植物之新育 

種,新藥開發等新興科學之基因技術 (1) 。目前人體之基因約有三萬多個,其所產生之蛋白質, 

經選擇性接合(alternative splicing),每個基因平均有三種蛋白質產生,即人體蛋白質平均約 

有十萬多種,其中約有 50%之功能為已知。而蛋白質尚有轉譯後修飾如磷酸化、醣化、乙醯 

化、甲基化等,故人體蛋白質總數,約有四十萬多種。這些蛋白質,有的直接可當藥物治療 

疾病,如人的生長激素,胰島素及造血素(erythropoietin)及當抗原製造抗體當藥物如 

Her-2/c-erb B2 治療乳癌等。 

貳、近代之蛋白質體學 

近代之蛋白體學(Proteomics)包括二維膠電泳 (2) ,質量分析(mass spectrometry analysis) 

及生物資訊學(Bioinformatics)之基因資料庫(genome database)所融合之新科技。Proteomics 

一般而言,有含有使用 high throughput 即高速分析有關,並分析細胞中全部蛋白質,包括 

Expression proteomics 及 Cell map proteomics。Expression proteomics 主要分析正常與疾病細胞 

之表現蛋白質及量之差異,而 Cell map proteomics 為蛋白質於細胞中,所形成之蛋白質複合 

體,或胞器(organelle)中蛋白質相互作用之研究。 

參、蛋白質體之表現分析 

蛋白質之剖析(profiling)為分析蛋白體(Proteome)之表現,及 proteome 之功能的第一 

步。目前雖然有微陣列(Microarray)分析法,它可分析其基因表現於 mRNA 層次,但實際 

發揮的功能蛋白質之動態及蛋白質之壽命長短,因種類而異;故基因表現轉錄之 mRNA 與轉

3 


譯之蛋白質其相關係數小於 0.5 (2) 。且蛋白質發揮功能尚須以其立體結構及修飾後成熟蛋白質 

來決定,此為 Microarray 分析無法達到。 

一、由二維膠電泳及質量分析,來鑑定蛋白質 

(一) 二維膠電泳法,通常以等電點聚焦 isoelectric focusing(IEF)電泳為第一維,第二維以 

SDS-PAGE,一次可分析約 3000 種蛋白質。可用 Coomassie blue 或 Silver staining 染色,再經 

in gel digestion,其蛋白質經蛋白質水解酶(protease)如 trypsin 水解後,其產物為多胜肽可 

做質量分析。 

(二) 蛋白質之鑑定 

1. Peptide mass-finger printing 法(PMF 法) 

上述 trypsin 水解產物可用 MALDI-TOF MS (Matrix assisted laser desorption ionization- time 

of fly mass spectrometer)所得質量質譜(spectrum)由儀器所附之軟體之資料庫之理論值, 

鑑定其蛋白質,此方法稱 peptide mass-finger printing 法 (3) ,平均一台一天可分析近百種之蛋 

白質,其敏感度達到 femtomole,可用 PSD 法(Post-source decay) (4) 或蛋白質定序(protein 

sequence)法 (5) 鑑定該蛋白質。但對不純之蛋白質混合物不易鑑定。 

2.胺基酸序列之分析法 

使用 ESI Q-TOF MS(Electron spray ionization Q-time of fly mass spectrometer)為飛行時間型 

(time of fly)及四電極柱型(Q-MS)ion trap 型,磁場型之質量分析之 MS/MS 組合,此方 

法可測定蛋白質經 trypsin 水解產物後經液相層析(LC)分離之 peptides 的胺基酸序列,雖 

然不屬 high throughput,但可精確定出胺基酸序列,即需蛋白質約為 f mole~ p mole,分析 

需一小時左右,可分析混合之蛋白質。 

二、Focus proteomics 

人的基因有 35,000 個,經 alternative splicing,轉譯後修飾,約有上百萬種,若要對這些 

蛋白質進行全面性的鑑定,既費時又費力,且不易達成其機能之分析,因此利用 Focus 

proteomics 的策略,對細胞內小器官如核、核膜、細胞膜、粒腺體,核小體等進行分析 (6) 或對 

蛋白質之複合體,如核醣體、proteosome、splisosome,進行其所含蛋白質鑑定,如此,較易 

達成蛋白質機能之解析。 

三、差異性表現(Differential display)之分析 

細胞於兩種不同狀態(如一正常,一為癌化),蛋白質個別抽出後由不同螢光化合物 Cy3 

(紅色)及 Cy5(綠色)個別標籤後,進行二維膠體電泳(2DE)分離,則兩種狀態均有之 

蛋白質呈黃色反應,正常為紅色,而癌化細胞為綠色。此方法可用於細胞用藥的處理前後之 

變化,疾病產生之前後或環境變化前後之變化 (7) 。 

四、同位素標籤法

4 


正常及癌細胞個別用 2 H 或 15 N 於細胞培養,細胞表現的蛋白質胜肽因培養液的差別而產 

生質量差異,可用 MS 個別測定出。另一種方式為 Isotope code affinity tags(ICAT),其試藥 

分為二種,分別是 Heavy reagent(d8-ICAT),light reagent(d0-ICAT),其質量差別為 8,將 

正常細胞及癌細胞分別和此二試劑結合,結合後,兩細胞之蛋白質混合並用 protease 水解, 

由於此試藥均有 biotin 做標誌所以可用 avidin 固定化之親合性 column,純化含 cysteine 之胜 

肽。再用 HPLC 分離後用 MS 分析其質量(如圖一) (8) 

圖一 (6) 

肆、Proteome 之功能分析 

一、Modificomics(轉譯後修飾之分析) 

Modificomics 為蛋白質經轉譯後之修飾後,有磷酸化、乙醯化(acetylation)、甲基化、 

myristylation、醣化、Amidation、ubiquitination 等。如磷酸化蛋白質體學(phosphoproteomics): 

為研究磷酸化蛋白質,其方法包括(1)磷酸化蛋白質(phosphoprotein)用磷酸化水解酶 

(phosphatase)水解,用電泳分析其 pI 值處理前後之變化;(2)用 phosphotyrosine 之單株抗 

體,可分析含 phosphotyrosine 之蛋白質;(3)用 MS 分析因磷酸化質量之差異;(4)蛋白質 

用 protease 水解後,把 phosphoserine 或 phosphothreonine 變化成 sulfihydryl group 用 amino beads 

分離 (9) ;(5)phosphoserine 可變化成 biotin group 用 avidin beads 純化 (10) 。

5 


二、轉譯後修飾之功能分析 

酵母菌之 26S proteosome 之蛋白質經轉譯後修飾曾被研究,結果顯示共含有 62 種 

proteins,其蛋白質 N 端(N-terminus)多被乙醯化,及有些磷酸化,該乙醯化及磷酸化均與 

proteosome 進行水解 ubiquitin protein 有關。 

三、蛋白質-蛋白質,蛋白質-ligand 相互作用之分析 

Interaction 為研究蛋白質與蛋白質或 ligand 專一性結合相關之技術,目前有三種。 

(一) Surface-plasma-resonance(SPR)用 Biacore 之設備測蛋白質與蛋白質相互作用,引起 SPR 

變化。 

(二) Yeast-two hybrid system。利用酵母菌,two-hybrid system 研究蛋白質與蛋白質相互作用, 

但其作用可能與成熟蛋白質有差異,需注意。 

(三) 蛋白質晶片(Protein chips),此方法優點為 high throughput,於 microchips 上點上直徑 

1mm 之點固定 ligand,後加上約 0.5~2 µl 含有蛋白質之樣品,後用 MALDI-TOF MS 分析。 

一個 chips 可用 24 個樣品,約 10 分可完成,chip 上也可固定抗體、酵素、蛋白質接受器 

(receptor)、病毒或 DNA 等。 

五、參考文獻 

1. Gygi, S. P., Rochon, Y., Franza, B. R., and Aebersold, R. (1999)Correlation between protein and mRNA 

abundance in yeast . Mol. Cell. Biol. 19, 1720-1730. 

2. Henzel, W. J., Billeci, T. M., Stults, J. T., Wang, S. C., Grimley, C., and Watanabe, C.(1993)Identifying 

proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence 

databases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5011-5015. 

3. Kaufman, R., Kirsch, D., and Spiengler, B.(1994)Int. J. Mass Spectrum Ion Processes 131, 355-385. 

4. Dreger, M., Bengtson, L., Schöneberg, T., Otto, H., and Hucho, F.(2001)Nuclear envelope proteomics: 

novel integral membrane proteins of the inner nuclear membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11, 

943-11, 948. 

5. Jungblut, P. R., Zimny-Arudt, U., Zeindl-Eberhart, E., Stullik. J., Koupilova, K., Pleissner, K. P., Otto, A., 

Müller, E., Sokolowska-Köhler, W.,Grabber, G.., and Stöffler, G.(1999)Proteomics in human disease: 

cancer, heart and infectious diseases. Electrophoresis 20, 2100-2110. 

6. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F. T., Gebb, M. H., and Aebersold, R.(1999)Quantitative 

analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnol. 17, 994-999. 

7. Zhou, H., Watts, J. D., and Aebersold, R.(2001)A systematic approach to the analysis of protein 

phosphorylation . Nature Biotechnol . 19, 375-378. 

8. Oda, Y., Nagasu, T., and Chait, B. T.(2001)Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for 

probing the phosphoproteome . Nature Biotechnol. 19, 379-382.

6 


9. Kimura, Y., Takaoka, M., Tanaka, S., Sassa, H., Tanaka, K., Polevoda, B., Sherman, F., and Hirano, H. 

(2000) N(alpha)-acetylation and proteolytic activity of the yeast 20 S proteasome. J. Biol. Chem. 275, 

4635-4639.

前言 

第二章 

蛋白質體學的研究方法 

The Principles of Proteomics 


陳威戎,廖大修 

7 

第二章、蛋白質體學的研究方法 

蛋白質體(Proteome),這個英文新字首先於 1994 年的 Siena 二維電泳(2-D Electrophoresis)會議中由 

Wilkins 等人使用,並於 1995 年正式由 Wasinger 等人在其發表之期刊論文中 

提出此一觀念;其後不僅在 1997 年起成為各大學術會議所指定之熱門討論主題,並在各著名 

期刊(包含 Science 及 Nature 等)中已有數百篇論文提及此一名詞;事實上,近年來蛋白質 

體早已廣泛地被接受及使用了。「蛋白質體」意指個體內所有被基因體(Genome)表達之蛋 

白質(protein)。更進一步以分子生物學中心定律(central dogma)此一由基因到活性蛋白質 

產物的一連串調控事件來看,基因體研究主要探討個別基因在染色體上的分佈、有無變異及 

其在不同生理狀況下表現的情形。基因只是四種鹼基分子的特定排列組合(不同的排序就好像 

是密碼),它們之所以對生物體有決定性的影響,乃是透過細胞內的轉錄及轉譯作用製造出各 

種不同的蛋白質來執行特定的生物功能,因此蛋白質體亦可被視為基因體的最終產物(如圖 

一)。 

截至目前為止,原核生物包含黴漿菌(Mycoplasma genitalium)、大腸桿菌(Escherichia 

coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、甲烷菌(Methanobacterium)等 90 種;真核生物包含酵 

母菌(Saccharomyces cerevisiae)、果蠅(Drosophila melanogaster)、阿拉伯芥(Arabidopsis 

thaliana)、線蟲(Caenorhabditis elegans)等生物個體之基因體均已被完全定序出來(如表一)。 

而過去十年基因體研究的浪潮,也在最近人類基因體序列解碼完成後可以說達到了頂峰:人 

類基因體已在 2001 年由美國政府及賽雷拉公司共同發表其 90%的序列初稿(draft),預計在 

2003 年完成完整序列之定序工作。人類基因體的大小約為 3300 百萬鹼基(Mb),其中 45% 

為重複性序列,僅 1.5%可決定出基因;總計人類約有 35000 個基因,目前僅約 26000 個基因 

被定位出來,且有 42%不具已知功能。一般認為僅有約 2%(約 6000 種)的人類疾病是由單 

一基因變異引發的,且目前僅 500 種可聯結到其對應基因;大部分的疾病都是由多基因所引 

發,且其中絕大多數尚不清楚其致病機轉。以癌症為例,要了解此種由許多基因變異引發之 

複雜病症,最佳捷徑便是直接研究其多種蛋白質產物所形成網絡之間交互作用的情形。因此, 

蛋白質功能的研究,可以說是繼基因體後生物醫學研究必然要走的道路。學者們為「在短時 

間內大規模探討眾多蛋白質的功能」的學問創造了一個新名詞--蛋白質體學(Proteomics)(或 

是稱為功能性基因體學, Functional genomics)。 

大家也許會感到好奇,為什麼我們要在短時間內進行大規模蛋白質功能的探討。舉例來 

說,從事基礎醫學研究的人都知道癌症的形成導因於細胞內基因表現不正常,而異常的基因

8 


表現連帶使得負責管理細胞功能運作的蛋白質也不正常,最後使得細胞生長調節失去控制而 

在生物體內產生腫瘤。因此,尋找腫瘤組織中異常表現的基因及蛋白質成為瞭解癌症成因的 

第一步。同樣的道理,許多其他人類重大疾病也牽涉到基因及蛋白質表現或功能異常的情況。 

基因體研究發展至今,學者們已經可以利用數種方法,包括 cDNA 微陣列分析(cDNA 

microassay),快速檢視特定組織中成千上萬種基因表現的狀況。但是,這些方法只能瞭解組 

織細胞中 DNA 轉錄為 mRNA 的情形,而 mRNA 的表現量並不等於真正具功能的蛋白質表 

現量。因此,基因體研究方法顯然已不能滿足我們對明瞭真實蛋白表現差異的渴望,而蛋白 

質體學的研究正是為此而發展出來的。以往的研究受限於蛋白質分析技術及對基因體瞭解有 

限,學者在短時間內能同時分析的蛋白質數目不多。而在過去十年之中,因為基因資料庫越 

來越完備,另為處理基因體序列相關之龐大資料而發展出生物資訊學(Bioinformatics),再 

加上蛋白質分析技術本身的大幅進步(特別是高靈敏度生物質譜儀的研發),使得蛋白質體 

的研究不再遙不可及。 

胜肽定序 

圖一、分子生物學中心定律與基因體學和蛋白質體學之關係 

(改編自: http://www.proteomics.co.kr/images/proteomics-1.jpg)

9 


能針對基因表現的產物作直接的呈現與研究的方法不僅適用於疾病的研究,更可以用來 

解決生物學上任何複雜的問題。希望對於細胞在生病與健康狀態下不同的運作方式作分子層 

級探討,需先了解有哪些蛋白質及其他細胞組成份存在、其交互作用為何、其交互作用的結 

果又是什麼?首要工作便是先找出哪一個部位的基因體被表達了?其蛋白質產物有多少?這 

些蛋白質產物經歷了什麼改變?蛋白質體學就是解答上述一系列問題最直接有效的方法!這 

在本教材中,我們將進一步詳細介紹各種蛋白質體學研究技術,包含二維膠體電泳、質譜儀、 

生物資訊學等;同時另闢章節介紹蛋白質體學在生物學、基礎醫學、臨床醫學及環境醫學等 

領域之應用。以下僅就各章節重點作提綱式的摘要敘述,我們希望大家在讀過這本「蛋白質 

體學」之後,能對此一嶄新的學門有更深一層的認識,能了解:(1)蛋白質體分析所包含的 

各種主要研究技術;與(2)蛋白質體技術已對現今生物與醫學研究的轉型帶來何種程度的貢 

獻與衝擊。 

表一、部分基因體已被完整定序之生物體 

物種基因體大小 

(Mbp) 

基因數目參考文獻 

黴漿菌 0.58 470 Fraser et al., 1995 

甲烷菌 1.66 1,738 Bult et al., 1996 

螺旋桿菌 1.7 1,590 Tomb et al., 1997 

流行感冒嗜血桿菌 1.8 1,743 Fleischmann et al., 1995 

枯草桿菌 4.2 4,100 Kunst et al., 1997 

結核桿菌 4.4 4,000 Cole et al., 1998 

大腸桿菌 4.6 4,288 Blattner et al., 1997 

酵母菌 12 5,885 Goffeau et al., 1996 

線蟲 97 19,100 The C.elegans Sequencing 

Consortium, 1998 

果蠅 120 13,601 Adams et al., 2000 

阿拉伯芥 115 25,498 The Arabidopsis Genome 

Initiative, 2000 

人類 3300 35,000 Cheung et al., 2001 

Lander et al., 2001 

(改編自 Proteome Research: Two-Dimensional Electrophoresis and Identification Methods, Rabilloud, ed., 

Springer Verlag, 2000 ) 

內容 

壹、蛋白質體學之研究技術(The proteome technology) 

蛋白質操作技術一般而言比以 DNA 為主體的分子生物學操作技術來得複雜,不僅只是 

其組成元件較多(20 種基本胺基酸比 4 種核苷酸),更是因為由 DNA 轉錄成 mRNA 時,會 

因數種不同的 splicing 方式產生多種產物;而轉譯成蛋白質後,尚有多種不同的轉譯後修飾 

作用會對蛋白質進行各種改變;可說幾乎每一種眞核生物的蛋白質在合成後都會受到數量及 

程度不等的修飾作用(如表二),包括 N 端與 C 端的切割及添加磷酸根、醣基、硫酸根、甲 

基、乙基、脂質等取代基。甚而只有單一基因體的個體,還可能擁有數種不同的蛋白質體;

即使是單細胞生物,其蛋白質體也可能因其生長條件的不同而有所差異。 

表二、常見的轉譯後修飾作用及其作用之序列 

(節錄自 Proteome Research: New Frotiers in Functional Genomics, Wilkins et al., eds., 

Springer Verlag, 1997) 

10 


本書 PARTⅡ將介紹蛋白質樣品的分離、純化等前處理步驟、二維電泳的實驗原理及方 

法,包含各種染色法及影像分析技術;PARTⅢ則將介紹各種質譜儀技術,包含電灑-離子化 

法(electrospray ionization, ESI)、基質輔助雷射脫附/離子化-飛行時間法(matrix-assisted laser 

desorption/ionization time-of-flight, MALDI-TOF)及液相層析-四極棒法(liquid chromatography-quadrupole, 

LC-Q MS/ MS)等,用以研究原態(native)及修飾後的蛋白質,進而利用 

生物資訊學(Bioinformatics)進行資料庫的分析比對工作,以達到蛋白質鑑定的效果,並進 

一步用以預測蛋白質的結構與功能。

教 

育 

蛋白質鑑定 

(質譜分析) 

樣品前處理 

二維電泳 

11 

轉譯後 

修飾作用 

生物資訊學 

新發現 

圖二、蛋白質體研究技術之組成元件 

(改編自 Proteome Research: New Frotiers in Functional Genomics, Wilkins et al., eds., 

Springer Verlag, 1997 ) 

機 

器 

人 

學 


貳、二維膠體電泳(Two dimensional polyacrlamide gel electrophoresis) 

在 1997 年以「二維聚乙醯膠體電泳(two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 

2-D PAGE)」作關鍵字利用 Medline 搜尋已可找到 4,957 篇發表的期刊論文,足見早已有許多 

研究人員在其實驗工作中使用過此種技術;但究竟此技術是從何時開始發展出來的呢? 

電泳技術是由 Tiselius 在近半世紀前發明的實驗技術,而蛋白質的二維分離法也已有近 

40 年的歷史了。自 Smithies 與 Poulik 最早在 1956 年利用紙與澱粉膠體電泳的組合分離血漿 

中的蛋白質後,電泳技術的更新及不連續緩衝液系統之發展均迅速地應用到二維電泳的領 

域:梯度膠體電泳被應用在提昇蛋白質色帶的尖銳度上(Margolis and Kenrick, 1967),其後 

也進而應用到二維電泳中(Margolis and Kenrick, 1969);這也為等電點焦集法(isoelectric 

focusing, IEF)應用到二維電泳中作鋪路(Dale and Latner, 1969 ; Macko and Stegemann, 1979 ; 

Emes et al., 1975)。直到 1975 年,第一個以蛋白質所帶淨電荷作第一維電泳之分離原理 

(IEF)、以蛋白質大小即分子量作第二維電泳分離原理(SDS-PAGE)的二維電泳系統正式 

被開發出來。此系統也被迅速應用到分析來自全細胞或組織中複雜的蛋白質混合物上(Iborra 

and Buhler, 1976 ; Klose, 1975 ; Scheele, 1975);同一時間,O’Farrell(1975)也將二維電泳分 

離技術之操作流程進一步最適化,這也為日後二維電泳的發展奠定良好的基礎。 

如果要將來自全細胞或組織的所有蛋白質分離並呈現在電泳膠體中,如何使用和分離過 

程一致的條件來將蛋白質完全溶解是非常重要的一個項目。目前唯一能將高度純化的蛋白質 

在一簡便的平行系統中達到徹底分離的技術就只有「二維電泳」。而其他技術的可行性,如將 

系列液相層析法或毛細管電泳(capillary Electrophoresis, CE)搭配質譜儀偵測作分析,則正 

被積極研究測試中。直到目前為止,仍無其他系統可以取代二維電泳來提供具再現性 

(reproducibility)且對複雜蛋白質混合物完全分離的技術。

12 


但這並不意味著以二維電泳系統從事蛋白質分離就絕對沒有任何問題存在,目前許多研 

究都是利用二維電泳來分離可溶的蛋白質,然而若利用合適的介面活性劑,膜蛋白也可被溶 

解以進行後續研究工作。近年來二維電泳技術的更新主要就是希望能應用在呈現原本無法被 

研究的蛋白質上;進一步則是希望從一般常見的蛋白質混合物中找出少見的蛋白質。要找出 

並對這些稀有蛋白質進行特性研究,須研發出可以在進入二維電泳前移除大量蛋白質並加以 

濃縮的方法。其他課題則著眼於會干擾分析結果的細胞中其他組成份(包含脂質、DNA 及鹽 

類等)對蛋白質樣品的污染。二維電泳可提供包含蛋白質的等電點(isoelectric point, PI)、分 

子量(apparent mass, Mr)及色點強度(spot intensity)等參數;並能進一步分離出色點,搭 

配蛋白酶切割進行後續的質譜學分析(如圖三)。 

圖三、資料庫中可提供之蛋白質體研究相關實驗參數 

在許多不屬於蛋白質體學此一領域中的研究者眼中,二維電泳仍未成為一例行性的蛋白 

質分離方法。為什麼要此技術成為蛋白質分離與呈現的首選方法需要花費如此長的一段時 

間,一般認為有下列三個原因: 

一、直到最近這幾年才有完全商品化且高品質的固定化酸鹼值梯度膠體(immobilized pH 

gradient, IPGs)與預製(precast)SDS-PAGE 膠體上市。要得到具有再現性的二維電泳結 

果最基本的要求就是在膠體的製作過程中需有良好的品質管制,因為即使在一個訓練精 

良的實驗室中,要使每天製作出來的電泳膠體品質完全一致仍是非常困難的。第一維電 

泳的分離原理即在於讓蛋白質在一 pH 梯度中泳動,當特定蛋白質移動到使其所帶淨電 

荷為零的位置時,它將停止不動而焦集下來。傳統 pH 梯度的建立方式便是利用一些被 

稱作 carrier ampholytes 的可溶性帶電化合物配製成混合緩衝溶液,如此形成之 pH 梯度 

並不穩定,容易使加入蛋白質樣品的量直接影響到分離效果;而使用 IPGs 將可有效解決

13 


上述問題,因為在 IPGs 之中,這些用來建立梯度的帶電化合物已被完善地固定在膠體之 

中,因此所形成之 pH 梯度是很穩定的。 

二、使用 IPGs 解決了傳統分離與分析蛋白質樣品時面臨的第二大問題,那就是量的限制;現 

今吾人能加入較大量的樣品進行分離,這也使得對單一蛋白質色帶進行化學分析成為可 

能。 

三、直到今日才有足夠廉價且效能強大的電腦硬體與程式軟體,可以提供對二維電泳後的膠 

體進行影像分析。 

參、蛋白質鑑定技術(Protein identification technologies) 

一旦成功將蛋白質分離並呈現在二維電泳膠體上之後,接下來要作什麼呢?二維電泳膠 

體上的蛋白質色帶就像夜空中的點點繁星,該如何辨別誰是誰呢? 

二維電泳最大的優點就在於它能徹底分離出可被辨識及分析的獨立蛋白質色帶,但目前 

的二維電泳技術大多尚未達到這樣的目標。純化單一蛋白質以進行後續特性分析原本就是個 

緩慢且耗費心力的工作歷程,目前結合了利用二維電泳分離毫克(mg)層級的大量蛋白質樣 

品與高效能、高靈敏度的鑑定技術已對傳統實驗方法帶來革命性的影響。在後基因體時代 

(post-genome era),蛋白質分析鑑定工作比早期容易許多;這是因為目前已有來自 DNA 定 

序結果所推衍建立的大量蛋白質序列資料庫可供查詢比對。舉例來說,當進行大腸桿菌或酵 

母菌的研究時,會發現其均已被完整定序且得到相對應的蛋白質序列,此時欲進行相關蛋白 

質的鑑定工作時,就僅只是序列比對工作,而非曠日費時的蛋白質定序工作。資料庫中可供 

使用的參數很多,包含蛋白質的分子量(apparent mass)、等電點(isoelectric point, 來自二維 

電泳膠體)、N 端或 C 端之「標籤序列(tag sequences)」、胺基酸組成及胜肽片段分子量資料 

等。 

當蛋白質身分被鑑定出來之後,接下來將是特性的分析;並可進一步探索此蛋白質在細 

胞中表現的含量、它的序列起始(N 端)與終了(C 端)是否真如分子生物學家所預測?在 

真核生物中通常並非如此。而希望得知此蛋白質正確的分子量大小,因為這將顯示其是否受 

到轉譯後修飾作用。目前針對二維電泳膠體上的單一蛋白色點(spot)進行分析,以釐清其 

醣基化(glycosylation)或磷酸化的程度,進而嘗試定位出修飾作用發生的確切位置所在,這 

些都已經能成功達成;若再搭配高效能的串聯質譜技術,分析 picomole 層級的微量蛋白質也 

將成為可能的! 

肆、生物資訊學與蛋白質體(Bioinformatics and the proteome) 

由上述可知,目前在蛋白質樣品的分離、呈現、鑑定與特性分析技術上均有了革命性的 

發展,接下來就是要開發出可供處理大量繁複資料庫的技術了。以基因體學研究來說,只需

14 


將資料做好分類以建立可供讀取的龐大聯結以及如何將大量的 DNA 序列作比較及整合,基 

本上這些資料都是線性且具個體專一性的。然而在蛋白質體學研究上就不僅如此了,首先, 

通常在不同細胞或組織中,同一個基因的表現就有可能不同,甚而在單一細胞內,同一基因 

的表現產物也有可能呈現不同形式。最顯而易見的就是蛋白質在不同細胞或組織中可能經歷 

完全不同的醣基化作用,而這也僅只是眾多變異修飾方式其中的一種而已。很多時候,這些 

不同形式的蛋白質可以在二維電泳膠體中以不同位置的色點呈現出來。 

上述這些理想對所有生物資訊學家而言都是一項又一項的挑戰,他們嘗試將蛋白質體分 

析所得的文字和影像資料在各種不同類型的資料庫中交叉比對使用,試圖去解釋類似「疾病 

組織與正常組織的差異何在?」這類的問題;如果這些問題能藉由生物資訊學獲得解答,那 

麼這將大幅增進對生物醫學的了解。 

最終的目標,是希望從蛋白質序列比對進展到對蛋白質三級結構的了解,包含對轉譯後 

修飾作用會如何影響蛋白質的構型等,都必須再作進一步的研究。值得慶幸的是,結構生物 

學和電腦分子模擬技術的巨大進展使得這個目標變得不再遙不可及,現在甚至已經可以對許 

多尚無結晶構造的蛋白質結構作出適切的模擬與預測。 

在本書第三章將詳細介紹目前常用的蛋白質體資料庫,在這些資料庫中我們已能看到包 

含蛋白質序列、核苷酸序列、二維電泳圖譜、蛋白質三級結構、轉譯後修飾作用、基因體學、 

代謝途徑等各式各樣建構完整的資料庫;無庸置疑地,未來生物資訊學的發展將對蛋白質體 

研究作出重要的貢獻。吾人可預期下列幾項趨勢: 

一、這個領域會隨著各項基因體計畫的陸續推動,而快速地蓬勃發展與擴增資料庫。 

二、隨著蛋白質體計畫的催生,所有以基因體為基礎的序列資料庫都將進一步轉型或擴充為 

蛋白質特性與功能分析的資料庫。 

三、隨著大量蛋白質體的產生,用以探討「蛋白質之間的交互作用」(protein-protein interactions)之新型資料庫勢必將隨之誕生。 

四、資料庫與期刊論文的差異將愈來愈模糊,因為為求時效,可能將有大量重要資料被直接 

發表登錄在資料庫中,而不再發表為正式論文。 

五、單一研究單位要維持龐大的資料庫將益形困難,是以愈來愈多的資料庫將作有效的整合 

(integration)並由多個單位共同管理與維護。 

伍、蛋白質體學在臨床與生物醫學上之應用 (Clinical and biomedical applications 

of proteomics) 

醫學的終極目標在於預防疾病的發生,或當疾病雖已發生但尚未造成永久性傷害或副作 

用前將之治癒。在治療疾病時,若無法完全治癒,也要提供充分的照護並紓解症狀。預防與 

治療方式的選擇取決於清楚地了解病人的患病狀況。診斷(diagnosis)一詞來自希臘文 

的”diagnosticos”,意指”認知的能力”(capable of recognition);診斷的過程有助於醫師對病人 

病況的掌握並進一步釐清與加以分類。截至今日為止,病患的診斷仍有賴醫師根據病人病歷

15 


與身體檢查,及作些分析檢驗工作如驗血及其他放射性檢驗等。一旦診斷結果建立之後,預 

後(prognosis),來自拉丁文的”prognosticus”,意指”預先知道”(knowing in advance),分析 

以引導治療方式的決定。 

任何醫學療程,姑且不論花費的限制,可依其對下列產生的影響略作區分: 

一、病人的診斷 

二、病人的預後 

三、治療方式的選擇 

四、對醫學是否有積極正面或負面但具預測性的價值 

五、是否有預防方式的存在 

目前依診斷分類所建立的預後資訊已愈來愈不敷使用,每個病人都將會需要量身訂作的 

預後評估資料。舉例來說,病人腫瘤發生轉移(metastasis)的潛力對每個病人來說都是非常 

獨特的,即使某兩個病人的臨床病理特徵完全相同,腫瘤發生轉移的潛力仍有可能完全不同; 

所以現今的診斷方式必須提高靈敏度以排除疾病或專一性地確認診斷結果。 

因此,若要達成醫學的終極目標,我們必須對疾病的成因及發展作更進一步的了解。在 

本書中我們將另闢章節詳述目前蛋白質體學在哪些基礎醫學、臨床醫學與環境醫學的學門中 

已作出貢獻(如圖四),它們如何被用來分析病人的樣品,以及如何協助醫療及研究人員對疾 

病有更深一層的認識。以下在此一簡介性的章節中僅就蛋白質體學在臨床與生物醫學研究的 

應用作一概括性的介紹。 

二維電泳在臨床上的應用潛力已在 1993 年由 Hochstrasser 與 Tissot 及 1995 年由 Young 

與 Tracy 作過文獻綜覽回顧。蛋白質體學在體液(body fluids)與組織活體切片(tissue biopsies) 

的分析上被認為特別有效。其應用包含下列各要項: 

一、辨識體液及組織活體切片之來源 

如:脊髓液、囊泡、血漿、腹水等。 

二、分析體液、細胞或組織中之蛋白質表現型及轉譯後修飾作用 

如:apolipoprotein E 與 haptoglobin。 

三、分析與偵測傳統方法中無法發現的免疫球蛋白殖株 

如在:遺傳、自體免疫(autoimmune)、感染性或新生性(neoplastic)疾病如:多發性硬 

化(multiple sclerosis)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、萊姆氏症(Lyme’s disease)、 

CMV 感染、B 型肝炎、Sjogren’s 症候群等。 

四、監控疾病病程及特定蛋白質表現 

如:發炎反應(inflammation)、早期腎或肝衰竭(early renal or hepatic insufficiency)、營 

養性疾病、毒理學(toxicology)等。 

五、發現新的疾病標記或其在體液、細胞或組織中之型式(pattern) 

蛋白質體學方法的目標在於對細胞或組織表現的所有蛋白質進行大量的平行分析,新技 

術的研發將有助於二維電泳膠體上的蛋白質分離呈現與其特性分析的潛力。最終這個宏觀的

16 


目標將能大幅減少不必要的一系列臨床分析檢驗進而降低樣品評估的花費。如上所述,蛋白 

質體學技術必須比傳統方法更靈敏且能更專一地針對病患樣品作例行性的診斷、預後及治 

療;並能逐漸降低病人檢驗及追蹤治療等醫療成本。 

圖四、蛋白質體學在臨床、生物醫學、結構生物學、毒理學、藥學及農業之應用 

蛋白質體學也能應用於毒理學及藥學的研究發展,另對細胞複製過程(cell cycle)與癌 

症的研究也正方興未艾。然而此技術現今仍面臨了數種限制,包含(1)細胞內 mRNA 的量 

並無法與蛋白產物的量完全符合,因此在研究微量蛋白質時會受到相當程度的限制。(2)另 

一項挑戰在於如何同時偵測、鑑定與測量大量基因表現產物的表現型式與轉譯後修飾作用, 

又需兼顧分析結果之再現性及低成本。 

陸、蛋白質體學在生物學上之應用(Biological applications of proteomics) 

蛋白質體學研究在生物學上可整理出下列幾點初步的應用: 

一、各物種二維電泳圖譜(2-DE maps)的建立:目前包含黴漿菌、原核生物及眞核生物都有 

相當多物種的基因體已被完成定序;其二維電泳圖譜也將陸續建立以作為了解各物種細 

胞或組織中蛋白質體的重要參考(reference)。 

二、追蹤生物個體的複雜性。 

三、自感染性疾病患者之樣品中鑑定出免疫性蛋白質(immunogenic proteins):包含過敏原 

(allergen)的篩選與鑑定此一重要領域。 

四、協助促進農產品改良並開發具高經濟價值之作物:包含防蟲植物、乳製品、紡織毛料、 

榖類製品、豆類製品等,都可以藉由特定具生物活性蛋白質之鑑定而加以應用發展。 

五、對所有高價值產品(如具療效之重組蛋白與疫苗)或低價值產品(如食品添加物等)進

結語 

行嚴密的品質控管。 

17 


過去二十年來在生物學與化學的領域都經歷了相當大的革命性進展,分子生物學的發展 

使得 DNA 與 RNA 可以作各種操作,並進而利用各種表現系統加以大量表達並進行各項研 

究;新穎的化學搭配偵測器(如質譜儀等)在新式儀器的開發上也扮演了重要的角色;更重 

要的是資訊科技的無遠弗屆帶來功能強大的生物資訊學領域,也提供生物學及化學研究全新 

的視野。近年來最具代表性的基因體學、蛋白質體學與組合化學(combinatorial chemistry) 

的發展,相當於宣告一個大規模科學(large-scale science)時代的來臨!這些新穎的學門也吸 

引了產業界,尤其是生技公司與大藥廠產生極大的興趣。 

有趣且巧合的是,基因體學和組合化學這兩項分屬於生物及化學領域的重大進展都不約 

而同地將目標間接指向蛋白質的研究探索:基因體定序相繼完成之後,重要的是進一步探討 

其產物,也就是各種蛋白質在個體內執行的生物活性;而組合化學則希望開發出可對特定蛋 

白質扮演拮抗劑(agonists and antagonists)作用的化合物(即藥物)。因此若能結合基因體學、 

蛋白質體學與組合化學,再加上可供自動處理大量樣品之機器人學(robotics),將誕生一種 

功能極為強大的研究套裝工具組合(如圖五);這樣的研究利器不僅可被用來供生物技術學家 

作新藥開發,更重要的是,它將可被應用到廣義生物學所有涵蓋的研究領域並作出重大的貢 

獻。我們可以說,這真是個令人興奮的時刻;一個充滿挑戰與前瞻的新科學時代!

18 


圖五、將可供處理大量樣品的機器人學(robotics)與蛋白質體學研究技術結合的實例 

(節錄自 Liebler, D. C.(2001)Introduction to Proteomics: Tool for the New Biology, 1 st Ed., 

Human Press.) 

參考文獻 

1. Wilkins, M. R., Williams, K. L., Appel, R. D., and Hochstrasser, D. F.(1997)Proteome Research: New 

Frontiers in Functional Genomics(Principles and Practice), 1 st Ed., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 

Germany. 

2. James, P. (2001)Proteome Research: Mass Spectrometry(Principles and Practice), 1st Ed., 

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Germany. 

3. Rabilloud, T. H. (2000)Proteome Research : Two-Dimensional Electrophoresis and Identification 

Methods(Principles and Practice), 1st Ed., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Germany. 

4. Liebler, D. C.(2001)Introduction to Proteomics: Tools for the New Biology, 1st Ed., Humana Press. 

5. Pennington, S., and Dunn, M. J.(2001)Proteomics: From Protein Sequence to Function, 1st Ed.,

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Germany. 

6. Palzkill, T.(2002)Proteomics, 1st Ed., Kluwer Academic Publishers 

19 


7. Wilkins, M. R., Sanchez, J. C., Williams, K. L., and Hochstrasser, D. F.(1996)Current challenges and 

future applications for protein maps and post-translational vector maps in proteome projects. 

Electrophoresis 17, 830-838. 

8. Wasinger, V., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Gooley, A. A., Wilkins M. R., Duncan, M., Williams, K. L., 

and Humphery-Smith, I.(1995)Progress with gene-product mapping of the mollicutes: Mycoplasma 

genitalium. Electrophoresis 16, 1090-1094. 

9. Friedrich, G. A.(1996)Moving beyond the genome projects. Nature Biotechnol. 14, 1234-1237.

前言 

第三章 

整合蛋白質體學的生物資訊工具 

國立台灣大學醫學院藥學系 

林榮信 

20 

第三章、整合蛋白質體學的生物資訊工具 

隨著電腦運算速度的高速成長,網路頻寬的提昇以及全球資訊網(World Wide Web)的 

普及,各類基因體、蛋白質體及化學資料庫的建立,以及許多生物相關的演算法的發明與演 

進,生物資訊學(Bioinformatics)已漸漸成為生命科學研究的一項重要工具。由於許多生物 

資訊的網路資源有著自由與公開的特性,研究人員可以運用生物資訊的工具來找出更有深度 

的科學問題,避免與世界上其他研究團隊做類似性質的研究,並可以整合各類生物知識對研 

究課題做更高層次統合性的了解。 

內容 

壹、蛋白質序列比較 

自從 1960 年代早期,有些實驗室就發現蛋白質的序列資料庫蛋白質序列資料庫 (Protein 

Sequence Databases)的建立有其必要性,因此像是 PIR (Protein Information Resource, 

http://pir.georgetown.edu/)便是原先為了研究蛋白質間演化上的關係,所開始建立的資料庫。 

依資料品質與所提供的註解的內容,該資料庫分為四個層次:PIR1 包括完整的以分類與以註 

解的紀錄;PIR2 則是尚未過全面審核且可能有重複性的初步資料;PIR3 為未經審核確認的資 

料;PIR4 則是一些不會被轉錄或轉譯的序列。德國的馬丁斯利德蛋白質科學研究所 

(Martinsried Institute for Protein Sciences)也建立了一個蛋白質序列資料庫 MIPS(http:// mips.gsf.de/ 

),其主要是結合 PATCHX 這個延伸資料庫整理所得。SWISS-PROT ( http:// 

tw.expasy.org/sprot/)則著重在高層次的註解資料,包括蛋白質的功能描述與蛋白質域段 

(domain)標定、轉譯後修改(post-translational modification)、變異種(variant)等等。在 

1996 年之後,其更運用電腦化的註解方式建立了 TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/trembl/ 

index.html)。此外,還有像 NRL-3D(http://www.psc.edu/general/software/packages/nrl3d/nrl_ 

3d.html)這樣的資料庫,其由 PDB 所取得序列,以 PIR 的命名原則來給予標題與生物來源, 

並提供 MEDLINE 的交互參考資料、二級結構、活性位置、結合位置、修改位置、關鍵字等 

等有用的註解。 

應用一般時是以 FASTA 格式(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/fasta.shtml)來做蛋白 

質的序列搜尋,差不多就是用蛋白質的單字母序列碼。許多的網路程式都提供了蛋白質序列 

多面向的分析,例如 ProSAL(Protein Sequence Analysis Launcher,http://xray.bmc. uu. se/sbnet/ 

prosal.html,)就是一個非常方便有用的網路服務。

貳、蛋白質結構與功能的預測 

21 


Protein Data Bank(PDB, http://www.rcsb.org/pdb/)可以說是結構生物學(Structural 

Biology)中最重要的資料庫。近年許多新藥的開發均利用到與疾病相關的蛋白質的三維結 

構,以電腦計算來對廣大的化學資料庫做虛擬篩選(virtual screening),因此與某些疾病相關 

的蛋白質結構的取得,將可大幅降低新藥開發所需要的時間與投資。由於知道分子結構之後, 

大大地有助於瞭解或推測蛋白質的功能,因此對未知實驗結構的蛋白質序列做理論結構預 

測,便成為後基因體時代一項重要的生物資訊研究領域。然而,許多結構的理論計算預測還 

是需要參考到已知的蛋白質結構,因此就更突顯出 Protein Data Bank 的重要性。 

一、二級結構預測 

蛋白質的基本二級結構包括 α-螺旋(α-helix)、β-平板(β-sheet)、環圈(loop)等等,主 

要由蛋白質骨幹(backbone)上的原子所形成的氫鍵所決定。二級結構常常是許多三級結構 

預測的基礎,目前在理論預測上也已達相當好的準確率,著名的網站如 PHD (http://cubic. bioc. 

columbia. edu/pp)、Sspro(http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/)、PROF(http://www. aber. ac.uk/ 

~phiwww/prof/index.html),還有像 JPred,(http://www.compbio.dundee.ac.uk/~ www -jpred/)這 

種統合許多各式各樣演算法的網路服務。此外,也有些做三維結構預測的網路服務也包括二 

維結構預測,如 PSI-pred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html)。 

二、三級結構分類 

許多人相信,蛋白質以序列來看雖然有數百萬到數千萬種,或甚至更多,但其三維結構 

經過相似性歸類之後,其實真正可具代表性的結構的數目,或稱其折疊方式(fold),卻應該 

是遠小於這樣的數目。在對 Protein Dank Bank 的眾多結構加以歸類分析之後,的確發現近年 

new fold 的數目成長有減緩的趨勢。這個觀察,也成為在蛋白質三維結構預測的理論基礎之 

一。由於蛋白質的結構與功能有極大的相關性,因此有些研究機構便專門研究如何來對蛋白 

質的結構來做解剖與分類。著名的有,SCOP(Structural Classification of Proteins, http:// scop. 

berkeley.edu)、CATH(Class, Architecture, Topology, and Homologues superfamily, http://www. 

biochem.ucl.ac.uk/bsm/ cath_new/index.html)、FSSP(Families of Structurally Similar Proteins, 

http://www.ebi.ac.uk/dali/fssp/fssp.html)等等。 

三、三級結構預測 

蛋白質三維結構預測主要有三大類方式:第一類是利用同源(homology)的觀念,即序 

列比較的方式,來做未知結構的模型,著名的代表有 SDSC1,(http://cl.sdsc.edu/hm.html)、 

CPHmodels(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)、SWISS-MODEL (http://www. expasy. 

ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)、ModBase (http://alto.compbio.ucsf.edu/ modbase-cgi/index. 

cgi);第二類則是用所謂縫製(threading)的方法,即將序列「縫」到各個已知的蛋白質三維 

的結構,再計算並比對出最佳的對映方式,著名代表則有 LOOPP(Learning, Observing and

22 


Outputting, Protein Patterns, http://ser-loopp.tc.cornell.edu/ loopp.html)、123D(http://123d.ncifcrf. 

gov/ run123D+.html)、PROSPECT(PROtein Structure Prediction and Evaluation Computer Toolkit, 

http://compbio.ornl.gov/structure/ prospect2/ command.html)、UCLA/DOE Fold Server(http://fold. 

doe-mbi.ucla.edu/);第三類則是完全不依賴已知的蛋白質結構所做的所謂第一原理(ab initio) 

預測,其代表則有 HMMSTR/Rosetta(http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php)等 

等,另外有些如 LINUS、MONSSTER 這些第一原理預測的程式等則尚未公開程式碼或提供 

網站服務。 

由上可知,目前已經有許多蛋白質結構預測的網站服務,為避免重覆輸入資料的不便, 

因此一些整合各類預測理論的網站服務的便應運而生,舉例如 META-PP(http://maple.bioc. 

columbia.edu/pp/submit_meta.html)、Meta(http://bioinfo.pl/Meta/)等等,只要輸入一次胺基 

酸順序後便可以得到許多預測程式傳回的結果。 

由於蛋白質結構預測有廣泛運用,其目標又有明確的定義,而其方法則有跨領域的特 

性,因此一個客觀的評估各種方法的機制有其必要,而且可行。在這樣的動機下,蛋白質結 

構預測中心(Protein Structure Prediction Center,(http://predictioncenter.llnl.gov/))便在每兩舉 

辦一次競賽,稱之為 CASP(Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction); 

在波蘭最近也建立了類似的網站服務,稱為 CAFASP(Critical Assessment of Fully Automated 

Structure Prediction, http://bioinfo.pl/cafasp/),從事三級結構預測結果的整理。在該機構也有網 

站服務在從事不間段連續性的蛋白質結構預測程式評估,稱作 LiveBench(http://bioinfo.pl/LiveBench/),這樣隨時只要有新的優秀預測程式,都可以立即被公佈為人所知。 

四、細胞膜蛋白預測 

細胞膜蛋白因為表現量很少,加上結晶條件不容易找到,所以雖然目前在 Protein Data 

Bank 上以有大約三萬個蛋白質結構被建檔,但是其中膜蛋白所佔比例卻不到百分之二。在這 

樣的情形下,就更顯出利用理論工具來做預測的重要性。如下幾個著名的網站服務:DAS 

(Dense Alignment Surface method, http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/)、TMHMM(http:// www. 

cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、TopPred2(http://www.sbc.su.se/~erikw/toppred2/)與 MOM- 

ENT(http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/moment/),便是用來預測穿透細胞膜的 helices,可 

以讓我們對未知的細胞膜蛋白有些基礎骨架上的了解。 

五、蛋白質域段(Protein Domain)分析預測 

經過對已經由 X-ray 結晶學與核磁共振所解出的蛋白質做結構分析,很容易可以發現很 

多蛋白質可以分成許多域段(domain),而這些域段則往往有各自專屬的功能,有時各域段則 

會相互協調合作,以完成更複雜的訊息傳遞、分子辨識與調控作用。對於未知結構的蛋白質, 

如果能夠對其域段做正確的分析,則不旦可以對各別域段的功能作各自獨立的研究分析,也 

可能可以從而利用 X-ray 結晶學與核磁共振以決定各別域段的結構,甚至進一步利用蛋白質

23 


嵌合(protein docking)這樣的計算方法,去預測出完整的蛋白質結構。由於對蛋白質做域段 

分析十分重要,因此現有的網站服務也十分眾多,著名的舉例如下:Pfam (http://pfam. wustl. 

edu/hmmsearch.shtml)、InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/ scan.html)、ProDom (http:// 

prodes.toulouse.inra.fr/prodom/current/html/home.php)、BLOCKS (http:// blocks.fhcrc.org/blocks 

search.html)、SMART(Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg. 

de/)、DomFish(Domain Fishing, http://www.bmm.icnet.uk/~ 3djigsaw/dom_fish/)、SnapDRAGON 

(http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/~rgeorge/ snapdragon/)、PROSITE(http://tw.expasy.ch/prosite 

/)。此外,經過序列比對,我們可以定出到不同家族蛋白質的特徵序列,有時候稱做指紋序 

列,這也可以算是域段分析的一環,著名的網站服務如:eMOTIF(http://dna.stanford. edu 

/identify )、 GeneQuiz ( http://jura.ebi.ac.uk:8765/ext-genequiz/ )、 PRINTS ( http://bioinf.man. 

ac .uk/dbbrowser/ PRINTS/PRINTS. html)、P-val FPSca(http://bioinf. man.ac.uk /cgi- bin /dbbrowser/fingerPRINTScan/muppet/ 

FPScan.cgi)。 

真核細胞的蛋白之可能的 Serine、Threonine 與 Tyrosine 磷酸化位置則可用 NetPhos 

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)來做預測。 

參、細胞內的蛋白質 

一、蛋白質細胞內分佈 

我們現在知道,新生的蛋白質常常利用所謂的訊號胜肽(signal peptide)以遞送到不同的 

胞器,到達目的地之後再予以去除。知道蛋白質在不同胞器的分佈也可以幫助了解各蛋白質 

之間的交互作用與功能。在幾個相關的網站之中,SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ 

SignalP/)可以由胺基酸序列預測訊號胜肽的存在與切斷位置,PsortII(http://psort.nibb.ac. 

jp/form2.html)則可用來預測蛋白質在細胞中的位置。 

二、蛋白質交互作用 

目前蛋白質之間相互的作用網絡已成為熱門的研究課題,現在也已經有些開放的網路資 

料庫公大家查詢已經知道的蛋白質交互作用與反應途徑,BIND (The Biomolecular Interaction 

Network Database, http://www.bind.ca/)便是一個著名的網站。DIP(Database of Interacting 

Proteins, http://dip.doe-mbi.ucla.edu/)則專門提供由實驗決定的蛋白質作用關係的資料庫。 

UMBER (University of Manchester Bioinformatics Education and Research, http://www.bioinf. 

man.ac.uk/resources/interact.shtml)則提供在資料庫中蛋白質及其相關的交互作用的圖像化關 

係。此外,在日本的 BRITE(Biomolecular Relations in Information Transmission and Expression, 

http://www.genome.ad.jp/brite/)則提供蛋白質及基因表現的關聯資料,其中部分結果是由微陣 

列的基因表現圖(gene expression profile)上的相似性所決定。除了蛋白質與蛋白質之間的交 

互作用之外,也有整理蛋白質與 DNA 交互作用的資料庫,如 DPInteract (http://arep.med. 

harvard.edu/dpinteract/)。當然,蛋白質與藥物或其他化學分子的交互作用也是極為重要的課

24 


題,因此 LIGAND(http://www.genome.ad.jp/dbget/ligand.html)就是為了研究這樣課題所建立 

的資料庫,其更提供了生物內的反應途徑。ReLiBase(http://www.ccdc. cam. ac.uk /prods /relibase)則提供一個方便的瀏覽器圖形介面以直接檢視接受體和接合分子的作用。 

有些資料庫甚至嘗試去將所有的生物分子的功能性作用加以建檔,如 MINT(Molecular 

Interaction Database, http://cbm.bio.uniroma2.it./mint/),也有些資料庫專門只收及一些酵素或其 

相關蛋白的資料,如 REBASE(The Restriction Enzyme Database, http://rebase.neb. com/rebase 

/rebase.html)。 

肆、其他相關生物資訊資源 

網路上的其他相關的生物資訊資源可以說是不勝枚舉,下面僅是一個簡單的條列式介紹: 

一、RegulonDB,(http://www.cifn.unam.mx/Computational_Genomics/regulondb/)轉錄調控與 

操縱子(operon)組織的資料庫。 

二、TRANSFAC(http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)轉錄因子資料庫。 

三、TRRD, Transcription Regulatory Region Database(http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases 

/trrd4/)轉錄調控區域資料庫。 

四、PIMRider®(http://pim.hybrigenics.com/pimrider/pimriderlobby/PimRiderLobby.jsp)蛋白質 

的反應途徑。 

五、BioCarta(http://www.biocarta.com/)功能蛋白質體服務,提供許多反應途徑的資料庫。 

六、BioCyc(http://biocyc.org/)基因體知識資料庫。 

七、EMP Project(http://www.empproject.com/)酵素與反應途徑的資料庫。 

八、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.ad.jp/kegg/)京都基 

因與基因體百科全書。 

九、PFBP(Protein Function and Biochemical Pathways, http://www.ebi.ac.uk/research/pfbp/)提 

供有組織別的代謝及其他生化途徑的詳盡資源。 

十、STKE(Signal Transduction Knowledge Environment, http://stke.sciencemag.org/)訊息傳遞 

的知識環境。 

結語 

這些資料庫中,許多企圖達到的功能範圍都很大;隨著時間,其內資料量必越來越充實, 

但也需要經常去使用才能知道哪一些服務最能做到自己最需要的功能。希望以這篇短文為基 

礎,讀者可以自行建立對自己最有用的生物資訊網路工作環境。

PARTⅡ 

25 

PARTⅡ、分離蛋白質研究技術 

分離蛋白質研究技術

內容 

壹、原理及策略 

26 

第四章、樣品來源的選擇、前處理及分類 

第四章 

樣品來源的選擇、前處理及分類 

Selection, Preparation and Classification of Target Proteins 


林榮耀 

供蛋白質體(Proteome)分析之蛋白質樣品,最重要為可溶性,不同的樣品如病毒、細 

菌至哺乳類組織等,其抽取內部蛋白質的方法不同,但主要有三個通則:(1)由樣品抽取, 

其所用方法簡單為宜,並其結果需有重現性;(2)以一次能分析多種蛋白質為佳;(3)最好 

避免使用管柱、透析等方法以避免蛋白質之被吸著。樣品之抽取法如表一,而常用的蛋白質 

樣品於表二。 

表一樣品之抽取蛋白質方法 

方法使用之導具樣品 

冷凍-溶解細胞 - 

Hypotonic 處理 - 

磨碎處理 Homogenizer. 

超音波處理超音波儀 

破碎切斷處理 Polytron, homogenizer, 

Warning blender. 

高壓型破碎處理 French press. 

表二可溶化試劑 

蛋白質變性劑 

界面活性劑 

還原劑 

成份 

培養細胞、血球、細菌 

血球 

軟組織 

培養細胞、血球、細菌 

肌肉、結締組織 

血球、細菌、培養細胞、 

植物細胞 

8M 尿素;7M 尿素╱2M thiourea 

0.5~1%Triton X-100;4%CHAPS, 0.1% SDS 

10~100mM dithiothreitol

27 


註:(1) 使用 thiourea 可使膜蛋白可溶性增加 (1) 。 

(2) 使用上述試劑濃度太高時,於 2-DE 之分離時低分子蛋白質之染色背景值高。 

貳、供二維電泳(2DE)分析之樣品抽取: 

2DE 操作時,如樣品之鹽濃度太高時,會於電泳時,導致電流上升,發熱增加,鹽離子 

游動,故蛋白質游動少使得分離效果降低;所以如樣品中鹽類濃度太高時,可用沉澱法或透 

析法,將鹽類和蛋白質樣品分離但需注意的是樣品之部分蛋白質會產生不溶的情況。以 2DE 

分離蛋白質有兩個目的(1)可以分離單一蛋白之 spot,它為含一級構造之蛋白質,可供分析 

其胺基酸序列,鑑定蛋白質;(2)另外可應用於探討蛋白質與蛋白質相互作用,在「不變性」 

條件下分離蛋白質複合體後,再用 2DE 分析。 

參、選擇那些蛋白質進行供構造分析,及如何選擇目標蛋白質(Target protein)? 

由 2DE 鑑定蛋白質後,進一步進行蛋白質立體結構分析如要點如下 (2,3) 

一、計畫之成果需具有較高生物醫學的意義,並能獲得智慧財產權者為優先。 

二、對有興趣之蛋白質之胺基酸序列進行比對,得胺基酸序列較高有類似性(homology),而 

其相同性(identity)如超過百分之卅者可歸為一類以進行群組(cluster)之分類。 

三、有興趣之蛋白質需考慮是否在大腸桿菌,酵母菌或昆蟲細胞等蛋白質表現系統進行,大 

量表現,考慮其蛋白質可溶性,是否容易純化及結晶等性質由各群組選擇一至數個當目 

標蛋白質。另外考慮下列事宜: 

(一) 人類有三萬五千個基因,約有拾萬種蛋白質,如一個 cluster 約有 10 種蛋白質,故可能 

有一萬個 clusters,它可能由世界各國於五至十年內完成立體結構。 

(二) 每一種 cluster 中之一個蛋白質、如其立體結構,闡明及了解其功能後則可預測及了解 

cluster 內其他蛋白質可能之結構與功能。 

(三) 目標蛋白質立體結構未明前,可根據分子進化來進行有系統的蛋白質分類,由統計上對 

有意義之胺基酸。 

(四) 如蛋白質間胺基酸系列有 20~25% 一樣時,可能有偶然發生類似性或相同性,故可能有 

功能不相關的蛋白質之混入,故一般以兩個蛋白質有 30~35% identity 可歸類為同一類功 

能的蛋白質。 

(五) 蛋白質胺基酸序列可利用生物資訊學(Bioinformatics)對其構造及功能推測,可用 NCB 

之 BLAST,如 E 達 0.1 於 10 8 data size 時顯示其有意義之相似 (4) 。 

肆、選擇 cluster 供研究之優先順位: 

得到 cluster 後,根據其於醫學生物學研究之重要性,並引用生物資訊由蛋白質所含 domain 

或 motif 儘可能分析可能有之分子功能及生理功能,決定研究優先次序後,由 cluster 之選擇 

一種蛋白質,經 cDNA cloning,蛋白質大量表現,可溶化、精製及結晶化,如上述步驟不順

利的話需換另一種蛋白質試作。 

伍、Domain 為單位的 target 蛋白質選擇: 

28 


一種蛋白質可能有一或數個 domains,尤其真核細胞之蛋白質因為分子機能進化過程中, 

最小的單位為 domain,故由具有複數 domains 之蛋白質進行研究較佳。由核磁共振 NMR 研 

究蛋白質結構分析之優點為不必把蛋白質結晶化,其缺點為蛋白質目前只能分析蛋白質分子 

量最大為 30,000,另一方面可用 limited digestion 進行蛋白質水解可幫忙獲得正確的判斷 

domain 之位置,故以 high throughput 分析 domain 之位置將為重要課題。 

陸、Projects 間之整合 

Projects 間之整合,可避免之重覆研究同一個蛋白質。2001 年於美國 Virginia 開之第二屆 

國際基因構造學會,達到共識,以延伸標記語言 XML(extensible markup language)為世界 

各國 projects 所研究蛋白質之登記,及報告研究進度,經此公開化,達到自由競爭。 

參考文獻 

1. Rabilloud, T. et al. (1997)Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electro- 

phoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 18, 307-316. 

2. Burley, S. K., Almo, S. C., Bonanno, J. B., Capel, M., Chance M. R., Gasterland, T., Lin, D., Sal., A., and 

Studier, F. W. (1999)Structural genomics: beyond the human genome project. Nature Genet. 23, 151- 

157. 

3. Yokoyama, S. et al.(2000)Structural genomics projects in Japan. Nature Struct. Biol. 7, 943-945. 

4. King, R. D., Saqi, M., Sagle, R., and Sternberg, M.(1997)DSC , public domain protein secondary 

structure predication. J. Comput. Appl. Biosci. 13, 473-474.

前言 

29 

第五章、蛋白質純化原理及技術 

第五章 

蛋白質純化原理及技術 

The Principle and Technology of Protein Purification 

國立台灣大學醫學院生物化學暨分子生物學研究所 1 

國立台灣大學生化科技系微生物與生化學研究所 2 

鄭宇哲 1 ,莊榮輝 2 ,廖大修 1 

本文大部分內容來自莊榮輝教授網頁,請參考附註中的延伸閱讀 (1) 。 

蛋白質的純化過程,可分為三個階段: 

一、粗萃取蛋白質(crude protein)‥ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全蛋白。 

二、部分純化(partially purified)‥ 初步的純化,使用各種管柱層析法。 

三、均質(homogeneous)‥ 目標蛋白質進一步精製純化,可用製備式電泳或 HPLC。 

壹、蛋白質抽取 

一、決定目標蛋白質 

二、打破細胞的方法 

(一) 乾式:不用加緩衝研磨液,直接研磨成乾粉。 

1. 液態氮研磨:材料在液態氮中凍結,以研砵打碎材料後研磨成粉。 

2. 利用磨粉機:類似果汁機,原本使用在乾磨中藥藥材。 

3. 利用球磨機(ball mill):以小球增加研磨面積,多用在研磨酵母菌粉。 

(二) 溼式:都要在低溫下研磨。 

1. 利用均質器:玻璃或鐵氟龍材質,是較溫和的研磨方法。 

2. 利用果汁機(waring blender):每打一分鐘,要間歇降溫,重複進行數次。 

3. 利用 Polytron:高速電動研磨機,目前最常用的均質器。 

4. 超音波震盪(ultrasonication):以超音波打破細胞,多用在微生物材料。 

(三) 打破細胞時注意事項: 

1. 在細胞均質化前,通常都要把材料先切成碎片(增大表面積)。材料亦可以液態氮急速冷 

卻,可以提高抽出率,且可防止酵素活性喪失。 

2. 植物材料的均質過程要特別小心,因植物細胞在打破後,會劇烈降低其 pH 值。很多植物 

材料有含酚化合物(phenolic compounds),在空氣中很快氧化成褐色色素。可在緩衝液加 

入 ß-mercaptoethanol,避免氧化。 

3. 有些蛋白質會附著在細胞壁或細胞膜上,不能以普通緩衝液溶出。可先把材料製成丙酮粉 

末(acetone powder),再加入緩衝液,此時稍具水溶性的蛋白質就會溶出。

4. 均質後可以離心分開可溶與不溶部分,離心不易分開的,可再用過濾法。 

圖一、等電點示意圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

30 


三、鹽沈澱法 

(一) 鹽溶(salting in) 

如圖一中所示,蛋白質會在某個環境 pH 值下呈現帶電荷為 0 的情形,此時該 pH 值稱為 

該蛋白質的等電點。而當環境的 pH 比該蛋白質的 pI 值為高的時候,此時蛋白質會帶負電; 

相反的,若當環境的 pH 比該蛋白質的 pI 值為低的時候,此時蛋白質會帶正電。經由此特性, 

可以用沈澱或層析等方式,分離不同 pI 值的蛋白質。 

若緩衝液的 pH 值調至此蛋白質的 pI,則蛋白質分子的淨電荷為零,分子間的排斥力下 

降,凝聚成大粒子沉澱下來。此時若增加緩衝液的離子濃度,則蛋白質的溶解度會漸漸上升, 

稱為鹽溶。其發生原因可能是鹽類離子包圍蛋白質表面,與分子上的帶電基團或極性區域作 

用,進而增加水合效果所造成的。 

(二) 鹽析(salting out) 

在緩衝液中蛋白質分子表面上非極性區域附近的水分子,被迫滯留在此區域附近,以便 

把蛋白質分子溶入水中。緩衝液中若外加入大量離子,如硫酸銨,則這些滯留的水分子會和 

新加入的離子產生水合,因而暴露出蛋白質上的非極性區;蛋白質分子間,即以非極性基團 

互相結合,造成大的沉澱粒子,此稱鹽析。 

(三) 硫酸銨(ammonia sulfate) 

原理: 

硫酸銨是一中性鹽,對蛋白質有相當好的安定作用。其所帶電子數也多,因此溶入水中 

後,會吸引大量水和銨根,硫酸跟離子水合,而無法隔離蛋白值的非極性區域,使得蛋白質 

沈澱。各種蛋白質因其表面的非極性區域分佈不同,所以會在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉 

澱。通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示。 

使用法: 

1. 添加硫酸銨時,要在冰浴中進行,不可一次把硫酸銨倒入以免造成局部濃度過高。溶解完

31 


全平衡後去離心以分離沈澱物。 

2. 將所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中,或者以沉澱形式保存,此兩種處理方法可使蛋白 

質相當安定。 

下面列出硫酸銨百分飽和濃度表供讀者參考 

最終硫酸銨百分飽和濃度 

0℃ 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 

加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數 

0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 603 697 0 

20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 469 557 20 

硫 25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 436 522 25 

酸 30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 402 488 30 

銨 

起 

始 

百 

分 

飽 

和 

濃 

度 

35 

40 

45 

50 

55 

60 

65 

70 

75 

80 

0 28 

0 

57 

29 

0 

87 

58 

29 

0 

118 

89 

59 

30 

0 

151 

120 

90 

60 

30 

0 

184 

153 

123 

92 

61 

31 

0 

218 

187 

156 

125 

93 

62 

31 

0 

254 

222 

190 

159 

127 

95 

63 

32 

0 

291 

258 

226 

194 

161 

129 

97 

65 

32 

0 

369 453 35 

335 418 40 

302 383 45 

268 348 50 

235 313 55 

201 279 60 

168 244 65 

134 209 70 

101 174 75 

34 139 80 

90 0 70 90 

100 0 100 

表一、硫酸銨飽和濃度,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載,本表數據來自參考文獻 (i) 

貳、色層分析法(Chromatography) 

一、色層分析法原理 

(一) 層析系統的兩個主要組成為固定相(stationary phase) 及流動相(mobile phase),二者 

各自有不同的極性或非極性強度;樣本分子因其自身極性的強弱,與固定相親和力大者, 

易留滯原地;與流動相親和力大者,易隨流動相移動,因而達成將混合物分離的目的。 

(二) 極性大小:這種與固定相或流動相之間的親和力,決定於樣本或兩相物質之化學本質, 

極性分子易與極性的固定相或流動相產生親和力,而非極性分子則易與非極性之流動相 

或固定相產生親和力,一個樣本分子,則依其極性大小在此兩相間做選擇。 

二、層析法操作概述 

(一) 管柱大小 

膠體過濾法所需的管柱較為細長,而吸附目標蛋白質的層析法如離子交換法,親和性層 

析法等所需的管柱可用矮胖型。 

(二) 管柱系統 

整套系統包括下列各部分: 

緩衝液(1)→ 幫浦(2)→ 管柱(3)→ 監視器(4)→ 分劃收集器(5)

圖二、液相層析管柱系統示意圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

(三) 管柱操作 

1. 膠體處理:許多膠體是乾燥粉末,使用前要先行膨潤。 

2. 膠體裝填:以下是裝填膠柱的詳細步驟。 

圖三、膠柱裝填方法示意圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

32 


(1) 洗好的膠體浸在緩衝液中,靜置過夜使之沉降, 

(2) 先把各儀器連結好,確定可正常運作,架好管柱,注意要確實垂直地面。 

(3) 先在管柱內加一些緩衝液(約 5 cm 高),看能否順利流出,關住出口。 

(4) 把上述膠體攪拌均勻,成為懸濁液,但勿產生氣泡。 

(5) 沿著管柱的管壁,慢慢倒入膠體,以免生成氣泡。 

(6) 一口氣倒完,等約 1 min 後打開出口,膠體開始沉降。 

(7) 勿使上方緩衝液層乾掉。 

(8) 膠體完全沉降後,應得到預計的膠體高度,否則要追加或挖去膠體。 

(9) 連通整個系統,檢查系統的封閉性,開啟幫浦開關加壓,使膠體堆積更緊密,並調整幫 

浦流速。

33 


(10) 膠體面可能會下降,adaptor 要再往下壓,以完全接觸膠面。 

(11) 以正常流速流洗數小時,可洗過夜,同時準備樣本。 

3. 樣本體積 

(1) 若為膠體過濾法,則體積限定在膠柱體積的 1 ~ 3%,若為其他吸附性的層析法,樣本體 

積不限,重要的是樣本中的蛋白質總量,有無超出膠體吸附的能力(capacity),這在每種 

膠體的說明書中皆有詳載。 

(2) 樣本溶液不可有沉澱,要先離心及過濾沈澱物。 

4. 沖提速度:在注入樣本後,就可以進行沖提(elution),以直徑 1.6 或 2.6 cm 管柱而言, 

通常每小時流速約 30 毫升左右,較粗的管柱可加快。 

5. 樣本收集:收集約定在每 2 ~ 5 mL 為一分劃單位(一管),但可依情況自行增減,最好使 

用分劃收集器(fraction collector),讀滴數、秒速均可。 

(四) 層析法分析 

在跑完管柱層析法之後,對每個分劃部分測其中的蛋白質濃度和酵素活性。在測完每管 

的蛋白質濃度及酵素活性後,將蛋白質濃度及將酵素活性對每一分劃做圖,再將兩個圖形重 

疊起來一起觀察(如圖四),如此,可以作為判斷的依據。 

圖四、膠體過濾層析法之沖提圖譜 

此例為對草菇中的去氧核醣核酸水解酵素的純化過程中的一個步驟,上圖中為隔一個分 

劃部分測量一次,橫軸代表分劃數,左邊的縱軸代表波長 280 nm 的吸光讀值,右邊的縱軸 

代表酵素活性。實心圓代表酵素活性而空心圓代表蛋白質濃度。由此圖可大致來判斷,所要 

純化的酵素在大概第 30 ~ 40 分劃部分處沖提出來,而有大量其他的蛋白質在第 50 分劃以 

後以後才沖提出來,所以這個層析步驟成功的將目標酵素與其他大部分的蛋白質分開。

34 


三、膠體過濾法 

(一) 原理概述 

屬於 partition 層析法,流動相為溶離緩衝液,固定相為膠體孔隙內的緩衝液。溶質(樣 

本蛋白質)根據其分子量的大小,決定分佈在這兩相的比例。分子量大的不易進入膠球,隨 

流動相溶離;分子量小的,則易竄入膠球內的固定相,而被延滯流出膠柱。分子的形狀、大 

小均為影響因素。 

(二) 膠體介質(support, matrix) 

1. Dextran:葡萄糖組成的多醣長鏈,經過架橋修飾,成為內部有均勻孔道的小球。由 

Pharmacia(瑞典) 開發的產品有下面數種: 

(1) Sephadex G 系列 (2) :是最早推出的介質,有各種適用分子量範圍,如 G-10, 15, 25, 50, 75, 

100 等,數字越大,適用的分子量就越大。 

A 

圖五、Sephadex G (3) ,圖 A 為其構造式,B 圖為掃瞄式電子顯微鏡照相圖 

(2) Sephacryl S 系列 (2) :使用 Bis 做架橋支持,因此比 Sephadex 有更好的耐高壓能力。有 

S-200, 300, 400 等,適用分子量大的樣本,但注意它有很高的非專一性吸附,要小心蛋白 

質被吸附在膠體內! 

(3) Sephadex LH 系列 (2) :Sephadex 上的 OH-基團被修飾成 hydroxylpropyl 衍生物,疏水性 

較大,可兼用極性或非極性緩衝液。 

2. Agarose:洋菜醣,是由海藻抽出的直鏈聚醣,長鏈分子間以氫鍵架橋,形成三次元膠體, 

可以濃度來控制孔徑大小。

35 


(1) Sepharose 及 Sepharose CL 系列:由 Pharmacia 公司出品,CL 系列特經架橋反應補強, 

可耐高壓高溫。各有 2B, 4B, 6B 三種,數字表示含膠百分比,越大孔徑越小,與 Sephadex 

相反。 

圖六、Sepharose (4) ,左圖為其構造單體,B 圖為其二級結構 

(2) Bio-Gel A 系列 (5) : 由 Bio-Rad 公司出品,有 A-0.5M, A-1.5M, A-5M, A-15M,數字表示 

其所適用的最高分子量。 

(3) Bio-Gel P 系列 (5) :由 Bio-Rad 公司出品,膠體由 Polyacrylamide 組成,Polyacrylamide 像 

電泳膠體一樣,有固定大小的孔徑,製成小球後可供層析分離之用。有 P-2, P-4, P-6, P-10, 

P-30, P-60 等。 

(三) 膠球大小 

膠球粒有一定大小,一般可分為 corse, medium, fine, super fine 四種粗細(grade);越粗 

的膠體,流率越好,但解析力越差。因膠球外面的緩衝液是由膠球表面向內擴散,樣本蛋白 

質也是以擴散方式進入膠球,再由中心向外擴散出來,因此膠球半徑越大,擴散距離越大, 

效果越差。 

(四) 膠體管柱 

1. 管柱大小選擇 

視所要分離樣本的體積而定,一支膠體體積為 100 mL 的管柱,可分離 1-3 mL 樣本。膠 

體過濾管柱以細長較妥,通常直徑為 1.6 或 2.6 cm,長度為 80 ~ 100 cm,太長者擴散作 

用明顯。 

2. 膠體管柱性質 

(1) 膠體過濾都以管柱方式進行,當管柱裝填完成,若膠柱總體積為 100 mL(total volume, 

Vt),則膠柱內液相總體積約 90 mL(liquid volume, Vl),其中流動相的體積(即介於膠 

球之間的緩衝液總體積, void volume, Vo)約為 35 mL,樣本分子則應於 35 ~ 90 mL(Ve) 

間溶離出來。 

(2) 如同 TLC 的 Rf 值,膠體過濾也有表示樣本溶離程度的指標(Kav);樣本的 Kav 與分 

子量成反比,因此可用來作分子量的測定。現在多直接以溶離體積表示樣本溶離程度。

圖七、膠體過濾溶離圖譜,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

36 


(五) 膠體的選擇 

取決於所要分離蛋白質樣本分子量的大小,並且預期溶離出來的蛋白質峰,可出現在 

Vo-Vt 區間的前半段(使目標蛋白質早些溶離出管柱),以降低因擴散所造成的不利影響。 

(六) 膠體保存 

1. 膠體暫不使用時,可在緩衝液中加 NaN3(0.01%)流洗一次,關好出口。 

2. 長期不用時最好取出膠體,在玻璃漏斗中以 PBS 洗過數個體積後,保存在 4℃中,再加 

數滴 NaN3 防菌。 

3. 已膨潤的膠體應貯於 4℃,但切勿貯藏在零下的溫度,膠體結構會破壞掉;乾粉或未尚未 

開封者,可貯於室溫。 

四、離子交換層析法 


離子交換法是一種吸附性層析法,流動相為溶離緩衝液,固定相為介質擔體表面的帶電 

基團。樣本中各種蛋白質分子,與介質表面帶電基團間的親和力強弱不同,吸附上去之後, 

可使用不同鹽濃度的緩衝液和蛋白質競爭帶電基團,或不同 pH 值緩衝業去改變蛋白質的帶 

電性,以分別溶離出這些成分。 

(二) 兩大類離子交換介質 

由介質帶電基團的不同,可分為兩大類: 

1. 陽離子交換介質(cation exchanger):擔體-陰離子基團 

2. 陰離子交換介質(anion exchanger):擔體-陽離子基團 

離子交換的進行,可視為各對偶離子 counter ions 間,對擔體介質上帶電基團的爭奪,其競 

爭優勢順序如下: 

(1) 帶電荷高者取代帶電荷低者。

37 


(2) 電荷相同時,原子序(或離子體積)大者較佔優勢。 

(3) 濃度可克服以上兩種優勢,高濃度氫離子可取代其它陽離子。 

(4) 離子取代優先順序: 

陽離子: 兩價陽離子 > NH 4+ > K + > Na + > H + > Li + 

陰離子: I - > Br - > Cl - > HCO 3- > CH3COO - , OH - 

(三) 離子交換介質 

1. 離子交換介質的種類很多,歸納起來分為陰離子及陽離子兩大類;每一類又依其帶電基團 

的強弱,分為強、中、弱三種。 

2. 另外依介質的材質不同,略分為合成樹脂(resin)及聚醣(glycan)兩種。 

3. 聚醣多使用 Sephadex, Sepharose, Cellulose 等為擔體。 

圖八、cellulose 結構圖 (9) 

(四) 選擇交換介質 

應考慮樣本蛋白質的等電點 pI,則先選擇適當緩衝液的 pH 值,使目標蛋白質帶有正(或 

負)電,而採用陽(或陰)離子交換介質。 

(五) 一般使用原則 

通常在純化蛋白質時,都使用較弱的離子交換介質,如有 DEAE(Diethylaminoethanol) 

或 CM(carboxymethyl)等帶電基團的膠體。而 DEAE 型膠體使用的 pH 不能高過 9,CM 

者不能高於 pH 6,否則介質會失去原先帶有的電荷。 

(六) 介質容量有限 

離子交換介質與蛋白質的結合量有一定限度,稱為該交換介質的結合容量(capacity); 

若超過此一容量,多出的樣本會直接流出。而交換介質的結合容量大小,受層析條件不同、 

蛋白質種類不同、緩衝液不同、pH 或離子濃度不同等,有很大的差異。 

(七) 緩衝液與層析系統 

1. 緩衝液種類可能會影響離子交換結果,例如 DEAE 介質若使用磷酸緩衝液,則其中的磷 

酸根離子(帶兩個負電)與交換介質的結合力相當強,會影響樣本蛋白質的結合。 

2. 而緩衝液的 pH 值的決定可定在樣本蛋白質 pI 的上或下一個 pH 單位,用酸鹼度溶離 

時,當緩衝液的 pH 趨近樣本分子的 pI 在 0.5 pH 單位以內,蛋白質會開始溶離出來。

38 


3. 決定緩衝液的 pH 與離子濃度後,交換介質要先平衡在此緩衝液中。 

4. 管柱系統:多使用矮胖型的管柱。 

5. 膠體裝填:裝填方法與膠體過濾法一樣;裝填完成後,要以緩衝液洗過數個體積後方可使 

用。 

(八) 管柱操作方法 

1. 樣本蛋白質液:樣本必須平衡在管柱所使用的緩衝液中。 

2. 溶離方法:一般使用鹽梯度;溶離方式有連續梯度(continuous gradient)及階段梯度(stepwise 

gradient)。 

圖九、離子交換法梯度示意圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

3. 梯度體積:通常溶離體積較大時,解析度較佳;但體積太大時,會使溶離出來的蛋白質濃 

度變稀。而梯度的上下範圍也要適當,範圍太寬或太窄,均會降低解析度。 

4. 膠體再生: 

蛋白質全部溶離出來後,交換介質要經過再生(regeneration)後,才能再次使用。可先以 

1 ~ 2 M NaCl 洗去雜蛋白,澈底清洗可用 0.1 M NaOH 流洗之後用大量的二次去離子水 

流洗乾淨;陰離子交換介質可用 1 M 醋酸鈉(pH 3.0)洗 1.5 個體積;再以緩衝液平衡 

完全,才能再度使用。 

五、親和層析法 


親和層析法的固定相為一固相擔體,上有專一性親和基團,流動相為溶離緩衝液。 

當樣本通過管柱時,與親和基團有專一性的分子結合到固定相上,非專一性分子則隨流動相 

洗出管柱。留在固定相上的分子,可用酸或鹼溶離,或用專一性游離分子溶離。 

(二) 親和法三項要素 

1. 對所要純化的物質(B),需有專一性配體 ligand(A),而 A, B 之間要有專一性親和力, 

結合亦需具可逆性,其解離常數(Kd) 約在 10 -4 ~ 10 -8 之間。 

2. 擔體具有可與配體連結的基團,且非專一性吸附力低,通透性良好。 

3. A-B 結合成的複合體(complex),可以方便地解離,而不傷害 A 或 B。

39 


(三) 固相擔體 

1. 材料:種類很多,但用在蛋白質,仍以聚醣類為最佳。以 Sepharose 為例,可自行用 CNBr 

活化,使糖分子接上-O-C≡N(cyanate ester)基,再與配體(通常為蛋白質)上的胺基反 

應。 

2. 耦合反應: 

(1) 介質先經緩衝液洗過後,加入配體溶液反應後,再加入填塞分子,除去介質上未完全反 

應的基團,裝入管柱流洗後即可使用。 

(2) 耦合緩衝液及樣本液中,不能含有會競爭耦合反應的分子;例如使用 CNBr 活化的 

Sepharose 時,不可用 Tris 或 glycine 緩衝液。 

(3) 有些親和層析法使用連結分子 spacer arm 來降低配體的立體障礙,但是 spacer arm 多為 

六到八個碳原子的碳氫鏈,有相當強的非極性,若表現出疏水性層析的作用,則可能對 

純化效果有影響。 

(四) 現成的親和吸著劑 

利用以上各種介質,可自行接上有用的配體,進行親和層析法;但商品售有很多已經接 

好配體的成品,使用上更方便,請參照參考文獻 (9) 中。 

六、HPLC(high performance liquid chromatography)與 FPLC(fast performance liquid 

chromatography) 

(一) 名詞概說 

HPLC 為高效能液相層析法,使用高壓推動溶離液,以加速層析過程。 FPLC 則不用高 

壓,但流洗速度也很快,是因為所用的介質通透性極高之故。 

(二) 優點 

1. 解析力增加:通常可降低介質的粒子大小以增加層析法的解析力。HPLC 使用 silica 或樹 

脂等耐壓介質,以極細的粒子,在高壓下緊密裝填而成。使用時要在高壓下進行,因此速 

度比較快,通常在一小時左右可完成。 

2. 使用方式廣泛:近來由於介質材料的發展,各種應用在大分子的液相層析法,均可 HPLC 

的方式來進行;不但加快分析速度,也使解析度提高很多。 

(三) HPLC 注意事項 

為適用在高壓的環境下,通常 HPLC 管柱的膠體粒子較細,以耐高壓,但是缺點是容易 

塞住。所以 HPLC 通常都用在比較後面的純化步驟中,通入的樣本較不複雜,塞住的機會也 

比較少。另外,在通 HPLC 的系統中應有過濾膜設備,以濾掉雜質;所使用的水也以二次去 

離子水為宜。 

(四) 酵素純化系統簡介 

1. AKTA 系統 (2) 

為 Pharmacia 所發展的系統,可以不用很高的壓力,在一小時內完成分離。

2. BioLogic DuoFlow Systems (5) 

40 


為 BioRad 公司所發展的系統,同樣可以使用 HPLC 管柱,也具有很好的操作性。 

參、其他在蛋白質純化中常用到的技術 

一、超高速離心法 


蛋白質分子在離心時,其分子量、分子密度、組成、形狀等,均會影響其沉降速率,沉降係 

數即用來描述此沉降性質。沈降係數的單位為 S(Svedberg unit),每一種蛋白質的沉降係數 

與其分子密度或分子量成正比。不同沉降係數的蛋白質,可利用超高速離心法,在密度梯度 

溶液中作分離。 

(二) 密度梯度作法 

1. 樣本溶液中直接溶入 CsCl,經離心後自動形成梯度。 

2. 使用梯度製造器,在離心管內預先拉好甘油或蔗糖的梯度,加樣本後離心。 

(三) 離心陀種類 

使用不同離心陀,有不同離心方式及效果。 

1. 角型(angle rotor):典型的離心方式,多用在大量製備時。 

2. 懸籃式(swing bucket rotor):傳統用在密度梯度離心。 

3. 垂直(vertical rotor):取代懸籃式,可縮短離心時間。 

(四) 操作注意 

超高速離心因為轉速極高,操作上要非常小心,新手要有熟練者在旁指導。要注意以下事宜: 

1. 離心管的平衡要準確,封管要確實,否則液體可能被抽乾。 

2. 轉速切勿超過所使用離心陀的最高速限,老舊者的最高限還要打折。 

3. 離心後要清理離心陀,可用水沖乾淨後晾乾;尤其使用 CsCl 者,非洗不可。 

二、超微薄膜過濾法(ultrafiltration, UF) 


使用具有極細孔徑的薄膜,可以分離分子量不同的分子;薄膜上的小孔,只能讓某分子量以 

下的分子通過,此分子量稱為該薄膜的 cut-off 值。其基本原理類似透析,但 UF 薄膜的孔 

徑則更細,而且可選擇孔徑大小。 

(二) 超微膜濃縮裝置 

因樣本體積的大小不同,有各種不同的微膜設計,常用者如下: 

1. 攪拌加壓過濾(stirred cell):加壓迫使分子濾過微膜,並在薄膜表面攪動,以防止局部過 

濃而阻塞微膜細孔。 

2. 微膜離心管: 離心管中橫置一微膜,利用離心力把小分子擠過,大分子留在上方;樣本 

數目多而體積少時,多採用此法。實驗室較常用的是 Stirred cell(Amicon), Centricon

(Centriprep)。 

41 


三、電泳檢定法 


1. 帶電分子在電場中會隨電流移動,是為泳動;其泳動的大小程度稱為泳動率(mobility)。 

泳動率與分子上電荷密度成正比,而與其分子間摩擦力成反比:上述之摩擦力,決定於此 

分子之大小、形狀。 

(所外加電壓 mV) × (分子之淨電荷密度) 

泳動率 ~ ──────────────────────── 

分子與介質間之摩擦力 

2. 蛋白質分子上的淨電荷,取決於環境 pH 高低;若環境 pH 高於其 pI,此蛋白質帶淨負 

電,反之帶淨正電;若剛好等於其 pI,淨電荷為零。 

3. 電泳系統中,電子由負極流向正極;帶負電的分子往正極跑,帶正電的分子往負極跑,不 

帶電者則不易泳動。大部分電泳系統的 pH 定在 8.3,在此 pH 下,凡是 pI 小於 8.3 的 

蛋白質均帶負電荷,可以往正極跑。 

4. 影響泳動的因素: 

促進泳動:低膠體濃度(孔徑大)、低濃度緩衝液、高電壓、高電流、高溫。 

降低泳動:上述各點的相反條件、樣本含高濃度鹽類、樣本 pH 太高或太低。 

(二) 電泳種類 

電泳需有一介質,作為電泳之場所。現今多用半固態的膠體。 

1. 澱粉膠體電泳(starch gel electrophoresis) 

2. 聚丙烯醯胺電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 

3. 洋菜糖膠體電泳(agarose gel electrophoresis) 

(三) 聚丙烯醯胺膠體電泳 

聚丙烯醯胺膠體電泳 PAGE 可分為兩種 

1. 原態膠體電泳及活性分析:蛋白質以原態進行電泳,因此酵素活性在電泳後得以保持,可 

在膠片上直接做活性測定或染色。 

2. SDS 膠體電泳及分子量測定:SDS 是界面活性劑,可使蛋白質變性,並在分子表面均勻 

佈上一層負電荷。因此在 SDS-PAGE 系統中,樣本分子的泳動率,僅取決於其分子量, 

而與原來分子所帶的電荷無關,故 SDS-PAGE 可用來測定變性狀態(denatured)蛋白質 

之分子量。 

配製聚丙烯醯胺膠體中所用的單體分子(monomer)為丙烯醯胺(acrylamide),

42 


H2C=CH-CO-NH2,架橋分子(bridge):Bis [N,N'-methylene-bis(acrylamide)] 可看作兩個 

丙烯醯胺單體分子連結在一起,可形成分叉點,以構成立體結構,自由基(free radical) 產 

生者:過硫酸銨(ammonium persulfate, APS),催化劑 TEMED(tetramethylethylenediamine) 

幫助游基電子的傳遞。Acrylamide 及 Bis 都有神經毒性。 

1. 鑄膠反應為一連串的連鎖反應 

(1) 自由基形成:靠上述自由基產生者 APS 生成自由基,再使單體分子成為自由基型式。 

(2) 膠體聚合反應:游基單體可首尾相接,以連鎖反應形成大分子的長鏈。 

(3) 交錯連結:若架橋分子加入聚合反應,則形成網狀三次元結構。 

2. 電泳的焦集作用 

Glycine:圖中以黑點(當環境 pH > 6.9 時,帶負電)或白點(當環境 pH = 6.9 時,不帶電 

之 zwitterion)表示。氯離子: 以斜線部分表示。樣本分子: 以兩種大小蛋白質為例。上述 

組成電泳的部分中,只有膠體的緩衝液含氯離子;而樣本溶液中則含有 glycine,沒有氯離子。 

樣本溶液-焦集膠體-分離膠體三段的 pH 是不連續性的,其 pH 分別為 8.3-6.9-8.9,而 

glycine 的 pI 恰為 6.9。電泳一開始 glycine 進入焦集膠體,立刻變成不帶電的的分子(白 

點),泳動率變小;同時氯離子則很快的往正極泳動,因此在氯離子與 glycine 之間有一段缺 

乏離子的空間,電壓變得很高。然而兩電極之間,要有負離子來帶動電流,此時只得利用蛋 

白質來傳導。而焦集膠體中的孔隙較疏,於是樣本分子不論大小,在此離子缺乏空間,全部 

快速往正極泳動,一直碰到氯離子的尾端聚集成一薄層。Glycine 慢慢通過焦集膠體,變回 

負離子,離子缺乏帶瓦解;蛋白質泳動到分離膠體,開始依其分子量、電荷等因素泳動。 

圖十、電泳焦集作用示意圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

(四) 染色及乾燥 

1. 膠片染色法 

膠片在電泳後要進行染色,才能看到樣本蛋白質所呈現的色帶。 

(1) 一般染色法:

43 


A. 硝酸銀(ammoniacal silver) 染色:以銀氨錯離子形式與蛋白質結合,銀離子再還原 

成金屬銀的深褐色。其靈敏度比下述 CBR 染色法高十至百倍。 

B. Coomassie Brilliant Blue R-250(CBR)染色:最常用的染色法,快速方便,靈敏度中 

等。利用 CBR 上的芳香基團與蛋白質的非極性區結合,以及所帶負電與蛋白質的正 

電基團結合。 

(2) 活性染色法:若酵素反應會產生有色物質,則可進行活性染色,但多數酵素須以原態 PAGE 

膠片進行。可惜大部分的酵素,均無法產生有色的生成物;則或可把膠片分劃,橫切成單 

位小片(disk),再以一般的活性測定法,在試管中加入基質液,分析每一小片中所含的酵 

素活性。這種固相酵素的反應,可以拉長反應時間,以提高生成物濃度,方便偵測。 

2. 膠片乾燥法 

請參閱參考文獻 (7) 。 

肆、蛋白質定量及酵素分析方法 

一、蛋白質定量法 

(一) 各種蛋白質定量法 

1. Biuret 法:銅離子在鹼性溶液中,會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合,生成紫色的複 

合物;兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似 biuret 的複合體。其精確度較差(數 

mg),且會受樣本中硫酸銨及 Tris 的干擾,但準確度較高,不受蛋白質的種類影響。 

2. UV 吸光法: 

(1) 胺基酸的芳香基團在 280 nm 有吸光。由於各種蛋白質所含芳香族胺基酸組成不一,它們 

在 280 nm 的吸光能力亦不同。 

(2) 在 280 nm 的吸光值為 1 時,濃度約為 1 mg/mL。 

二、酵素活性測定法 

(一) 反應設計原則 

1. 測定生成物的產生量,比測基質(反應物)的消失量,更方便且靈敏。 

2. 反應流程儘量簡單,太複雜的操作過程,增加工作量及成本。 

3. 複雜的反應,可能產生某些意外的生成物(或 pH 改變),回饋抑制酵素反應。 

4. 反應條件要有利於指定反應方向的進行,可以移除生成物,或接上耦合反應。 

5. 小心樣本中有無其他酵素(或抑制劑)干擾,會因為消耗反應物或生成物,而加強或減弱 

目標酵素的活性,造成假象。 

(二) 反應基質及酵素濃度 

在試管中進行的酵素活性分析,與在生物體內的酵素反應,有相當的差距;為使反應達最大 

活性(Vmax),或往指定方向進行,所使用基質濃度為十倍 Km。 

(三) 酵素活性分析

44 


酵素活性的偵測,通常是固定在一段時間(t)內,觀察生成物的產量(P)。因此反應進行一 

定時間後需中止反應,再進行生成物的定量。而 P/t 即為此酵素的反應速率(vo),也就是酵 

素活性。 

1. 酵素活性測定方法 

(1) 直接測定生成物:所有去氫酵素均可測定 NAD + 與 NADH 間的變化量,即為去氫脢的 

活性;例如酒精去氫酵素催化下式之正反向反應: 

Ethanol + NAD + → Acetaldehyde + NADH + H + 

反應過程中 NADH 在 340 nm 波長有吸光變化。 

(2) 耦合反應法:若生成物(P)無法直接測得,設法把生成物再進行耦合反應,變成可測量 

的產物(Q);很多酵素可耦合到上述去氫脢的反應,則可測 340 nm 波長變化。 

(3) 化學測定法:若生成物具有化學活性,則可直接進行化學反應;例如蔗糖轉化酵素 

(invertase, IT)可將蔗糖水解成果糖及葡萄糖,可測定生成物還原糖的還原力。 

2. 中止酵素反應的方法 

注意任何中止反應的方法均不得破壞生成物,或干擾儀器測定。 

(1) 用 3 ~ 5% TCA(三氯乙酸)改變 pH,使酵素變性沉澱,再離心去除沉澱取上清。 

(2) 急速加熱(100℃水浴)10 min 或用 1% SDS 中止反應。 

(3) 若該酵素需二價離子,則加入 EDTA 中止反應。 

(4) 若該酵素有專一性抑制劑,則可加入抑制劑。 

3. 酵素活性連續測定法 

連續測定法可不用刻意中止酵素反應,但通常要使用儀器同步監控生成物。若生成物無法直 

接觀測,則可接續一耦合反應,把生成物轉變為容易觀察的物質。 

(1) 連續的耦合反應:耦合反應在連續測定法應用相當多,但由於耦合反應更複雜,甚至成 

為一個迷你的代謝途徑,要作好對照的控制組,以免誤差。 

(2) 維持酵素活性:酵素是有活性的分子,而可能隨時失去活性;應該考慮各種最佳的環境 

與條件,以便使酵素保持在最安定的狀態。 

緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度,兩者都會影響酵素的活性。各種緩衝液都 

有其適用的 pH 範圍,圖十一列出常用的緩衝液。

圖十一、各種常用緩衝液比較圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

(3) 添加物:經常在緩衝液中加入一些物質,以增加酵素安定或保持活性。 

圖十二、各種常用緩衝液比較圖,出自延伸閱讀 (1) ,經同意後轉載 

45 


(4) 濃度的影響:改變緩衝液的濃度,對其 pH 可能有影響。緩衝液的種類不同,酵素活性 

的表現也會有差異,有些酵素甚至失去活性。緩衝液可以十倍濃度貯存,高濃度可防止微 

生物生長,並保持每次實驗所使用藥品的穩定度。注意在稀釋後,溶液的 pH 也許會改 

變一些,尤其是磷酸緩衝液很容易受到濃度改變所影響。 

4. 酵素活性之維持 

(1) 酵素的安定性不同 

(2) 酵素失活的原因: 

可歸類成如下的物理性或化學性原因。 

A. 蛋白質變性:離開細胞的生理環境後,蛋白質可能遇到極端的 pH 條件、不適的溫

46 


度或變性劑,均會使蛋白質的構形破壞。 

B. 酵素活性區受到破壞:在抽取過程中,若失去 cofactor 輔助,或者活性區的關鍵胺 

基酸被修飾,均可造成酵素活性區受到破壞。最常見的影響是氧化,尤其是 cysteine 

上的 -SH 基很容易被氧化。一般加入 EDTA 除去可活化氧分子的二價離子;或加 

入抗氧化劑,以自身氧化防止 -SH 基氧化。 

C. 蛋白酵素水解:細胞內有許多蛋白脢,細胞被打破後即釋放到酵素溶液中,而很快 

去水解酵素。可用蛋白脢的抑制劑防止之,一般使用 PMSF(phenylmethylsulfonyl 

fluoride)。 

5. 如何保持活性 

若酵素不太穩定,活性不易保持,請參考下列處理方式: 

(1) 儘快進行純化及各項分析,隨時保持在 4℃ 或冰浴中。 

(2) 讓酵素保存在硫酸銨固體沉澱中,要比溶液狀態安定得多。 

(3) 勿隨意凍結或解凍酵素液,可加防凍劑(如甘油或醣類) 以液態保存。 

(4) 冷凍乾燥雖可長期保存酵素,但有些酵素活性可能會因而下降。 

(5) 若容易受微生物污染,可經無菌過濾後保存(當然也會損失一些酵素)。 

(四) 酵素活性單位 

活性單位(activity unit)是酵素活性高低的指標。一個活性單位的定義,是在固定溫度 

及 pH 下,每分鐘可催化 1 mmole 基質的活性。但很多情況下,為了操作或計算的方便, 

直接用測定產物所得的吸光值,除以單位時間來表示活性,因此活性單位的定義可能不同。 

伍、酵素純化策略 

一、純化策略 

正確的純化策略極為重要,往往可以使純化達事半功倍之效,因此事前要有極為充分的 

準備與規劃過程。 

二、純化步驟設計 

(一) 影響純化的因素:設計純化步驟時,需考慮下列各項要求: 

1. 高活性:酵素的比活性要能顯著提高,各種酵素因材料來源及含量多寡不一,純化倍率也 

有高低;不過就同一樣本而言,當然越高越好。 

2. 高回收率:一般指總活性的回收。 

3. 高純度:純度與活性是酵素純化的兩大目的,以達到均質酵素為最終目標;相對而言,在 

電泳上看不到其它雜質,即可視為均質。 

4. 方便與快速:方法要儘量簡便,步驟勿拖太久,因為酵素活性可能隨著時間而急速降低 

5. 經濟:許多試劑相當昂貴,大量使用時要考慮錢的問題。 

(二) 組合純化步驟

47 


1. 已知的酵素,可依照已發表的步驟進行,有問題再作改進。 

2. 利用該酵素的特殊性質來純化,如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱 

穩定性等。 

(三) 純化方法分類:通常同一個純化方法不會重複使用,最好是交叉使用各種蛋白質的不同 

性質,來設計一連串的純化步驟。 

三、純化表 

純化結果以純化表(purification table)摘要列出整個過程及結果。 

(一) 純化表的製作 

表二、草菇去氧核醣核酸水解酵素之純化表 

由表四中,每一純化步驟均需測量全部蛋白質量(total protein)及全部酵素活性(total 

activity)。而比活性(specific activity)這一欄是由全部酵素活性除全部蛋白質量而得;回收 

率(recovery)則是由該列的全部酵素活性除起始步驟的全部酵素活性而得;純化倍率則是由 

該列的比活性除起始的比活性而得。 

(二) 檢討純化表 

回收率超過 100% 時,表示粗抽取液中可能含有酵素之抑制因子,或含有干擾活性分析的物 

質,經去除後酵素活性大增。若回收顯著偏低,表示此一純化步驟並不理想,應探討緩衝液、 

溶離液成分有無問題,或者是純化流程設計是否不良。 

(三) 純度的要求 

純化得到的酵素,以電泳檢定已達相當純度,應可供大多數實驗需要;若有必要,可再經 HPLC 

或其它方法純化。並非所有的實驗都必要使用均質酵素,有很多實驗(如酵素動力學、分子 

量測定)都不需完全均質的蛋白質。 

陸、延伸閱讀

48 


1. 台大農業化學研究所莊榮輝教授的網頁,內容豐富,解說詳盡,中文環境值得常常拜訪: 

http://ac220.ac.ntu.edu.tw/%7Ejuang/JRH/index.htm 

2. 美國瑞森勒科研中心內的層析法教學網站,簡單易懂: 

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html 

3. 英國雪菲爾大學內生物分子分離純化及電泳技術:http://usitweb.shef.ac.uk/~mba97iy/ 

4. 細胞均質方法:http://www.cvmbs.colostate.edu/microbiology/tb/ResearchMA2.html 

5. 比利時 Louvain – Catholic 大學內洋菜膠體電泳圖解及操作說明: 

http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/electrotext.html 

6. 美國新墨西哥州立大學內電泳教學圖解: 

http://weather.nmsu.edu/Teaching_Material/soil698/electrophoresis/index.html 

7. 各種生化實驗的操作流程說明及常見問題解答:http://www.methodbook.net/index.html 

8. 美國肯塔基大學藥學系內的 HPLC 教學說明: 

http://www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/hplcmytry.html 

9. 非常實用的 HPLC 疑難解答,講解簡單明瞭,易學易用,內設有討論區,可前往發問: 

http://www.dq.fct.unl.pt/QOF/hplcts1.html 

參考文獻 

1. Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291 

2. http://www5.amershambiosciences.com 

3. http://bioquimica.fcien.edu.uy 

4. http://sciences.univ-angers.fr 

5. http://www.bio-rad.com 

6. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/organic/carb.html 

7. 莊榮輝, 博士論文, 國立台灣大學農業化學研究所, p.72-74

前言 

第六章 

蛋白質交互作用之研究 

Methods in Protein - Protein Interactions 

國立陽明大學生化所 

翟建富,廖辰中 

49 

第六章、蛋白質交互作用之研究 

細胞中有許多反應是透過蛋白質間的交互作用達成,如細胞的生長控制,蛋白質的運送 

與代謝反應等。分析這些蛋白質複體(protein complex)的組成與蛋白質間的交互作用與調控 

一直是生命科學相關領域所研究的重點。 

細胞內蛋白質的交互作用,依其在細胞中所扮演的角色有很大的差異。有些蛋白質複體 

非常穩定,例如參與代謝反應的酵素如丙酮酸去氫酶(pyruvate dehydrogenase)在進行催化 

反應時,參與反應的蛋白質必須形成完整的複體;有些蛋白質複體的組成則會隨著細胞生理 

條件的不同而產生變化,例如細胞中有許多參與訊息傳遞的蛋白質,只有在特定情況下,才 

會與目標蛋白質進行短暫的交互作用(transient protein-protein internations),蛋白質激酶 

(protein kinase)即是此類型的蛋白質;蛋白質激酶在特定情況下,會與目標蛋白質進行短暫 

的交互作用,並且對目標蛋白質進行修飾反應(modification),舉凡細胞生長、細胞週期(cell 

cycle)、代謝反應的調節及細胞內訊息傳遞(signal transduction)等重要的細胞生理反應,均 

是透過此類型的蛋白質間交互作用來達成。此章節的內容涵蓋:研究蛋白質間交互作用方法 

的介紹與蛋白質交互作用動力學的研究。 

內容 

壹、研究蛋白質交互作用之方法 

一、酵母菌雙雜交系統(Yeast Two Hybrid System) 

酵母菌雙雜交系統可以測試不同基因所產生的蛋白質,彼此間是否會發生交互作用。雙 

雜交系統的原理是將兩不同基因分別接上轉錄活化因子(transcription activator)的 DNA 結合 

功能區(DNA -binding domain (DBD))與活化功能區(activation domain (AD))的基因序列上, 

並送入酵母菌表現,若它們轉錄及轉譯出的蛋白質有交互作用,即可啟動酵母菌上的報導基 

因(reporter gene)(如圖一)。目前此方法主要是利用酵母菌(yeast)作為表現系統,此技術 

亦可應用於其他真核細胞中。 

利用酵母菌雙雜交系統研究蛋白質間交互作用,有以下幾個優點:(1)酵母菌雙雜交系 

統只需要將 DNA 序列選殖至適當的質體,即可測試兩基因所表現的蛋白質是否可產生交互 

作用,並不需要進行蛋白質的純化,因此有利於進行大規模篩選的實驗;(2)當發現兩蛋白 

質可交互作用,還可以利用基因重組的技術,找出目標蛋白質中哪些功能區(domain)或是 

胺基酸序列參與蛋白質結合反應;(3)雙雜交系統與其他 in vitro 的實驗步驟比較起來,比較

50 


接近真正的生理條件。四、雙雜交系統的靈敏度高,依 Li 等人 (1) 的實驗結果,利用雙雜交系 

統。 

圖一、酵母菌雙雜交系統(yeast two hybrid system) 

將兩種欲測試的基因分別接在轉錄因子(transcription factor)的結合位功能區(binding domain) 

及活化功能區(activation domain),並且送入酵母菌中進行表現,如果兩個測試蛋白質可產 

生交互作用則可啟動報導基因(report gene) 

偵測蛋白質的結合常數,發現較其他方法靈敏,所以此方法可以廣泛地運用於蛋白質交 

互作用的研究。 

雙雜交系統的缺點為:(1)此系統利用融合蛋白質(fusion protein)作為偵測系統,融 

合蛋白質在酵母菌內必須具有正確的構形才具有活性,而且蛋白質結合位可能會被轉錄因子 

功能區(transcription factor domain)所遮蔽,而無法表現正確的活性;(2)雙雜交系統只能 

研究一對一的蛋白質反應;(3)無法調整蛋白質結合時的反應條件,有些較弱的蛋白質結合 

無法觀察到;(4)蛋白質在酵母菌中表現後,無法進行適當的 posttranslational modification, 

其交互作用亦會受到影響 

整體而言,酵母菌雙雜交系統對於研究蛋白質交互作用是很好的選擇,此系統尤其適合 

大規模的篩選。

51 


二、蛋白質親合性層析(Protein Affinity Chromatography) 

蛋白質親合性管柱是結合蛋白質交互作用與管柱純化的方法,我們可以用釣魚來比喻此 

實驗策略;首先將標的蛋白質如餌一樣固定於管柱中,再利用這些餌分離細胞粗抽液中,可 

與標的蛋白質進行結合反應的蛋白質(如圖二);目前此實驗策略可以結合蛋白質二維電泳及 

質譜分析,快速鑑定參與結合反應的蛋白質種類。 

進行蛋白質親合性管柱實驗的第一個步驟,是純化欲研究的標的蛋白質(圖二-A)。一般 

而言,除非標的蛋白質的基因序列為未知,才採用傳統純化步驟純化標的蛋白質;目前較常 

利用且效率較高的純化方法,是將基因選殖至表現載體進行蛋白質的大量表現。 

步驟二(圖二-B):將純化的標的蛋白質固定於管柱上;將蛋白質固定於管柱的方法有多 

種,如果純化的蛋白質已含有專一性結合的序列,例如 His-tag、GST-tag 等,則可以選擇利 

用這些親合性尾端,將蛋白質固定於可專一結合這些蛋白質的管柱上;如果蛋白質不含親合 

性的尾端,則可利用共價鍵的方式將蛋白質固定於管柱上,形成親合性管柱。 

步驟三(圖二-C):將欲分析的粗抽液,通過親合性管柱並在低鹽的條件下進行沖堤;此 

步驟的主要目的是將未結合及非專一性結合的蛋白質移除,只有與標的蛋白質結合的部分留 

在管柱內。 

步驟四(圖二-D):利用高鹽或是含有介面活性劑如 SDS(sodium dodecyl sulfate)的溶 

液,將結合於管柱中的其他蛋白質沖堤出,這些被沖堤出的蛋白質,即是與目標蛋白質有交 

互作用的蛋白質。分析與鑑定這些蛋白質的種類,可利用抗體、胺基酸定序、MALDI-TOF 

等方法。 

雖然蛋白質親合性管柱,可以有效率的找出細胞中有哪些蛋白質可與標的蛋白質進行結 

合,但是此方法是一種 in vitro 的實驗,因此所得到的結果可能是實驗條件及人為操作所產生 

的假象,所以利用此實驗策略需注意以下幾點: 

(一) 必須有控制組進行對照。有些蛋白質與管柱會產生非專一性的結合,利用不含標的蛋白 

質的空管柱進行相同的實驗步驟,即可將這些非專一性結合的蛋白質給剔除。 

(二) 在細胞中有些蛋白質需經過修飾作用,才具有生理活性,若是將這些未進行修飾反應的 

蛋白質進行親合性管柱的純化步驟,可能會無法得到正確的結果。例如利用含有 SH2 domain 

的蛋白質如 transcription factor E2F 與 Rb 蛋白質進行結合反應,實驗結果發現其對未磷酸化 

Rb 具有較高的親合性 (2-4) ,如果其表現載體所送的細胞無法對表現出的蛋白質進行適當的 

修飾反應,利用這些需經過 posttranslationally modified 才具有正常功能的蛋白質進行親合性 

純化實驗,將無法得到正確的結果。研究 bovine papillomavirus E5 oncoprotein 與α-adaptin-like 

molecular 的交互作用時,必須將可表現 E5 的表現載體放至 NIH 3T3 細胞中表現,才會具有 

活性 (5) 。因此,若希望透過蛋白質-蛋白質交互作用,選擇性分離純化其他蛋白質,必須考慮 

蛋白質 posttranslational modification 對蛋白質交互作用的影響。

52 


圖二、利用親合性純化結合質譜儀分析蛋白質交互作用 

利用親合性純化結合質譜儀分析蛋白質交互作用其操作步驟如下:(A)純化含有親合性尾端 

的蛋白質。(B)將純化的標的蛋白質固定於管柱上。(C)將欲分析的粗抽液,通過親合性管 

柱並進行沖堤,移除非專一性結合的蛋白質。(D)利用高鹽或是含有介面活性劑如 SDS 的溶 

液,將結合於管柱中的其他蛋白質沖提出。(E)鑑定蛋白質種類。 

(三) 將標的蛋白質固定於管柱的過程,可能會造成蛋白質的失活,使得親合性純化的實驗失 

敗。例如將 E. coli λN 蛋白質(λN protein),固定於管柱的反應,常造成 λN 蛋白質的失活, 

推測其原因可能是 λN 蛋白質其胺基酸序列中含有多個離胺酸(lysine),因此利用 cyanogen 

bromide(CNBr)活化 bead 表面 matrix 的步驟,會使得 λN 蛋白質與 matrix 形成多個共價鍵 

結,並造成 λN 蛋白質的失活 (6) ,因此進行固定化反應時,必須確認固定於管柱上的蛋白質, 

具有正常的活性及蛋白質結構。 

(四) 有些蛋白質需要與其他次單位(subunit)結合形成複體後,才具有活性。為確定進行固 

定化反應後的蛋白質為複體結構,可利用含 SDS 與不含 SDS 的溶液沖堤管柱,並且比較兩 

者的結果。以 RNA polymerase 的固定化反應為例,E. coli RNA 聚合酶(polymerase)進行固 

定化反應後,其複體含有完整的次單位,而哺乳動物的 RNA polymerase II 進行固定化反應後, 

其複體卻少了一個次單位 (7) 。 

(五) 如同其他 in vitro 的實驗,當我們發現某蛋白質會與標的蛋白質產生結合反應,可能需要 

利用其他的方法證明兩蛋白質在生理情況下,確實會產生有意義的結合反應,否則容易得到

錯誤的結論。 

53 


三、親和性轉漬(Affinity blotting) 

親和性轉漬的實驗策略與親合性管柱類似;蛋白質混合物可以先利用電泳分離後,再將 

電泳片中的蛋白質轉印(transfer)到 nitrocellulose 或是 PVDF 的膜上,並利用其他欲測試的 

蛋白質或是 ligand 與膜上的蛋白質進行結合測試(如圖三)。這種方法與西方墨點法(Western 

blotting)類似,只是西方點墨法是以抗體為探針。因為上述的方法可以分析未經分離步驟的 

蛋白質混合物,因此特別適合用來分析膜蛋白中受體與 ligand 結合的研究。 

利用電泳分離蛋白質的步驟,電泳片中最好不要含有 SDS 等蛋白質變性試劑,雖然將蛋 

白質由電泳片轉印至 PVDF 膜的過程,可以去除變性試劑,使得部分蛋白質回復其正常構形 

及功能;但對於那些需形成複體才具有活性的蛋白質而言,電泳片中的變性試劑會破壞蛋白 

質其次單位(subunit)的組成,所以這些被破壞的蛋白質複體被轉印至 PVDF 膜上,還是無 

法表現其正常的功能。 

為了配合各種不同的偵測方式,當作探針的蛋白質或 ligand 可以利用不同的方法製備, 

例如表現蛋白質的過程中,在蛋白質上設計特別序列的胺基酸於尾端如 His-tag 或是 GST-tag 

均是目前實驗室中常用的方式;如果偵測的目標蛋白質的含量很少,為了增加偵測的靈敏度, 

可以採用放射性標定的探針進行實驗。Calmodulin-binding proteins 的研究,即是利用親和性 

轉漬的方式進行實驗的例子 (8) 。 

Calmodulin 可以用 125I 進行標定作為探針,並對轉印到 nitrocellulose 膜上的蛋白質進行 

結合測試;此研究策略較其他方法有利的地方在於可同時偵測多個對 Calmodulin 具結合力的 

蛋白質。 

為了增加蛋白質的分離效果,也可以採用二維電泳作為分離的工具,例如研究 TypeII 

camp-dependent protein kinase 與 regulatory subunit 的交互作用實驗 (9) ,即利用二維電泳進行 

蛋白質的分離。 

四、免疫共沈澱法(Immunoprecipitation) 

免疫共沈澱反應是觀察蛋白質交互作用的典型方法,分析時只需將抗體加至細胞粗萃取 

液中,細胞萃取液中的抗原會與抗體結合,經過分離及清洗的步驟,即可分析與抗原結合的 

蛋白質。 

為了避免得到錯誤的結果,進行免疫共沈澱反應需注意以下幾點:(1)必須確定共沈澱 

下來的蛋白質是透過特定的抗體,而不是其他抗體所造成。利用單株抗體(monoclonal 

antibody)進行共沈澱反應,即可避免上述的疑慮。(2)進行共沈澱所用的抗體只與特定蛋白 

質結合,也就是專一性要夠高。

54 


圖三、Affinity blotting 的實驗策略 

蛋白質混合物可以先利用電泳分離後,再將電泳片中的蛋白質轉印(transfer)到 nitrocellulose 

或是 PVDF 的膜上,並利用其他欲測試的蛋白質或是 ligand 與膜上的蛋白質進行結合測試。 

五、連結試劑(Cross-linking agents) 

連結試劑也是實驗室中常用來研究蛋白質間交互作用的一種方法,此方法主要是應用於 

觀察一些結合較差,或是短暫結合反應的蛋白質交互作用。 

結合連結試劑與蛋白質電泳,可以分析細胞中有哪些蛋白質形成複體結構。分析蛋白質 

複體組成的方法包含了四個主要步驟(如圖四)。步驟一:使用連結試劑將細胞中形成複體的 

蛋白質結合在一起,形成一穩定的複體結構。步驟二:在不含還原劑的情況下,利用 SDS-PAGE 

分離已進行連結反應的複體;此時,不同分子量的蛋白質複體,會依分子量的大小,在電泳片 

中產生不同的移動速率。步驟三:進行第二次電泳之前,先利用還原劑處理電泳片中的蛋白質 

複體,還原劑可以將連結兩蛋白質的連結試劑,其結構中的雙硫鍵(disulfite bond)打斷(即 

PS-SP’ → PS + SP’) ; 步驟四:將還原劑處理過的蛋白質複體,進行第二次 SDS-PADE 分離。 

未形成複體的蛋白質,因為其移動的速率與第一維電泳相同,因此進行第二次電泳時會位於 

電泳片對角線的位置,但是那些形成複體的蛋白質,進行第一次電泳時,分子量較大所以移 

動較慢,但是進行第二次電泳時,因為蛋白質間的連結試劑其雙硫鍵結被破壞,所以在第二 

次 SDS-PAGE 電泳時,蛋白質的移動速率會較第一次快(因分子量變小),所以會移動至電 

泳片對角線的下方。利用此方法,我們可以快速的分析有哪些蛋白質彼此間會形成複體的結 

構。 

連結試劑被廣泛應用研究複體酵素(multienzyme complex)蛋白質間的結構關係例如大 

腸桿菌的 F1-ATPase (10, 11) 及核糖體 ribosome 的結構 (12, 13) 。

55 


圖四、利用連結試劑分析蛋白質複體 

(A)連結試劑與蛋白質結合示意圖。(B)利用連結試劑找出形成複體蛋白質的分析方法。 

貳、蛋白質交互作用動力學的研究 

研究蛋白質交互作用最終的目的,在於探討這些蛋白質間的交互作用在生理反應中所扮 

演的角色;蛋白質結合動力學,是研究蛋白質交互作用的重要課題;目前有幾種測量蛋白質 

結合常數(binding constant)的方法被堤出,以下即針對這些常用的方法進行討論。 

一、分子篩管柱(gel filtration column)測定蛋白質交互作用 

分子篩管柱分析法是一種常用的測量方法,此方法的基本原理是競爭性結合測試,分子 

篩管柱只是分離複體(標的蛋白質與配位蛋白質所形成的複體)與單體(配位蛋白質)的工 

具;分子篩管柱分析法需結合蛋白質的放射線標定,並利用 radioactive exchange kinetics 的研 

究,得到蛋白質間的解離速率常數: koff(dissociation rate constant)。其實驗過程包含以下步驟 

(如圖五):步驟一(如圖五-A):先將標的蛋白質與標定的配位蛋白質形成複體,並利用大 

量未標定的配位蛋白質與複體進行競爭性結合。步驟二(如圖五-B):利用分子篩管柱分析不 

同反應時間的樣品,分子篩管柱可以將分子量大的蛋白質複體與分子量小的單體分離。步驟 

三(如圖五-C):測量複體的放射線強度並且做圖;結合緊密的蛋白質複體其放射線強度的下 

降速率較慢,反之,結合不緊密的蛋白質複體其放射線強度的下降速率較快,所以由放射線 

強度的下降速率可以計算出兩蛋白質間的解離速率常數: koff。

56 


圖五、利用分子篩管柱分析法分析蛋白質結合動力學 

(A)先將標的蛋白質與標定的配位蛋白質形成複體,並利用大量未標定的配位蛋白質與複 

體進行競爭性結合。(B)利用分子篩管柱分析不同反應時間的樣品,分子篩管柱可以將分子 

量大的蛋白質複體與分子量小的單體分離。(C)測量複體的放射線強度並且作圖。 

大腸桿菌素(colicin)為一種殺菌毒素,其 Im 蛋白質為了要有效率中和大腸桿菌素的活 

性,必須與大腸桿菌素緊密的結合,才能確保合成大腸桿菌素的細菌本身不受到傷害。大腸 

桿菌素與免疫蛋白質(Im protein)的解離速率常數即利用分子篩管柱分析法分析兩蛋白質的 

radioactive exchange kinetics,計算出兩者的解離速率常數(dissociation rate constant : koff)為 

3.7 × 10 -7 S -1 ,以此數值推算,兩蛋白質所形成的複體需三星期的時間才解離 50% (14) 。 

二、螢光法(Fluorescence method)測量蛋白質交互作用 

螢光法測量蛋白質交互作用,其原理是測量蛋白質中的色胺酸(tryptophan)螢光法的變 

化(如圖五)。蛋白質中的色胺酸其螢光發射光譜(fluorescence emission spectrum)最高值的 

波長,會因所在環境疏水性的變化而改變,因此我們可以藉由觀察特定波長的發射光,推測 

蛋白質結構是否有產生變化,我們可以假設此結構變化是因為蛋白質產生結合反應所造成。

57 


利用此現象,我們可以測量兩蛋白質的結合常數;stopped flow 即是應用此原理的例子,stopped 

flow 可以觀察兩蛋白質混合後,短時間內(10 msec ~ 1sec)螢光發射光譜的變化,藉由蛋白 

質濃度與螢光發射光譜的變化速率,可以推算出兩蛋白質的結合速率常數(association rate 

constant : kon)(如圖六);利用此方法所測得大腸桿菌素(colicin)與其免疫蛋白(Im protein) 

的結合常數為 4 × 10 9 M -1 S -1 。應用此方法測量蛋白值的交互作用有兩個限制:(1)蛋白質序 

列中必須含有色胺酸;(2)當兩蛋白質結合時,必須產生螢光的變化。 

圖六、利用螢光法(Fluorescence method)分析蛋白質結合動力學 

(A)Stopped flow 儀器示意圖; 將兩蛋白質分別置於機器 syringe 中;測試時機器瞬間將兩 

蛋白質注射至 Mixing chamber 中混合,並以螢光光譜儀記錄蛋白質因交互作用所產生的螢光 

變化。(B)實驗結果;由結果得知兩蛋白質混合後,於 10 msec 內完成結合反應。 

三、表面薄層共振技術(Surface plasmon resonance technology)測量蛋白質交互作用 

表面薄層共振技術,可以應用於研究蛋白質間的交互作用。表面薄層共振是一種光學現 

象,其原理是當有一束偏極光進入感應片的玻璃稜鏡時,會產生全反射。但是由於光在進行 

時,會有部分電子會與感應片上金箔層的金屬原子產生共振作用,所以在某反射角度會產生 

能量下降的情況,此能量下降的角度會隨著感應片上,結合分子的分子量變化而改變;因此, 

只要偵測感應片表面折射光其能量下降的角度的變化速率,即可計算出分子間的結合與分離 

速率常數。 

圖七為一般實驗所得到的感應圖,圖中的橫軸所代表的是反應時間,縱軸所代表的是 RU 

(Resonance unit),此 RU 值的變化可以代表生物分子作用的結合反應,RU 上升的速度與反 

應物結合的強度也有關。進行結合反應前需將標的蛋白質固定於感應片表面,固定反應完成

58 


後,再進行結合反應測試。圖中的 A 區是平衡區,此時感應片表面只有緩衝溶液流過,接著 

將 B 區是結合區,此時感應片表面流過的是配位蛋白質,當配位蛋白質與標的蛋白質產生結 

合反應時,感應片表面的質量會產生變化,所以 RU 值會增加,隨著時間的增加,固定於感 

應片表面的標的蛋白質的結合位會逐漸飽和,所以 RU 值的增加會趨緩,最後達到平衡。接 

著使用緩衝溶液對感應片表面的蛋白質複體進行沖堤(C 區),此時結合的配位蛋白質會與固 

定於感應片表面的標的蛋白質分離,此時 RU 值會降低。當反應完成後,利用較強的條件將 

所有的配位蛋白質沖洗乾淨,以進行下一循環的結合反應。由圖中的 B 區與 C 區的 RU 值變 

化,我們可以計算出配位蛋白質與標的蛋白質的結合與分離速率常數。 

圖七、利用表面薄層共振技術分析蛋白質結合動力學 

圖中的 A 區是平衡區,此時感應片表面只有緩衝溶液流過,接著將 B 區是結合區,此時感應 

片表面流過的是配位蛋白質,當配位蛋白質與標的蛋白質產生結合反應時,感應片表面的質 

量會產生變化,所以 RU 值會增加,隨著時間的增加,固定於感應片表面的標的蛋白質的結 

合位會逐漸飽和,所以 RU 值的增加會趨緩,最後達到平衡。接著使用緩衝溶液對感應片表 

面的蛋白質複體進行沖堤(C 區),此時結合的配位蛋白質會與固定於感應片表面的標的蛋白 

質分離,此時 RU 值會降低 

有許多蛋白質間的交互作用是利用表面薄層共振技術所測得,例如 IL-13 receptor alpha1 

chain(IL-13R alpha1)、IL-13R alpha2 與 IL-4R alpha 間的蛋白質結合動力學的研究 (15) 。,即 

是其中的一個例子。 

以表面薄層共振技術進行蛋白質結合動力學的研究,需注意以下問題:(1)此實驗步驟 

需將標的蛋白質固定於感應片表面,某些蛋白質經過固定化的程序後可能會失活,如果進行

59 


結合測試時 RU 值的變化不明顯,可能需要改變固定化的方法。(2)固定於感應片表面的蛋 

白質必須能承受再生的反應步驟,如此才可進行下一循環的反應;一般而言,再生步驟是利 

用酸的條件(pH 3),將配位蛋白質洗下,如果所固定於感應片表面的蛋白質對酸性環境敏感, 

可能需要調整再生步驟所使用的條件。(3)結合反應快的蛋白質,為了避免進料速度成為結 

合反應的限定步驟,所以研究結合反應快的蛋白質其進料速度不可太慢。(4)利用表面薄層 

共振技術研究蛋白質的結合動力學,其可測得的速率常數有一範圍,結合太快及結合緊密的 

蛋白質並不適用此方法。 

參、影響蛋白質結合動力學的參數 

一、結合常數(Binding constant) 

如果蛋白質(Protein : P)與另一個蛋白質(Ligand : L)的結合,是簡單一對一的模式, 

兩者結合的情況可以可以用下列方程式來表示: 

Kd =[Pf][Lf]/[PL] 

式中 Kd 為分離常數(dissociation constant),[Pf]與[Lf]是指未結合的蛋白質與配位體的濃 

度(free form),而[PL]是指結合的蛋白質與配位體的濃度。 

蛋白質與配位體間的交互作用還有另外兩種方式表示,第一種方式是親合常數(affinity 

constant):Ka 來表示:Ka=[PL]/ [Pf][Lf],也就是 Ka=1/[Kd]。第二種是以反應速率常數的方式來 

表示;因為形成 PL 的速率可以表示成 ka[Pf][Lf],其中 ka 是指結合速率常數(association rate 

constant),而 PL 的解離速率可以表示成 kd[PL],其中 kd 是指解離速率常數(dissociation rate 

constant),當達到平衡時,蛋白質複體 PL 的形成與解離速率相等,經過推導後我們可以得到 

結合常數:Kd = kd/ka。 

二、蛋白質與配位體濃度 

為了評估哪些蛋白質可進行結合反應,因此細胞內或是某特定區間中,蛋白質及配位體 

的總濃度(Pt 及 Lt)亦是一重要的變因。當我們評估蛋白質中形成複體結構的比例時,有兩 

個參數可以明顯的影響推論的結果。舉例來說,如果 Kd=[Pt]=[Lt],此時有 38%的 P 或 L 會形 

成 PL 複體的形式。如果 kd 增加 10 倍(弱的結合),此時只有 8.4%的 P 或 L 會形成 PL 複體 

的形式。如果 kd 降低 10 倍(強的結合),則形成 PL 複體形式的比例則會達 73%。P 及 L 在 

細胞內的濃度同樣會有相同的影響。我們如果知道[Pt]及[Lt]後我們可以依據下列的式子推得 

PL 複體的濃度:[PL]={([Pt]+[Lt]+kd)/2}-1/2{([Pt]+[Lt]+kd) 2 -4[Lt][Pt]} 1/2 (54) 

三、競爭性蛋白質的影響 

有時蛋白質間的作用力,細胞內所觀察到的結果與胞外測得的結果不同,可能是細胞內

60 


存有競爭性結合的蛋白質或是配位體所造成;舉例來說,如果蛋白質與配位體 1 (ligand1) 

的濃度等於 kd,則有 38%的蛋白質會形成複體,如果另一個配位體 L2,其對蛋白值的親合力 

只有 1/10,但是濃度卻高於 L1 1000 倍,此時形成的複體主要以 PL2 的形式為主(99%),PL1 

形式的複體只佔少部分。 

四、輔因子(cofactor)的影響 

有兩種類型的輔因子會影響蛋白質間的交互作用,第一種類型為小分子,例如 Ca 2+ 、 

ATP、GTP 等,第二種類型為細胞內的大分子例如蛋白質、DNA、RNA 等,這些分子與蛋白 

質結合後,造成蛋白質分子結構變化,而影響蛋白質間的結合。 

五、細胞區隔(Cellular compartmentation)的影響 

有些蛋白質與配位體的結合反應,會因為位於細胞中不同的區隔環境而有差異,例如有 

些 transcription factors 會位於蛋白質與細胞核兩個部分,但只有位於核內的 transcription factors 

會與其他參與 transcription 反應的蛋白質交互作用。 

六、溶液條件的影響 

影響蛋白質交互作用的因素中還包含了溶液的 pH 及其中所含的離子濃度,此外有些可 

增加溶液黏稠度的試劑如甘油等亦會影響蛋白質間的結合反應 (16) 。在胞外進行蛋白質結合測 

試時,必須考慮溶液的條件是否與生理環境相同。 

結語 

細胞內許多生理反應,都必須透過蛋白質交互作用才能進行,研究蛋白質間的交互作用 

可以讓我們對細胞生理有更進一步的了解。 

目前有許多物種的染色體已完成定序的工作,透過序列分析後,發現有許多基因所表現 

的蛋白質其功能未知;透過蛋白質交互作用的研究,對於探討這些功能未知的基因所表現出 

的蛋白質在細胞內的功能,有很大的助益。 

參考文獻 

1. Li, B., and Fields, S.(1993)Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T 

antigen by using the yeast two-hybrid system. FASEB J. 7, 957-963. 

2. Ludlow, J. W., DeCaprio, J. A., Huang, C. M., Lee, W., Paucha, H. E., and Livingston, D. M.(1989)SV40 

large T antigen binds preferentially to an underphosphorylated member of the retinoblastoma 

susceptibility gene product family. Cell 56, 57-65. 

3. Ludlow, J. W., Glendening, C. L., Livingston, D. M., and DeCaprio, J. A.(1993)Specific enzymatic 

dephosphorylation of the retinoblastoma protein. Mol. Cell. Biol. 13, 367-372.

61 


4. Wiman, K. G. (1993)The retinoblastoma gene: role in cell cycle control and cell differentiation. FASEB 

J. 7, 841-845. 

5. Cohen, B. D., Lowy, D. R., and Schiller. J. T.(1993)The conserved C-terminal domain of the bovine 

papillomavirus E5 oncoprotein can associate with an alpha-adaptin-like molecule: a possible link between 

growth factor receptors and viral transformation. Mol. Cell. Biol. 13, 6462-6468. 

6. Greenblatt, J., and Li, J.(1981)The nusA gene protein of Escherichia coli. Its identification and a 

demonstration that it interacts with the gene N transcription anti-termination protein of bacteriophage 

lambda. J. Mol. Biol. 147, 11-23. 

7. Burton, D. R., Barbas, C. F., Persson, M. A. A., Koenig, S., Chanock, R. M., and Lerner, R. A.(1991)A 

large array of human monoclonal antibodies to type 1 human immunodeficiency virus from combinatorial 

libraries of asymptomatic seropositive individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10134-10137. 

8. Glenney, J. R., and Weber, K.(1983)Methods Enzymol. 102, 204-210. 

9. Carr, D. W., and Scott, J. D.(1992)Blotting and band-shifting: techniques for studying protein-protein 

interactions.Trends Biochem. Sci. 17, 246-249. 

10. Baird, B. A., and Hammes, G. G.(1976)Chemical cross-linking studies of chloroplast coupling factor 1. 

J. Biol. Chem. 251, 6953-6962. 

11. Bragg, P. D., and Hou, C.(1980)A cross-linking study of the Ca2+, Mg2+-activated adenosine 

triphosphatase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 106, 495-503. 

12. Cover, J. A., Lambert, J. M., Norman, C. M., and Traut, R. R.(1981)Identification of proteins at the 

subunit interface of the Escherichia coli ribosome by cross-linking with dimethyl 3,3'- dithiobis 

(propionimidate). Biochemistry 20, 2843-2852. 

13. Traut, R. R., Casiano, C., and Zecherle, N.(1989)Crosslinking of protein subunits and ligands by the 

introduction of disulphide bonds, pp.101-133. In T. E. Creighton(ed.), Protein function: a practical 

approach. IRL Press, Oxford. 

14. Wallis, R., Leung, K. Y., Pommer, A. J., Videler, H., Moore, G. R., James, R., and Kleanthous, C. (1995) 

Protein-protein interactions in colicin E9 DNase-immunity protein complexes. 2. Cognate and 

noncognate interactions that span the millimolar to femtomolar affinity range. Biochemistry 34, 

13751-13759. 

15. Andrews, A. L., Holloway, J. W., Puddicombe, S. M., Holgate, S. T., and Davies, D. E.(2002) Kinetic 

analysis of the interleukin-13 receptor complex. J. Biol. Chem. 277, 46073-46078. 

16. Jarvis, T. C., Ring, D. M., Daube, S., and Von Hippel, P. H.(1990)"Macromolecular crowding": 

thermodynamic consequences for protein-protein interactions within the T4 DNA replication complex. J. 

Biol. Chem. 265, 15160–15167.

前言 

62 

第七章、二維凝膠電泳在蛋白質體研究之應用 

第七章 

二維凝膠電泳在蛋白質體研究之應用 

Application of Two Dimensional Gel Electrophoresis 

in Proteomic Research 

中央研究院生物化學研究所 1 

中央研究院蛋白質體研究核心設施 2 

吳啟裕 1 ,楊振欽 2 ,施正文 2 ,徐維澤 2 

二維凝膠電泳分析技術早在 1970 年代就被發明並且有效應用於純化與分離複雜蛋白質 

混和物,但由於後續搭配的蛋白質分析鑑定技術(例如:N-端胺基酸定序或抗體西方點墨法) 

受到相當程度限制(例如:定序效能與靈敏度或抗體種類數量與專一性),再加上此技術具有 

高度操作的技術複雜度與再現性問題,造成此技術雖具有效分離複雜蛋白質的特殊優點但仍 

不被普遍利用。1900 年代後基因大量定序時代的開始,許多物種的基因序列已完成解析並建 

立成為有效搜尋的資料庫,此基因序列資料庫徹底改變了先前蛋白質分析鑑定的策略與效 

能,目前蛋白質分析鑑定主要流程為:蛋白質分離純化、酵素水解成特定片段胜肽、質譜儀 

質量測定與定序、及基因序列資料庫搜尋比對等,因而促成表現性蛋白質體學(Expression 

Proteomics)的興起。在所有蛋白質分離方法中,二維凝膠電泳分析技術是目前能夠同時分離 

上千種蛋白質的唯一方法,並且因其二維蛋白質分佈結果數據圖具有定性與定量雙重特點, 

非常適用於蛋白質二維圖譜資料庫建立與比對分析,促成二維凝膠電泳分析在後基因時代─ 

蛋白質體學領域受到重新的重視與普遍應用。本章節內容包含以下幾個二維凝膠電泳在蛋白 

質體學應用的相關課題:二維凝膠電泳樣品製備、二維凝膠電泳分離技術、蛋白質染色定量、 

蛋白質圖譜影像截取與比對分析、二維凝膠電泳分析的限制等,使讀者能清楚熟悉二維凝膠 

電泳如何有效應用於蛋白質體學相關研究 (1,2) 。 

內容 

壹、二維凝膠電泳樣品製備 

二維凝膠電泳分析結果成敗絕大部分取決於分析前樣品品質的好壞,蛋白質樣品以外雜 

質如何有效移除避免干擾將是成敗的關鍵,但在移除雜質的過程中又必須審慎考量蛋白質樣 

品是否會在此移除雜質過程也被移除而造成未來分析比對上的假性差異。為達到有效成功的 

樣品製備,本單元分成樣品製備原則、樣品如何有效溶解、常用移除雜質的方法及如何避免 

蛋白質樣品被水解等小主題來說明。 

一、樣品製備原則 

(一) 由於蛋白質樣品中各蛋白質間的相對含量(濃度)差異通常甚大,而二維凝膠電泳分析

63 


僅較能呈現含量較多的蛋白質物種,因此如何針對研究標的蛋白質以適當的樣品前區分 

方法來濃縮並同時移除其他含量多蛋白質的干擾或以前區分來降低分析樣品的複雜 

度,以達到相對微量蛋白質能有效呈現於二維凝膠電泳圖譜中。 

(二) 需注意二維凝膠電泳分析過程中(特別是 IEF)蛋白質樣品的溶解情況,特別是尋求針 

對某些大分子量或疏水性蛋白質提高其溶解度的最佳溶劑如何選擇。 

(三) 製備或前處理樣品過程需特別注意如何有效避免樣品被部分水解。可考慮在低溫的條件 

下快速製備、利用蛋白質水解酵素抑制劑或變性試劑來前處理樣品。 

(四) 製備過程中所使用之試劑藥品要避免有任何改變蛋白質的原有性質(例如:電荷、分子 

量)的可能,例如較高濃度 SDS 由於其附著於蛋白質後會影響蛋白質的原有等電位點, 

故它並不適合被大量應用於 IEF 分離過程的蛋白質溶解試劑。 

(五) 其他非蛋白質雜質會干擾分離過程或染色成像,因此必需以前處理來有效降低這些雜 

質,但在除去雜質等處理步驟須注意蛋白質樣品的完整性,因前處理可能同時損失部份 

蛋白質之造成許多額外假性誤差,所以進行樣品前處理以降低雜質時須仔細考量前處理 

策略以達到在提高分析樣品品質與完整性間能同時兼顧。 

(六) 由於二維凝膠電泳易受雜質干擾而分析結果不佳,因此樣品製備時要使用較高品質的藥 

品,並且最好是需是新鮮配置或分裝冰凍保存,以提高分析結果品質。 

二、樣品如何有效溶解 

為能得到正確且再現性高的二維凝膠電泳蛋白質圖譜,分析樣品需在各個分析過程能確 

保有效保持溶解於溶液當中(特別是在 IEF 分析過程),因此如何有效溶解樣品是二維凝膠電 

泳非常重要的議題。為達有效溶解樣品之目的,於第一維 IEF 分離標準溶液中通常含有:中 

性 chaotrope、中性或兩性(zwitterionic)界面活性劑(detergent)、雙硫鍵還原劑及 ampholytes 

與緩衝液,分別說明於下: 

(一) 中性 Chaotropes 

為使蛋白質於 IEF 分離時能完全去摺疊(unfold),對一般性質蛋白質在傳統上 IEF 分離 

是單以(8~9M)urea 為主要 chaotropes 試劑;而對疏水性或大分子蛋白質進行 IEF 分離時則 

是以(7M)urea 及(2M)thiourea 混合試劑較適用,但最佳 chaotropes 濃度則隨樣品而有所 

差異。不過須注意的是 thiourea 及其不純物會干擾 IEF 中 pH 3~5 區域的分離品質。另外, 

某些樣品 (例如 TCA 沉澱樣品)溶解過程可能相當緩慢,必須確認樣品完全有效溶解於溶 

劑中。另外,須避免含有 urea 樣品溶液超過 30℃,大於此溫度下 urea 容易變質產生 isocyanate 

而與蛋白質反應修飾(carbamylation),而造成蛋白質電荷性質上的改變。 

(二) 中性或兩性界面活性劑 

界面活性劑能有效溶解蛋白質故常添加於 IEF 樣品溶液中,但由於在 IEF 分離時施以高 

電壓(例如:8000V),因此所選擇使用的界面活性劑需要符合不帶電性或淨電荷為零等條件。

64 


在早期是以 triton X-100 或 Nonidet P-40 為主要常用的界面活性劑,但最近以在 IPG 

(immobilized pH gradient)系統下則通常是以(2~4%)CHAPS 為界面活性劑;此外亦有許 

多其他類試劑被開發應用,例如:SBS-10。此外,雖然以 SDS 是萃取蛋白質很好的溶解試 

劑,但由於 SDS 帶有負電荷因而在 IEF 分離過程中會干擾蛋白質原有電荷,若一定要用到 SDS 

為有效溶劑時,必須確認在跑 IEF 系統前先降低 SDS 濃度於 0.25%(w/v)以下,並且確認 

溶劑中其他界面活性劑的濃度需大於 8 倍以上的 SDS 濃度。 

(三) 雙硫鍵(disulfite bond)還原劑 

為使具有雙硫鍵蛋白質能有效去摺疊時需要以適當的還原劑來打斷其雙硫鍵。早期蛋白 

質化學方法是以 2-mercaptoethanol 來還原雙硫鍵,但目前大多是以 dithiothreitol(DTT)及 

dithioerythritol(DTE)來取代,因為其具有較高純度及可在低濃度下即具有還原力等特性, 

一般使用濃度為 20mM~100mM。最近 tributylphosphine(TBP)被有效應用於提高疏水性蛋 

白質溶解度,但須注意由於 TBP 的部份水相不溶性與操作不方便性等缺點,目前使用上並不 

如 DTT 與 DTE 普遍。 

(四) Ampholytes 與緩衝液 

利用 ampholytes 此類試劑不但能提高樣品溶液的 pH 緩衝容量,並且能有效降低蛋白質 

間的電荷交互作用而產生的聚集作用,在一般樣品製備時, ampholytes 濃度可達 2%(v/v)。 

在緩衝液濃度方面,以 Tris-HCl 為例其使用濃度可達 40mM,但仍需注意是否會因濃度太高 

(帶電離子太高)而影響到 IEF 的分離結果。 

三、常用移除雜質的方法 

在進行表現性蛋白質體學研究樣品製備時經常有大量非蛋白質雜質的干擾,包括有機/無 

機分子、核酸、脂質及其他雜質等會嚴重影響整體二維凝膠電泳的分離效果,因此務必需要 

利用適當移除雜質略與步驟將雜質有效去除,分別說明於下: 

(一) 移除有機/無機分子 

具電荷之有機/無機分子會增加 IEF 分離時的導電度,因而造成高導電度而無法有效加上 

高電壓而使 IEF 系統無法有效進行蛋白質聚焦分離。目前最常用來去除此類雜質的方法是 

TCA/acetone 沉澱法及有機溶劑沉澱法;雖然透析法及分子篩層析法則經常在傳統蛋白質分離 

被用來進行去鹽的方法,但目前並不普遍應用在二維凝膠電泳的樣品製備上。另外如何有效 

移除樣品外過多含高鹽溶液亦是值得注意的步驟,例如在撙備培養細胞樣品時,常用磷酸鹽 

溶液(PBS)來重複清洗細胞以避免培養基的污染,若磷酸鹽洗液未能完全移除時會因其磷 

酸鹽存在過多而干擾後續 IEF 分離效果。 

(二) 核酸 

若分析樣品(尤其是培養細胞樣品)含有相當多量核酸(DNA/RNA)不僅會造成在 IEF 

系統中產生聚焦不良的現象外,亦會造成樣品的黏稠度提高而無法有效進樣於分離系統中。

65 


雖然大分子量核酸能藉由高速離心除去,但亦可能會同時除去掉許多大分子量蛋白質及與核 

酸結合之蛋白質而影響整體表現性蛋白質體的結果。一般可利用在未加 chaotrpes(例如 6M 

urea)前以核酸溶解酶來降解成小分子核苷酸後再移除以減緩此問題,但須注意的是核酸溶 

解酶本身亦屬於蛋白質會有造成對蛋白質樣品相當程度污染的可能。 

(三) 脂質 

脂質污染物能與蛋白質樣品結合而造成整體蛋白質溶解度的降低而無法有效呈現於二維 

凝膠電泳結果圖中。此外脂質亦會與界面活性劑形成複合物而降低界面活性劑溶解蛋白質樣 

品的能力,可利用有機溶劑沉澱或加入過量界面活性劑來解決脂質存在所造成的問題。 

(四) 其他雜質 

樣品中其他雜質則必須根據雜質的特性設計適當策略來進行移除以減低干擾,例如植物 

樣品中常含有 phenolic 化合物,其特殊處理的方法為加入還原劑(如 DTE 或 DTT)或有機 

溶劑沉澱法,以避免或降低因其氧化而修飾到蛋白質殘基。 

四、如何避免蛋白質樣品被水解 

由於大部份生物樣品內都含有許多蛋白水解酶,當樣品前處理過程中若無適當抑制或去 

活蛋白水解酶的活性時,許多蛋白質可能因受到蛋白水解酶酵解而破壞,因此需要加以適當 

的方法抑制或去活各種蛋白水解酶。常用的方法如下: 

(一) 因第一維 IEF 溶液需含有高濃度的 chaotropes(例如 8M Urea),不僅達到有效溶解蛋白 

質樣品的功能並且能達到變性去活蛋白水解酵素的活性,因為在高濃度的 chaotropes 環 

境下絕大部分酵素活性都將因變性而失去其水解活性,而達到樣品避免被水解的目的, 

此方法是最簡單且常用的方法。 

(二) 利用蛋白水解酶抑制劑來達到避免蛋白質樣品被水解而破壞樣品原來的本性,但值得注 

意的是部份抑制劑(例如 PMSF)可能亦會修飾上蛋白質本身樣品。一般常用的蛋白水 

解酵素抑制劑如下: 

1. PMSF 和 AEBSF:針對 serine 及 cysteine 類型水解酵素活化中心進行修飾反應而達到抑制 

其酵素活性的效果。由於還原劑 DTE 或 DTT 會干擾 PMSF 或 AEBSF 修飾反應,故必需注 

意樣品在加入還原劑前,先加入 PMSF 等試劑。 

2. EDTA 或 EGTA:利用其有效抓住金屬離子的特性,而能抑制需要金屬離子輔助的蛋白水 

解酵素,但濃度不要超過 1mM 否則會影響後續 IEF 分離。 

3. 以胜肽水解酵素抑制劑(protease peptide inhibitor)抑制水解酵素活性。 

貳、二維凝膠電泳分離技術 

一、第一維:以固定化 pH 梯度(IPG)進行等電點聚焦(IEF) 

(一) 原理

66 


所謂等電點(pI,isoelectric point)是指蛋白質於某特定 pH 值下該蛋白質的總淨電荷為 

零時,稱此時的 pH 值為此蛋白質的等電點。由於蛋白質是由 20 種不同胺基酸所組成,所以 

蛋白質之化學特性具有類似胺基酸的帶電特性;即在不同 pH 的環境下會分別可能帶正電荷、 

負電荷或中性不帶電,當環境之 pH 小於 pI 時,蛋白質會帶正電荷;在 pH 值大於 pI 值時, 

蛋白質將會帶負電荷。IEF 分離即是利用蛋白質間 pI 差異作為分離的依據。 

(二) 固定化 pH 梯度(IPG, Immobilized pH gradient)膠條 

IEF 技術早期方法是利用 carrier ampholytes 為介質加上高電壓後來造成 pH 梯度,但此法 

受到 carrier ampholytes 於高電壓下會隨時間改變而產生偏移現象因而造成所形成的 pH 梯度 

不穩定,使的早期 IEF 技術再現性上出現問題,加上其所能分析樣品的容量受限及利用以 

carrier ampholytes 的 pH 梯度膠條容易斷裂不易操作等缺點,因而有 Immobilized pH gradient 

(IPG)的發明,IPG 具有改善 carrier ampholytes 所造成的漂移問題、良好的再現性、較多蛋 

白質分離容量及對樣品含鹽濃度容忍性加大等改善後的優點,因而 IPG 逐漸取代 carrier 

ampholytes 而成為目前 IEF 分離的主流。 

(三) IEF 樣品進樣方式:主要分為 cup 進樣及 in-gel 進樣兩種方式。 

1. Cup 進樣:方法是將未覆水 IPG 膠片先以 IEF 溶液進行水合膨脹後,再將樣品置於 IPG 

膠上樣品進樣 cup 中,樣品以低電壓通電方式自樣品 cup 中以固定接觸點位置進 IPG 膠片 

中,再進行高電壓 IEF 分離。此方法較適用於分離小 pH 範圍 (例如 narrow range IPG)或 

鹼性區域蛋白質。但此方法可能出現許多缺點,包括進樣時高濃度樣品易產生沉澱及低移 

動度等問題,蛋白質可能沉澱於樣品 cup 與 IPG 間進樣接觸點而產生定量上的問題。另外 

分別由電極兩端進樣個別嘗試進樣並不一定就能找到適合條件而得到好的結果。 

2. In-gel 進樣:此方法有主要可分為被動(passive)及主動(active)進樣兩種。此進樣方式 

的優點是進樣到 IEF 分離程序一系列連續進行而減少許多間斷操作手續及樣品進樣時較無 

cup 進樣出現的沉澱問題而較適合大量進樣。而其缺點是 IPG 鹼性端(如 pH 6-11)樣品可 

能損失嚴重及在長時間覆水進樣過程(>12 小時)可能被蛋白水解酶水解的可能。 

(1) 被動進樣:主要是將樣品與 IPG 膠片一起同時水合膨脹,在不通電的條件下使樣品隨 IEF 

溶液覆水而滲入 IPG 膠條 12 小時以上後,再給予高電壓進行 IEF 聚焦分離。 

(2) 主動進樣:與被動進樣方法相類似,但最大不同點在於樣品隨 IEF 溶液覆水滲入 IPG 膠 

條時便開始給予低電壓(30-50V),12 小時以上後再給予高電壓進行 IEF 聚焦分離,此 

方法具有能部份去鹽(desalt)及增加高分子量蛋白質進樣的特別效果,是目前最普遍使 

用 IEF 進樣的方法。 

(四) IEF 聚焦分離條件 

IEF 聚焦分離程序可分為三階段:進樣電壓、開跑電壓及聚焦電壓,聚焦條件單位通常 

是以電壓-時間(Vh,Voltage-hour)計算。進樣電壓及開跑電壓條件通常不同樣品可以固定條 

件不變,但聚焦電壓則必須隨分析樣品的種類、組成複雜度、含量多寡及 IPG 膠條長短與範

67 


圍等性質而作對應調整,例如以 18cm IPG 膠條(pH 3-10)分離大腸桿菌樣品 (0.25mg)時 

通常僅需要 35,000Vh 即可聚焦;而同樣以 18cm IPG 膠條(pH 3-10)分離動物細胞樣品 

(0.25mg)時則須增加到 60,000Vh 才可具焦完成。 

二、第二維:以 SDS-PAGE 根據蛋白質分子量分離 

(一) 原理 

SDS-PAGE 是利用 SDS 分子均勻分佈結合於蛋白質,再配合還原劑(DTT or DTE) 將 

雙硫鍵打開,最後徹底將蛋白質的二級與三級構形完全破壞,使蛋白質維持在一級結構的構 

形狀況下單位蛋白質質量攜帶有同等量 SDS 分子,使得雖由各種不同胺基酸所組成的蛋白 

質其單位質量下卻能帶有同等負電量等特性(SDS/ protein: 1.4/1(w/w)),最終 SDS-蛋白 

質複合物在電場作用下於 PAGE 中純粹以蛋白質分子量大小為移動快慢的依據,形成大分子 

移動較慢;小分子移動較快而到達不同分子量蛋白質分離的效果。經由調整 PAGE 凝膠中丙 

烯醯胺單體(acrylamide)與構成網狀支鏈之 N,N’-methylene-bis(acrylamide)(cross linker) 

之間的濃度與比例,來控制聚合後 PAGE 凝膠孔洞大小及形狀。聚丙烯醯胺膠體的形成,是 

把單元體的丙烯醯胺一個一個串接起來,若在聚合的過程中接到一個 N,N’-methylene-bis 

( acrylamide ),則此長鏈會產生分枝,因而造成立體的網狀構造,控制丙烯醯胺及 

N,N’-methylene-bis(acrylamide)的濃度,即可調整這些網目的大小,丙烯醯胺與 N,N’methylene-bis(acrylamide)的濃度高低和膠體的平均孔徑大小成反比;通常是以%T(total 

monomer concentration)及%C(cross-linking monomer concentration)來描述孔洞的孔洞性質。 

SDS-蛋白質複合物於 PAGE 分離結果具有 log WM(分子量)正比於移動距離的線性關係, 

此關係是 SDS-PAEG 利用分子量標準品來估算未知分子量蛋白質的重要依據,但須特別注意 

的是許多蛋白質複合物(如醣蛋白質)由於單位質量結合 SDS 的量較純蛋白質少,故此分 

子移動相對較慢而不符合上述之線性關係。 

% T = 

% C = 

(acrylamide + cross-linker) (w) 

Total volumn (vol) 


Total volumn (vol) 

(cross-linker) (w) 


(二) SDS-PAGE 凝膠規格 

使用於表現性蛋白質體研究之 SDS-PAGE 凝膠具有許多與一般 SDS-PAGE 凝膠不同的性 

質,包括僅具有 separating gel 以分子量的大小來做為分離蛋白質的區域而不需要具有蛋白質 

聚焦的 stacking gel 及 PAGE 凝膠本身鑄膠時不含 SDS 以避免丙烯醯胺單體因 SDS 干擾聚合 

時不完全而產生丙烯醯胺修飾蛋白質造成後續質譜儀鑑定蛋白質上的問題與困難。Separating

68 


gel 又根據分離分子量的適合範圍而概分為二種緩衝溶液系統:Tris-Glycine 系統(適合分離 

10~150 kD 範圍)及 Tris-Tricine 系統(適合解析 10 kD 以下的多胜肽)。根據 PAGE 孔洞性 

質又可區分為均勻型(homogeneous)及梯度型(gradient)兩種。均勻型 PAGE 較適用分離 

某特定區域分子量,而梯度型 PAGE 則較能適用於分子量分布較廣範圍的樣品。而根據 PAGE 

分離時之硬體裝置設計又可區分為水平式與直立式兩種,水平式因受分離片數容量的限制, 

而直立式因具有同時分離多片的容量,因此直立式是較水平式常被用於表現型蛋白質體學上 

的分析。PAGE 的厚度以 1.0 及 1.5mm 最為常用,1.0mm 厚度凝膠具有較高靈敏度的優點, 

而 1.5mm 則具有較不易破裂容易操作的優點。根據凝膠大小來分,目前有 7x7;13x13;16x16; 

18.5x18.5 及 20x26 cm 等尺寸凝膠可供選擇,但目前以 18.5x18.5 cm 最為常用。以上有關凝 

膠規格的選擇仍需視實際樣品組成與整體研究目的需求而定。 

(三) SDS-PAGE 凝膠操作流程: 

1. 準備 SDS-PAGE 凝膠:根據需要決定好凝膠數量與規格後,可自行製備凝膠或直接 

購買已預鑄的凝膠,預鑄凝膠具有較高再現性及省時省力等優點,但缺點是成本價格 

相對較高及僅提供一般常用規格。 

2. 將跑好 IEF 的 IPG 膠條先於 SDS 平衡溶液中進行雙硫鍵還原反應(約 15 分鐘),再於 SDS 

平衡溶液中進行 alkyltion 反應(約 15 分鐘),一般是以 DTT 或 DTE 進行還原反應而以 IAA 

(iodoacetamide)進行 alkyltion 反應,此時已聚焦好蛋白質必須吸附足夠量的 SDS 以確保 

完全溶解以順利進行後續 SDS-PAGE 分離。 

3. 將完成 SDS 平衡的 IPG 膠條置於 SDS-PAGE 凝膠頂端上,再以含有 0.5% argose 的 SDS 

緩衝液完成固定 IPG 膠條,必須注意操作過程避免刮傷膠條及避免 IPG 膠條與 PAGE 介 

面存在氣泡而造成樣品損失。 

4. 將含有 IPG 膠條的-PAGE 置於跑膠儀器槽後,注入足夠量 SDS-PAGE 跑膠緩衝溶液後施 

予適當跑膠電壓,跑膠電壓視凝膠規格與分離快慢而定,可參考供應儀器使用說明建議的 

條件。 

參、蛋白質染色定量 

當 SDS-PAGE 凝膠電泳結束分離後最重要的歩驟就是將蛋白質染色定量,但與一般 

SDS-PAGE 染色不同,表現性蛋白質 SDS-PAGE 所使用的染色法除必須是考慮到染色強度與 

蛋白質濃度是否呈線性關係與靈敏度問題外,更必須考慮到染色試劑是否會造成蛋白質修飾 

而影響到後續質譜鑑定分析及染色影像截取的解析度與定量準確度等議題。 

一、染色劑選擇原則 

為能符合表現性蛋白質體的定量與準確的需要,選擇何種染色劑的考量原則是: 

(一) 染色劑量測靈敏度(sensitivity)。 

(二) 定量線性度(linearity)與線性濃度範圍(dynamic range)。

(三) 染色重現性(reproducibility)。 

(四) 質譜可相容性(compatibility)。 

(五) 影像截取解析度(resolution)與準確度(accuracy)。 

(六) 整體染色程序成本、操作方便性及所需人力與時間等。 

69 


二、常用於蛋白質體學之凝膠染色的方法比較 

一般常用之染色法大約可分成五個種類,包括:比色分析法、墨點法、放射性法、化學 

冷光偵測法及螢光染色法,而目前僅以比色分析法及螢光染色法較常被應用於二維凝膠電泳 

分析,例如:Coomassie stain、Silver stain、Copper Stain、Zinc Stain、SYPRO Orange 及 SYPRO 

Ruby 等。本章節將僅比較討論 colloidal Coomassie、Classical Silver-Stain 、mass spectrometry-compatible 

silver stain 及 Sypro Ruby stain。於表一中,目前常用的染色方式是(1)、(3) 

及(4),以上染色法各有其優缺點,例如以 Coomassie blue 與 Sypro Ruby 比較來說,利用 

Sypro Ruby 所能染色出來的蛋白質點比起 Coomassie blue 染色法來的靈敏許多(參見圖一), 

但使用 Sypro Ruby 所需的成本卻遠較 Coomassie blue 染色法要昂貴很多,包括 Sypro Ruby 試 

劑價格及需要貴重的雷射螢光掃描機來截取螢光影像,因此需根據實際需要來審慎選擇恰當 

的染色方法。 

表一、目前常用於蛋白質體學凝膠染色方法的比較 

染色法時間 Mass 再現性 

(1) Colloidal Coomassie Method Sub-µg 1~2 天 V V 

(2) Classical Silver-Staining Method ~5ng 耗人力 X X 

(3) Mass Spectrometry-Compatible 

Silver Staining 

~10ng 耗人力 V X 

(4) Fluorescent Stains ~5ng 6 hr V V

70 


Coomassie blue 染色 Sypro Ruby 染色 

圖一、Coomassie Blue 染色與 Sypro Ruby 染色之靈敏度比較 

肆、蛋白質影像截取與比對分析 

當 SDS-PAGE 凝膠電泳染色結束後,必須根據染色性質種類以適當影像截取方法來得到 

良好影像品質以利後續進行影像分析比對,影像截取時須注意影像的品質因素,包括定量的 

線性度、靈敏度與解析度,而影像品質絕對與後續影像分析比對結果是息息相關。 

一、蛋白質影像截取 

(一) 影像截取儀器分類:大體上依據影像截取硬體系統來區分可分為三大類型 

1. 可見光掃瞄系統:適用於肉眼可觀察到之染色方法(例如 silver 染色及 coomassie blue 染 

色),影像截取是利用可見光線通透數值以呈現染色強度,具有所需儀器系統較為便宜的 

優點。 

2. 高感度 CCD(Charged-coupled device)影像截取系統:以 CCD 儀器以照相曝光方式截取 

影像,可調整收集影像訊號曝光時間與光圈大小來調整截取影像強弱與品質,可適用於 

silver 染色、coomassie blue 染色、螢光染色及化學冷光染色(例如 ECL),具有中靈敏度 

與解析度、高線性濃度範圍優點。 

3. 雷色激發掃瞄系統:以適當特定波長雷射激發蛋白質螢光染劑(例如 Sypro Ruby 可以 

532nm 雷射波長),螢光染劑發出放射光能(例如 Sypro Ruby 經激發後發射波長 618nm 光 

能),經過適當波長濾鏡而藉由光子訊號放大轉換器(PMT)將螢光光子以電子訊號收集, 

適用於 silver 染色、coomassie blue 染色及螢光染色,具有高靈敏度、高解析度及高線性濃 

度範圍等優點,但有相對所需儀器較為昂貴的缺點。 

(二) 選擇影像截取方式需考量的因素:影像截取在表現性蛋白質體研究定量上具有非常重要 

的角色,唯有以正確影像截取系統來收取高品質影像圖譜才能有後續精確的影像分析結

果。掃描時需考慮的因素有: 

1. 影像解析度。 

2. 偵測靈敏度。 

3. 偵測濃度線性範圍。 

71 


二、蛋白質影像比對分析 

由於二維蛋白質定量圖譜定量資料無法僅由肉眼與影像呈現軟體來達到影像比對分析, 

而必須應用二維圖譜專用分析軟體才能達到蛋白質點偵測、定量、比對及資料運算以分析比 

對出各蛋白質點的定量數值,並建立出二維圖譜資料庫以達到在各實驗室之間的資料相互交 

流與整合。進行影像分析的一般程序如下: 

(一) 影像呈現與調整:調整影像方位,剪裁多餘部分,調整適當對比與明暗。在做這些調整 

時僅改變視覺感受並不影響其原本實際定量數值。 

(二) 蛋白質點偵測、定義及定量:此步驟是整體影像分析定量的重要關鍵點。須定義哪些是 

真正蛋白質點,而哪些又屬於雜點而必須去除不列入計算,此步驟通常是先利用分析軟 

體的自動點偵測功能後,再加以進行人工修改確認。 

(三) 蛋白質點配對:選定參考樣品圖譜,再與其他樣品具有相同座標位置的蛋白質點圖譜相 

互配對比較,此步驟通常亦是利用分析軟體自動點的配對功能後,再加以進行人工的再 

確認以排除自動配對的錯誤。 

(四) 配對編輯:利用軟體分析配對的趨勢向量分析,由配對向量分析趨勢能有效快速再確認 

檢查出配對是否正確,以確保比對結果分析的正確性。 

(五) 分子量及等電點 pI 校正:利用已知標準蛋白質點作為參考值,再利用分析軟體分子量 

及等電點 pI 定位功能,並標示出其他未知蛋白質點之預測分子量及 pI。 

(六) 合成平均值圖譜:為求實驗準確性與再現性,同一樣品至少需進行三重複以上,可利用 

分析軟體平均值圖譜功能合成出平均值圖譜,以降低人為單次實驗的可能誤差藉以提高 

實驗準確性與再現性。 

(七) 圖譜標準化:利用相同標準化參數與程序,依依將個別圖譜進行標準化(normalization) 

運算,以降低在個別樣品在進樣、染色及成像時的個別差異。 

(八) 資料分析:可利用軟體選擇性顯示、分析、搜尋與統計所要資料,並且可選擇多種格式 

輸出或列印數值。 

(九) 圖譜註解:將該蛋白質點之相關特性資訊(例如質譜鑑定數據與鑑定結果)整合於二維 

影像圖譜中而形成整合性資料庫以有效整理大量的複雜資料,並可藉此資料庫有效紀錄 

並追蹤樣品實驗分析流程。 

目前已有許多影像分析套裝軟體可以取得,例如 ImageMaster TM 2D Elite、Melanie TM 、 

PDQuest TM 、Phoretix TM 、Progenesis TM 、ProteomeWeaver TM 及 Z3 TM 等套裝應用軟體,它們

72 


大都具有以上基本分析程序的功能,但必須強調的是雖然這些軟體具有很多其他功能來增 

強分析圖譜的效果,但若是原本二維電泳分析圖譜就是不佳時,軟體是無法改善分離不佳 

的結果並且會造成軟體分析上的困難與時間浪費,必須是優先考慮重新由樣品製備開始檢 

討整體分離過程以得到良好的分離圖譜結果,再進行影像軟體分析才是可行之道。 

伍、二維凝膠電泳分析的限制 

雖然二維凝膠電泳能有效應用於表現蛋白質體學之分離流程分析,包括分析出蛋白質種 

類數量、含量、分子量、等電點、同型體(isoforms)及轉譯後修飾等、但也同時暴露許多缺 

點,例如無法有效分離某些特定性質蛋白質(如:膜蛋白、強酸性與強鹼性蛋白,大分子極 

小分子蛋白)、無法有效偵測微量蛋白質、及無法保持蛋白質生化活性、蛋白質相互作用、三 

度空間結構,細胞位置等限制,必須以其他技術方法來補足二維凝膠電泳分析的弱點,畢竟目 

前為有任何單一的分析技術如 DNA 定序在基因分析般能全面回答所有蛋白質體學上的所有 

問題,而是善用各種蛋白質分析技術特點來有效運用於回答各個層次的疑問,再統合各個層 

次得到的互補答案以拼湊出整體蛋白質體學的解答。 

結語 

二維凝膠電泳技術分離複雜蛋白質混和物的能力目前已被接受可被廣泛應用於表現性蛋 

白質體學研究,此技術配合上質譜儀分析更可進一步被有效應用於蛋白質轉譯後修飾性質與 

種類的相關研究。但由於其無法有效分離某些特定蛋白質(例如膜蛋白、強酸性與強鹼性蛋 

白及大分子與極小分子蛋白質)、其操作流程複雜且繁複不易自動化、及其目前染色靈敏度受 

限等問題,似乎造成二維凝膠電泳技術在未來要應用於表現性蛋白質體學研究上有相當大的 

限制,但由於蛋白質分離鑑定遠較基因體定序的複雜度要高上幾十倍,甚至要上百倍,在目 

前仍未有發展出其他比目前二維凝膠電泳技術更廣泛分離所有蛋白質的新技術之前提下,二 

維凝膠電泳分析仍是目前持續成為想要進入表現性蛋白質體學研究領域的入門基礎技術,特 

別是二維凝膠電泳技術在蛋白質同型體與轉譯後修飾性質與種類的特有分析能力是其他蛋白 

質分離技術目前無法替代的。 

致謝 

感謝中央研究院生物化學所王惠鈞所長與陳水田研究員在蛋白質體學研究上的指導與協 

助及基因體醫學國家型計畫經費的支持。 

參考文獻 

1. Westermeier, R., and Naven, T.(2002)Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Ana- 

lysis. Wiley-VCH Verlag-GmbH Weinheim.

73 


2. Simpson, R. J.,(2003)Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 

New York, 91-218.

前言 

第八章 

蛋白質表現系統 

Protein Expression Systems 

國立成功大學生化所 

陳品晟,張育嘉,石宗憲,吳華林 

74 

第八章、蛋白質表現系統 

在後基因體時代來臨的現今,研究蛋白質的功能已成為下一步研究的重點。蛋白質的功 

能除了與胺基酸序列有關外,蛋白質的正確折疊(folding)、立體結構與轉譯後修飾 

(posttranslational modification),如醣基化(glycosylation)、雙硫鍵形成(disulfide bond 

formation)等更是重要的因素。因此如何取得有功能的蛋白質來進行更深入的研究或應用, 

乃成為一不可或缺的重要技術。要取得有功能的標的蛋白,首先可利用基因工程的技術,將 

標的基因接至適當的載體(vector),再把基因重組過後的載體送入宿主細胞。經由篩選標誌 

(selection marker),挑選出帶有外源基因(heterologous gene)的菌株,藉由大量培養外源基 

因轉殖的細胞並引導表現而得到大量標的蛋白質。目前常用來進行蛋白質表現的系統有大腸 

桿菌、酵母菌、昆蟲細胞與哺乳動物細胞等,以下便針對各蛋白質表現系統進行介紹。 

內容 

壹、利用大腸桿菌表現蛋白質 

一、簡介 

利用大腸桿菌表現系統表現外源蛋白(heterologous proteins)是一最優先的選擇, 因為 

其表現量大,且細菌的培養較容易,花費較少。但是若蛋白質須要經過修飾才有功能的話, 

或許需要利用真核細胞表現系統才能辦到。所以在選擇使用那種一系統做蛋白質表現之前需 

要先了解標的蛋白質的特質。若蛋白質分子較小,低於 100 個胺基酸時,可以將該基因和某 

段特定蛋白質的基因連接在一起,表現出融合蛋白,有助於蛋白質的穩定及分離。有些蛋白 

表現時,在菌體內容易形成內涵體(inclusion body)。在選擇使用的系統時,蛋白質的需要量 

亦是重要的考量因素。若需要大量的蛋白質時,則要嘗試多種不同宿主(host)及載體 

(vector),並花時間找出分離純化的最佳條件。在純化的過程亦需要注意到蛋白質的穩定性 

(1) 。 

大腸桿菌表現系統(E. coli expression system)常用的載體及啟動子(promotor)可分為幾類: 

(一) 利用 isopropylthio-ß-D-galactoside(IPTG)誘發啟動子(IPTG-inducible promotor)。包括: 

1. trp-lac 啟動子: 

利用 trp promotor -35 區與 lacUV5 promotor –10 區接合組成的。受 lac repressor 的調控,但 

不受 cAMP 的影響,如 pKK223-3 及 pTrc99A (2) 。

75 


2. lac 啟動子: 

包括 pUC,pZT,pSK,pBluscript,pGEM 等質體(plasmid),其含有一段 lac Z 啟動子及 

胺基端的基因。此系統的質體中通常帶有-galactosidase 基因, -galactosidase 會水解受質 

X-gal 而產生藍色產物,因而使帶有此質體的菌落呈現出藍色;當外來基因構築入此質體之 

lac Z 啟動子之後, -galatosidase 基因便會被破壞,而使得帶有外來基因質體之菌落呈現出 

白色。利用藍色變白色的菌體群落(colony)來判斷細菌轉形(transformation)是否成功。 

培養時需要加入 cAMP 活化蛋白質(cAMP activator protein),表現蛋白時培養基不加葡萄 

醣。 

(二) 噬菌體 T7 啟動子。如 PET 質體,將一要表現的基因放在 T7 啟動子或 T7 lac(內含 lac 

operator)之後,利用 T7 RNA 聚合脢(polymerase)調節蛋白質表現。這質體含有 pBR322 

之 colE1 於複製啟始點及 ampicilin,kanamycin 的抗藥基因 (3) 。 

(三) 噬菌體 λPL 啟動子。如 pHUB, pPLc, pKC30, pAS1,pRM1 等質體。λPL 啟動子受 

到溫度敏感抑制子(temperature-sensitive repressor)cIts857 的抑制,在低溫度培養的情 

況下表現受抑制, 但在高溫度時蛋白可以表現。使用的宿主細菌須內含有 cIts 857。此 

種受溫度調控而誘發的啟動子適合用來表現對宿主細胞會產生細胞毒性的蛋白。 

在表現蛋白質的時候,經常將標的蛋白與另一蛋白接合做成融合蛋白,此融合蛋白可以 

保護表現的蛋白質不被水解,改善溶解度,將蛋白運送至特定位置,利用親合性管柱純化較 

容易等優點。常用來與標的蛋白結合的蛋白有-galactosidase、alkaline phosphatase、glutathione 

S-transferase(GST)、maltose binding proteins (MBP)、thioredoxin、disulfide bond formation 

domain 及 cellulose binding domain 等。若在融合蛋白與標的蛋白中間設計有適當的胺基酸片 

段,則可以在蛋白質經純化之後,用化學方法或酵素水解方法去掉融合蛋白質的部分。常使 

用水解酵素包括 enterokinase,Factor Xa,renin,tobacco etch virus(TEV)protease 等。 

用來破壞細菌體以得到所要蛋白的方法,可選用超音波震盪(ultrasonic),酵素水解細胞 

壁(lysozyme),剪力法(French press),反覆冷凍再解凍(freeze-thawing)等方式進行。外 

源蛋白質在大腸桿菌內合成時,常會形成蛋白質內涵體(inclusion body),其中含有相當純度 

的標的蛋白質,但該蛋白質之立體結構通常是不正確的。內涵體可以用低速離心 

(10,000-20,000xg,4℃)得到。特定蛋白質是會以內涵體方式表現出來,或以可溶方式表現 

該蛋白尚難預測。但可以利用在低溫環境下表現蛋白,或和 GST,MBP,thioredoxin 等表現 

融合蛋白來減少形成內涵體的可能性。利用 thioredoxin 或含有將蛋白送出細胞膜的訊號序列 

(signal peptide),細菌可以將蛋白質送到胞膜與胞外壁中間,使蛋白質呈現可溶解的狀態。 

若有蛋白質表現於內涵體中,可以嘗試將蛋白質溶解,然後重新再折疊(refolding),如此可 

能得到有具有活性的蛋白。要將內涵體形式的蛋白質溶解,通常可使用 6-8M 尿素(urea), 

5-8M guanidine hydrochloride,及調整溶液 pH 值,而後再進行再折疊的步驟 (4) 。 

若要得到較大量的蛋白質表現在菌體中,需要注意到蛋白質的起始碼(initiation codon

76 


ATG)的相對位置。其必須在 SD 鹼基序列(Shine-Dalgarno sequence,轉譯時之核醣體結合 

位置)之下游 5~7 鹼基的位置, 蛋白表現較佳。且要注意在這 SD 鹼基序列上下游位置不要 

形成二級結構,才不會影響蛋白質表現量。若基因含有細菌不常使用的代碼(codon)時,亦 

要考濾將 codon 替換,若序列中含有 AGA,AGG 在基因前端位置則容易和 Shine- Dalgarno 

形成二級結構,影響蛋白的表現量。在 DNA 5’端中若 G+C 總量超過 40%,亦可能影響蛋 

白表現。在蛋白質表現時所使用的培養基的組成亦可能對蛋白表現量亦有很大的影響,通常 

可先用 LB 培養基,然後再嘗試改進。 

二、大腸桿菌表現蛋白質方法簡介 

(一) 常用於表現蛋白質的質體依其啟動子的不同可分為三種,分述如下: 

第一個系統是利用 IPTG 誘發啟動子(IPTG-inducible promoter)表現蛋白: 

1. 基因轉殖: 可使用的質體有許多種,以 pGEM-3Z 為例,在其 lacZ 胜肽之前有 lac operon, 

其可置入多重基因,前後有 T7 及 SP6 轉錄(transcription)啟始及一抗 ampicillin 基因。通 

常使用的大腸菌含有 lacI q 的基因,當未加入 IPTG 時,其可表現 lac 抑制子(lac repressor) 

而抑制標的蛋白的表現。可以將標的基因放入質體之後,做轉形(transformation),再將菌 

體塗抹在含 50 g/ml ampicillin 的 LB 培養基上,培養 37℃過夜。經過小量培養,利用雜交 

反應或限制脢,及 DNA 定序確認所選殖的轉殖菌是正確的。 

2. 細菌生長的狀態會影響蛋白質的表現,其受 IPTG 誘發生成蛋白質之前及之後的細菌生長 

情況皆需要控制。最先使用小量培養建立培養之最佳條件。取 1 ml 含有 ampicillin 的 LB 培 

養液,加入菌落,在 20~37℃培養過夜。由培養菌液中取 50μl,加入到 5 ml LB 培養液中 

約兩小時, 直到細胞到達 log phase 生長曲線之一半高度(A550 = 0.5-1.0)。取一小部分出 

來作對照,另一部分加入約 1mM 的 IPTG 再培養,經不同時段分別取出菌液,離心,沈殿 

後,菌體加入 100μl 的 SDS-gel buffer,加熱 100℃處理,離心之後作 SDS-PAGE 電泳分析, 

確定蛋白的表現。當培養條件己清楚,便可以做較大量培養。取含 ampicillin 之 LB 培養液 

50ml 置於 250~500ml 之培養瓶,過夜培養。取培養菌液 5~50 ml 加入到 500ml 之培養液 

中,置於 2 公升錐瓶中搖動培養到 OD550 約 0.5-1.0,再加入 IPTG 誘發,培養最佳表現時 

間後,取出菌體進行蛋白質純化。 

第二個系統是利用 T7 噬菌體啟動子之表現系統 

在介紹 T7 噬菌體啟動子之表現系統之前,必須先了解 pET(plasmid for expression by T7 

polymerase)與宿主細胞的關係。 pET 上具有 T7 噬菌體啟動子,而我們欲表現的基因則建 

構於此啟動子之後。pET 質體可由市面購得,在此簡示 Novagen 公司所提供之圖示(如圖一)。 

pET 的宿主細胞(E. coli)有很多種選擇,其中最常用的菌株為 BL21 及 HMS174,其基因體 

上具有潛伏性的噬菌體 DE3(lysogenic bacteriophage DE3),而噬菌體 DE3 上具有表現 T7 噬 

菌體的 RNA 聚合脢的基因(T7 gene 1),它會受 lac UV5 啟動子的控制(lac UV5 啟動子可

77 


被 IPTG 所誘導)。因此,當 IPTG 加入培養液中,就可活化 lac UV5 啟動子並誘導 T7 RNA 

聚合脢的生成,進而轉錄及轉譯 pET 質體上的標的基因。(如圖二) 

圖一、pET 質體 

(原圖出自 Novagen 公司網頁:http://www.novagen.com/SharedImages/TechnicalLiterature/7_TB026.pdf)

78 


圖二、BL21(DE3)pLysS 

(A)當 E. coli RNA 聚合脢(E.coli RNA polymerase)與 Lac 啟動子(promoter)結合時, T7gene 

1被表現,產生 T7 RNA 聚合酶(T7 RNA polymerase); 若 Lac 抑制子(Lac repressor)(E. 

coli 基因體上的 Lac I gene 所表現))與 Lac O 結合時,T7 gene 1 則不表現。 

(B) T7 RNA 聚合酶與 pET 上的 T7 啟動子(T7 promoter) 結合後,標的基因 (target gene) 

則會被表現 ; 同樣地,若 Lac 抑制子與 Lac O 結合時,T7 gene 1 也不會表現。 

(C)若宿主細胞內含有另外一個質體(pLys S 或 pLys E)時,這個質體上的 T7 lysozyme 基因 

會產生 T7 lysozyme,而抑制 T7 RNA 聚合脢的作用。因此,pET 上的 T7 啟動子不被啟 

動, 欲表現的蛋白也不會被表現。

79 


利用 T7 噬菌體的啟動子(bacteriophage T7 promoter)表現蛋白有以下幾點優點 : 

1. T7 噬菌體的 RNA 聚合脢(bacteriophage T7 RNA polymerase)不會被 rifampicin 所抑制, 

而大腸桿菌 RNA 聚合脢則會被 rifampicin 所抑制,因此可藉由 rifampicin 來區分宿主細 

胞表現的蛋白。 

2. 噬菌體表現的酵素只辨認 T7 噬菌體的啟動子,而 T7 噬菌體的啟動子不會出現在大腸桿 

菌的基因體中。 

3. T7 噬菌體的 RNA 聚合脢可在環狀的質體上轉錄許多次,因此可能會表現一些大腸桿菌 

RNA 聚合脢所不能有效轉錄的基因。 

用 pET 這種表現蛋白的系統常遇到的問題是 : 當標的蛋白對宿主細胞有毒性,雖然未 

加入誘導劑 (如 IPTG),仍可能有一些 lac UV5 啟動子被活化而產生少量之 T7 RNA 聚合脢。 

這種背景活性所產生的毒性蛋白已足夠危害 BL21(DE3)或 HMS174(DE3)菌體所建立的 

平衡狀態。因此,為了克服此困難,可在宿主細胞內再輸入一個可溶性的質體, pLysS 或 

pLysE。這種質體會產生 T7 聚合脢的天然抑制物,可減少 T7 RNA 聚合脢的基礎活性,但不 

阻礙誘導產生大量蛋白。另外,它會分解大腸桿菌宿主細胞細胞壁上的 peptidoglycan,使菌 

體細胞在極溫和的條件下即可將菌體裂解。 

第三個系統是利用鹼性去磷酸脢啟動子(alkaline phosphatase promotor,phoA)和訊號序 

列(signal sequence)來表現分泌外來蛋白質 

有些蛋白質容易被細胞內的蛋白脢分解,也有些蛋白質在細胞質內是不具生物活性的, 

必須被輸送到細胞外進行正確的摺疊(fold),才具有生物活性。因此表現這些外來蛋白質並 

輸送到細胞外可能會是比較好的方式。然而要將標的蛋白質表現並輸送至細胞外可能會遇到 

兩個問題:(1)蛋白質產量太低;(2)訊號序列(signal peptide)並沒有被切掉,或者是切在 

不正確的位置。這些問題可藉由在訊號序列切割位置(signal sequence cleavage site)和標的 

蛋白質之間,插入 spacer amino acids,或是利用宿主細胞去表現一種或更多的訊號序列蛋白 

分解脢(signal peptidase)。 

本方法則是藉由 DNA 重組將 phoA 訊號序列融合到標的蛋白質之前。PhoA 基因會表現 

出鹼性去磷酸脢(alkaline phosphatase),當過多的磷存在時,會抑制 phoA 基因的表現;而 

當細菌的生長進入了休止期(lag phase)時,則磷存在 medium 中的量下降,此時 pho operon 

則會被誘導而活化,進而大量表現蛋白,並藉由訊號序列傳輸到細胞內膜和外膜之間時,再 

由細菌分泌的 signal peptidase 將此訊號序列切掉。此系統有兩個優點:(1)標的蛋白質是逐 

漸增加,可避免像其他調節啟動子系統所造成的急性誘導(acute induction)而形成的內涵體 

(inclusion bodies);(2)逐漸增加標的蛋白質較不易對宿主細胞(host cell)造成毒性。 

(二) 內涵體型形式(inclusion bodies)蛋白之純化 

當我們在利用基因轉殖技術大量生產蛋白質時,常常因產物來不及摺疊,或因缺乏足夠 

的摺疊機制,以致其在宿主細胞內形成不具活性且不易溶解的內涵體(inclusion bodies)。目

80 


前雖然對於大腸桿菌中,形成內涵體形式蛋白質的機制尚不清楚,但是經由這個特性,我們 

可以得到大量且純度高的蛋白質,然後利用溶解及再摺疊(refold)的過程使蛋白質恢復活性。 

以內涵體的形式來表現的蛋白質,除了因為在大腸桿菌中過量表現外源基因的蛋白外, 

我們也可經由基因重組的方式來將一些小分子、易在環境中變性及斷裂、或是對細胞具有毒 

性的蛋白質,使它們形成內涵體以方便純化或是避免對細胞造成毒性。當然,在純化內涵體 

形式的蛋白質時,其溶解及再摺疊的條件跟蛋白質本身的大小及結構、純化後蛋白質的純度、 

所用的溶劑的 pH 及離子強度、再摺疊的速率都有關係,需要找到最佳的條件才能使得此蛋 

白質有高純度並具備活性。 

首先我們先製備細胞萃取液,以 5000xg 離心菌液後再以 lysozyme 及 PMSF 蛋白脢抑制 

劑跟菌體作用 20 分鐘,再加入 deoxycholic acid;第二步要純化出內涵體。經由一次高速離心 

後,加入含 EDTA 或 Triton X-100 的細胞溶解緩衝液去清洗沉澱物,此步驟可以移去大部分 

可溶解的大腸桿菌蛋白質;最後,內涵體則需經過溶解及再摺疊的程序,才能得到易溶解且 

具有活性的蛋白。溶解的方法可以用 6M guanidine HCl、6-8M urea、detergent、extreme pH 

buffers 等溶劑,再利用透析(dialysis)或是膠體過濾(gel filtration)等方法去除這些溶劑, 

藉此達成再摺疊的目的。 

(三) 利用親和性樹脂(Affinity resin)純化重組蛋白 

蛋白質純化過程,除了傳統上使用的分子篩(size exclusion)及離子交換樹脂純化蛋白 

之外,可考慮使用親和管柱,較為方便。親和性樹脂管柱層析法對於重組蛋白的純化是非常 

方便且快速的方法,不同種類特性的重組蛋白可分別與其相對應的親和性樹脂進行蛋白純化 

的工作,以下介紹三種常用的親和性樹脂純化方法: 

1. 利用 GST 親和性樹脂純化重組蛋白: 

GST column是一種常見的親和性液相層分析法。其原理是利用 glutathione S-transfera 

(GST;麩胱咁汰硫轉換脢)與其受質 glutathione(麩胱咁汰)之間所具有的高親合力來設 

計的純化策略。 

首先,利用分子生物學的技術,用聚合脢連鎖反應的方式放大我們所需要的基因,再利 

用限制脢將所需要的基因接至含有 GST 的載體上(pGEX),再送入宿主細胞(例如 BL21 或 

DH3 等大腸桿菌)進行蛋白質表現。然後,利用超音波震盪法或剪力法將宿主細胞打破取得 

含有 GST 的重組蛋白。 

親和性管柱則是將 glutathione 固定在膠體上,利用 GST 對 glutathione 有高度的親合性的 

特性,使含 GST 的重組蛋白與 glutathione 膠體緊密結合。洗去其他雜蛋白之後,再用含有還 

原態 glutathione 的緩衝溶液置換出留在膠體上的 GST 重組蛋白,藉以純化出 GST 融合重組 

蛋白 (5,6) 。 

2. 藉由澱粉醣樹脂的親和性層析法,純化麥芽糖結合的融合蛋白質 

麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein, MBP)是一個由大腸桿菌之 malE gene 表現的

81 


核外漿蛋白,其為細菌中麥芽糖運送蛋白質系統的組成之一。另外,因 MBP 對麥芽糖及麥芽 

糊精具有親和性,所以可藉由與糖交叉結合的瓊脂糖基質(agarose matrix)來純化此類蛋白 

質。 

pMAL-c2 或 pMAL-p2 載體含有 IPTG 誘導的 tac 啟動子(promoter),其前後與多選殖區 

(extensive polycloning site)及一終結子相鄰,而且橫跨-半乳糖苷脢的氨基端,所以可藉由 

細菌菌落的藍/白篩選,來判斷是否有選殖進入這些載體。malE 序列與多選擇區之間用十個 

天門冬胺酸分開,有利於 Factor X 蛋白脢將融合蛋白切下,除此之外,還可促進 MBP 融合蛋 

白質與親和性樹脂結合。pMAL-c2 不含 MBP 的訊號序列(signal sequence),而 pMAL-p2 含 

有此序列,因此可引導 MBP 融合蛋白質進到核外漿腔室中,蛋白質進到這些腔室後,則可藉 

由滲透性衝擊而快速分離,如此便可減少融合蛋白與蛋白脢的接觸 (7) 。 

比起 GST 融合蛋白,MBP 融合蛋白有一個潛在的優勢,即 malE 基因源自 E. coli,因此 

malE 基因能在細菌中非常有效率地進行轉錄及轉譯等表現;相反的,不存於細菌的 GST 基 

因序列,是否能與細菌中的轉錄、轉譯等機制最有效率地配合,仍是未知。 

3. 藉由固定鎳離子(Ni 2+ )的吸附層析法,純化組織胺酸(histidine)標記的蛋白質 

含有多組織胺酸的蛋白質會與一些過渡金屬緊密地結合,例如帶有六個組織胺酸的蛋白 

質會與帶有二價鎳離子的樹脂結合。利用適當的沖洗來移除雜蛋白後,而將帶有六個組織胺 

酸的蛋白則以水溶性的競爭螯和劑沖提下來。因為金屬螯和層析法不但高效率,高結合容積 

(2.5 ml 的管柱即可純化 20 mg 的重組蛋白)、高濃縮效力以及快速,所以被普遍地應用,常 

被當作純化的第一個步驟,且鎳離子樹脂可輕易的再生而可重複使用很多次。 

要進行金屬螯和層析法的第一個步驟,即將六個組織胺酸的序列接到蛋白質上,而此序 

列通常位在氨基端或羧基端。另外,在組織胺酸序列及蛋白質之間也可嵌入一兩個甘胺酸或 

特定的蛋白脢切割點,有利於在純化後,可將六個組織胺酸的序列移除,也有助於將被吸附 

的蛋白質從親和性基質上切割下來。 

任何螯合劑都會干擾金屬螯和層析法,因此用來層析的緩衝劑必須不含有 EDTA 和 

EGTA,而用來沖提標的蛋白的螯和劑則可為 imidazole 或 EDTA,其中 imidazole 是較具選擇 

性的洗提液,無論什麼時候皆可用。利用 10-150 mM imidazole 的線性梯度來確立最低沖提效 

力的濃度,有效沖提狀態通常是在 pH 7-8 的 50-100 mM imidazole,雖然 EDTA 較有效,但是 

它會將鎳離子一起從 NTA-瓊脂糖(nitrilotriacetate-agarose)上抓下來,因此在許多應用上, 

都需先利用透析或第二個層析步驟將鎳離子移除 (8) 。 

貳、酵母菌蛋白表現系統(Yeast expression system) 

許多有醫藥價值的蛋白質是很難從細胞或是組織中分離出來的,但由於現代科技的進 

步,使得我們可以利用基因重組技術(或稱之為遺傳工程技術),也就是將特定基因設法轉 

殖嵌入宿主的 DNA 中,藉著宿主細胞來合成這些相關的蛋白質,而這個過程則稱為外源基

82 


因的表現。而目前我們已經可以利用哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌或酵母菌來大量產生各 

種蛋白質。而屬於真核生物的酵母菌,則是一個很好的宿主細胞來表現外源蛋白質,其所具 

備的優點如下: 

一、酵母菌是單細胞生物,生長速率較快,在短時間內便可大量培養及合成蛋白質。 

二、酵母菌是真核生物,具有修飾真核生物的基因及其蛋白質的功能,包括醣基化、雙 

硫鍵的形成等等。 

三、酵母菌所用的原料較簡單及廉價,因此在培養方面較容易。 

四、酵母菌基因數量不大,大概只有人類的三十分之一,很容易進行基因轉殖的工作。 

五、同時由於酵母菌被研究的較徹底,因此有許多酵母菌的菌種及質體已被商業化同時被廣 

泛的使用。 

至於利用細菌表現系統雖然有產量高及時間短的優點但是卻有著以下的缺點: 

(1) 有些蛋白質在細胞內會形成內涵體(inclusion body)。由於有內涵體形成,故在純化時必 

須先將內涵體溶解,待純化完後,最後還需將蛋白質再折疊(refolding)成原來的三級結 

構。 

(2) 有些已經純化完的蛋白質可能會含有一些內毒素,因此大大的減低了其在醫藥方面的應用 

的可能性。 

酵母菌既為真核生物,因此以其為宿主而表現的哺乳類動物細胞蛋白質,其蛋白質的修 

飾過程(modifications)大致和哺乳類細胞相同。然而,在酵母菌表現系統上還是有一些缺點 

的:例如有一些在高等真核生物內的蛋白質,其醣基化的位置及程度對於其生物活性是相當 

重要的。但是利用酵母菌表現系統可能沒有辦法很精確的做到這一點。雖然如此,但是酵母 

菌表現系統仍然不失為一個可以應用在各方面的蛋白質表現系統 (9) 。 

因此本章的目的就是要介紹一些酵母菌表現系統的相關資訊。如有那些酵母菌種類,包 

含已被研究最徹底的兩種酵母菌表現系統:Saccharomyces cerevisiae 及 Pichia pastoris 表現 

系統,以及有哪些不同的啟動子(promoter),應該用什麼方式去調控?有哪些酵母菌品種 

可以利用,應該如何去選擇,才能大量的去表現蛋白質?有那些方法可以將基因直接嵌入酵 

母菌的染色體上,與酵母菌的染色體同步複製?及蛋白質最後應該位在何處,是細胞質 

(cytosol)、胞器內(subcellular organelles)或是分泌至培養基(culture medium)內?及最 

後蛋白質被純化出來的數量為何差距甚大,影響的因子有哪些? 

一、表現株的構築 

(一) 表現載體 

所有的表現載體被設計為大腸桿菌/酵母菌載體(shuttle vector),包括帶有大腸桿菌中 

的複製起點(origin of replication),在兩種宿主細胞皆有功能之標誌(marker),由啟動子 

(promoter)和結束子(terminator)序列組成的表現卡匣(expression cassette),位於啟動子 

和結束子序列間的多轉殖位置(multiple cloning site, MCS),外源基因編碼序列由此插入。目

前實驗室中常用的表現載體之一,如 Invitrogen 公司的 pPICZ(如圖三): 

83 


圖三、pPICZ 質體 

(原圖出自 Invitrogen 公司網頁:http://www.invitrogen.com/content/sfs/vectors/ppiczalpha_map.pdf) 

(二) 啟動子 

表現時,外源基因序列被融合至高度表現基因的啟動子之後,如 alcohol dehydrogenase 1 

(ADH1)、phosphoglycerate kinase(PGK)、triose phosphate isomerase(TPI),這些啟動子元 

件控制持續表現(constitutive expression)或藉由培養液中的特殊成分來誘導(induction)。以 

下針對兩個不同的啟動子(PAOX 及 PGAP)的特性加以說明: 

1. PAOX: 

P. pastoris 有兩個基因 AOX1 和 AOX2 編譯醇類氧化脢(alcohol oxidase),AOX1 基因為 

細胞中醇類氧化脢活性主要提供者,AOX1 基因的表現量受轉錄程度被控制 (10) ,在甲醇生長

84 


的細胞,約 5% poly(A) + RNA 來自 AOX1,若生長的培養基中有其他的碳源,便無法偵測 

到 AOX1 訊息。AOX1 基因的調節牽涉兩個機轉,分別為抑制的機轉與誘導的機轉。雖類似於 

S. cerevisiae GAL1 基因的調節,不同的是,抑制性碳源(如培養液中的葡萄糖)缺乏並不會 

使 AOX1 被轉錄,而高程度轉錄誘導必須有甲醇存在。甲醇誘導基因表現的使用不適合食品 

產品的生產,因為甲醇具潛在性的危險,特別是需要大量發酵時,因此,不需甲醇誘導的啟 

動子對表現某些蛋白具吸引力 (11) 。 

2. PGAP: 

P. pastoris 的 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAP)基因啟動子在葡萄糖存在 

下能持續表現(constitutive expression),GAP 啟動子活化程度在甘油和甲醇生長的細胞分別 

約為葡萄糖的三分之二和三分之一。使用 GAP 啟動子的優點,在於不需甲醇來誘導,不需改 

變培養液的碳源,使菌株持續生長。然而,GAP 啟動子持續表現系統,對於用來生產對酵母 

菌有毒的蛋白並非好的選擇,因為酵母菌生長會受到影響。 

(三) 選擇標誌(Selectable markers) 

雖然傳統和分子基因技術於酵母菌中已有很好的發展,但很少選擇標誌於酵母菌的分子 

基因操作被描述,存在的標誌限制於生合成路徑基因,S. cerevisiae 或 P. pastoris 的 HIS4 基因, 

S.cerevisiae 的 ARG4 基因,和對 bleomycin 相關藥品 zeocin 有抗藥性,Strepto- alloteichus 

hindustanus 的 Sh ble 基因。此外 P. pastoris 的 ADE1(PR-amido imidazole- succinocarboxamide 

synthase)、ARG4(argininosuccinate lysate)和 URA3(orotidine 5’-phosphate decarboxylase) 

基因,這些選擇標誌已被整合入表現載體,而一系列包含 ade1、arg4、his4 和 ura3 各種組合 

的宿主菌株也被產生。 

(四) 宿主菌株 

大部分宿主菌株為營養缺陷突變株,以利包含適當選擇標誌基因載體於轉形 

(transformation)時篩選,轉形前,所有菌株生長於複方培養液,或供應適當營養的簡單培 

養液。以下針對不同特性的菌株做進一步的說明: 

1. 甲醇利用表現型酵母菌株: 

大部分的 P. pastoris 宿主菌株,以野生型生長速度生長於甲醇(Mut + ,甲醇利用正表現 

型 methanol utilization plus phenotype),然而,因為一個或兩個 AOX1 基因的刪除,根據其利 

用甲醇能力,有兩種型式的宿主菌株。AOX 突變株有時比野生型產生更多的外源蛋白,但這 

些突變株不似 Mut + 菌株大量發酵時需要大量的甲醇,KM71 的 AOX1 部分被刪除,只能依賴 

較弱的 AOX2 作甲醇代謝,於此碳源中生長較慢(Mut S ,甲醇利用慢表現型 methanol utilization 

slow phenotype),另一菌株 MC100-3 刪除兩個 AOX 基因,無法生長於甲醇中(Mut - ,甲醇利 

用負表現型 methanol utilization minus phenotype)。這些菌株,包括 Mut - 菌株,保留以 AOX1 

啟動子高度誘導表現的能力 (12) 。

85 


2. 蛋白水解脢缺乏酵母菌株: 

幾個蛋白水解脢缺乏菌株,SMD1163(his4 pep4 prb1)、SMD1165(his4 prb1)及 SMD1168 

(his4 pep4),顯示有效減少外源蛋白被水解,這在發酵培養特別被注意,因為高細胞密度和 

少比例細胞溶解合併產生相對高濃度液泡蛋白水解脢。不幸的,這些蛋白水解脢缺乏菌株不 

似野生型菌株有活力,除了較低的生存力,較低的生長速度,亦提高轉形的困難度,因此, 

蛋白水解脢突變株的使用,僅推薦於其他方法仍不能減少蛋白水解時以得到滿意的結果。 

(五) 表現載體嵌入酵母菌基因組 

表現載體嵌入酵母菌基因組以產生穩定的表現菌株,有兩種方法來完成。最簡單的方法 

是限制載體在標誌基因(如 HIS4)或啟動子基因片段(如 AOX1)單一位置,然後轉形至適 

當的營養缺陷突變株,由 DNA 末端引發同源性重組(homologous recombination),導致以高 

頻率單一交換型式嵌入這些基因座(50~80% His + 轉型株),其餘的轉形株經過基因交換,僅 

載體上的標誌基因嵌入突變株宿主,並沒有載體基因序列的基因座。另一方面,某些酵母菌 

表現載體被水解,使表現卡匣和標誌基因釋放,大約 10~20%的轉形株為基因置換的結果,其 

宿主基因遭刪除,置換成表現卡匣和標誌基因。 

(六) 產生多倍數質體菌株 

蛋白表現的最佳化通常包括多倍數質體表現菌株的分離,表現卡匣多重嵌入菌株有時可 

比單一倍數菌株產生更多的外源蛋白 (13) 。三個方法可產生多倍數質體表現菌株。第一個方法 

牽涉構築有頭尾相接多倍數表現卡匣的載體,這個方法的優點,尤其在人類醫藥上,是表現 

卡匣的精確數目已知,並可藉由 DNA 定序方式來驗證。第二個方法利用包含酵母菌 HIS4 和 

細菌 Tn903kan r 基因的表現載體,細菌 kanamycin 抗藥基因對真核生物抗生素 G418 亦有抗藥 

性,G418 抗藥程度粗略的反應載體倍數。酵母菌首先轉型為 His + 原質營養株,多倍數轉型株 

藉由重複塗至包含 G418 洋菜平板被篩選,這個方法產生富含多倍數表現載體的菌株,然而 

載體倍數的差異非常大,因此必須對大量的轉形株(50~100 個)作進一步質體倍數和表現程 

度的分析,藉由這個方法,最多攜帶 30 倍數表現卡匣的菌株被分離。第三個方法是使用含細 

菌 Sh ble 基因的載體構築多倍數質體菌株,此基因對於抗生素 zeocin 有抗藥性,相較於 G418 

篩選,包含 zeocin 標誌的表現卡匣轉型株可被直接篩選,而簡單藉由塗至高濃度 zeocin 洋菜 

平板,多倍數表現卡匣菌株可被篩出,因為 Sh ble 基因選擇標誌可用於細菌和酵母菌,這些 

表現載體可方便被使用,然而,與 G418 篩選相同,大部分的轉型菌株對高濃度 zeocin 有抗 

藥性並不包含多倍數載體,必須挑選大量轉型株再作進一步分析。 

二、分泌蛋白的轉譯後修飾(post-translational modification) 

酵母菌表現系統勝於其他細菌表現系統,主要優點在於酵母菌可執行許多關於高等真核 

生物獨特的轉譯後修飾,如訊號序列(signal sequences)的加工(processing)、摺疊(folding)、 

雙硫鍵結形成、特定型式脂質的加成,以及 O 鏈結和 N 鏈結醣基化。

86 


(一) 分泌訊號(secretion signal)的選擇 

酵母菌表現的外源蛋白可產生在細胞內或細胞外,由於酵母菌只分泌少量的內生性蛋 

白,在培養液中外源蛋白可佔總蛋白大部分比例,因此將外源蛋白導向培養液可視為純化 

(purification)的第一步。然而考量蛋白的穩定性及摺疊需要,分泌的選擇通常根據外源蛋 

白於原來的宿主中是否可正常的分泌,在實際應用上,研究人員可簡單的選擇生技公司(如 

Invitrogen ® )已建構的表現卡匣(expression cassettes),選定載體後,將外源基因插入編譯天 

然分泌訊號 S. cerevisiae α-factor prepropeptide 或 P. pastoris acid phosphatase(PHO1)訊號的 

序列之後 (14) 。 

(二) O 鏈結醣基化(O-Linked glycosylation) 

酵母菌可以將 O 鏈結和 N 鏈結碳水化合物部分加到分泌的蛋白中,真核細胞組合 O 鏈 

結醣至 serine 或 threonine 的氫氧基,在哺乳動物中,O 鏈結寡醣由多種不同的醣組成,包括 

N-acetylgalactosamine、galactose(Gal)和 sialic acid(NeuAc),相對的,低等真核生物如酵 

母菌所增加 O 鏈結寡醣僅由 mannose(Man)組成。O 鏈結醣基化並無一致性與一級氨基酸 

序列存在,不同的宿主可增加 O 鏈結醣到相同蛋白的不同位置,因此即使一個蛋白在天然宿 

主中沒有醣基化,我們不能確定是否酵母菌對此外源蛋白不進行醣基化,同時亦不該認為酵 

母菌所選特定的 serine 或 threonine 醣基化和原來宿主相同 (9) 。 

(三) N 鏈結醣基化(N-Linked glycosylation) 

在所有的真核生物中,N 鏈結醣基化開始於內質網,轉移脂質鏈結寡醣單元 

Glc3Man9GlcNAc2(Glc=glucose;GlcNAc=N-acetylglucosamine)到特定序列 Asn-X-Ser/Thr 

的 asparagine,這個寡醣中心被縮剪成 Man8GlcNAc2,關於這點,低等(如酵母菌或其他真菌) 

或高等真核生物的醣基化型式不同,哺乳動物的高爾基氏體執行一系列的縮減或加成反應產 

生 Man5-6GlcNAc2(多 mannose 型式)、幾種不同醣混合(複合形式)或兩者組合(混合型式) 

組成之寡醣。在 S. cerevisiae 中,N 鏈結中心單元於高爾基氏體增加 mannose 外鏈而延長,這 

些外鏈長度變化非常大,使內生性和外源分泌蛋白在大小上不同,這些鏈典型為 50~150 個 

mannose,是一種高度醣基化。 

一些 P. pastoris 分泌的外源蛋白,顯示相似於 S. cerevisiae 中觀察到的高度醣基化,N 鏈 

結多 mannose 寡醣被酵母菌的分泌系統增加到蛋白上,於醫藥工業外源分泌蛋白的使用上有 

著重要的問題,當被靜脈注射至哺乳動物時表現極度的抗源性,也於血液中快速的被肝清除, 

另一個問題,酵母菌和哺乳動物 N 鏈結醣基化型式的不同,長外鏈可能干擾外源蛋白的摺疊 

和功能。 

相較於 S. cerevisiae 分泌蛋白的寡醣結構,P. pastoris 至少有三點不同,首先,也是最重 

要的,是缺乏高度醣基化,使用寡醣描繪技術,顯示 P. pastoris 分泌蛋白的外鏈典型是 

Man8GlcNAc2 或 Man9GlcNAc2;其他的不同是-1,6 鏈結 mannose 存在於中心相關的結構, 

於 P. pastoris 分泌的 invertase、tissue-type plasminogen activator 的 kringle 2 區域和其他蛋白皆

87 


有報告;最後,P. pastoris 寡醣沒有末端-1,3 鏈結 mannose 9 ,這些鏈結使許多酵母菌產生的 

重組蛋白不適用於人類醫藥用途。 

三、利用酵母菌表現系統表現的外源性蛋白質之應用 

(一) Epidermal Growth Factor(上皮細胞生長因子) 

上皮細胞生長因子起初是由成鼠的下顎腺中分離出來的。而其主要的功能則是會促進許 

多細胞的增生,特別是上皮細胞。有許多型態的上皮細胞生長因子都已被發現,包含人類的 

上皮細胞生長因子(h-EGF)。而人類的上皮細胞生長因子是一個由 53 個胺基酸所組成的蛋 

白質,可在許多體液中發現,例如奶汁、尿液、及精液。因此利用 Saccharomyces cerevisiae 

表現系統來表現上皮細胞生長因子,雖然前面多加了一個酵母菌的訊號序列(signal 

sequences),可以讓蛋白質分泌至培養基中。但是在純化之後,發現合成的上皮細胞生長因子 

可以促進有絲分裂,同時可在動物實驗上會促進傷口的上皮細胞加速再生 (15) 。 

(二) Insulin-like Growth Factor-1(類胰島素生長因子-1) 

類胰島素生長因子-1 具有促進血液流通和細胞再生,從而促進新陳代謝;同時也能刺激 

肌肉細胞生長和分化及刺激人体重要淋巴細胞的生長,增加 T 細胞和 B 細胞數量,進而提高 

身体免疫功能。也有一些實驗室利用酵母菌來表現類胰島素生長因子-1,根據其所表現的蛋 

白質的量、醣基化的程度、及是否為分泌性蛋白,皆會影響其生物活性。同時也發現類胰島 

素生長因子-1 若是分泌至培養基中,會產生毒性並對酵母菌的生長造成影響,以致回收率降 

低。而此問題後來則經由分離出對類胰島素生長因子-1 有耐受性的酵母菌才獲得解決 (16) 。 

(三) Fibroblast Growth Factor(纖維母細胞生長因子) 

纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)是一種水溶性多胜蛋白,不論是鹼 

性(basic)和酸性(acidic),都具有許多不同型式分子量的產物,範圍是 18~24kd。具有使 

內皮細胞分裂和觸發血管新生的能力。它能增強許多種細胞的分化能力,如上皮細胞或纖維 

母細胞。但在用酵母菌表現時發現纖維母細胞生長因子前端的第一個胺基酸會被切斷;但在 

測試細胞活性時,例如纖維母細胞及內皮細胞增生的實驗時,發現其生物活性仍存在 (17) 。 

因此由以上的說明讓我們可以得知不同種類的酵母菌表現系統可以用來表現不同種類的 

外源性蛋白,包括人類、老鼠、鳥類、魚類、病毒、寄生蟲等等。不論使用何種酵母菌或者 

使用一定程度的持續性或者是調控性的啟動子(promoter),以及所採用的質體(plasmid)是 

多倍或是低倍的插入酵母菌的染色體中,皆可以適用。由於有這幾項特點,因此能夠成功的 

運用在許多方面。而且不同於其他的真核生物表現系統,酵母菌表現系統可用較低廉的培養 

基培養,同時其生長快速(半生期約 2-4 小時),可在短時間內達到較高的細胞量。 

在探討利用酵母菌表現系統去生產外源性蛋白時,我們也清楚的了解酵母菌對後轉譯 

(post-transcription)和後轉錄(post-translation)的調控和真核生物是相類似的,這對於蛋白 

質的生物活性及穩定性是不可或缺的。幾個例子來說,像是結構很複雜的肝炎病毒顆粒,其

88 


在酵母菌內可以形成正確的結構,同時製造可以去感染的肝炎病毒。 

在本章中也介紹一些經由酵母菌表現系統生產外源性蛋白的例子,同時利用酵母菌去表 

現也應用在許多方面,如醫學、製藥、食品工業等領域上。因此在新興的生物科技中,酵母 

菌的應用亦開始嶄露頭角。 

參、昆蟲細胞表現系統(Insect cell expression system) 

雖然原核細胞表現較為大量、快速、經濟。但是許多分子量較大,或須經過修飾之蛋白 

質,在原核細胞表現不見得適當,因此利用真核細胞發展出許多系统包括酵母菌, 霉菌,動 

物細胞。在真核細胞表現系統可以分為兩大類,一大類是利用暫時性或穩定轉殖基因表現外 

源蛋白,另一類是利用獨立病毒表現蛋白。 

第一類使用將可以在真核細胞轉錄轉譯的單元放入到細菌的質體中, 取出標的 DNA 轉 

殖到真核細胞,表現蛋白質大部分是為無毒且為分泌性蛋白。第二類則是利用 DNA 病毒, 

如 vaccinia virus,herpes virus,adenovirus 與 baculovirus。將標的基因和病毒之 DNA 在宿主 

細胞內進行同源性重組(homologous recombination)。這種類形的病毒常導致細胞分解,可以 

用來表現少量蛋白質。 

在昆蟲細胞利用穩定轉殖細胞表現蛋白質有些系統可以使用,但尚不普遍。而利用重組 

病毒可以得到較大量的蛋白質較被方便使用。故只介紹重組病毒系統. 

一、桿狀病毒表現系統(Baculovirus expression system) 

通常將標的蛋白的基因接到加州苜蓿尺蠖蛾繁殼核多角體病毒(Autographa californica 

multiple nucleopolyhedroviruses,AcMNPV)的多角體蛋白(polyhedrin)或 p10 蛋白的啟動子 

之後。這兩種蛋白質對病毒複製並不重要,且在感染後期被大量表現。這系統較其他真核細 

胞表現蛋白質時的量較多,尤其對細胞內的蛋白質表現更佳,且較容易回收。可以放入的 DNA 

長度亦有很寬的範圍。不須要有 helper virus,容易大量培養,不感染其他脊椎動物細胞,較 

為安全。可以將病毒直接感染昆蟲或昆蟲細胞,由蟲體或昆蟲細胞取得蛋白 (18) 。 

(一) 桿狀病毒的生物特性 

桿狀病毒(baculovirus)為雙股 DNA 病毒,可感染非脊椎動物物種,為節肢動物蝶、蛾 

類之重要病原體,因病毒顆粒外裹核蛋白層(nucleocapsid)呈桿狀的外形而被命名。於發現 

的多種桿狀病毒中,以感染昆蟲綱之昆蟲為主,且其感染的寄主則大多侷限於某些特定之昆 

蟲目,主要為鱗翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)之昆蟲種類為最多。桿狀病毒 

在病毒分類上屬桿狀病毒科(Baculoviridae),其下又可分成兩個亞科:可產生包含體之真桿 

狀病毒亞科(Eubaculovirinae)和不產生包含體之裸桿狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)。真 

桿狀病毒亞科的最大特徵就是在感染的細胞核內有結晶狀體形成,即所謂內涵體(occluded 

body),內涵體內包埋著病毒粒子,此病毒便稱為內涵體病毒(occluded viruses)或稱核多角 

體病毒。由於內涵體之結構和形態不同又可分成核多角體病毒屬(nucleopolyhedroviruses,

89 


NPV)和顆粒體病毒屬(granuloviruses, GV)。核多角體病毒屬病毒依其病毒粒子中所包裹 

之核蛋白質鞘(nucleocapsid)數目多寡而區分成兩個亞屬:若外膜只包裹了一個核蛋白質鞘 

則稱單殼核多角體病毒(single nucleocapsid nucleopolyhedroviruses, SNPV),以家蠶核多角 

體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedroviruses, BmNPV)為主;若每個病毒粒子含有兩個以上 

核蛋白質鞘包裹於脂蛋白外膜稱之繁殼核多角體病毒(multiple nucleocapsid nucleopolyhedroviruses, 

MNPV),以加州苜蓿尺蠖蛾繁殼核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedroviruses,AcMNPV)為主。核多角體病毒屬所形成的內涵體通稱為多角體(polyhedra),直徑約 

40-50 nm,長度約 200-400 nm,在受感染的細胞內多則可達 30 顆以上,每個核 

多角體內可包埋 100 個以上的病毒粒子。內涵體之形成將有助於維持病毒體在環境下的耐受 

性(如抗紫外線、乾燥及其他化學因子等),以持續維持其在環境的感染能力 (19) 。 

桿狀病毒為雙股環狀超螺旋結構的 DNA 病毒,基因組大小為 80~220 Kb。以苜蓿尺蠖蛾 

核多角體病毒(AcMNPV)為例,是目前分子生物層次上研究的較清楚的桿狀病毒。AcMNPV 

病毒核心(core)是由 133.9 Kb 的雙股環狀超螺旋 DNA 與蛋白質所組成,病毒核心被鞘蛋白 

(capsid)包裹形成核蛋白鞘(nucleocapsid),核蛋白鞘外面再被一層脂蛋白外膜包裹,便形 

成完整之病毒粒子,病毒粒子最後再被核多角體蛋白包裹而成為內涵體病毒。 

病毒在自然環境下感染昆蟲的生活史,是從昆蟲食入含有內涵體病毒之食物後開始,當 

內涵體病毒進入蟲體,病毒核多角體蛋白會在蟲體中腸腸道的鹼性環境下被溶解,而釋出病 

毒顆粒。病毒粒外膜會與中腸之上皮細胞膜融合,病毒核蛋白質鞘便進入細胞內,然後鞘蛋 

白在細胞質中被分解而裸露出病毒 DNA,DNA 再進入核內進行病毒複製增殖。桿狀病毒在 

感染宿主後具有雙相性複製循環生活史(biphasic replication life cycle),感染的初期並不產生 

內涵體,只進行病毒 DNA 複製增殖,在新蛋白質鞘形成後,無內涵體之病毒粒子便以出芽 

的方式去感染其他健康的細胞,此時產生的病毒稱之為出芽性病毒(budded viruses),主要是 

細胞間之感染。感染非常晚期(約感染 20-24 小時後),許多後期的基因便被啟動,主要是 

核多角體蛋白和 p10 蛋白這兩個基因,此時於細胞內產生核多角體蛋白和纖維狀物質(fibrous 

material),並開始形成內涵體,包裹病毒粒子,產生內涵體病毒,待被感染細胞裂解之後便 

可進行蟲體間的感染。其中內涵體病毒主導蟲與蟲體間的感染,而細胞間的感染和蔓延則主 

要是靠出芽性病毒。 

桿狀病毒的基因表現是屬於階段性的調控(temporal regulation),主要分為四個時期: 早 

期(early phase),晚期(late phase),非常晚期(very late phase)及細胞溶解期(lytic phase)。 

在早期(感染後 0-6 小時),進行病毒 DNA 的複製。感染晚期(感染後 6-24 小時)則延續 

DNA 的複製,並開始產生出芽性病毒。感染非常晚期(感染後 20-24 小時),主要產生 p10 

以及核多角體蛋白(polyhedrin),此兩種蛋白質的基因可在寄主細胞內高度表現且大量被產 

生,一般在感染末期之蟲體內的總蛋白質含量中,核多角體蛋白的產量幾乎可達 50%以上, 

主因受強勢之啟動子(promoter)控制。而 p10 蛋白在末期亦為產量顯著的病毒蛋白和病毒

90 


溶解細胞的能力有關。核多角體蛋白是一個由 245 個氨基酸組成(29 kDa)的蛋白質,是核 

多角體的主要成份,在桿狀病毒感染細胞晚期被大量表現(0.5-1 g/ml),由於桿狀病毒的雙 

相生活史,就算無法形成內涵體進行蟲體間之感染,桿狀病毒刪除晚期之核多角體基因和 p10 

基因亦能持續的進行細胞間的複製和感染,故這些後期的基因對病毒而言是非必要基因,更 

由於多角體蛋白在核多角體病毒的基因組上是表現量很高的基因,加上其為非必要基因的關 

係,且有強勢的啟動子,故適合進行基因改造的工作。將外來基因構築於多角體蛋白基因的 

啟動子控制下,已有相當多的報告顯示確實能有效產生具有生物活性的外源蛋白質。 

(二) 桿狀病毒表現載體之發展現況 

核多角體病毒的 DNA 上有許多優越的特性,使得桿狀病毒由原來單純只應用於農業的 

昆蟲防治,轉變到蛋白基因工程上,作為表現外源蛋白絕佳的病毒載體,其特性如下:(1) 

具雙股的 DNA,方便做基因的剪接操作,且能接入較大片段的外來基因;(2)桿狀病毒基因 

組有至少一種以上的基因是非必要的基因(如:核多角體蛋白基因,p10 蛋白基因等),且又 

都具相當高之蛋白表現率,故可被外來基因加以取代 ;(3)所構築的表現載體,可插入原核 

或真核的外來基因,除可產生大量的重組蛋白外,且能進行真核細胞特有的轉譯後修飾作用 

(posttranslational modification);(4)對脊椎動物或植物皆無病源性,且細胞培養的方式並 

不使用轉形細胞,故不會造成對操作人員的危險性 (20) 。在桿狀病毒表現系統中,現在最常被 

建構的表現載體主要為加州苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(AcMNPV)和家蠶核多角體病毒 

(BmNPV)這兩種,而其中又以 AcMNPV 這個表現系統最為普遍。因為 AcMNPV 的寄主域 

較廣,細胞增殖間期較短(約 18-24 小時),可資利用之轉移載體範圍較廣,較多的啟動子可 

供利用等。而 BmNPV 寄主域就小的多,主要是感染家蠶細胞或幼蟲而已。而且 AcMNPV 所 

感染細胞株,其細胞增殖的速度也較家蠶細胞為快,而且也較好培養,故在重組蛋白表現時 

較有效率。不過當要做蟲體感染時,BmNPV 的寄主卻有蟲體大易飼養的優點,且在蟲體內 

的蛋白表現比單一型態的細胞培養更能提供完整的轉譯後修飾作用。 

現在已知昆蟲細胞幾乎有能力完成多數哺乳動物複雜的轉譯後修飾作用,包括分泌 

( secretion ),訊號胜肽序列的斷裂(signal piptide cleavage ),脂肪修飾作用(lipid 

modification),蛋白質摺疊(folding),磷酸化作用(phosphorylation)及 N-,O-linked 醣化作 

用(glycosylation)等。到目前為止已有很多外源性的基因,被選殖放到桿狀病毒表現系統表 

現相關之重組蛋白質,但其產量的變化範圍很大,從人類凝血脢調節素(thrombo- modulin) 

的產量 1-10 mg/L 到β-galactosidase 的 600 mg/L 的高產量皆有。用來進行蛋白表現的昆蟲細 

胞株主要有兩類:秋行軍昆蟲細胞株(Spodoptera frugiperda ovarian cell lines),包含:sf-9、 

sf-21;另類為擬尺蠖細胞株(Trichoplusia ni egg cell lines),包含:TN-368 及 High 5 等。昆 

蟲細胞的最佳生長溫度為 27℃左右,不用額外供給二氧化碳(CO2),細胞培養方式可分為附 

著性培養及懸浮性培養;其中以懸浮性培養加入 0.1-0.2 %的表面作用劑(pluronic F-68)可 

提高單位面積內細胞的密度,較適用於蛋白大量之表現。而造成不同蛋白產量差異如此大的

91 


原因,可能影響蛋白表現的因子有:細胞株的差異,基因以及基因產物對昆蟲細胞的毒性, 

選用啟動子的差異,還有細胞的培養方法,病毒感染時的細胞密度,時間與所加入病毒的量 

都會造成蛋白質產量的差異。 

(三) 桿狀病毒表現系統的構築 

包含外來基因之重組病毒之構築是昆蟲細胞表現系統的關鍵步驟。重組病毒載體的取 

得,最便利的做法就是直接購買試劑套組。目前市面上 Invitrogen 及 CLONTECH 兩家公司均 

可提供相關產品的服務。下圖簡示 Invitrogen 公司所提供的質體 pBlueBacHis2(如圖四) 

圖四、pBlueBacHis2 質體 

(原圖出自 Invitrogen 公司網頁:http://www.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pbluebachis2_map.pdf) 

首先取直鏈型桿狀病毒 DNA 和包含外來基因之轉移質體(transfer plasmid)一起共同轉 

染(cotransfection)昆蟲細胞,而可得到具有活性之重組病毒。直鏈型病毒 DNA 為一不具活 

性的病毒 DNA,利用獨特的限制脢將病毒 DNA 上某些複製必須之基因片段移除,使之不具 

有複製能力;然而在基因轉移質體上具有病毒複製必須基因的完整片段,及帶有報告基因

92 


(reporter gene),如 LacZ 或 GFP,當質體和直鏈型病毒一起轉染昆蟲細胞,直鏈型病毒 DNA 

會與基因轉移質體發生同源性重組(homologous recombination),此時病毒便具有完整基因, 

可在昆蟲細胞間複製及進行感染。當重組病毒感染細胞時,會產生噬菌斑(plaque),由於重 

組病毒帶有報告基因如 LacZ 或 GFP,便可由噬菌斑分析(plaque assay)實驗將重組病毒選 

殖出來進行量產,用來生產重組蛋白(實驗步驟如下圖)。蛋白質的純化會是得到高純度蛋白 

質的關鍵步驟,很多不同的基因轉移質體(transfer plasmid)被發展於不同的運用,最常見的 

系統為質體上帶有便於純化的融合蛋白基因,如 glutathione-S-transferase(GST)基因或具有 

6 個重複的組胺酸(His-6 tag)基因,而可產生相關的融合蛋白,便於利用相關的蛋白純化技 

術,以得到高純度蛋白質產物。其中帶有 GST 融合蛋白的產物可以利用 GST 親合性樹脂加 

以純化;含有多組胺酸的融合蛋白會與一些 2 + 陽離子的過渡金屬緊密結合,所以可以鎳離子 

螯合樹脂等方法加以純化。 

Linearized Baculovirus DNA 

3’ end of report gene 5’ Essential ORF 

Homologous recombination 

Report gene Gene of interest Complete ORF 

Gene Transfer Plasmid 

Cotransfection 

Report gene Gene of interest Complete ORF 

Recombinant Baculovirus 

Plaques assay 

Virus amplification 

Large scale expression of recombinant protein 

肆、哺乳動物細胞表現重組蛋白(Mammalian cell expression system) 

近年來由於生物科技的突飛猛進,促使利用哺乳動物細胞表現重組蛋白的系統上的利用 

更加的重要。許多蛋白質合成的過程中,必須經過一連串嚴格的控管(quality control)及修

93 


飾(modification)的過程,才能具有正常的生理功能,包括:醣基化(glycosylation)、 

disulfide-bond formation、protein folding。而利用哺乳動物細胞系統表現重組蛋白,則有效地 

製造出具生物活性(bioactive)及經過正確修飾(modified)的蛋白質。故在現今所可以利用 

的表現系統中,這特性是無可取代的。 

一、表現系統的選擇 

選擇利用哺乳動物細胞表現系統時,首先必須要考慮表現的方式,包括:短暫性的表現 

(transient expression)或持續性的表現(stable expression),這兩種方法各有其優點及限制。 

對於短暫性的表現是一個簡單有效率的表現方法,在此方法中蛋白質的表現量和持續性的表 

現的量是相當的,但是如其字義上所示的此方法為短暫性的表現,送入細胞中的質體 DNA 

(plasmid DNA)並不會鑲嵌入細胞的基因中,所以其表現蛋白質的時間不長,約為 48 小時 

至 7 天左右。至於表現載體的選擇,目前市面上有多種商品可供選擇,可依實驗目的挑選帶 

有合適啟動子及篩選標的基因的質體,下圖簡示 Invitrogen 公司的 pCR3.1-Uni 質體(如圖五) 

圖五、pCR3.1-Uni 質體 

(原圖出自 Invitrogen 公司網頁:http://www.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcr3_1uni_map.pdf) 

二、基因送入細胞中的方法 

現今發展出許多可以將基因送入真核細胞中表現的方法,這些方法主分為三類:生化的 

方法(biochemical methods),物理的方法(physical methods)將基因經轉染(transfection) 

的過程送入,另一種為病毒調控的 tranduction。磷酸鈣沉澱法(calcium phosphate precipitation

94 


method)可以用在短暫性表現或持續性表現蛋白質的系統上,在此方法中是讓 DNA,磷酸鈣 

在 HEPES 緩衝液系統中作用形成 DNA-磷酸鈣沉澱物,然後使此沉澱物與單一細胞接觸後, 

接下來幾小時中經由細胞的吞蝕作用(endocytosis)將 DNA 送入細胞。然後經過清洗換上新 

鮮的培養液後,在 24-48 小時後,細胞會恢復正常的狀態。在轉染過程中(transfection),若 

給予 physiological shock(如利用 glycerol 或 DMSO 作用)會增加其效率。一般來說,細胞經 

過此過程後,大約 40-80%的細胞會暫時性地表現重組蛋白。如果要建立持續性表現的細胞 

株,則必須在利用送入的質體 DNA 上所帶有的篩選標記(selection marker),利用藥物來持 

續性地篩選出質體 DNA 已經鑲嵌入基因中的細胞株,而取得持續性表現的單一細胞株。 

除了磷酸鈣沉澱法,利用 liposome 將 DNA 帶入細胞中的方法,近來已經商品化。,其 

原理主要是將 DNA 與 liposome 混合,形成外面包裹著一層脂質的 DNA。商品化的帶陰電性 

的脂質 DOTMA(N-[1-(2,3-dioleyoxy)propyl]-N,N,N-trimethyl ammonium chloride)可 

以與帶正電的 DNA 形成複合物。將此帶有 DNA 的脂質球,與細胞一起作用,將 DNA 送入 

細胞中。不論在附著式(adherent)、懸浮態(suspension)的細胞株或是短暫性表現、持續性 

表現系統,皆可使用這方法來將 DNA 轉感入細胞中。根據研究顯示,liposome 方法在於短暫 

性表現系統中效率比磷酸鈣沉澱法高 (21) 。 

電穿孔法(electroporation)是一種快速且效率非常高的方法,此法的原理是利用高電壓 

的電子脈衝(high-voltage electric pluse)改變細胞的滲透性(permeablize)將 DNA 送入細胞 

中。在此方法中若要成功地達到高效率方面式需要注意:第一是所使用的電壓強度,若使用 

的電壓過高會造成細胞死亡,無法達到將 DNA 送入細胞中表達蛋白質的功能,所以得先測 

試出適當的電壓數,算出最高轉染效率與細胞死亡的比例。一般來說,使用的電壓數約介於 

250 至 1000 伏特,以數個短時間(0.5~10 msec)的短暫作用。通常此法需要較多量的質體 

DNA,約 20-100μg 左右,如果實驗的要求是需要多次的做高效率的轉染反應或增加鑲嵌的 

效率,此法是較佳的選擇。環狀的 DNA(circular DNA)能使用在短暫性表現的系統,而直 

線形的 DNA(linear DNA)則較適合用來得到高效率的持續性表現的系統。 

三、篩選標的(selection marker)的使用 

通常利用哺乳動物細胞大量表現重組蛋白,需要利用持續性表現系統來得到持續表現的 

細胞株,而要得到持續性表現的細胞株則必須藉助篩選標的(selection marker)方式來篩選。 

常用來當作篩選標的的基因有 neo、glutamine synthetase、dhfr、tk 等基因,分別利用藥物來 

篩選出質體 DNA 已經鑲嵌的單一細胞株。以 neo 基因為例,這個基因可以轉錄成一個蛋白 

質產物 aminoglycoside 3’-phosphotransferase,這蛋白質可以分解抗生素 G418(aminoglycoside 

antibiotic),經過 G418 的作用,將 80S ribosome 的作用抑制而造成細胞死亡,藉此方法來篩 

選出轉染成功的細胞株。這個篩選方法可以廣泛用在個個不同的細胞株上,但是不同細胞株 

對 G418 的敏感度不同,所以使用的劑量也不相同,必須先測試適當的劑量;一般來說,400

95 


μg/ml G418 用在 HeLa 細胞、COS monkey 細胞或 CHO 細胞等細胞株上,是一個很有效的 

劑量。 

四、基因的表現(gene expression)的增加通常與基因放大(gene amplification)有關 

經常用來當作哺乳動物細胞表現的細胞為 immortalized 的細胞,最常用的有 HEK-293 

(human embryonic kidney 293 cell)、COS cell、CHO(Chinese hamster ovary)、BHK-21(baby 

hamster kidney)、MDCK、NIH/3T3 等。在短暫性表現系統時,選擇附著式的(attached)細 

胞株較適合,如 HEK-293 及 COS 細胞株。雖然這兩種細胞株可在 T-flasks 或滾瓶式培養瓶 

(roller bottle)的方式下培養,但若要做大量的生產則會有困難,因為這些細胞是附著性的 

細胞株。現今,由於 microcarrier 或 fibro-disk 的系統的發明,使這些細胞株可以吸附於 matrix 

上並利用發酵槽來大量培養。 

若是懸浮式的細胞,則不需要利用 microcarrier 或 fibro-disk 的系統來幫助,可以直接大 

量培養。CHO 細胞為一廣泛運用的細胞株,在此細胞株中所表現出的醣蛋白(如:tPA 及 EPO) 

的碳水化合物的結構及組成已經過進一步地研究,而此系統已經成功地製造人類醫藥用的蛋 

白質。另一個常用的細胞株為 BHK-21(baby hamster kidney),這是一個 fibroblast-like 的細 

胞株,可以懸浮式的或吸附式的培養皆可。可能是由於 ER 的控制的特性不同,BHK-21 細胞 

株用來表現人類凝血第八因子(factor VIII)上比 CHO 細胞株更有效率。一般來說 CHO 細胞 

及 BHK-21 細胞較適合用來持續性表現系統,而且這些細胞皆可在不加入血清(serum-free) 

的培養液中生長 (22) 。 

哺乳動物細胞表現系統的進步相當的迅速,而利用此表現系統來得到高表現量的重組蛋 

白尤其是重要的。事實上,這個表現系統對於那些需要經過修飾才具有功能活性的蛋白質的 

研究是相當有幫助的,但是要利用此表現系統來表現重組蛋白質前,有幾個條件是需事前評 

估的 ;(1)所需要的重組蛋白質的量;(2)什麼時候需要拿到這些重組蛋白質;(3)想表現 

的蛋白質需要哪些修飾的系統(post-translation modification),以選擇適當的細胞株;(4)需 

不需要利用誘發性的系統(inducible system),此重組蛋白質是否對細胞有毒性?利用短暫性 

表現系統來表現蛋白質,可以在很短的時間內拿到一定量的蛋白質,而持續性表現系統則能 

得到大量的蛋白質。哺乳動物細胞表現系統的成功,利用蛋白質設計(protein engineering) 

方法所設計出來的蛋白質可以被表現出。而這些產物將增進對於蛋白質的複雜的功能研究及 

創造出帶有新功能或具有醫療用途的蛋白質。 

伍、蛋白質表現系統之比較 

以上所介紹之蛋白質表現系統,目前皆廣泛被使用於各類蛋白質的表現與純化,究竟要 

使用哪一種表現系統,必須要先考慮欲表現蛋白的特性,並比較不同系統的差異,最後再選 

擇一種可能較適當的系統來進行蛋白質表現。通常評估不同的蛋白表現系統,會考慮其對蛋

96 


白質修飾(如醣基化,折疊)的影響,表現速率的差異以及成本的高低等。以蛋白質修飾而 

言,哺乳動物細胞表現系統最能合適的將蛋白修飾及正確折疊,其次為昆蟲細胞系統及酵母 

菌系統,但酵母菌所表現的蛋白可能會有過度醣基化的現象,大腸桿菌系統的效果最差。因 

此,若欲表現蛋白的折疊及轉譯後修飾對其功能非常重要,則應選擇具蛋白質修飾功能的表 

現系統。以表現量而言,用大腸桿菌系統來表現蛋白的效率最高,其次為酵母菌系統,昆蟲 

細胞與哺乳動物細胞的蛋白產量則較差。所以若希望能大量取得表現蛋白,可以考慮大腸桿 

菌或酵母菌系統,且此兩種系統目前皆可應用於發酵槽的大量培養,更可增加蛋白的產量。 

若以成本估算,昆蟲細胞與哺乳動物細胞的培養需要較昂貴的培養液,且蛋白表現量較低, 

因此成本較高。相對而言,大腸桿菌或酵母菌系統的培養較容易,培養液便宜,蛋白產量較 

高,故成本較低。各種系統之特點如下表所示: 

蛋白表現系統特點 

大腸桿菌蛋白質修飾效果差,蛋白產量高,成本較低 

酵母菌系統具蛋白質修飾功能,但可能會過度醣基化;蛋白產量高,成本低 

昆蟲細胞具蛋白質修飾功能,蛋白產量低,成本高 

哺乳動物細胞具蛋白質修飾功能,蛋白產量較低,成本較高 

結語 

目前的生物技術中已成功的建立多種,包括原核生物及真核生物細胞的蛋白質表現系 

統,提供我們多樣化的選擇。雖然如此,我們仍須針對欲表現蛋白的特性,蛋白質表現產量 

的需求等等因素加以考量,挑選一種可能較適當的系統進行蛋白質表現。然而,有時一開始 

的選擇不一定是最恰當的,這時便需要根據所發生的問題調整蛋白質表現的策略。例如在大 

腸桿菌系統表現出來的蛋白不具生物活性,那可能要考慮換至酵母菌或哺乳動物細胞進行蛋 

白質表現;又或從酵母菌表現出來的蛋白醣基化的程度太嚴重,那就可能要考慮更改至昆蟲 

細胞系統表現等。必須充分瞭解各表現系統的優劣點及欲表現蛋白的特性,方能找到合適的 

系統表現出標的蛋白,進而研究其功能及做更深入、更廣泛的應用。 

參考文獻 

1. Germino, J., and Bastia, D.(1984)Rapid purification of a cloned gene product by genetic fusion and 

site-specific proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4692-4696. 

2. de Boer, H. A., Comstock, L. J., and Vasser, M.(1983)The tac promoter: A functional hybrid derived 

from the trp and lac promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25. 

3. Studier, F. W., and Moffatt, B. A.(1986)Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective 

high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113-130.

97 


4. Itakura, K., Hirose, T., Crea, R., Riggs, A. D., Heyneker, H. L., Bolivar, F., and Boyer, H. W.(1977) 

Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science 

198, 1056-1063. 

5. Bar-Peled, M., and Raikhel, N. V.(1996)A method for isolation and purification of specific antibodies to 

a protein fused to the GST. Analytical Biochemistry, 241, 140-142. 

6. Harris, M.(1998)Use of GST-fusion and related constructs for the identification of interacting proteins. 

Methods Mol. Biol, 88, 87-99. 

7. Handl, C. E., Harel, J., Flock, J. I., and Dubreuil J. D.(1993)High yield of active STb enterotoxin from 

a fusion protein(MBP-STb)expressed in Escherichia coli. Protein Expression & Purification. 4, 

275-281. 

8. Porath, J., and Olin, B.(1983)immobilised metal ion affinity adsorption and immobilised metal ion 

affinity chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilised iron and nickel 

ions. Biochemistry 22, 1621-1630. 

9. Romanos, M. A., Scorer, C. A., and Clare, J. J.(1992)Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 

8, 423-488. 

10. Cregg, J. M., Madden, K. R., Barringer, K. J., Thill, G. P., and Stillman, C. A.(1989)Functional 

characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast. Pichia pastoris. Mol. Cell. Biol. 9, 

1316-1323. 

11. Tschopp, J. F., Brust, P. F., Cregg, J. M., Stillman, C. A., and Gingeras, T. R. (1987) Expression of the 

LacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res, 15,3859-3876. 

12. Sreekrishna, K., Potenz, R. H., Cruze, J. A., McCombie, W. R., Parker, K. A., Nelles, L., Mazzaferro, P. 

K., Holden, K. A., Harrison, R. G.., and Wood, P. J.(1988)High level expression of heterologous proteins 

in methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Basic Microbiol. 28, 265-278. 

13. Scorer, C. A., Clare, J. J., McCombie, W. R., Romanos, M. A., and Sreekrishna, K.(1994)Rapid 

selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign gene 

expression. Biotechnology(NY)12, 181-184. 

14. Ernst, J. F. (1986) Improved secretion of heterologous proteins by Saccharomyces cerevisiae:effects of 

promoter substitution in α-factor fusions. DNA 5, 483-491. 

15. Urdea, M. S., Merryweather, J. P., Mullenbach, G. T., Coit, D., Heberlein, U., Valenzuela, P., and Barr, P. 

J. (1983)Chemical synthesis of a gene for human epidermal growth factor urogastrone and its 

expression in yeast, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80, 7461-7465. 

16. Bayne, M. L., Applebaum, J., Chicchi, G. G., Hayes, N. S., Green, B. G., and Cascieri, M. A.(1988) 

Expression , purification and characterization of recombinant human insulin-like factor I in yeast, GENE 

66, 235-244.

98 


17. Gospodarowicz, D.(1987)Isolation and characterization of acidic and basic fibroblast growth factor, 

Methods Enzymol. 147, 106-119. 

18. Miller, L. K.(1988)Baculoviruses as gene expression vectors. Ann. Rev. Microbiol. 42,177-199. 

19. Mattewws, R. E. F.(1982)Classification and nomenclature of viruses. Intervirol. 17, 1-199. 

20. Miller L. K.(1988). Baculoviruses for foreign gene expression in insect cells.Biotechnology 10, 

457-465. 

21. Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. 

M., and Danielson, M.(1987)Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417. 

22. Reiter, M., and Bluml, G.(1994)Large-scale mammalian cell culture. Curr. Opin. Biotechnol. 5, 175- 

179.

PARTⅢ 

99 

PARTⅢ、質譜儀技術微量蛋白質研究之應用 

質譜儀技術在微量蛋 

白質研究之應用

前言 

100 

第九章、質譜儀的技術原理介紹及蛋白質鑑定 

第九章 

質譜儀的技術原理介紹及蛋白質鑑定 

The Principle and Technology of Mass Spectrometry 

and Protein Identification 


陳靜瑩,廖大修 

質譜技術的基本原理是樣品分子在離子化後,根據各個離子間的質荷比(m/z)的差異來 

分離並確定分子量。其原理早在二十世紀初已確立,但是自1980起出現的新的離子化技術, 

使質譜的應用不再侷限在分析小分子揮發物質而已,還可以應用到研究生化大分子。如今, 

質譜技術已成為蛋白質體學中重要的分析工具。 

常見的蛋白質體學研究的方式是將蛋白質混合液(如細胞萃取液等),利用二維電泳膠片分 

離後,挖取欲分析的蛋白質點。利用膠體內蛋白酵素將未知的蛋白質水解成胜肽(peptide) 

後,便可得胜肽混合物,接著可將此胜肽混合物送入質譜儀中進行分析。將所收到的質譜資 

料與已知的蛋白質資料庫進行比對便可鑑定未知蛋白質為何種蛋白質(如圖一)。 

現今質譜儀在蛋白質體學中主要的應用有(1)蛋白質的鑑定;(2)蛋白質合成後的修 

飾研究;(3)蛋白質的定量分析;(4)蛋白質間之交互作用的研究。 

一維與二維 

的電泳膠片 

電腦進行序列比對收尋、Peptide/ 

蛋白質鑑定及蛋白質合成後修鑑定 

圖一、蛋白質體學研究之流程圖 (1) 

影像經由電腦分 

析 

MALDI-質譜 

分析 

挖下蛋白質點, 

進行酵素水解 

得到 MALDI 與 ESI 的 

實驗數據 

胜肽混和液 

LC-ESI-質譜 

與質譜/質譜分 

析

樣品進樣離子化區 

樣品板 

HPLC 

圖二、質譜儀的基本組成 

MALDI 

ESI 

內容 

壹、質譜儀的技術原理介紹 

真空系統 

質譜 

分析區 

101 


離子測 

定區 

質譜: TOF 

串聯質譜: Ion Trap 

Triple quadrupole 

Q-TOF 

資料分 

析系統 

所謂的質譜儀,主要包括為五個部分:(1)樣品進樣區(sample);(2)離子化區 

(ionization);(3)質譜分析區(mass analyser)(4)離子測定區(detector)及(5)資料 

分析系統(data system)。此外,為避免少量的樣品分子會與空氣粒子碰撞而碎裂,質譜儀 

須在高度真空下進行分析測定(如圖二)。 

一、樣品進樣區: 

胜肽樣品進樣主要有兩種,分別為將樣品於點在樣品板上的固態進品法或是樣品溶於溶 

液的液態進樣法。至於用何種方式進樣則是取決於離子化方式,若是用MADLI方式進行離子 

化,則選用點在樣品板上的固態進樣。如果是用ESI方式來進行離子化,則選用液態進樣。 

二、離子化區: 

常用的離子化方式有兩種,一種是基質輔助雷射解吸/離子化(matrix-assisted laser 

desorption/ionization,MALDI),另一種是電噴灑離子化(electrospray ionization,ESI)。 

(一) 基質輔助雷射解吸/離子化(MALDI) (2) 

所謂的MALDI是將樣品與有機小分子的基質相混合後,點至樣品板上置乾,接著以奈秒 

間距的雷射波照射。通常是使用氮分子雷射,基質對其產生的337 nm雷射波長有較強吸收, 

當雷射打在樣品-基質晶體時,基質聚集能量進行快速加熱,使其基體昇華,同時將非揮發性 

樣品釋放到氣相中(如圖三)。基質的加入使樣品-基質外的分子間相互作用減少,解決了大

102 


分子的氣化問題。 

使用MALDI方式進行離子化的優點是:(1)對鹽類的忍受度較高,可允許樣品溶於一 

般生物緩衝液;(2)MALDI主要生成帶單電荷離子,而使所得之質譜簡明易判讀。但缺點 

則是(1)不同的peptide所產生的訊號強度會不同,不易用於定量;(2)無法生成多電荷離 

子,故不易對大分子進行分析。 

圖三、利用MADLI來使生化分子產生離子化 (1) 

(二) 電噴灑離子化(ESI) (3) 

所謂的ESI是液態樣品經由毛細管送樣後,利用毛細管和質譜儀間的電位差及氮氣來產 

生噴霧形式存在的帶電微粒。當帶電微粒加熱時,中性溶劑蒸發,液體體積縮小,最終可將 

溶劑完全蒸發移除,在質譜儀的電場吸引下,僅有離子化的樣品才會進入儀器中,如此一來, 

可降低溶劑所產生的背景值。ESI的特徵之一是可生成穩定的複數帶電離子,因此而使分子的 

質荷比降低(如圖四)。這樣一來,即使是質量很大的巨大分子也可測得。相同質量的離子 

化分子有機會帶不同的電荷,在得到不同的質荷比後,可經由計算得到分子的真實分子量(如 

圖五)。因同位素峰間的質荷比差與帶電數相對應(如,1+離子碳同位素峰間質荷比差為1, 

2+離子碳同位素峰間質荷比差為0.5。),在解析離子化分子的同位素峰也可確定帶電數,如 

此便可求得正確的分子量。

圖四、利用ESI來使生化分子產生離子化 (1) 

103 


使用ESI進行離子化的優點除了可產生複數帶電離子外,還因為ESI適用於液態樣品進 

樣,所以可結合高效率液態層析方法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和 

毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)等分離技術,將混合液先進行分離,再送入質譜 

儀中。而ESI的缺點則是對緩衝液和鹽的忍受度偏低,當有這些物質存在時,可能會與樣品形 

成複合物,而產生難以指認的分子量或抑制待測物離子的形成。當樣品中不含鹽類和緩衝液 

時,訊號產生的情況會得以改善。但這問題可在使用ESI離子化前,先使用HPLC,便可樣品 

中的雜質除去。 

把液態色層分析與質譜儀結合(LC-MS),在一次操作步驟中即可將樣品內雜質除去、 

樣品進行分離及樣品濃縮之後,便可直接測定。這樣一來便可增加胜肽的辨識率。此外,毛 

細管管柱的使用與奈電噴灑(Nanoelectrospray) (5) 技術的建立,使得質譜儀能測得飛莫耳 

(10-15 mole = fmol)量的樣品。 

圖五、同一個蛋白質(分子量10,000)帶有1-5個質子時,在質譜儀上所測得的質荷比分別為 

10,001,5001,3334,2501及2001 (4) 

與以往的離子化方式不同的,上述這兩類技術能使得蛋白質轉變為氣態離子而不會改變

104 


其結構與形體,所以能快速準確地測定生化大分子的分子量;再結合各種新的質譜分析技術, 

便可以為蛋白質研究開闢了新的道路。生化大分子多為極性、難揮發化合物,不易氣化,用 

傳統質譜無法測定。但隨著新的離子化技術的廣泛應用,現已能高效地離子化完整或片斷的 

生化大分子聚合物,從而進行質譜測定。由於這兩種離子化方式擴大了質譜儀的應用範圍, 

故得到2002年的諾貝爾化學獎的肯定。 

三、質譜分析區 

質譜測定部分最常見的有飛行時間式質譜儀(Time of Flight,TOF)、四極柱式質譜儀 

(Quadrupole Mass Spectrometer)及四極柱離子阱式質譜儀(Quadrupole ion trap mass 

spectrometers)。 

(一) 飛行時間式質譜儀(Time of flight,TOF) (6) 

其測定的基本原理為,將帶電離子在一個真空室中加速射出,然後測量其落地前所需之 

飛行時間。它們達到偵測器的先後與其質量以及電荷有關,越輕而且電荷越高者,越快 

抵達。 

(二) 四極柱式質譜儀(Quadrupole Mass Spectrometer) (7) 

四極柱式質譜儀基本原理是利用一固定的施加電位下,使只有某一個質荷比(m/e)的離 

子呈穩定振動並通過四極圓柱,到達偵測器而被偵測到,其他質荷比之離子則因軌道振 

幅越來越大而撞擊到四極柱上而被中和。 

(三) 四極柱離子阱式質譜儀(Quadrupole ion trap mass spectrometers) (8) 

離子阱式質譜儀基本原理則是利用一個三維的電場將帶電離子困住,再改變電場讓不同 

的質荷比的離子一個個的自離子阱中射出,再來偵測訊號。 

上述的質譜儀都可進行單一質譜(Single stage mass spectrometers)分析,但以TOF能測 

得的質量最準確。 

若利用單一質譜測定分子離子的荷質比,會無法分辨組成相同但排列序列不同的分子 

(如圖六)。為提高分子鑑定率,於是發展出串聯質譜(Tandem mass spectrometers)分析。 

所謂的串聯質譜是在第一次質譜得到分子離子後,選取擁有特定荷質比的離子作為母離子 

(parent ion),與惰性氣體碰撞,產生碰撞誘導解離(Collision-Induced Dissociation,CID), 

形成一系列子離子(daughter ion),這時排列序列不同會產生不同的子離子系列,如此一來, 

便可分辨組成相同但排列序列不同擁有同分子(如圖七)。結合四極柱式與飛行時間的 

Q-TOF、反射式TOF(Reflection TOF)及Ion Trap都可進行串聯質譜分析。

105 


圖六、A與B分別代表兩個序列不同的離子,但因有相同的組成,而有相同質荷比,無法區別。 

在碰撞誘導分離(CID),A與B分別產生a1、a2與b1、b2不同的子離子後,才能判斷A與B為 

兩個不同的離子。 

圖七、(a)單一質譜分析儀中包含三個部分,離子來源、質譜分析及離子偵測器。圖中的質譜 

分析為飛行時間式質譜儀(TOF),荷質比的測定是由測量離子落地前所需之飛行時間。在右 

側的圖為蛋白質水解後,所產生的胜肽質量指紋(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)質譜圖。 

(b)串聯質譜分析儀包括有離子來源、第一次質譜分析、氣體碰撞區、第二次質譜分析及離子 

偵測器(Ion detector)。第一次質譜分析可挑選擁有特定荷質比的離子,將之送入氣體碰撞區。 

碰撞後所產生的產物再由第二次質譜分析之。胜肽經串聯質譜分析,可得到一系列遞減的斷 

裂離子。在右側的圖為胜肽斷裂離子圖形(peptide fragmentation pattern) (9) 

貳、質譜儀在蛋白質定性的應用 

A B 

碰撞誘起解離 

(CID) 

a1 a2 b1 b2 

一、利用質譜與資料庫比對來鑑定蛋白質與胜肽 

在鑑定蛋白質方面,像MALDI-TOF這類以單一質譜為主的質譜儀,最常應用在胜肽質 

量指紋(peptide mass mapping,PMF)分析上。其原理為不同的蛋白質會有不同的蛋白酵素

106 


水解位置,將純化後的蛋白質水解後,便會產生特定的胜肽片段混合液。將這些胜肽片段混 

合液利用MALDI-TOF分析鑑定其質量後,利用電腦與資料庫中已知的蛋白質進行搜尋比對 

(如圖八)。PMF鑑定法的優點適用於比對多量樣品,但其缺點則是當有數種蛋白質混合在 

一起時,無法用此方法分析。 

圖八、胜肽質量指紋(PMF)為利用特定胺基酸水解酵素(通常為胰蛋白酶)水解蛋白質, 

水解後所產生的胜肽片段,與蛋白質的序列有關。將這些胜肽片段混合液利用質譜儀分析鑑 

定這些胜肽的質量,再利用電腦與資料庫中已知的蛋白質進行搜尋比對 (10) 。 

二、利用串聯質譜來鑑定及定序胜肽 

當有數種蛋白質混合在一起時,此時便可運用擁有串連質譜功能的質譜儀進行分析。即 

使是胜肽混合物,質譜儀可先在第一次質譜分析後,選取特定荷質比的離子,再與惰性氣體 

碰撞,引起碰撞誘起解離,使胜肽鏈斷裂,形成一系列離子,主要是N端碎片離子系列(B系 

列)和C端碎片離子系列(Y系列)(如圖九),在進行第二次的質譜測定。將這些碎片離子 

系列的質荷比資料送入電腦,與資料庫中已知的蛋白質進行搜尋,便可鑑定出此胜肽的胺基 

酸序列(如圖十)。

107 


圖九、胜肽經串聯質譜分析,所得斷裂離子之命名。碰撞誘起解離(CID)常常會隨機的在 

胜肽產生單點斷裂,而形成一系列離子,這些離子的質量往往僅相差一個胺基酸殘基。Y系 

列碎片離子是自C端遞增殘基,b系列碎片離子是則是自N端遞增殘基。當單點斷裂發生在胜 

肽骨架上其他位置,則會產生a與x系列離子,c與z等系列離子。 (11) 

串聯質譜還可運用在解讀未知的胜肽序列(De novo sequencing of peptides)上,因為當 

胜肽因碰撞誘起解離而產生一系列階梯狀的子離子。每一個子離子間所差的質量,即是因撞 

擊而產生掉落的胺基酸的質量差,因此可從這些數據推論得到未知的胜肽的胺基酸序列(如 

圖十一)。有許多胜肽與蛋白質都已用串聯質譜解讀序列成功 (12-13) 。 

參、質譜儀在蛋白質定量的應用 

x5 z5 

a3 c3 

在蛋白質體學研究中,蛋白質表現量也是屬於非常重要的研究課題之一,在質譜儀中, 

樣品產生訊號強度與樣品的量有關。因此可利用質譜儀來進行蛋白質定量。早期常用的定量 

方式是利用穩定的同位素,如2H, 13C, 15N進行蛋白質標示(Stable-isotope labeling)後,將 

有同位素標示的蛋白質與沒有同位素標示的蛋白質混合,在相同條件下進行蛋白質酵素水解 

及質譜分析,並比較同序列的胜肽所產生的訊號比 (14) 。但其缺點是無法直接測得組織內的蛋 

白質表現量,含穩定的同位素培養液所費不貲且可能影響細胞生長及蛋白表現。除此之外, 

無法預先得知增加質量的多少。

108 


圖十、串聯質譜定序。胜肽因碰撞誘導解離而產生一系列階梯狀的子離子,這些子離子碎片 

與胜肽的胺基酸序列有關。利用質譜儀分析鑑定這些子離子的荷電比,再利用電腦與已知的 

蛋白質或核苷酸資料庫來中進行搜尋比對 (10) 。 

現今可利用同位素標記親和標籤(Isotope Coded Affinity Tags,ICAT) 技術來進行定量 

分析。ICAT試劑分為兩種,分別為D0和D8。將這兩種試劑與同種細胞的不同形態(如正常 

細胞和腫瘤細胞)中的所有蛋白質反應(如D0與正常細胞混合,D8與腫瘤細胞混合),然後 

把兩種反應產物混合在一起進行蛋白質酵素水解。由於試劑只選擇與半胱胺酸(cysteine)反 

應,所以只有含有半胱胺酸的胜肽會被標記。利用親和色層管柱分離被標記的胜肽後,進行 

質譜與串聯質譜測定。質譜鑑定中,如出現一組質量相差8的訊號峰,可由D0和D8峰的質譜 

相對強度,進行定量測定,同時還可由串聯質譜鑑定是否為同一胜肽(如圖十一) (15) 。

109 


圖十一、質譜運用在蛋白質表現之定量測定。(A)ICAT試劑的構造。(B)將兩個不同 

來源取得的等量細胞萃取液,分別用D0-ICAT和D8-ICAT反應。然後把兩種反應產物混合在一 

起進行蛋白質酵素水解、親和色層管柱分離及質譜與串聯質譜測定。測定D0和D8的質譜相對 

強度便可求得兩種不同細胞中,同一蛋白質表現的差異。另外可利用串聯質譜來鑑定此蛋白 

質為何種蛋白質 (16) 

肆、質譜儀在蛋白質合成後修飾鑑定上的使用 

如要研究蛋白質合成後修飾(posttranslational modifications-PTM),則蛋白質體學是唯 

一的選擇工具。蛋白質合成後修飾有許多種的修飾。其中以磷酸化修飾,在生物體內扮演了 

控制訊息傳遞、調節蛋白質活性等相當重要的角色,其含量低、調控反應的變化量些微,增 

加了其純化及判定相對量的困難度,所以就質譜儀在分析蛋白質磷酸化位置的應用進行探討。 

磷酸化蛋白質攜帶負電荷,如果未經適當的前處理,其質譜上[M+H] + 訊號往往被其他非 

磷酸化的訊號所抑制而無法偵測到。可利用固相金屬親和性層析管柱(immobilized metal 

affinity chromatography(IMAC))先純化濃縮帶負電的磷酸化胜肽,以增加訊號。先用微酸 

性溶液洗去沒有磷酸化的胜肽,再以磷酸鈉緩衝液將磷酸化胜肽衝提析出,進質譜儀作定序 

與定量的分析 (17) 。

110 


另一個方法則是用鹼性磷酸酵素(Alkaline phosphatase)除去磷酸根,接著將樣品通入 

MALDI 質譜儀中分析。有磷酸化的胜肽與去磷酸化的胜肽,其質量會差 80Da。對胜肽而言, 

如出現這種質量差便可知此段胜肽有磷酸化 (18) 。 

另外也可以用串聯質譜來對胜肽進行碰撞誘導電離,生成磷酸特異標記的離子。碰撞誘 

導電離會使磷酸化胜肽易於進行脫去反應(elimination reaction),而失去一個磷酸。這時子離 

子中會出現一減少98 Da的訊號。如將這些碎片離子系列的質荷比資料送入電腦,與資料庫中 

已知的蛋白質進行搜尋,考慮對酪胺酸(Tyrosine)、絲胺酸(Serine)和蘇胺酸(Threonine) 

這些胺基酸殘基的質量多加80 Da,如此一來,不但可鑑定出此胜肽的胺基酸序列,還可鑑定 

出是哪一個胺基酸上有磷酸化。 

伍、質譜儀在蛋白質間相互作用研究之運用。 

在蛋白質體學中另一重要的議題便是要了解,蛋白質組合物之間的交互作用。純化蛋白 

質組合物最常用的方式是運用親和力(affinity)來進行純化。例如共同免疫沉澱法(Co-immunoprecipitation) 

(19) 或 GST融合蛋白沉澱法(GST-pull down) (20) ,至於會與DNA結合的蛋白質 

則可合成寡核苷酸,將蛋白質抓下來 (21) 。純化後的蛋白質組合物,用一維電泳膠片分離後, 

將染色好的蛋白質點挖下,利用膠體內酵素水解後,分別將peptide水解產物送入MALDI質譜 

儀或ESI質譜儀中進行蛋白質鑑定比對。也可以將蛋白質組合物直接用酵素水解後,利用 

LC-MS/MS將混合的peptide先經由管柱色層分離後,在用串聯質譜進行鑑定(如圖十二) (22) 。 

圖十二、利用共同免疫沉澱法、GST融合蛋白沉澱法將蛋白質抓下來後,有兩種可用來分析 

蛋白質組成物的方法。(a)純化後的蛋白質組合物,用SDS電泳膠片分離後,染色的蛋白質 

點挖下,進行膠體內酵素水解,分別將胜肽送入質譜儀中進行蛋白質鑑定比對;(b)將蛋白 

質組合物直接用酵素水解後,利用LC-MS/MS將混合的胜肽先經由管柱色層分離後,再用串

聯質譜進行鑑定蛋白質組合物中存有哪些蛋白質 (9) 。 

結語 

111 


質譜儀是現今蛋白質體學中進行研究所不可或缺的分析技術,理論上,任何可以被純化 

的蛋白質組合物或胞器都可用質譜儀來分析。由於ESI和MALDI等離子化技術的應用,可快 

速、穩定、準確地測定大分子。 

參考文獻 

1. Bakhtiar, R., and Nelson, R. W.(2001)Mass spectrometry of the proteome. Mol. Pharmacol. 60, 

405–415. 

2. Karas, M., and Hillenkamp, F.(1988)Laser desorption ionization of proteins with molecular masses 

exceeding 10,000 daltons. Anal. Chem. 60, 2299–2301. 

3. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S.F., and Whitehouse, C.M.(1989)Electrospray ionization 

for mass spectrometry of large biomolecules. Science 246, 64–71. 

4. Siuzdak, G.(1996)The emergence of mass spectrometry in biochemical research. in Mass Spectrometry 

for Biotechnology,pp16, Academic Press, San Diego, CA. 

5. Wilm, M., and Mann, M.(1996)Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Anal. Chem. 

68, 1–8. 

6. Guilhaus, M.(1995)Orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 30, 

1519. 

7. Yates, J. R.(1996)Protein structure analysis by mass spectrometry. Methods Enzymol. 271, 351-377. 

8. March, R. E.(1996)An Introduction to Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry. J. Mass Spectrom. 32, 

351-369. 

9. Yates, J. R. (2000)Mass spectrometry. From genomics to proteomics. Trends Genet 16, 5-8. 

10. Yates, J. R.(1998)Mass spectrometry and the age of the proteome. J. Mass Spectrom. 33, 1-19. 

11. Mann, M., Hendrickson, R. C., and Pandey, A.(2001)Analysis of proteins and proteomes by mass 

spectrometry. Annu. Rev. Biochem. 70, 437–73. 

12. Cox, A. L., Skipper, J., Chen, Y., Henderson, R. A., Darrow, T. L., Shabanowitz, J., Engelhard, V. H., 

Hunt, D. F., and Slingluff, Jr. C. L.(1994)Identification of a peptide recognized by five melan- 

oma-specific human cytotoxic T cell lines. Science 264, 716-719. 

13. Hunt, D. F., Henderson, R. A., Shabanowitz, J., Sakaguchi, K., Michel, H., Sevilir, N., Cox, A. L., 

Appella, E., and Engelhard, V.H.(1992)Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule 

HLA-A2.1 by mass spectrometry. Science 225, 1261-1263. 

14. De Leenheer, A. P., and Thienpont, L. M.(1992)Applications of Isotope Dilution-Mass Spectrometry in 

Clinical Chemistry, Pharmacokinetics and Toxicology. Mass Spectrom Rev 11, 249-307.

112 


15. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M.H., and Aebersold, R.(1999)Quantitative 

analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol 17, 994-999. 

16. Griffin, T. J., and Aebersold, R.(2001)Advances in proteome analysis by mass spectrometry. J. Biol 

Chem. 276, 45497-45500. 

17. Posewitz, M. C., and Tempst, P. ( 1999 ) Immobilized gallium(III) affinity chromatography of 

phosphopeptides. Anal. Chem.71, 2883–92. 

18. Powell, K. A., Valova, V. A., Malladi, C. S., Jensen, O. N., Larsen, M. R., and Robinson, P. J.(2000) 

Phosphorylation of dynamin I on Ser-795 by protein kinase C blocks its association with phospholipids. 

J. Biol. Chem. 275. 11610–11617. 

19. Boehning, D., and Joseph, S. K.(2000)Direct association of ligand-binding and pore domains in homo- 

and heterotetrameric inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. EMBO J. 19, 5450–5459. 

20. Rameil, P., Lecine, P., Ghysdael, J., Gouilleux, F., Kahn-Perles, B., and Imbert, J.(2000)Oncogene 19, 

2086–2097. 

21. Nordhoff, E., Krogsdam, A. M., Jorgensen, H. F., Kallipolitis, B. H., Clark, B. F., Roepstorff, P., and 

Kristiansen, K.(1999)Rapid identification of DNA-binding proteins by mass spectrometry. Nat. 

Biotechnol. 17, 884–888. 

22. Link, A. J., Eng, J., Schieltz, D. M., Carmack, E., Mize, G. J., Morris, D. R., Garvik, B. M., and Yates, 

III J.R.(1999)Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 17, 

676–682.

前言 

第十章 

串聯質譜儀測定法 

Tandem Mass Spectrometry 

中研院生物化學研究所 

陳水田,曾致勳 

113 

第十章、串聯質譜儀測定法 

由於各種基因體研究計畫(genome project)的陸續進行及完成,提供生命科學研究許多 

的基因資訊,使我們瞭解基因與細胞、組織及疾病之間的關連性。然而大多數的生物功能是 

表現在蛋白質層級而非基因層級。因為會有各種調控及修飾作用發生 (1) ,所以有 DNA 的存 

在,不能完全代表有 RNA 之表現。而 RNA 之表現也不一定完全能代表蛋白質之表現。更 

重要的是,蛋白質在各組織器官間的表現也有差異,在發育之各時期及正常細胞與腫瘤細胞 

間也有差異。而且蛋白質在細胞內之表現位置(例如在細胞核或在細胞質)的不同也會影響 

其功能 (2) 。因此對蛋白質直接且深入的研究是極為重要的課題。因為蛋白質本身組成、結構 

及功能較基因複雜,也使蛋白質的研究一直是需要花費更多時間來瞭解。人類基因體計畫 

(human genome project)也於 1990 年開始發展,於 2001 年二月已完成 90%以上的初步定序 

結果 (3) ,至此進入後基因體時代(post-genomics era),其中最受矚目的是蛋白質體(proteome) 

的研究。蛋白質體學(proteomics)是研究蛋白質分離、鑑定及特性分析的一門學科。其中的 

二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)是分離蛋白質的技術,而質譜分析 

(mass spectrometry, MS)則是鑑定及分析蛋白質的重要技術。 

質譜分析法應用的快速成長,發生在與氣相層析分析法結合時,藉由氣相層析將許多複 

雜的混合物之個別成份分離進行即時質譜分析,這個階段成長大多是在石油和環境的應用分 

析中發生。藉由合適於蛋白質和氨基酸分析上的游離化技術的發展,如電噴灑離子化 

(Electrospary,ES)和基質輔助雷射去吸附游離化(Matrix-assisted laser desorption/ionisation, 

MALDI) (4) ,在與生物醫學分析的應用為基礎上,質譜分析法正在經歷快速成長的另一階段。 

四個主要的質譜分析優點對蛋白質定序和鑑定分別為(1)高敏感性(2)快速分析(3)大量 

資訊獲得及(4)能表示後修飾作用的特色。近幾年來,質量範圍增加到大於 10 -5 道爾頓 

(Dalton),而且樣品分析量只需求 10 -15 莫耳(femtomole)濃度。這能力與串聯質譜被改良 

或的新的分析器設計、高通量資料分析的軟硬體和自動化工程的完成有關。 

內容 

壹、質譜分析法的一般概念 

質譜儀依照物質離子的質荷比(mass charge ratio,m/z)將其分離,且記錄每個離子的相 

對含量。儀器主要由三個組成(如圖一)(1)離子源(2)分析器將離子源(Ion source)離子 

化的離子依據不同質荷比分離(3)偵測器系統。此外,為了維持高真空要求(10 -6 到 10 -8 mmHg)

的真空裝置和一套電腦用以控制儀器、獲得且分析數據及比對參考資料庫 (5) 。 

真空系統 

導入系統 

離子系統 

分析系統 

偵測系統 

資料系統 

圖一、質譜儀的組成 

渦輪幫浦擴散幫浦機械幫浦 

樣品盤高效率液相層析儀 

氣相層析儀 

114 


基質輔助雷射去吸附游離化大氣壓游離電噴灑離子化 

離子噴灑快速原子撞擊電游離化學游離 

飛行時間四極體離子陷阱磁場式扇形式 

傅立業-轉換加速共振 

微頻道盤電子倍增器複合式 

微軟系統昇陽系統 spark工作站 DEC工作站 

質譜分析法的原理是氣相離子的質量與電荷比(m/z)的測量。質譜分析法幾乎是一個毀 

滅性的分析法,意謂樣品會被耗盡。在1900年,Sir. J. J. Thomson 發展了早期的技術 (6) 。質譜 

分析法在許多的領域中有重要的功能,包括生物化學 (7) 、生物技術 (8) 、藥理學 (9) 微生物學 (10) 

和蛋白質體學及功能性基因體領域 (11,12) ,今天質譜分析是檢測生命分子特性最敏感的方法。 

類固醇可能在10 -12 克(picogram)含量被發現 (13,14) 、蛋白質在10 -12 莫耳(picomole)含量下 

被鑑定 (15,16) 和神經性胜肽可能在10 -18 莫耳(zeptomole)含量被偵測 (17) 。生物化學的質譜分析 

的許多進步,主要是由於在1980年代中柔軟離子化(soft ionization)的發展,使極性和熱不 

穩定的生命分子可電離和汽化的方法。現今在生物化學實驗室中使質譜儀成為一個常用的儀 

器。那柔軟離子化方式為基質輔助雷射去吸附游離化 (18) 和電噴灑 (19-21 )。這些離子化方法已經 

可直接的分析極性和熱地不穩定的生命分子,生命分子的非共價複合物現今能在10 6 道爾頓 

(megadalton,MDa)分子量範圍中被分析 (22) 。在最近十年期間,質譜分析法已經脫穎而出 

成為分子層級生物研究的主要分析技術。已經有大的生物分子的研究在質譜儀器及其應用 

上,特別地在蛋白質和胜肽分析的領域。 

當離化分子被轉移到氣體相的時候,許多分析器利用樣品特有的質荷比進行解析,像是 

四極體質量濾器(quadrupole mass fulters,Q) (23) 、雙層聚焦磁性和電性扇形(double-focusing 

magnetic and electric sector) (24,25) 、飛行時間(time of fight,TOF) (26,27) 、四極體離子陷阱 

(quadrupole ion traps) (28,29) 和傅立業轉換離子迴旋加速共振(fourier-transform ion cyclotron

115 


resonance,FTICR) (30) 質量分析器。分析器的選擇將因特定的應用和需要,將可能影響研究 

的準確度、解析度、敏感度及成本。 

而二個或更多個的分析器可以被聯合造成一個串聯的質譜儀,它最簡單的 MS/MS 形式 

(如圖二) 是由二個質譜儀所組成藉著第一個分析器(MS1)使離子被選擇而再被第二個分 

析器分析(MS2),另外像是一個三層四極體(triple stage quadrupole) (31) 或一個混合的儀器 (由 

二個不同的分析器所組成),如四極體-或磁性的扇形-TOF (32) 。這些串聯的質譜儀的一個特 

徵是在二個分析器區域之間設置的一個踫撞細胞(collision cell) (33) 。這一個碰撞細胞有惰性 

氣體(如氬氣)進入,已經被第一個分析器選擇的母離子(precursor ion),被碰撞而且片段 

化分裂。在串聯的質譜分析法(MS/ MS)過程生產的碎片是子離子(product ion),而且他 

們的質量測量是在第二個分析器區域中。子離子的性質能被使用決定氨基酸的初級結構,也 

就是胺基酸序列 (34) ,這 MS/ MS 分析在現代的生物化學中被廣泛地使用。 

圖二、串聯質譜儀 

樣品導入 

離子源 

第一分析器 

(MS1) 

片段化區 

資料處理器 

貳、串聯質譜儀(Tandem mass spectrometer) 

第二分析器 

(MS2) 

偵測器 

串聯質譜分析法(MS/ MS)藉由在質譜儀之內樣品碎片的特定離子和辨認所產生的碎片 

離子可得到結構資訊。而串聯質譜分析法也使特定的化合物能夠在複雜混合物中,根據其不 

同的篩選模式而被偵測。 

MS/MS 的基本的概念為如何決定質量在 MS1 的一個母離子和在 MS2 的一個子離子 

之間的關係,依據 MS1 和 MS2 掃瞄的模式,不同的質量可能被研究。這些如含一個母離子 

的分裂和含它所有的碎片(子離子掃瞄)的測量、多重的母離子的選擇和檢驗是否為一個共 

同的碎片(母離子掃瞄)或掃瞄許多的母離子全部喪失相同的不帶電物質(中性丟失掃瞄, 

Neutral loss scan)(如圖三) (35-37) 。 

一、子離子掃瞄(precursor ion scan)在 MS1 時選擇一特定分析離子,使其和氣體(如氮 

氣)碰撞,進行碰撞活化解離,然後在 MS2 掃瞄所有的離子。利用此法的掃瞄圖譜可 

以鑑定某一特定化合物結構。 

二、母離子掃瞄(product ion scan)在 MS2 選擇一特定的子離子,找尋 MS1 能產生此被選

116 


擇的子離子的母離子。利用此法的掃瞄圖譜可以找出某些特定化合物具有特定片段。 

圖三、串聯質譜的掃瞄模式 

三、中性丟失掃瞄(neutral loss scan)對 MS1 及 MS2 做差異某一固定質量的同步掃瞄,可 

在複雜混合物中找尋具有相同官能基。 

四、選擇反應偵測(selected reaction monitoring)被使用減少在定量分析期間遇到的干擾, 

增強訊號雜訊比(signal-to-noise ratio)提高靈敏度,適於微量分析。 

上述檢測模式亦可混合使用,形成混合的掃瞄模式,如中性丟失掃瞄/母離子掃瞄或中性

117 


丟失掃瞄/選擇反應偵測等模式,混合的掃瞄模式提供更多樣的訊息及縮短分析時間,更 

可因實驗的需求而做不同的設計,使實驗條件更方便掌控。 

以藥物在 MS/MS 應用為例應用,子離子掃瞄可能被使用獲得來自藥物物質、雜質和污 

染物的母離子的性質上的訊息,這能在未知的事物鑑定有所助益。這方法也可能被使用來決 

定胜肽和蛋白質碎片的胺基酸順序。MS/ MS 有利於分析混合物,即在質譜儀加上一個分離 

裝置,像是一個液體或氣體層析分析儀。MS/ MS 可能被用來選擇自一個成分的母離子而用 

獲得的結構資訊。MS/ MS 也可能在新陳代謝中被用來學習用結構的特徵,像是與藥物物質 

有關的新陳代謝產物尋找相關的分子。所有的新陳代謝產物都可能含有丟失,如一個中性的 

碎片的同一的官能基。在這情況,一個中性丟失掃瞄將顯示所有的這些情形。例如:carboxyl 

酸將全部喪失中性的二氧化碳 (38) 。 

一、串聯質譜片段化 

MS/ MS 在生物化學的領域中,最常使用的是以子離子或母離子掃瞄對胜肽和核甘酸的 

序列分析實驗。一個斷裂能在一個胜肽的任何的位置上發生,而一個圖譜也含有所有的可能 

的離子峰。有三個不同類型的鍵結可沿著胺基酸主幹斷裂: NH-CH、 CH-CO 及 CO- 

NH 化學鍵。每個化學鍵破壞時可形成二個樣式,一個中性的分子和另一個是帶電荷的分子, 

而只有帶電荷樣式可被質譜儀檢測。電荷可停留在其中任何一個二個碎片上,依據二個式樣 

的化學特性和相對的質子親和力,每個胺基酸殘餘物有六種可能的碎片離子可能產生,將這 

些貼上標籤於圖四中表示,如藉由 A、B 和 C 表示在 N 末端碎片有電荷的離子和 X、Y 

和 Z 離子表示在 C末端碎片有電荷的離子。最常的斷裂位置在 CO-NH 化學鍵,可產生 B 和 

或 Y 離子。在低能量的碰撞引誘下,一個胜肽主要地沿著它的主幹攜帶一個正電荷,以發生 

A 、B 和 Y離子居多(即是一個三層帶四極或一個離子陷阱)。除此之外,這些離子能時常 

由於氨或水的損失而形成的新的離子 (5,35,37) 。 

H 2 N CH C 

N-termin 

al 

圖四、斷裂模式 

CH 3 

H 2 N CH C 

R 

O 

X3 Y3 Z3 X2 Y2 Z2 X1 Y1 Z1 

+2H +2H 

+2H 

O 

A1 B1 

H 

N 

H 

N 

+2H 

C1 

CH C 

CH 3 

CH C 

R 

O 

O 

H 

N 

H 

N 

+2H 

A2 B2 C2 

CH C 

CH 3 

CH C 

R 

O 

O 

H 

N 

H 

N 

+2H 

A3 B3 C3 

CH C 

CH 3 

CH C 

R 

O 

C-termin 

O 

OH 

OH

118 


二、串聯質譜儀的種類 

串聯質譜儀以不同的串聯方式區分為兩種系統如表一。以「空間」串聯的串聯質譜儀依 

實驗設計的不同含有多個分析器,儀器如串聯四極體-四極體(如圖五)和四極體-飛行時間 

(圖六)、磁場式扇形-四極體等。而以「時間」串聯的串聯質譜儀僅含有一個分析器,且分 

析器必須能捕捉離子。儀器如離子陷阱(ion trap),這些儀器是沒被限制在簡單的 MS/ MS 

實驗,但是在最佳的情況時能達成複式的 MS/MS/MS…分析,及使用離子迴旋加速共振(ion 

cyclotron resonance,ICR)技術的傅立業轉換質譜,一系列的離子在陷阱(trap)中被選擇而 

且以一個適當的射頻脈衝啟動。 

圖五、串聯四極體質譜儀 

+ 

+ + 

+ 

+ + + 

+ 

+ 

+ 

+ + 

+ + 

+ 

+ 

+ 

+ + 

圖六、混合四極體-飛行時間質譜儀 

參、串聯質譜分析法的最近的發展 

質譜分析法現在正在很快速地發展,而和生物研究的整合是一個主要的驅動力。新的儀 

器被設計符合蛋白質體時代的自動化分析的需要。ES和 MALDI是自動化發展中適當的電離 

技術,在和串聯質譜儀的結合中,為生物研究上提供大量、快速及正確的分析工具,下面將 

簡要地描述三種新的質譜儀器組態, MALDI Q-TOF 、MALDI TOF-TOF 和新一代的Q-TOF 

可結合 MALDI 和超微量液相層析(nano- or capillary- LC),全部將以鑑定蛋白質和氨基酸 

描述。

表一、串聯質譜的分類 

「空間」式串聯 

(tandem in space) 

「時間」式串聯 

(tandem in time) 

119 


一、MALDI Q-TOF 

結合胜肽指紋辨識(peptide mass fingerprinting,PMF)的高的速率和高處理樣品量的 

MALDI和特異性MALDI Q-TOF串聯質譜已被發展 (39) 。通常MALDI PMF 是有效率的,當吻 

合的胜肽片段的數目在統計上具有意義時候,但是鑑定個別的胜肽離子特色的能力直到最近 

都被限制。但藉由離子源後裂解(post source decay,PSD)的應用,一些 MS/ MS 資訊可能 

在一個 MALDI TOF 實驗中被獲得。然而,低的母離子解析度、差的準確度及低含量的子離 

子一起出現在這一個操作時,將使蛋白質的鑑定更為困難 (40) 。在 MALDI Q-TOF 串聯質量圖 

譜中PSD子離子的含量通常是低的,主要是由於一個在C端帶單一電荷的酵素水解肽所造 

成。 

然而,MALDI Q-TOF 的 MS 和 MS/MS 模式的高的準確度和優良的解析度讓蛋白質的 

識別可經由 PMF 或從被胜肽母離子因碰撞誘導分離(collision induced dissociation,CID)所 

產生的 MS/MS 資訊中獲得。這種儀器的使用不需考慮對試樣作區分和額外的純化等在電噴 

灑質量測量需要考慮的問題,而且 PMF 和 MS/MS 實驗可能發生在相同的訊息目標上。另 

一個優點是時間面:試樣不會在訊息目標出現幾分鐘之內被耗盡。然而,數據品質從這一個 

混合的儀器獲得和超微電噴灑 QTOF(nanospary-QTOF)儀器的時候相比時仍然不高。 

二、MALDI TOF-TOF 

串聯四極體(tandem quadrupole) 

四極體-飛行時間(quadrupole-time-of-flight) 

反射式-飛行時間(reflectron-time-of-flight) 

串聯扇形(tandem sector) 

扇形-四極體(sector-quadrepole) 

離子陷阱(ion trap) 

傅立葉轉換(fourier transform) 

這是最近發展的儀器使用 TOF 的技術用以母離子選擇和子離子測定。主要的目地是使 

一個串聯質譜儀具有可比擬磁場式扇形質譜儀的解析度和質量準確度,且亦保有MALDI-TOF 

具有的偵測速度和可測定的質量範圍 (41) 。一個依時間為基準的離子選擇器已經被發展,讓一 

個具高解析度的特定 m/ z 離子從第一個 TOF 分析器被傳輸,而其它離子則被排除。當離子

120 


到達時,使用二個可以快速地開起和關閉的柵欄控制。第一個柵欄排除低質量離子和第二個 

柵欄排除高質量離子。選擇器的解析能力高達 2000 的 m/z 層級足夠用以選擇單一同位素的 

胜肽,且不會有重要的傳輸損失發生。被第一個 TOF 質量分析器分開的離子以碰撞細胞的 

PSD 或高能 CID 被篩選。兩者的 TOF 分析器在延緩引出(delayed extraction)模式中被操 

作,而且讓一個一個子離子光譜在一次操作中完全被獲得,測量的解析能力在2000–10,000 

(FWHM)的範圍中 (42) 。 

這一個儀器的主要的缺點是對高質量子離子的敏感度較弱。這一個限制使只能提供一個 

分子量大約在 1800 道爾頓胜肽的 MS/ MS實驗的完全序列訊息。當分析的蛋白質酵素水解 

物在10 -12 莫耳或更少量,使用傳統的試樣製備技術的時候,敏感度也是一個問題。在這情況, 

有用的序列離子只能從圖譜的最強烈的信號被發生。儀器設計顯得有趣的,而且主要用以進 

行大量且繁雜如蛋白質分析的一個最佳化工具。然而,一個一個單一電荷的胜肽離子藉著一 

個 MALDI 離子源會減少可能產生的完全序列訊息。因此,一個直角的電噴灑離子源將會對 

於儀器的界面是有用的。 

三、MALDI Q-TOF/ LC-MS/MS、ES Q-TOF LC-MS/ MS及MALDI/ ES Q-TOF/ LC-MS/ MS 

對不宜用來分析分子量較大、熱不穩定或極性較大等樣品的氣相層析質譜儀(GC/ MS), 

LC/MS/MS 也是一種互補的工具。也由於使用了線上(on-line)技術,讓 LC/MS/MS 可直接 

分析已先經由液相層析儀分離純化之蛋白質及胜肽。 

多重的導入介面模式 MS/MS平台:結合 MALDI 和ES儀器最近已經在市場之上被發 

展。這一個新的質譜儀的設計,以在不停機狀況下進行離子源模式之間變更為特色。質量分 

析有在傳統的` V '模式TOF上面可以偵測 20,000 m/z的質量範圍和解析度 10,000 

(FWHM)。儀器有可選擇的` W '模式 TOF 技術為最大的解析度(>20,000 FWHM), 

但是在敏感度上有一些損失。對蛋白質和胜肽鑑定研究上,低能量 CID及高解析度在一個單 

一儀器上具有 MALDI 和電游離電離之間轉換離子源的功能將使儀器很有吸引力。 

肆、質譜的應用 

一、蛋白質 

許多蛋白質分析目前有兩個方向(1)尚未被分析的蛋白質和(2)分析起源於用化學或 

酵素地水解的蛋白質。 

(一) 分子的質量 

三種質譜分析法的電離技術被普遍使用於測量蛋白質的分子的質量,這些是 ES MS , 

MALDI MS 和電漿去吸附(plasma desorption,PD)MS,而且每個有特定的優點和限制, 

如分解、敏感度、鹽類、精密度的感受性、速率和最重要的是,大批的測量準確度。然而, 

一些限制適用於全部,如避免試樣的 SDS 或其他的表面活化劑、磷酸鹽緩衝劑和過量的任 

何的鹽類或其他的主要的污染物。

121 


(二) 後轉譯修飾 

對一個蛋白質的許多化學變化發生在核糖體上的合成後,包括一部分的蛋白質水解、醣 

基化(glycosylation) (43) 、醯基化(acylation)、磷酸化(phosophorylation)、甲基化(methylation) 

及雙硫鍵(disulfite bond)的交互反應等 (44) 。這些共同的特點是他們變更原來分子的質量。仰 

賴特定的分析,鑑定特異性修飾如分析蛋白質添加化學藥劑或酵素前後變化,及分析蛋白質 

水解胜肽所發生的小特異性胜肽變化 (45-47) 。 

(三) 雙硫鍵結的位置 

雙硫鍵結在蛋白質中的數目及位置,藉著質譜分析法可相當有效地找出分子內和分子間 

的位置 (47) 。蛋白質的半胱氨醯 cysteinyl 殘留物的數目可很快地被蛋白質的烴基化作用決 

定。每個氮苯乙基基團 pyridylethyl 基團為每個被修改的 cysteinyl 殘餘物增加 105 道爾頓。 

分子的質量分析,在使用烴基化前後以 ES 或 MALDI MS 測定,如此可提供被修改的 

cysteinyl 殘留物的總數。雖然質譜分析法為雙硫鍵的位置提供一些重要的資訊,但是它不能 

排除能在一個蛋白質中發生的複雜和交換的雙硫化學鍵,而在原來的蛋白質中不表現。這在 

蛋白質的分離、試樣製備和分析期間能自己發生。 

(四) 非共價相互作用 

許多蛋白質鍵結其他的分子,像是低的分子的配體(ligand)或其他的蛋白質形成的成分 

複合物。雖然有許多已經被使用測量這些相互作用的化學計量和動力學的技術,質譜分析法 

已經開始被使用測量這些複合物的分子的質量。因為只有一些例子已經被發表,所以目前質 

譜分析法是否成功,仍然不是清楚。雖然在非共價相互作用的測量之應用還在成長中,目前 

進行的蛋白質-配體和蛋白質-蛋白質相互作用方面的研究是可被寄予希望的發展 (48-49) 。 

二、胜肽 

近年來,質譜分析法已經被使用來分析,使用的游離方法,像是電子游離(electron 

ionisation,EI)和化學游離(chemical ionisation,CI)在 N 端或 C 端進行衍生化作用和不活 

化支鏈後而增加其揮發性。ES 和 MALDI 游離方法有效的被應用,這些技術在分子生物分 

析使用頻繁,而且在胜肽分析有某些特定的優點,如下列例子所說明。 

(一) 混合分析 

最好的胜肽的分析是在進行大批分析之前,先有一個分離的階段。為了獲得更豐富的、 

有效率的、適當的和省時的研究,使用 LC/ MS 或 CE/ MS 技術進行線上操作分析(on-line)。 

識別被蛋白質酵素所水解而成的胜肽是 LC/ MS 應用於胜肽混合物的分析之一。通常儘 

管水解物僅含有 30-40 或更多的胜肽碎片,多數胜肽(>90%)依然可被辨識。質譜分析法 

的能力在這情況可很好地說明,因為不但能根據個別的質量圖譜而測量胜肽的分子質量,而 

且一些胜肽碎片離子也可得到胺基酸序列的訊息。Y 離子是起源於 C 端的離子碎片和另一來 

自 N 端的 B 離子,ES 可有效地應用 LC/MS 在複雜的混合分析上被使用 (51) 。如圖七所示將 

1742.893 m/z MS 生胜肽片段進一步進行 MSMS 分析。CE/MS 在生物分子是快速成長分析的

122 


技術。因為試樣載入量很小(10-50 nanoliters),試樣的濃度是大約相同於 LC/ MS ,即 10-50 

pmols/L。特別的應用已經在微的使用 m/z 範圍監測技術可到達 10 -21 莫耳(attomole)敏感 

度。 

圖七、MS 及 MS/ MS 質譜圖譜 

(二) 序列分析 

新的游離化和分析器技術對質譜分析法的能力是一個重要的衝擊,可定序大約分子量 

2500 道爾頓且含量少(10 -12 莫耳)的分子。兩種一般的方法是,首先包括以 MS/ MS 技術進 

行行產品的游離、胜肽離子斷裂和識別,和而第二種則利用特定的酵素或化學反應形成胜肽 

和使用質譜分析法分析產物。二不同類型的 MS/MS 儀器普遍被用到胜肽序列定序,如三層 

四極質譜儀(triple quadrupole spectrometer)和串聯的高效率磁場式質譜儀 (37,52-53) 。 

例如三重的四極體,也可有效地使用於序列小的胜肽,通常在 2000 道爾頓下。三重的 

四極儀器通常在低的解析下可將敏感度最佳化,全部分子的離子同位素會通過第一個分析 

者。充分的斷裂數據可獲得到胜肽序列順序。三重的四極體主要的優點是儀表設計小,複雜 

度低,而且價格被定得比高能磁場式的 MS/ MS 系統的少四分之一。三重式四極體 MS/ MS 

系統由於它的低的加速電壓符合 ES 原理,減少分裂性的電子放電。一般 MS/MS 圖譜在頂 

端顯示列出可能的 A , B 和 Y 離子碎片,根據一個一個地在質譜中被發現的離子,胜肽 

序列次序從這些離子碎片被獲得 (4,54) 。 

結語

123 


質譜分析法已經成為生命科學研究上的一個重要的分析的工具。它的速率、準確度和敏 

感性和傳統的分析技術相比較是無與倫比的。蛋白質的鑑定和初級結構特性研究在後基因體 

時代有一個快速地成長領域,在結合電游離串聯質譜儀和基質輔助雷射去吸附游離時間飛行 

的胜肽指紋辨識可以有效率地解釋許多發生的問題。多數最近決定的基因體序列沒有是在蛋 

白質層級上所表現。胺基酸順序的分析及鑑定後轉譯修飾作用和蛋白質的結構及功能等重要 

的階段有所關聯。 

串聯質譜儀是複雜的儀器。串聯質譜分析法不是一個簡單的方法,需要數個的專門領域 

的科學家共同進行操作分析。串聯質譜儀器昂貴和妥善率達成是必須考量的成本。將來在實 

驗室中,串聯質譜儀分析法將成為一個強力的工具。串聯質譜儀分析法和其他形式的質譜分 

析法將來或許被使用分析其他的可治療的病變或更多檢測上。 

參考文獻 

1. Quadroni, M., and James, P.(1999)Proteomics and automation. Electrophoresis 20, 664-677. 

2. Banks, R. E., Dunn, M. J., Hochstrasser, D. F., Sanchez, J. C., Blackstock, W., Pappin, D. J., and Selby, P. 

J.(2000)Proteomics: new perspectives, new biomedical opportunities. The Lancet. 356, 1749-1756. 

3. Pandey, A., and Mann, M.(2000)Proteomics to study genes and genomes. Nature 405, 837-846. 

4. Costello, C. E.(1999)Bioanalytic applications of mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 

10, 22-28. 

5. Liebler, D.(2002)Introduction to proteomics-tools for the new biology. pp.55-98.Humana Press. 

6. Thomson, J. J.(1913)Rays of Positive Electricity and Their Applications to Chemical Analysis, 

Longmans Green, London 

7. Siuzdak, G.(1994)The emergence of mass spectrometry in biochemical research. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA 91, 11290–11297. 

8. Carr, S. A., Hemling, M. E., Bean, M. F., and Roberts, G. D.(1991)Integration of mass spectrometry in 

analytical biotechnology. Anal. Chem. 63, 2802–2824. 

9. Fenselau, C.(1992)Tandem mass spectrometry: the competitive edge for pharmacology. Annu. Rev. 

Pharmacol. Toxicol. 32, 555–578. 

10. Easterling, M. L., Colangelo, C. M., Scott, R. A., and Amster, I. J.(1998)Monitoring protein expression 

in whole bacterial cells with MALDI time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 70, 2704–2709. 

11. Roepstorff, P.(1997) Mass spectrometry in protein studies from genome to function. Curr. Opin. 

Biotech. 8, 6–13. 

12. Pandey, A., and Mann, M.(2000)Proteomics to study genes and genomes. Nature 405, 837–846 

13. Chatman, K., Hollenbeck, T., Hagey, L., Vallee, M., Purdy, R., Weiss, F., and Siuzdak, G.(1999) 

Nanoelectrospray mass spectrometry and precursor ion monitoring for quantitative steroid analysis and 

attomole sensitivity. Anal. Chem. 71, 2358-2363.

124 


14. Griæths, W. J., Liu, S., Yang, Y., Purdy, R. H., and Sjovall, J.(1999)Nanoelectrospray tandem mass 

spectrometry for the analysis of neurosteroid sulphates. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 1595-1610. 

15. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., and Mann, M.(1996)Mass spectrometric sequencing of proteins 

from silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858. 

16. Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Brelt, S., Schweigerer, L., Fotsis, T., and Mann, M.(1996) 

Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. 

Nature(London)379, 466-469. 

17. Andre, P. E., Emmett, M. R., and Caprioli, R. M.(1994)Micro-electrospray : zeptomole/attomole per 

microlitre sensitivity for peptides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5, 867-869. 

18. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., and Hillenkamp, F.(1987)Matrix-assisted ultraviolet laser desor 

-ption of non-volatile compounds. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proces. 78, 53–68. 

19. Yamashita, M., and Fenn, J. B. (1984) Electrospray ion source: another variation on the free-jet theme. 

J. Phys. Chem. 88, 4451–4459. 

20. Yamashita, M., and Fenn, J. B.(1984)Negative ion production with the electrospray ion source. J. Phys. 

Chem. 88, 4671–4675. 

21. Alexandrov, M. L., Gall, L. N., Krasnov, N. V., Nikolaev, V. I., Pavlenko, V. A., and Shkurov, V. A. 

(1984) Direct coupling of a microcolumn liquid chromatograph and a mass spectrometer. Bioorg. Khim. 

10, 710–712. 

22. Rostom, A. A., and Robinson, C. V.(1999)Detection of the intact GroEL chaperonin assembly by mass 

spectrometry. J.Am. Chem. Soc. 121, 4718-4719. 

23. Paul, V. W., and Steinwedel, H.(1953)Ein neues Massenspektrometer ohne Magnetfeld. Z. Naturforsch. 

8a, 448–450. 

24. Dempster, A. J.(1918)A new method of positive ray analysis. Phys. Rev. 11, 316–324 

25. Johnson, E. G., and Nier, A. O. (1953) Angular aberrations in sector-shaped electromagnetic lenses for 

focusing beams of charged particles. Phys. Rev. 91, 10–17. 

26. Wiley, W. C., and McLaren, I. H.(1955)Time-of-flight mass spectrometer with improved resolution. 

Rev. Sci. Instrum. 26, 1150–1157. 

27. Guilhaus, M., Mlynski, V., and Selby, D.(1997)Perfect timing: time of flight mass spectrometry. Rapid 

Commun. Mass Spectrom. 11, 951–962. 

28. Paul, W., and Steinwedel, H.(1960)US Patent number 2939-2952. 

29. March, R. E.(1997)An introduction to quadrupole ion trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 32, 

351–369. 

30. Comisarow, M. B., and Marshall, A. G. (1974) Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy. 

Chem. Phys. Lett. 25, 282–283. 

31. Yost, R. A., and Enke, C. G. (1978) Selected ion fragmentation with a tandem quadrupole mass

spectrometer. J. Am. Chem. Soc. 100, 2274–2275. 

125 


32. Bateman, R. H., Green, M. R., Scott, G., and Clayton, E. ( 1995 ) A combined magnetic 

sector-time-of-flight mass spectrometer for structural determination studies by tandem mass spectrometry. 

Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1227–1233. 

33. Hoffmann, E. de.(1996)Tandem mass spectrometry: a primer. J. Mass Spectrom. 31, 129–137. 

34. McLafferty, F. W.(1983)Tandem Mass Spectrometry. Wiley, New York 

35. Mann, M., Hendrickson, R. C., and Pandet, A.(2001)Analysis of proteins and proteomes by mass 

spectrometry. Annu. Rev. Biochem.70, 437-473. 

36. Griffiths, W. J., Jonsson, A. P., Liu, S., Rai, D. K., and Wang, Y.(2001)Electrospray And tandem mass 

spectrometry in biochemistry.Biochem. J. 355, 545-561. 

37. Dass, C.(2001)Principles and practice of biological mass spectrometry.chp.4:tandem mass spectrometry. 

38. American college of medical genetics/American society of human genetics test and technology transfer 

committee workinggroup.(2000)Tandem mass spectrometry in newborn screening.ACMG/ASHG 

statement. 2,No.4. 

39. Shevchenko, A., Loboda, A., Shevchenko, A., Ens, W., and Standing, K. G.(2000)MALDI quadrupole 

time-of-flight mass spectrometry: a powerful tool for proteomic research. Anal. Chem. 72, 2132–2141. 

40. Griffin, P. R., MacCoss, M. J., Eng, J. K., Blevins, R. A., Aaronson, J. S., and Yates, J. R.(1995)Direct 

database searching with MALDI-PSD spectra of peptides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 

1546–1551. 

41. Vestal, M., Juhasz, P., Hines, W., and Martin, S.(2000)A new delayed extraction MALDI-TOF MS-MS 

for characterization of protein digests. In: Mass Spectrometry in Biology and Medicine, pp. 1-16, Carr S. 

A., Burlingame A. L. and Baldwin M. A, Humana Press, Totowa, N. J. 

42. Loboda, A. V., Krutchinsky, A. N., Bromirski, M., Ens, W., and Standing, K. G.(2000)A tandem 

quadrupole/time-of-flight mass spectrometer with a matrix-assisted laser desorption/ionization source: 

design and performance. Rapid Commun. Mass spectrum. 14,1047-1057. 

43.Kuster, B., Krogh, T. N., Mortz, E., and Harvey, D. J.(2001)Glycosylation analysis of gel-separated 

proteins . Proteomics 1, 350-361. 

44. Krishna, R. G., and Wold, F. "Post-Translational Modifications of Proteins", in Methods in Protein 

Sequence Analysis,(K. Imahori and F. Sakiyama, eds.), Plenum Press, New York, 167-171, 1993. 

45. Aebersold, R., and Goodlett, D. R.(2001)Mass spectrometry in proteomics. Chem. Rev.101, 269-295. 

46. Teng-umnauy, P., Morris, H. R., Dell, A., Panico, M., Paxton, T., and West, C. M.(1998)The cyto- 

plasmic F-box binding protein SKP1 contains a novel pentasaccharide linked to hydroxyproline in 

Dictyostelium. J. Biol. Chem. 273,18242-18249. 

47. Lacko, A. G., Reason, A. J., Nuckolls, C., Kudchodkar, B. J., Nair, M. P., Suundarrajan, G., Pritchard, P. 

H., Morris, H. R., and Dell, A.(1998)Characterization of recombinant human plasma lecithin :cholesterol

126 


acetyltransferase(LCAT): N-linkedcarbohydrate structures and catylytic properties. J. Lipid Res. 39, 

807-820. 

48. Smith, D. L., and Zhou, Z. (1990) "Strategies for Locating Disulfide Bonds in Proteins", in Methods in 

Enzymology: Mass Spectrometry,(J. A. McCloskey, ed.), Vol. 193, Academic Press, Inc., San Diego, 

374-389. 

49. Smith, R. D., and Light-Wahl, K. J.(1993)The observation of non-covalent interactions in solution by 

electrospray ionization mass spectrometry : promise, pitfalls and prognosis. Biol. Mass Spectrom. 22, 

493-501. 

50. Pramanik, B. N., Bartner, P. L., Mirza, U. A., Liu, Y. H., and Ganguly, A. K.(1998)Electrospray 

ionization mass spectrometry for the study of non-covalent complexes : an emerging technology. J. Mass 

Spectrom. 33, 911-920. 

51. Ling, V., Guzzetta, A. W., Canova-Davis, E., Stults, J. T., and Hancock, W. S.(1991)"Characterization 

of the Tryptic Map of Recombinant DNA Derived Tissue Plasminogen Activator by High-Performance 

Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry", Anal. Chem. 63, 2909-2915. 

52. Hunt, D. F., Krishnamurthy, T., Shabanowitz, J., Griffin, P. R., Yates, J. R., Martino, P. A. McCormack, 

A. L., and Hauer, C. R. (1991) in Mass Spectrometry of Peptides, (D. M. Desiderio, ed.), CRC Press, 

Inc., Boca Raton, FL, 139-158. 

53. Biemann, K.(1990)"Sequencing of Peptides by Tandem Mass Spectrometry and High-Energy 

Collision-Induced Dissociation", in Methods in Enzymology: Mass Spectrometry, (J. A. McCloskey, 

ed.), Academic Press, Inc., San Diego, CA, 455-479. 

54. Shevchenko, A., Loboda, A., Shevchenko, A., Ens, W., and Standing, K. G.(2000)MALDI quadrupole 

time-of-flight mass spectrometry:a powerful tool for proteomic research. Anal. Chem. 72, 2132-2141.

前言 

127 

第十一章、介質輔助雷射脫附離子化質譜法 

第十一章 

介質輔助雷射脫附離子化質譜法 

Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry, 

MALDI-MS 

國立成功大學環境醫學研究所 

廖寶琦 

上一章介紹的是電噴灑離子化(electrospray ionization, ESI),本章將介紹的是介質輔助 

雷射脫附離子化(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI),它們都是質譜儀離子源 

(Ion source),能將蛋白質分子換為氣相蛋白質離子,再導入質譜儀中進行質荷比 

(mass-to-charge ratio, m/z)量測,由質荷比可計算出蛋白質的分子質量。目前電噴灑離子化 

與介質輔助雷射脫附離子化兩種質譜分析方法已經成為蛋白質體學研究不可或缺的工具。 

2002 年諾貝爾化學獎頒給最早提出以質譜與核磁共振方法研究蛋白質的三位學者,其中一位 

是發展電噴灑離子化質譜儀的 Dr. John B. Fenn,另一位就是發現介質輔助雷射脫附離子化原 

理的日本學者 Koichi Tanaka。Tanaka 並未有多數諾貝爾得主擁有的博士學位,他於 1983 年 

自日本 Tohoku 大學取得工程學士學位,後來進入 Shimadzu 公司服務,在產業界從事研發工 

作,於 1987 年第一次報導介質輔助雷射脫附離子化現象。另有兩位德國學者 Hillenkamp 與 

Karas 在早期研究介質輔助雷射脫附離子化頗有成就,但 Tanaka 是最早發現該現象的人,所 

以諾貝爾獎的榮耀歸於他。 

介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化相比較,至少有下列幾點明顯的不同處:(1) 

電噴灑離子化一般用來分析溶液樣本,介質輔助雷射脫附離子化一般用來分析固態樣本;(2) 

電噴灑離子化除了可以分析蛋白質等巨分子外,也廣泛應用於分析有機小分子,如藥物、代 

謝物等;相對的,介質輔助雷射脫附離子化目前主要是應用於蛋白質等巨分子的分析。 

以下就介質輔助雷射脫附離子源構造與樣本製備方式、介質的作用與經常被使用介質的 

種類、蛋白質用介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析所能得到的數據、常與介質輔助雷射脫 

附離子源連接的質量分析器之種類、該種數據在蛋白質體學研究的意義、及介質輔助雷射脫 

附離子化與電噴灑離子化的比較、表面增強雷射脫附離子化(surface-enhanced laser 

desorption/ionization, SELDI)等內容分別說明。 

內容 

壹、介質輔助雷射脫附離子源構造與樣本製備方式 (1-3) 

介質輔助雷射脫附離子源的基本構造可用圖一來說明,離子源主要是由脈衝式雷射光源 

(pulsed laser source)與樣本盤(sample plate)組成。樣本製備的方式是將蛋白質溶液與介質 

溶液混合,然後將混合溶液在空氣中自然風乾(air-dried),去除溶劑後形成固態樣本於樣本

128 


盤。利用介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析蛋白質只需極少量的蛋白質,一般的做法是將 

約 0.5 毫升(0.5 L)濃度約 1 毫體積莫耳濃度(1 M)的蛋白質溶液(其中約含 0.5 pmol 的蛋 

白質),與 0.5 L 的介質溶液充分混合來製備樣本,一般常用的介質是小分子有機酸如 sinapinic 

acid 或-cyano-4-hydroxy cinnamic acid,用它們在 acetonitrile/去離子水(體積比 1:1 或 2:1)中 

之飽和溶液即可;也就是說,混合後的溶液含有少量的蛋白質與大量的小分子有機酸介質, 

當溶液中的水與有機溶劑揮發後,就剩下均勻混合的蛋白質與介質,成為樣本盤上薄薄的一 

層固態樣本(如圖二所示)。將含此樣本之樣本盤置入離子源裝置的真空腔,以脈衝式雷射光 

源照射,就可以產生氣相蛋白質離子。以離子源產生氣相離子(gas phase ion)再利用質量分 

析器(mass analyzer)量測質荷比(mass-to-charge ratio)是目前所有質譜儀運作的基本原理。 

如圖一所示,以上述方式產生的氣相蛋白質離子,經電場加速至質量分析器,即可量測出蛋 

白質離子的質荷比,進而計算出蛋白質分子質量。 

圖一、介質輔助雷射脫附離子源構造與質譜儀銜接介面

129 


目前最常使用的脈衝式雷射光源是氮氣雷射(nitrogen laser),氮氣雷射能提供 3 奈秒 

(ns)、波長為 337 nm 的脈衝紫外光(ultraviolet light),在極短的時間內將能量轉移至介質, 

是介質輔助雷射脫附離子化發生的必要條件之一。利用其他的脈衝式雷射光源也可以進行介 

質輔助雷射脫附離子化過程,不過氮氣雷射的價格便宜、使用簡便,目前在介質輔助雷射脫 

附離子化質譜儀受到廣泛的使用。介質輔助雷射脫附離子源能銜接的質量分析器有許多種, 

但最早且使用最多的是飛行時間質量分析器(time-of-flight mass analyzer),飛行時間質量分 

析器的運作方式極適合與脈衝式離子源連接使用,且可操作的質荷比上限為所有常見的質量 

分析器中最高,很適合分析質荷比極大的蛋白質離子。 

圖二、以介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析蛋白質的樣本置備方法 

貳、介質的作用與經常被使用介質的種類 (1-3) 

目前已知介質在產生氣態蛋白質離子的過程中至少扮演下列角色:(1)將蛋白質分子在 

介質中分開;(2)吸收雷射光的能量;(3)將蛋白質分子送入氣相;(4)將蛋白質分子離子 

化。 

以雷射光將有機分子光離子化(photoionization)並以質譜儀分析,早在 1970 年代就被 

普遍使用,成為一種微量分析方法,但無法應用於如蛋白質等巨大有機分子的分析。假想如 

圖三(A)所示的情形,將固態蛋白質樣本以雷射光照射,會發生什麼效應呢?欲以質譜儀 

分析蛋白質,必須先將固態的蛋白質分子在真空下轉換成氣態的蛋白質離子,這須達成兩個 

條件:(1)將個別蛋白質分子由蛋白質聚集成的固態中脫附出來成氣態;(2)將脫附出來的 

氣態蛋白質分子離子(daughter ion)化。將固態蛋白質樣本以雷射光照射,由於固態樣本中 

蛋白質分子間因分子大的關係需較高的能量脫附,所需的高能量往往同時將蛋白質分子光裂 

解(photo-degradation);相對比之下,有機小分子就容易以低能量脫附氣化,同時藉光離子 

化以質譜儀分析。蛋白質分子光解離後成為碎片,自然就無法以質譜儀量測完整的分子質量。 

相對的,如圖三(B)所示,當蛋白質溶液加介質溶液混合成樣本時,蛋白質分子與介質分 

子均勻的分布於溶液中,同時因蛋白質與介質的比例極低,風乾後的固態樣本中即成為蛋白 

質分子在介質中均勻分開的狀態;此時將固態樣本以雷射光照射,介質分子扮演的角色成為

130 


有效率地吸收雷射光能量,在介質分子吸收光能並氣化的過程中,將蛋白質分子完整的帶入 

真空中成為氣態蛋白質分子,而不至遭遇光裂解的厄運。為使介質有效率地吸收雷射光能量, 

使用的介質須與雷射光波長配合,例如 sinapinic acid 與 -cyano-4-hydroxy cinnamic acid 都能 

有效率的吸收波長為 337 nm 的氮氣雷射光。 

圖三、蛋白質固態樣本無介質輔助(A)與有介質輔助(B)的雷射脫附過程示意圖 

在此利用一個比喻,試圖讓讀者能更深入瞭解介質的作用(如圖四之卡通圖)。假想有 

50 位學生擠在一個狹小的教室中(一群未與介質混合的蛋白質分子),並手拉手團結起來抵 

抗外敵(蛋白質分子間有作用力),如果試圖以高能量的砲彈(雷射光)將學生轟出來,雖然 

可達到目的(蛋白質脫附),但學生們必然死傷慘烈(蛋白質光裂解);相對的,如只留下 5 

位學生在教室中(少量蛋白質),並在教室中塞滿枕頭(大量介質),並使 5 位學生均勻的分 

布於枕頭間(將蛋白質分子在介質中分開),此時可以用較低能量的砲彈(較低功率雷射光), 

將不知團結的枕頭轟出教室外(介質分子受雷射光氣化離開固態樣本),同時枕頭的動能會將 

這幾位學生推出教室外,且避免讓學生承受砲彈的能量而死傷(產生完整而未裂解的氣態蛋 

白質分子)。

131 


圖四、以教室中學生比喻說明介質作用之卡通圖:無介質輔助(A)與有介質輔助(B)的雷 

射脫附過程 

以上的描述說明了介質在產生氣態蛋白質離子的過程中扮演的三個角色(將蛋白質分子 

在介質中分開、吸收雷射光的能量、將蛋白質分子送入氣相),但第四個角色(將蛋白質分子 

離子化)如何發生呢?一般是認為雷射光將介質氣化時,同時經由光化學反應(photochemical 

reaction)會形成大量的質子化介質分子(protonated matrix molecule),這些質子化介質分子 

在真空中與氣態蛋白質分子相遇,會發生質子轉移反應(proton transfer reaction),形成氣態 

的質子化蛋白質分子(protonated protein molecule),氣態的質子化蛋白質分子是帶有正電荷 

的離子,可以被質量分析器量測出蛋白質離子的質荷比,進而計算出蛋白質分子質量。 

欲以介質輔助雷射脫附產生氣態蛋白質離子,所施加的雷射光的功率有一個極小臨界值 

(laser power threshold),也就是說,太低的雷射光的功率不足以發生所要的效果,經研究者 

量測後,此臨界值約在 1 MW/cm 2 左右;在實務上,一般是將固定功率的雷射光源經過一個 

可變的光衰減裝置,將樣本置入真空腔後,慢慢增加雷射光的功率,一直到可以在質譜儀上 

觀測到蛋白質訊號為止。

132 


介質與蛋白質的混合比例,也對蛋白質能否發生介質輔助雷射脫附離子化過程十分重 

要,一般有效的莫耳數混合比例在數百與數十萬之間;如果蛋白質的比例過高,無法讓介質 

有效的發生作用,成功的產生氣態蛋白質離子。初使用介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析 

蛋白質的研究者,常因無法觀測到蛋白質訊號,而將蛋白質濃度提高,而仍無法得到訊號; 

此時往往將蛋白質濃度降低,而能成功地得到蛋白質訊號;降低分析物濃度才能得到訊號, 

這一點與一般人的直覺迴異,是以介質輔助雷射脫附離子化分析蛋白質時須留意之處,也是 

一個挺有趣的現象。 

文獻中曾被報導過能被當作介質的有機分子很多,且分析不同的物質須採用不同的介 

質,例如分析蛋白質、DNA、有機合成高分子(synthetic polymer)等不同化學性質的巨分子 

所採用的介質都不同。經常被使用來分析蛋白質的介質有 sinapinic acid、-cyano-4-hydroxy 

cinnamic acid、與 2,5-dihydroxybenzoic acid 三種;sinapinic acid 較適合分析分子量至少在 10 

kDa 以上的蛋白質, -cyano-4-hydroxy cinnamic acid 較適合分析分子量較小的胜肽, 

2,5-dihydroxybenzoic acid 似乎較無分子量範圍的限制,但製備出來的樣本較不均勻。 

以下將我們對介質輔助雷射脫附如何形成氣態蛋白質離子的過程與機制之了解作一總 

結:(1)樣本製備方式是將蛋白質溶液與介質溶液混合後乾成固態樣本;(2)以脈衝式雷射 

光源照射樣本,就可以產生氣相蛋白質離子;(3)介質的作用是將蛋白質分子在介質中分開, 

同時吸收雷射光的能量氣化,氣化過程中順便將蛋白質脫附離開固態樣本;(4)介質的另一 

作用是藉質子化後介質分子與蛋白質分子進行質子轉移反應,將蛋白質離子化。 

參、蛋白質用介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析所能得到的數據 (4-8) 

如電噴灑過程一樣,蛋白質樣本經介質輔助雷射脫附離子化過程會形成帶有正電荷的氣 

態蛋白質離子,正電荷也是以質子化(protonation)的方式形成於蛋白質的鹼性官能基(basic 

functional group)上。不過,經介質輔助雷射脫附離子化過程形成氣態蛋白質離子,與經電噴 

灑離子化過程的產物在電荷數目上有很大的差異;蛋白質樣本經電噴灑離子化過程一般情形 

下形成帶有多個正電荷的氣態離子,鹼性氨基酸數目越多則氣態蛋白質離子電荷數目越大; 

相對的,不論鹼性氨基酸數目多寡,蛋白質樣本經介質輔助雷射脫附離子化過程一般情形下 

形成只帶有一個正電荷的氣態離子為主,有時也會觀察到帶有兩個、甚至三個的正電荷的氣 

態離子,但是它們的訊號強度多半較只帶有一個正電荷的氣態離子低。 

圖五是牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)樣本經介質輔助雷射脫附離子化所產 

生的訊號。由於訊號來源是只帶有一個正電荷的氣態離子,可容易地計算出蛋白質的精確質 

量。介質輔助雷射脫附離子化十分適合用來分析胜肽混合物,圖六是將牛血清白蛋白以 trypsin 

水解酶消化分解成胜肽碎片後,經介質輔助雷射脫附離子化所產生的質譜圖譜。

133 


圖五、牛血清白蛋白(BSA)樣本經介質輔助雷射脫附離子化所產生的質譜圖譜,其中標示 

的訊號代表帶一個與兩個正電荷數目的蛋白質離子。 

圖六、將牛血清白蛋白以 trypsin 水解酶消化分解成胜肽碎片後,經介質輔助雷射脫附離子化 

所產生的質譜圖譜。 

肆、常與介質輔助雷射脫附離子源連接的質量分析器之種類 

介質輔助雷射脫附離子化只是一種離子源,離子源產生的氣態蛋白質離子仍需利用質量 

分析器來量測質荷比,進而求得蛋白質分子質量。介質輔助雷射脫離子化剛發展出來時,最 

常連接的質量分析器是飛行時間質量分析器(time-of-flight mass analyzer)。飛行時間質量分 

析器由一個離子加速電場與無場區域(field-free region)所組成(如圖一中上端所示),離子 

源中由介質輔助雷射脫離子化過程形成的蛋白質離子,經電場加速後,進入無場區域飛行至

134 


離子偵測器(ion detector);因為所有帶相同電荷的離子,經同一電場加速後動能相同,所以 

當離子的質荷比越大時,經電場加速後的速度越小,飛行經過無場區域的時間就越長;換句 

話說,經由量測飛行時間可以換算出質荷比。早期飛行時間質量分析器被用來量測介質輔助 

雷射脫附離子化所產生的氣態蛋白質離子有兩個主要原因:(1)正如上一章所討論的,能連 

續產生離子的電噴灑離子源與連續式操作的四極棒質量分析器,較容易互相連接使用;脈衝 

式操作的飛行時間質量分析器也十分適合連接能產生離子脈衝的介質輔助雷射脫離子源。(2) 

飛行時間質量分析器的可操作質荷比範圍很高,幾乎沒有上限,適合分析質量大、只帶有單 

一電荷的蛋白質離子。圖六即是由四極棒質量分析器量測的數據, 

截至目前為止,大多數的介質輔助雷射脫附離子化質譜儀都使用,飛行時間質量分析器。 

數年前四極棒-直交式飛行時間混成串連式質量分析器(quadrupole-orthogonal time-of-flight 

hybrid tandem mass analyzer)被發展出來連接電噴灑離子源之後,研究者又把它連接至介質 

輔助雷射脫附離子源使用。所以目前可以購買到配備電噴灑與介質輔助雷射脫附兩種離子源 

的四極棒-直交式飛行時間混成串連式質譜儀,此種儀器可以進行極高質荷比解析力的串連 

式質譜分析,目前廣泛的應用於蛋白質體學研究。 

除了四極棒-直交式飛行時間混成串連式質量分析器,目前最新的發展是以串連式飛行 

時間質量分析器(tandem time-of-flight, TOF/ TOF)來分析介質輔助雷射脫附離子源所產生的 

離子,可以對胜肽離子進行極快速、高產出(high throughput),同時具極高質荷比解析力的 

串連式質譜分析,適合進行需要高產出速度的蛋白質體研究。 

也有研究者將介質輔助雷射脫附離子化所產生的氣態蛋白質離子以離子井質量分析器 

(ion trap mass analyzer)與傅立葉轉換離子迴旋共振質量分析器(Fourier transformation ion 

cyclotron resonance mass analyzer)分析,但尚未被普遍的使用。。 

伍、介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析在蛋白質體學研究的意義 

電噴灑離子化與介質輔助雷射脫附離子化兩種方法,與質譜儀結合都能精確量測蛋白質 

分子質量與鑑別蛋白質,成為蛋白質體研究的重要工具。利用質譜儀數據進行「蛋白質身份 

鑑定」(protein identification)的概念與方法,請參照上一章「電噴灑離子化」中的簡略解說, 

或參考本書另有專章介紹這些方法的細節。 

陸、介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化的比較 (5,7,8) 

介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化都是適合分析蛋白質的質譜方法,但是對於樣 

本中鹽類不純物(salt impurities)的忍受度(tolerance),有極大的差異。介質輔助雷射脫附 

離子化可以分析含有極高鹽類的蛋白質樣本,即使蛋白質溶液中含高達數十個 mM 的鹽類, 

往往仍可以成功的得到蛋白質訊號,只是鹽類的存在仍會提高蛋白質的最低可偵測下限 

(lowest detection limit)。相對的,電噴灑離子化對於樣本中鹽類不純物的忍受度極低,濃度 

在 mM 甚至µM 的鹽類不純物,往往導致無法以電噴灑離子化觀測到蛋白質訊號;所以在實

135 


務上往往將電噴灑離子化前端連接逆相液相層析(reverse phase liquid chromatography)使用, 

因為逆相液相層析能有效的將鹽類不純物移除,將不含鹽類的蛋白質導入電噴灑離子化質譜 

儀分析。 

在前一章與本章的介紹內容中,讀者可以發現介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化 

有許多相似之處,也有許多不同之處,以下將對介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化的 

比較作較完整的綜合敘述。 

介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化相似之處:(1)兩種方法的發現者,同在 2002 

年獲頒諾貝爾化學獎;(2)都是質譜學上所稱的「軟性離子化法」(soft ionization),能讓巨 

分子在離子化過程中保持完整(intact);(3)都能精確量測蛋白質分子質量;(4)都被用來 

產生質譜數據可作為蛋白質鑑別工具;(5)都已成為蛋白質體學研究的重要工具;(6)兩種 

方法的分析靈敏度都極高,只需消耗 pmol 以下的蛋白質樣本;(7)分析蛋白質樣本時,質譜 

儀通常以正離子模式操作。 

介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化不同之處:(1)介質輔助雷射脫附離子化主要 

被應用於蛋白質分析,電噴灑離子化則被廣泛的應用於天然物有機物、藥物、代謝物、及的 

蛋白質分析;(2)介質輔助雷射脫附離子化使用固態樣本,電噴灑離子化使用液態溶液樣本; 

(3)介質輔助雷射脫附離子化對於樣本中鹽類不純物的忍受度高,相對的,電噴灑離子化對 

於樣本中鹽類不純物的忍受度極低;(4)電噴灑離子化常連接液相層析使用,介質輔助雷射脫 

附離子化不能;(5)介質輔助雷射脫附離子化的操作是脈衝式,電噴灑離子化則連續式;(6) 

介質輔助雷射脫附離子化適合分析蛋白質混合物,電噴灑離子化則較不合適。 

另外在某些特性上,介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化有些相似,但不完全相同, 

有下列兩點值得提出討論:(1)兩種方法可連接不同的質量分析器使用,但介質輔助雷射脫 

附離子化的連接組合方式較受限制而種類較少;(2)形成正離子的方式都是使蛋白質分子質 

子化,但電噴灑離子化形成帶多電荷的離子,而介質輔助雷射脫附離子化形成單一電荷的離 

子為主。 

柒、表面增強雷射脫附離子化(surface-enhanced laser desorption/ ionization, 

SELDI) (9-11) 

介質輔助雷射脫附離子化質譜儀在 1987 年由 Tanaka 提出後,廣泛的應用於蛋白質的分 

析上。但是,介質輔助雷射脫附離子化只能分析固態樣本,無法像電噴灑離子化一般與液相 

層析連線使用,所以應用介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析由細胞或組織萃取出來的複雜 

蛋白質混合物時,必須先進行樣本前處理,將複雜蛋白質混合物作部分純化與去鹽(desalt) 

處理,再與介質混合製備成固態樣本進行介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析。一個常利用 

的方式,即是將複雜蛋白質混合物先以各種液相層析法,例如 ion exchange、size exclusion、 

affinity、reverse phase 等,作分離與去鹽程序,再將經由一種或多種上述液相層析法流析出來 

的成分,分別與介質混合製備成固態樣本進行介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析。這樣的

136 


做法當然因整個程序不易自動化,而耗費人力且費時。 

1993 年 Hutchens 與 Yip 兩位研究者,提出表面增強雷射脫附離子化(surface-enhanced laser 

desorption/ ionization, SELDI)的概念。他們認為,既然蛋白質樣本溶液與介質溶液混合後, 

須將溶液混合製備於一個表面上成為固態樣本,為何不利用一些具備不同化學性質的表面來 

幫助複雜蛋白質混合物進行部分純化與去鹽(desalt)處理呢?例如將複雜蛋白質混合物置於 

反相(reverse phase)固相萃取材料的表面吸附,利用高極性的溶劑沖洗樣本去除鹽類,再將 

溶於低極性溶劑的介質加入,即可將蛋白質或胜肽由固相萃取材料的表面脫附,同時讓蛋白 

質或胜肽與介質混合,製備成固態樣本進行介質輔助雷射脫附離子化質譜儀分析。也可以將 

複雜的蛋白質混合物吸附於反相固相萃取材料,先以不同極性的溶劑沖洗樣本,對蛋白質混 

合物作初步分離,留下部分蛋白質,也就是將複雜的蛋白質混合物簡化,再進行介質輔助雷 

射脫附離子化質譜儀分析。 

相類似的概念應用於已有固定化抗體(immobilized antibody)的表面,經過適當的加樣、 

沖洗步驟,即可將複雜的蛋白質混合物簡化成只含抗原(antigen)蛋白質,再進行介質輔助 

雷射脫附離子化質譜儀分析。這樣的表面也可以是有固定化接受體(receptor)的材料,用來 

尋找與分析 ligand;也可以是離子交換樹脂,利用複雜的蛋白質混合物中個別蛋白質帶電荷 

量之差異,來進行粗分後簡化樣本中的蛋白質種類,再進行介質輔助雷射脫附離子化質譜儀 

分析。表面材料也可以是含有固定化金屬鐵離子,可以將磷酸化胜肽(phosphorylated peptides) 

作選擇性純化再進行質譜分析;甚至可以將蛋白質水解酶 trypsin 固定化於一個表面材料,將 

蛋白質樣本放上去後,立即進行水解反應,將蛋白質切成胜肽碎片,進行介質輔助雷射脫附 

離子化質譜儀分析後,所得到的質譜數據可直接進行蛋白質身分鑑定。 

簡單來說,表面增強雷射脫附離子化結合樣本前處理與質譜分析樣本製備於一體,利用 

不同化學性質的表面,可將複雜的蛋白質或胜肽混合物,作快速、簡便的質譜分析。如此的 

概念很快的就被用來發展出一種稱為蛋白質晶片陣列(protein chip arrays)的蛋白質體研究工 

具,再一片蛋白質晶片陣列上,有一群由不同化學性質的材質所形成的點陣列表面,可以對 

同一個複雜的蛋白質或胜肽混合物作不同的樣本前處理,一併送入質譜儀分析;蛋白質晶片 

陣列則可以利用標準化後的晶片製程大量製造,降低生產成本,成品則可以供不同的應用場 

合使用。 

表面增強雷射脫附離子化質譜分析在近年來有許多應用於臨床樣本之蛋白質體研究的實 

例。David Ho 等人於 2002 年發表了一篇文章,描述他們如何利用表面增強雷射脫附離子化 

質譜分析找出抗人類免疫不全病毒(human immunodeficiency virus, HIV)因子的分子身份 

(molecular identity);自 1986 年起,研究者就知道一些被稱為「已感染人類免疫不全病毒之 

長期不發病者」(HIV-1-infected long-trm nonprogressors)會分泌一種水溶性因子,能抑制 HIV-1 

病毒的複製,但是多年來經過許多研究者的努力,仍然尚未能發現該因子的分子身份。Ho 等 

人將已感染人類免疫不全病毒之長期不發病者身上的免疫細胞 CD8 T cells 取出,以表面增強 

雷射脫附離子化質譜儀分析那些免疫細胞受刺激後分泌的蛋白質成分,經過與會發病者的樣

137 


本比較,發現長期不發病者果然會分泌一類叫做-defensins 的蛋白質,推測就是十多年來研究 

者想要瞭解的能抑制 HIV-1 病毒複製因子。此外,也有研究者以表面增強雷射脫附離子化質 

譜儀分析膀胱癌病人尿液中的蛋白質,發現利用這種研究工具可以快速找到準確度較高的診 

斷標記(diagnostic marker)。 

結語 

目前介質輔助雷射脫附離子化與電噴灑離子化兩種質譜分析方法已經成為蛋白質體學 

研究不可或缺的工具,2002 年諾貝爾化學獎頒給提出這兩種方法的學者,也說明了此兩種質 

譜分析方法在蛋白質體學研究的重要性與影響。以目前許多研究者對蛋白質體學研究的期待 

與熱衷,與此兩種質譜分析方法的應用仍有改進的空間兩方面來看,似乎可以預見,需求面 

會繼續的支持技術供給面的更一步進展,大家等著看更精采的後續發展吧! 

誌謝 

本文有一些精美的插圖,是由成功大學環境醫學研究所陳邦維同學製作的,作者在此感 

謝他的幫助。 

參考文獻 

1. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., and Chait, B. T.(1991)Matrix-assisted laser desorption / ioniz- 

ation of biopolymers. Anal. Chem. 15, 1993-1200. 

2. Karas, M., and Bahr, U.(1991)Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mass 

Spectrom. Rev. 10, 335-357. 

3. Stults, J. (1995) Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry(MALDI-MS). Curr. 

Opin. Struc. Biol. 5, 691-698. 

4. Brian, T. C., and Stephen, B. H.(1992)Weighing naked proteins:practical, high-accuracy mass 

measurement of peptides and proteins. Science. 257, 1885-1894. 

5. Nguyen, D. N., Becker, G. W., and Riggin, R. M.(1995)Protein mass spectrometry:application to 

analytical biotechnology. J. Chromatogr. A. 705, 21-45. 

6. Alomirah, H. F., Alli, I., and Konishi, Y.(2000)Application of mass spectrometry to food proteins and 

peptides. J. Chromatogr. A. 893, 1-21. 

7. Gray, S. (1994)The emergence of mass spectrometry in biochemical research. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA. 91, 11290-11297. 

8. Peter, R.(1993)Mass spectrometry of proteins. Trends Anal. Chem. 12, 413-421. 

9. Merchant, M., Weinberger, S. R.(2000)Recent advancements in surface-enhanced laser desorption/ 

ionization-time of flight-mass spectrometry. Electrophoresis. 21, 1164-1167. 

10. Zhang, L., Yu, W., He, T., Yu, J., Caffrey, R. E., Dalmasso, E. A., Fu, T. P., Mei, J., Ho, J. J., Zhang, W.,

138 


Lopez, P., and Ho, D. D.(2002)Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-1 

activity of CD8 antiviral factor. Science. 298, 995-1000. 

11. Vlahou, A., Schellhammer, P. F., Mendrinos, S., Patel, K., Kondylis, F. I., Gong, L., Nasim, S., and 

Wright, G. L. Jr.(2001)Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell 

carcinoma of the bladder in urine. Am. J. Pathol. 158, 1491-1502.

前言 

第十二章 

電噴灑離子化質譜法 

Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS 

國立成功大學環境醫學研究所 

廖寶琦 

139 

第十二章、電噴灑離子化質譜法 

電噴灑離子化(electrospray ionization, ESI)是一種質譜儀離子源(Ion source),能直接 

將溶液中的帶電荷離子或高極性分子在大氣壓力下經由電噴灑的過程轉換為氣相離子,再導 

入質譜儀中進行質荷比(mass-to-charge ratio, m/z)量測,由質荷比可計算出分析物的分子質 

量。電噴灑離子化質譜儀的應用極廣,例如在新生兒罕見代謝疾病篩尋與藥物動力學研究, 

它被用來量測含複雜基質的血液樣本中特定有機小分子之濃度;電噴灑離子化質譜儀也能分 

析巨分子(macromolecule),過去十年來研究者將之應用於蛋白質的分析有極大的進展,目 

前電噴灑離子化與介質輔助雷射脫附離子化(matrix-assisted laser desorption ionization, 

MALDI)兩種質譜分析方法已經成為蛋白質體學研究不可或缺的工具。2002 年諾貝爾化學獎 

頒給最早提出以質譜與核磁共振方法研究蛋白質的三位學者,其中一位是前耶魯大學化工系 

教授 Dr. John B. Fenn,得獎原因就是他在 1988 年提出能以電噴灑離子化質譜儀精確量測蛋白 

質分子質量的構想與實驗證據 (1) 。 

以下就電噴灑離子源構造、電噴灑如何形成氣態離子、蛋白質用電噴灑離子化質譜儀分 

析所能得到的數據、常與電噴灑離子化連接的質量分析器之種類、該種數據在蛋白質體學研 

究的意義、及電噴灑離子源微小化的趨勢等內容分別說明。 

內容 

壹、電噴灑離子源構造及電噴灑如何形成氣態離子 (2-6) 

電噴灑離子源的基本構造極為簡單,可用圖一來說明,主體是一支金屬製成的毛細管噴 

嘴(內徑約為數微米至數百微米),距噴嘴出口 1~2 公分處置放一片相對電極,將含有蛋白質 

的水溶液樣本注入毛細管,並在金屬細管與相對電極間加數千伏特(一般儀器的設計約在 3000 

~ 5000 V)的電位差,就可以觀察到電噴灑現象。如果將含有蛋白質的水溶液樣本在不加電 

壓下經幫浦注入金屬毛細管,可以想像會在毛細管屬管出口形成一道微細水柱,而並不會有 

噴灑成微液滴的現象發生;但是當金屬管噴嘴與質譜儀的入口之間被施與數千伏特的電位 

差,這時候有趣的現象發生了,微細水柱消失,取而代之的是水溶液噴灑成帶有電荷的微液 

滴,這些微液滴直徑約在次微米大小,提供了質譜儀分析蛋白質分子質量的原料。 

為什麼數千伏特的電位差會使水溶液噴灑成帶有電荷的微液滴呢?圖二為描述發生電噴 

灑現象的示意圖。在水溶液樣本流至金屬管噴嘴出口時,在沒有電場的情形下,水溶液會因 

為表面張力而自然的形成一個圓球面,水溶液中則含有許多解離且均勻分布的正負離子。如

140 


果在噴嘴施與正電壓,水溶液中的正負離子會在電場中受力而往相反方向移動,這使得水溶 

液球形表面上會聚集許多正離子(如圖二 A);而電場對正離子的作用力會牽引液面向外,如 

果這時候逐漸提高在金屬管噴嘴的電壓,當這牽引力大過表面張力,電噴灑現象就會發生(如 

圖二 B);此時液面形成圓椎型,稱為泰勒椎(Taylor cone),泰勒椎尖端會陸續釋放出帶有正 

電荷的微液滴,此即是電噴灑現象。 

如果有一個合適的電源供應器,加上一般打針用的注射針頭與一金屬片當相對電極,除 

了需注意高電壓的安全問題之外,在實驗室中製造電噴灑現象並不困難。圖三是現場實際拍 

攝電噴灑過程的照片。 

圖一、電噴灑離子源構造與質譜儀銜接介面 

圖二、(A)溶液中解離的正離子受電場牽引,推擠管道出口端液面成為圓錐形;(B)正離子 

受電場牽引之力大於液面的表面張力,形成可穩定產生電噴灑的泰勒錐。

圖三、現場實際拍攝電噴灑過程的照片。 

圖四、電噴灑所產生的帶電荷液滴如何形成氣相離子過程示意圖 

141 


以離子源產生氣相離子(gas phase ion)再利用質量分析器(mass analyzer)量測質荷比 

(mass-to-charge ratio)是目前所有質譜儀運作的基本原理。圖四為描述由帶電荷液滴產生氣 

相離子示意圖。帶電荷微液滴在電場引導下於飛行過程中不斷與空氣接觸,溶劑不斷的揮發 

造成液滴體積縮小,分佈於液滴表面的電荷密度漸增(如圖四 A),再次突破液滴表面張力形 

成更小的帶電荷液滴(如圖四 B);此相同的過程在電噴灑噴嘴與質譜儀入口間電場引導下經 

過多次反覆,帶電荷液滴經多次分裂,體積不斷縮小而將溶劑逐漸去除(如圖四 C),以上所 

描述的可以說是一種帶電荷微液滴去溶劑(desolvation)的過程;電噴灑所產生的微液滴由溶 

劑、溶質(蛋白質)、電荷組成,少了溶劑,即剩下帶電荷之溶質(蛋白質),也就是說,不 

斷縮小體積的帶電荷液滴最後會產生完全不含溶劑分子的氣態溶質(蛋白質)離子,順著壓 

力差(圖四:電噴灑過程在大氣壓或低氣壓下進行,而質譜儀的質量分析器在真空狀態下操 

作)與電位差進入質譜儀的質量分析器內進行質荷比的分析。 

至於經多次分裂體積不斷縮小的帶電荷液滴最後如何產生完全不含溶劑分子的氣相離子 

呢?文獻中曾有兩種不同的機制被提出來解釋觀察到的現象。第一種稱為離子蒸發模式(ion

142 


evaporation model),當經多次分裂的帶電荷液滴體積縮小至直徑約為 10~20 nm 時,液滴中的 

離子可以在強電場的影響之下,直接脫離液滴蒸發成為氣相離子。第二種稱為電荷殘餘模式 

(charge residue model),該模式描述的是另一種可能產生氣相離子的方式,當帶電荷液滴經 

多次分裂後,每個液滴的體積不但縮小同時每個液滴中的離子數也跟著減少,最後會形成一 

些只含單一離子的且無法再更進一步分裂的極小液滴(single ion droplet);這樣的液滴如果其 

中只含單一蛋白質離子,可以看作是一個蛋白質離子(含有多個正電荷分散在鹼性氨基酸上) 

周圍因氫鍵結合力依附著許多水(溶劑)分子,當這個含水分子的蛋白質離子順著壓力差與 

電位差進入真空狀態下的質譜儀質量分析器時,會經歷許多次與氣體分子的碰撞而取得能 

量,將水分子脫離蛋白質離子,而產生完全不含溶劑分子的氣態蛋白質離子,上述現象有文 

獻稱之為利用碰撞活化去聚集(declustering by collision activation)的過程。近幾年的文獻多 

認為離子蒸發模式較適合描述較小氣態離子(如鈉離子等)的產生過程,不適合說明巨大的 

氣態蛋白質離子產生過程;相對的,電荷殘餘模式似乎能解釋許多我們對氣態蛋白質離子產 

生過程所觀察到的現象。 

為了增加電噴灑離子化效率,通常樣品會溶於具有極性的有機溶劑(如使用 methanol 或 

acetonitrile)與水的混合溶液,以增加溶劑揮發的速度與降低表面張力。有一些儀器利用霧化 

氣體(nebulizer gas)輔助噴灑成微液滴加效果(如圖五);也有一些儀器利用由質量分析器 

入口向電噴灑噴嘴流動的氣簾(curtain gas)或從側面提供經過加熱的氣流(turbo gas)使溶 

劑加速揮發。電噴灑適於產生正離子或負離子,端視所施電壓之正或負而定,一般而言,分 

析蛋白質、胜肽大多使用正離子電噴灑。 

圖五、利用霧化氣體、氣簾、加熱氣流輔助電噴灑離子化效率的示意圖 

以下將我們對電噴灑如何形成氣態蛋白質離子的過程與機制之了解作一總結:(1)該過

143 


程可以大略分成電噴灑成液滴(droplet formation)、液滴縮小(drop shrinkage)、與產生氣態 

蛋白質離子(gaseous ion formation)三段過程;(2)在強電場下,酸化的蛋白質樣本溶液會 

形成泰勒椎釋放出帶有正電荷的微液滴;(3)微液滴上的溶劑蒸發造成液滴體積縮小、表面 

電荷密度過大,而引起液滴分裂成更小液滴;(4)一個電噴灑成的微液滴可進行多次上述分 

裂過程,最後形成眾多的極小液滴;(5)極小液滴可視為一個蛋白質離子上附著多個溶劑分 

子,氣態蛋白質離子可經由碰撞活化去聚集過程產生;(6)由酸化的蛋白質樣本溶液經電噴 

灑形成的氣態蛋白質離子帶有多個正電荷,且電荷數目與蛋白質鹼性氨基酸數目有關,鹼性 

氨基酸數目越多則電荷數目越大;(7)在蛋白質樣本溶液中加入具有極性的有機溶劑、霧化 

氣體、輔助性乾燥氣體幫助微液滴去溶劑等手段,都有增進電噴灑形成氣態蛋白質離子的效 

果。 

貳、蛋白質用電噴灑離子化質譜儀分析所能得到的數據 (7-11) 

如前所述,由酸化的蛋白質樣本溶液經電噴灑會形成帶有多個正電荷的氣態蛋白質離 

子,這些正電荷是以質子化(protonation)的方式形成於蛋白質的鹼性官能基(basic functional 

group)上。蛋白質的 N 端(N-terminus)、鹼性氨基酸(basic amino acid)如(arginine)與(lysine) 

都有含氮原子組成的鹼性官能基,這些鹼性官能基在酸化的溶液中會與質子酸(H + , proton) 

結合而帶正電荷,蛋白質樣本溶液中帶有多個正電荷的液態蛋白質離子,經電噴灑過程即形 

成帶有多個正電荷的氣態離子。氣態蛋白質離子的電荷數目不一定與原溶液中液態蛋白質離 

子的電荷數目相同,但與蛋白質鹼性氨基酸數目有關,鹼性氨基酸數目越多則氣態蛋白質離 

子電荷數目越大,此外,也與蛋白質樣本溶液中酸化的程度有關。所以,在利用電噴灑離子 

化質譜儀分析蛋白質時,常在蛋白質樣本溶液中加入甲酸(formic acid)或乙酸(acetic acid) 

等易揮發的酸,來幫助氣態蛋白質正離子的產生。利用甲酸製備酸化的蛋白質樣本溶液,然 

後經電噴灑形成帶有多個正電荷的氣態蛋白質離子過程,可以利用下列化學式來說明。 

solvation electrospray 

M (solid) + H2O+HCOOH [M+mH] n+ (liquid) [M+nH] n+ ( gas ) (式一) 

其中,M 代表蛋白質分子,m 是溶液中蛋白質帶正電荷數目,n 是氣態蛋白質離子的電 

荷數目,電荷數目一定是整數;m 與 n 的大小不一定相同,但與蛋白質鹼性氨基 

酸數目及酸的強度(受酸的種類、濃度、溶液組成等因素影響)有關。 

質譜儀分析是一種氣態離子的質荷比(mass to charge ratio, m/z)量測,對上述以質子化 

方式形成的氣態蛋白質離子而言,質量是蛋白質分子量加上 n 個質子酸,質子酸(H + )的質 

量是 1.0007(約為 1),電荷數目是 n(整數),質荷比可以利用下式來計算。

144 


質荷比(m/z) = (M+n)/n (式二) 

其中,M 在此代表蛋白質分子量;n 是電荷數目(整數);m/z 是質荷比。 

電噴灑時因產生的眾多氣態蛋白質離子所帶的正電荷數目不同會呈現一個分佈。換句話 

說,同時電噴灑所產生的眾多氣態蛋白質離子,有些帶的電荷數目多一點,有些帶的電荷數 

目少一點,呈現一個分佈(如圖六)。圖六是溶菌酶蛋白(lysozyme)經電噴灑產生的質譜圖 

譜,其中的訊號代表帶不同正電荷數目的蛋白質離子。電噴灑離子化質譜儀能精確量測蛋白 

質分子質量,那麼,由圖六的質譜圖譜如何計算蛋白質分子量呢?圖六中的訊號都已經標示 

了蛋白質離子帶正電荷的數目,利用(式二)即可計算出蛋白質的精確質量。以訊號強度最 

強的 m/z 2044.7 訊號峰為例: 

(式二) 質荷比(m/z) = (M+n)/n 

將圖六的數據帶入上式,得 

2044.7 = (M + 7)/7 

即可計算出蛋白質的精確質量為 14306 Da 

圖六、溶菌酶蛋白經電噴灑產生的質譜圖譜,其中的訊號代表帶不同正電荷數目的蛋白質離 

子。 

圖六中的每一個訊號峰都可以據以計算出蛋白質的精確質量,當然,其先決條件是必須 

知道產生該訊號峰的蛋白質離子之帶正電荷的數目。然而質譜圖數據只能提供質荷比,那要 

如何知道每個訊號峰所對應的電荷數目呢?常用的方式有兩種。首先想像圖六中的訊號峰都 

未標示電荷數目,第一種方式假設圖六中相鄰的訊號峰所對應的電荷數目相差 1;我們知道,

145 


電荷數目都是整數,同時對某一個蛋白質離子而言,帶正電荷的數目越大,所產生的訊號峰 

質荷比越小,所以利用(式二)與圖六中的兩個相鄰的訊號峰 m/z 2044.7 及 m/z 1789.0,可 

以得到下列聯立方程式: 

(1) 2044.7 = (M + n)/n 

(2) 1789.0 = (M + n+1)/(n+1) 

解開上述聯立方程式中的兩個未知數 M 與 n,同時考慮 n 必須是整數的限制,即可計算出 

電荷數目 n 值與蛋白質的精確質量 M 值。圖六中的每一個訊號峰都可以利用相似的過程計算 

出一個蛋白質的質量,不同訊號峰計算出的值可能因訊號峰 m/z 值的量測不確定度而稍有差 

異,可以利用求平均值的方式減小量測不確定度。 

第二種知道訊號峰所對應之帶正電荷數目的方式是利用同位素訊號峰,此種方式一般應用 

於分子量較小的蛋白質,以下利用圖七來說明。 

圖七、一個 1178 Da 的胜肽所產生的電噴灑質譜圖譜 

圖七是一個 1178 Da 的胜肽(peptide)所產生的電噴灑質譜圖譜,可以看到有兩群訊號峰; 

右邊的訊號峰群是由帶 1 個正電荷的胜肽所產生,訊號峰群中有 m/z 1178.7、1179.7、1180.7、 

1181.7 等數值連續相差 1.0 的四個訊號峰,這些訊號峰是由自然界中的同位素分布所造成的。 

左邊的訊號峰群是由帶 2 個正電荷的胜肽所產生,m/z 值應為(M+2)/2,所以可以看到 m/z 

589.9、590.4、590.9、591.4 等數值連續相差 0.5 的四個訊號峰。反過來說,如果訊號峰所對 

應的電荷數目未知,查看同位素訊號峰群中的間隔大小就可以知道了;如果間隔大小為 1.0, 

則是帶 1 個正電荷;如果間隔大小為 0.5,則是帶 2 個正電荷;如果間隔大小為 0.33,則是帶

146 


3 個正電荷;如果間隔大小為 0.25,則是帶 4 個正電荷;依此可類推。此種方式一般應用於 

分子量較小的胜肽,因為胜肽的氨基酸數少,帶正電荷數目也小,並且一般的質譜儀就可以 

將同位素訊號峰群解析的很好,據以計算訊號峰所對應之帶正電荷數目不是問題。相反的, 

分子量大於 10,000 Da 以上的蛋白質,帶正電荷數目大,除非利用超高解析度的質譜儀,一 

般的質譜儀無法將同位素訊號峰群解析的很好,多數情況下利用第一種方式計算訊號峰所對 

應的電荷數目。 

參、常與電噴灑離子化連接的質量分析器之種類 (11) 

電噴灑離子化只是一種離子源,離子源產生的氣態蛋白質離子仍需利用質量分析器來量 

測質荷比,進而求得蛋白質分子質量。電噴灑離子化剛發展出來時,最常連接的質量分析器 

是四極棒質量分析器(quadrupole mass analyzer)。四極棒質量分析器由四個平行的電極棒所 

組成(如圖一中右端所示),在電極棒上施與不同的高頻率交流電壓,四極棒即便成一個質荷 

比過濾器(mass-to-charge filter),可以藉由控制交流電壓參數讓不同質荷比的氣態蛋白質離 

子通過四極棒,這就構成質荷比量測的原理。早期四極棒質量分析器被用來量測電噴灑離子 

化所產生的氣態蛋白質離子有兩個主要原因:(1)四極棒質量分析器極適合、也容易連接能 

連續產生離子的電噴灑離子源;相對的,飛行時間質量分析器(time-of-flight mass analyzer) 

的操作為脈衝式(pulse mode),較不易與連續產生離子的電噴灑離子源連接;換句話說,電 

噴灑離子源與四極棒質量分析器皆適合連續式(continuous mode)操作,互相連接較容易。(2) 

一般而言,四極棒質量分析器的可操作質荷比範圍較窄,上限約在 m/z 3000-4000 左右,本來 

不易分析質量大的蛋白質離子(如果蛋白質只帶有單一電荷的話)。然而,電噴灑離子源通常 

產生的氣態蛋白質離子帶有多電荷,且蛋白質質量越大,帶電荷數目越大,所以經電噴灑離 

子源產生的蛋白質離子其質荷比多在四極棒質量分析器的可量測的範圍內。圖六即是由四極 

棒質量分析器量測的數據,即使溶菌酶蛋白的分子量約有 14.3 kDa,因經電噴灑離子化所產 

生的氣態蛋白質離子帶有 5 ~ 11 個正電荷,其 m/z 皆在 3000 之內,都可以用四極棒質量分析 

器量測。 

繼四極棒質量分析器之後,很快有研究者將電噴灑離子化所產生的氣態蛋白質離子以離 

子井質量分析器(ion trap mass analyzer)分析,離子井質量分析器與四極棒質量分析器的操 

作原理有一些類似,但更容易對胜肽離子進行串連式質譜儀(tandem mass spectrometry)分 

析,提供蛋白質身份鑑定(protein identification)的功能。下一節將會討論到串連式質譜儀分 

析與蛋白質身份鑑定在蛋白質體學研究的意義。從歷史上來看,在 1990 年代末期,以電噴灑 

離子源連接離子井質量分析器後,此種儀器提供了便宜、可靠、容易使用的工具來進行蛋白 

質身份鑑定,是電噴灑離子化法廣泛的應用於蛋白質體學研究的開始。此外,有一種介於四 

極棒與離子井間的混合式串連式質量分析器被發展出來,稱之為 Q-trap,是一種兼具定性與 

定量功能的儀器,也可以連接電噴灑離子使用。 

雖然以四極棒質量分析器與離子井質量分析器來分析電噴灑離子化所產生的氣態蛋白質

147 


離子有廣泛的應用,但這兩種質量分析器的共同缺點是解析度不高,一般只能達到單位解析 

度(unit resolution),也就是說,只能區分 1 個質荷比單位的差別,例如 1000 與 1001。後來 

有研究者想出以直交式飛行時間(orthogonal time-of-flight)質量分析器連接電噴灑離子源的 

方式,解析度可以高達 10,000;也就是說,對質荷比 1000 的胜肽離子,其解析力(resolving 

power)可以達到 0.1 質荷比單位,對蛋白質身份鑑定的正確率有極大的助益。圖七的數據即 

是由直交式飛行時間質量分析器所量測得到的,因為有如此高的質荷比解析力,才能看出同 

位素訊號峰間的區別。 

近年來有一種四極棒-直交式飛行時間混成串連式質量分析器(quadrupole-orthogonal 

time-of-flight hybrid tandem mass analyzer)被發展出來,可以連接電噴灑離子源,進行極高質 

荷比解析力的串連式質譜分析,目前廣泛的應用於蛋白質體學研究。 

除了上述質量分析器之外,也有研究者將電噴灑離子源連接至磁場式質量分析器 

(magnetic mass analyzer)與傅立葉轉換離子迴旋共振質量分析器(Fourier transformation ion 

cyclotron resonance mass analyzer),也可得到高解度的分析,尤其是後者解析度可高達數百 

萬,但因價格與技術成熟度等因素尚未被普遍的使用。目前也有研究者製造出離子井-傅立 

葉轉換離子迴旋共振混成串連式質量分析器(ion trap-Fourier transformation ion cyclotron 

resonance hybrid tandem mass analyzer),與電噴灑離子源連接,但也因價格與技術成熟度等因 

素尚未被普遍的使用。 

肆、電噴灑離子化質譜儀分析在蛋白質體學研究的意義 (7-9,11) 

電噴灑離子化與介質輔助雷射脫附離子化兩種方法,與質譜儀結合能精確量測蛋白質分 

子質量,開啟了蛋白質分析的新紀元。能精確量測蛋白質分子質量,代表此種量測工具有極 

佳的解析力,來區分、鑑別具有不同分子質量的蛋白質,這樣的工具似乎正是蛋白質體學研 

究所必需的。然而,簡單的量測蛋白質分子質量,仍有許多應用上的限制,尤其是對分子量 

在 10,000 Da 的蛋白質來說,現有的質譜儀仍缺乏足夠的解析力,來鑑別所有的蛋白質。 

在 1990 年代中期,多位此領域的研究者陸續提出「蛋白質身份鑑定」(protein 

identification)的概念與方法,這些方法源於一個看似簡單卻極重要的概念:一個蛋白質分子 

經水解所能得到的多個碎片,他們的質量分布(pattern)一定與蛋白質的序列相關。假想由 

肝癌病人身上分離出數百種可能與肝癌疾病有關的蛋白質,如何能知道那些蛋白質的身份 

(identities)?將某個待鑑定身份的蛋白質以 trypsin 水解酶降解成胜肽碎片,由於 trypsin 只 

水解(arginine)與(lysine)的 C 端,所得到的胜肽碎片質量分布,具有一定的特異性,可 

以用來與蛋白質序列資料庫比對,鑑定出蛋白質的身份。比對的方式基本上是將資料庫中的 

每一筆蛋白質序列,利用計算機模擬水解後所得到的胜肽碎片之質量分布,換句話說,一筆 

蛋白質序列會有一組具有一定的特異性的質量分布,此種分布文獻中一般稱為「胜肽質量指 

紋」(peptide mass fingerprint),不同的序列會產生不同的胜肽質量指紋;比對的過程即是將 

待鑑定身份的蛋白質經水解成胜肽碎片所量測到的質譜數據,與資料庫產生的每一筆胜肽質

148 


量指紋作「比對」(mapping),即可鑑定出蛋白質的身份。 

「胜肽質量指紋」的概念被提出不久,又有研究者指出將蛋白質降解後之胜肽,進行串 

連式質譜儀(tandem mass spectrometry)分析,可以得到胜肽裂解後質量分布(peptide 

fragmentation pattern),也可以用來比對蛋白質序列資料庫,鑑定出蛋白質的身份;由於本書 

另有專章介紹這些方法的細節,在此不贅述。在此欲說明的重點是,由於上述研究的成果, 

研究者瞭解到經由比對蛋白質序列資料庫的方式,質譜儀分析(包含電噴灑離子化與介質輔 

助雷射脫附離子化兩種方法)可以用來鑑定蛋白質的身份。此種鑑定蛋白質的身份的工具尚 

有下列特點:(1)此種工具在人類基因圖譜計劃(human genome project)完成之後,因為有 

幾近完整蛋白質序列資料依據(即 DNA 序列),對人類蛋白質體的研究將有極大的應用價值。 

(2)相對於 Edman 蛋白質定序儀,質譜儀分析較快速,且可以用較少的樣本量完成分析, 

加上質譜儀分析的可自動化程度算是很好的,提供了一個高量產(high throughput)分析工具, 

能對許多微量的蛋白質快速分析,這對進行蛋白質體研究有極大的助益。 

伍、電噴灑離子源微小化的趨勢 (12,13) 

研究者發現電噴灑離子化產生的質譜訊號似乎是與分析物樣本在溶液中的濃度成比例, 

但與溶液的流速較無關聯,也就是說,用較低的溶液流速,消耗較少的樣本,只要分析物樣 

本在溶液中的濃度維持相同,仍可以得到強度相當的訊號,這就是電噴灑離子化特有的濃度 

敏感(concentration sensitive)現象。早期使用的電噴灑噴嘴(spraying nozzle),噴嘴內徑約 

有一百微米(um)以上,分析物樣本在溶液的流速約在每分鐘數個至數百個微升(microliters) 

之間,很難將流速降低至每分鐘一個微升以下;近年來的研究,有人利用熔矽毛細管(fused 

silica capillary)製作成內徑只有 5~10 微米的微小化電噴灑噴嘴,可以極低流速(約 100~200 

nL/min),提供穩定的電噴灑質譜訊號,由於流速只有每分鐘數百個奈升(nL/min),有文獻 

將之稱為奈噴灑離子源(nanospray ion source)。所以過去改進電灑離子化技術的研究呈現一 

個重要的共同趨勢,就是將形成電噴灑現象的噴嘴(nozzle)口徑愈做愈小,以提供在低流速 

下穩定的電噴灑,由早期使用的金屬噴嘴直徑約為數百個微米(micron),現在已發展出使用 

矽玻璃毛細管拉延技術和應用微機電系統(MEMS)製程技術於微小化噴嘴,得到極精細及 

再現性高而且只有數十個微米乃至只有數個微米直徑的微型噴嘴,一般稱為微噴灑 

(microspray)或奈噴灑(nanospray)技術,將流速降至每分鐘微升甚至每分鐘奈升。 

奈噴灑離子源對於分析微量蛋白質而言,是一個不可或缺的工具,因為有了這個工具代 

表了微量的樣本在使用低流速的系統下,由於濃度的提高,可以得到強度較高的訊號。蛋白 

質體研究的一個重要限制,在於許多微量的蛋白質往往低於質譜儀的偵測下限而無法進行分 

析,但這些微量的蛋白質卻可能在生理上有重要的功能(例如訊息傳遞分子),奈噴灑離子化 

質譜儀分析提供了一個靈敏的分析工具來研究微量的蛋白質。 

結語

149 


質譜分析技術的發明,可以追溯自二十世紀初期,人類已經可以利用質譜儀分析氣體分 

子的質量;在二十世紀結束前,人類終於找到了精確量測巨大蛋白質分子質量的方法,有兩 

種方法幾乎是同時期,也就是 1980 年代中期,被研究者發現而提出,這兩種方法就是電噴灑 

離子化與介質輔助雷射脫附離子化質譜分析技術。前者是本章介紹的主題,它與後者有一個 

基本的不同之處;電噴灑提供一個將液體樣本中分子離子(daughter ion)化得過程,而介質 

輔助雷射脫附離子化則是針對固態的樣本進行分析。這樣的差別,使得電噴灑離子化質譜分 

析技術遠比介質輔助雷射脫附離子化質譜分析技術,適合與高效能液相層析(high performance 

liquid chromatography )連線結合成為液相層析質譜儀(liquid chromatography-mass 

spectrometry) (14) 。液相層析質譜儀可以將蛋白質經水解酶降解後的複雜胜肽碎片混合物作有 

效率的分離,而陸續由液相層析管柱流入電噴灑離子源,產生胜肽離子而得到質譜數據,再 

利用質譜數據所形成的質量分布,與蛋白質序列資料庫比對,鑑定出蛋白質的身份;為了能 

分析蛋白質體中微量的蛋白質,這幾年更有人將毛細管液相層析結合奈噴灑離子源,發展出 

可以對 femtomolar 微量蛋白質進行身份鑑定的工具,這是目前蛋白質體學研究中進行蛋白質 

身份鑑定最普遍被使用的方式之一。另外值得一提的是,這樣的分析工具目前是高度自動化 

而具有高產出的能力,適合用來進行蛋白質體學研究。 

回顧蛋白質體學研究發展歷史,可以從需求面與技術供給面兩者來觀察。二十世紀後期 

基因體學研究的蓬勃發展,乃至於人類基因圖譜計劃完成,提供了蛋白質體學研究的需求面; 

而質譜分析技術(包含電噴灑離子化)的發展則提供了進行蛋白質體學研究適當的工具。綜 

觀上述電噴灑離子源、各式質量分析器、甚至毛細管液相層析、前端蛋白質樣本處理技術(此 

部份因篇幅關係在本章未能介紹)的發展,皆因蛋白質體學研究時代的來臨與需求,有快速 

與不斷創新的發展,可謂是好戲連棚,可以猜測的是,這樣的創新突破可能仍會持續進行下 

去,且讓我們拭目以待! 

參考文獻 

1. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., and Whitehouse, C. M. (1989)Electrospray ionization for 

mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71. 

2. Kebarle, P.(2000)A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass 

spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 804-817. 

3. Castano, M. G., and Fernandezn, J.(2000)Kinetic of small ion evaporation from the charge and mass 

distribution of multiply charged clusters in electrosprays. J. Mass Spectrom. 35, 790-803. 

4. Van Berkel, G. J., Asano, K. G., and Schnier, P. D.(2001)Electrochemical processes in a wire- 

in-a-capillary bulk-loaded, nano-electrospray emitter. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 853-862. 

5. Bruins, A. P.(1998)Mechanistic aspects of electrospray ionization. J. Chromatogr. A. 794, 345-357. 

6. Kebarle, P., and Tang, L. (1993)From ions in solution to ions in the gas phase. Anal. Chem. 65, 972-975. 

7. Richard, D. S., Joseph, A. L., Rachel, R. O., Mark, B., and Harold, R. U.(1991) Principles and practice of

150 


electrospray ionization-mass spectrometry for large polypeptides and proteins. Mass spectrom. rev. 10, 

359-451. 

8. Gaskell, S. J.(1997)Electrospray:principles and practice. J. Mass Spectrom. 32, 677-688. 

9. Richard, D. S., Joseph, A. L., Charles, G. E., Charles, J. B., and Harold, R. U.(1990)New developments in 

biochemical mass spectrometry:electrospray ionization. Anal. Chem. 62, 882-899 

10. Cole, R. B.(2000). Some tenets pertaining to electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass 

Spectrom. 35, 763-772. 

11. William, J. G., Andreas, P. J., Suya, L., Dilip, K. R., and Yuqin, W.(2001)Electrospray and tandem mass 

spectrometry in biochemistry. Biochem. J. 355, 541-561. 

12. Wilm, M., and Mann, M. (1996)Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Anal. Chem. 

68, 1-8. 

13. Karas, M., Bahr, U., and Dulcks, T.(2000)Nano-electrospray ionization mass spectrometry addressing 

analytical problems beyond routine. Fresenius J. Anal. Chem. 366, 669-676. 

14. Fligge, T. A., Bruns, K., and Przybylski, M.(1998)Analytical development of electrospray and 

nanoelectrography mass spectrometry in combination with liquid chromatography for the 

characterization of proteins. J. Chromatogr. B. 706, 91-100.

前言 

151 

第十三章、離子井質譜儀於蛋白質體學上的應用 

第十三章 

離子井質譜儀於蛋白質體學上的應用 

Ion Trap Tandem Mass Spectrometry in Proteomic Analyses 

永進生物科技股份有限公司研發部 

蔡有光 

蛋白質體學(Proteomics)是一門用來研究一群蛋白質的科學與技術 (1-3) 。其目的是希望 

藉研究特定的代謝路徑、細胞胞器、細胞、組織、器官甚至整個生物體之中,所有蛋白質(蛋 

白質體)之性質的變化,以了解整個單元在不同生理與疾病狀態下的變化。我們有興趣的蛋 

白質體性質,包括了蛋白質的種類與數量、後轉譯修飾基(post-translational modification)、 

在細胞胞器間的運動與分佈、蛋白質間的交互作用等等。另一方面,離子井質譜儀應用於生 

物醫學的研究 (4) ,算來已將近十年的歷史。這段期間當中,它一直是各類蛋白質分析實驗的 

重要工具。本章將簡單介紹離子井質譜儀的結構、原理與操作,並以實例說明它在蛋白質體 

學上各類重要問題的應用。 

內容 

壹、離子井質譜儀的結構 

離子井質譜儀跟一般的質譜儀一樣,可分為三個部分:離子源(ion source)、質量分析器 

(mass analyzer)、以及離子偵測器(ion detector)(如圖一)。 

圖一、離子井質譜儀的基本結構包括離子源、質量分析器與離子偵測器 

離子源的作用,在於把固體或液體內的離子轉化成氣態。在蛋白質與胜肽的分析實驗中, 

最常用與離子井質量分析器連結的離子源有兩種:電噴灑游離(electrospray ionization 或 ESI)

152 


與基質輔助雷射誘發脫附游離(matrix-assisted laser desorption / ionization 或 MALDI)。前者 

適用於液體的樣本的分析,而後者則適用於固態樣本的分析。 

離子井質量分析器為此類質譜儀中的最特殊的結構。由三個電極所構成,包括兩個帽形 

電極(cap electrode),以及一個環形電極(ring electrode),整體大小約為一個網球的大小。 

離子井本身是一對稱性的結構,帽狀電極與環型電極的軸心在離子井內排列在同一直線上(如 

圖二、圖三);在此對稱組合的電極結構上施以電壓,便能在離子井內構成分布對稱的電場。 

代表軸心的直線一般定義成 Z 軸,而軸上有一中心點,與兩帽形電極呈等距(如圖三)。在離 

子井內的任一空間點相對於中心點的位置,可以用兩個座標值表達清楚:一是 r 值,是空間 

點與 Z 軸最近的距離;一是 z 值,是空間點在 Z 軸上與中心點的距離(如圖三)。有了這個 

空間概念,比較容易理解離子在離子井內的運動。 

圖二、離子井質量分析器的構造。它包括一對帽形電極與一個環形電極 

圖三、離子井質量分析器的內部空間。內部的任一空間點,可用 z 與 r 值定義它與中心點的 

相對關係。而加諸環形電極的叫基本電壓,施於帽形電極的是輔助電壓

貳、離子井質量分析器的基本原理與實際操作 

153 


一、基本原理 

在了解離子井質量分析器的實際操作,必須先介紹幾個離子井操控離子運動的電壓。與 

離子井操作最重要的電壓有兩個:基本電壓(fundamental rf)與輔助電壓(supplementary 

potential)。 

(一) 基本電壓(Fundamental rf) 

這是加在環形電極上的來回振盪的電壓,其大小範圍為 0 到 7000 伏特,而變化的頻率大 

小一般是 1.1 百萬赫茲(MHz)。這個電壓會在離子井內形成一對稱於 Z 軸的拋物面形狀的 

電場 (5) 。當離子距離中心點愈遠時,逼使它回到中心點的拉力就愈大。離子進入離子井後, 

會在這電場的作用下,循著軌道作環繞中心點的規則性運動。倘使離子井內充有氦氣,這些 

氦氣分子則會以輕微碰撞的方式,不斷的迫使離子運動的動能不斷縮小,最後離子井內的離 

子僅能在 Z 軸上作來回的振盪運動(如圖五)。也因為這個作用,這些氦氣分子被稱為挫弱氣 

體(damping gas)。此外,也有人叫它作浸浴氣體(bath gas)或目標氣體(target gas)。而離 

子來回運動的頻率與離子的質荷比有關,質荷比小的離子運動頻率較高,這頻率通常被叫做 

現實頻率(secular frequency) (6) 。而對一特定離子的運動而言,其運動擺幅與基本電壓值成 

正相關,亦即電壓愈大時離子運動的擺幅也愈大。因此,設定基本電壓的高低,便可以決定 

留在離子井內的離子質荷比範圍。只要不斷的提高基本電壓,便可以漸次驅排出不同質荷比 

的離子。 

(二) 輔助電壓(Supplementary potential) 

這是加諸於帽形電極間的電壓,本身屬於不斷來回變化的交流電壓,故以往稱為「交流 

電壓」(ac voltage),也有人叫它作輔助電壓(supplementary 或 auxiliary potential)。讓特定荷 

質比的離子的運動產生共振效應,是它在離子井操作上的主要功能。當輔助電壓的頻率與離 

子的現實頻率相等時,便會誘發離子產生共振效應。此時,離子飛行的擺幅會隨時間不斷增 

大,但因頻率不變而擺幅增加,故而離子飛行的速率與動能也不斷躍升。若是輔助電壓的電 

壓幅度較大時,會驅排發生共振的離子,而在離子偵測器上產生訊號,整個現象叫做共振驅 

排(resonance ejection) (7) 。若是輔助電壓的電壓幅度較小時,這些離子僅會與挫弱氣體作劇 

烈碰撞,導致離子結構的不穩定而斷裂,這個現象叫做共振激發(resonance excitation),此 

時的輔助電壓,有人叫它作搔癢電壓(tickle voltage)。 

二、離子井質譜儀的實際操作 

在一般蛋白質的分析中,離子井質譜儀常與液相層析儀做串聯使用,以分離蛋白質消解 

物(protein digest)中的複雜的胜肽成分。分離之後的冲提物,則直接引流到離子井質譜儀, 

經由電噴霧作用,將胜肽離子化,導引入離子井質量測定器內做分析。 

這類的實驗經常會運用三階段式質譜掃描(triple-play)的實驗技巧。首先,先測量當下 

進入質譜儀的離子究竟有哪些,又稱作一般質譜掃描(或稱 MS scan)。根據這個資料,我們

154 


可以選擇有興趣的離子做結構上的分析。為了知道離子的確實質量,會做一高解析度的放大 

式質譜掃描(或稱 zoom scan),以推算離子的電荷數。由電荷數乘上質荷比,便可求得離子 

的確實的質量。最後,我們將這個特定的離子打碎,分析其碎片離子的質譜圖,或稱串聯式 

質譜圖(tandem mass spectrum 或 MS/MS spectrum);而這個掃描,特別叫做串聯式質譜掃 

描(MS/MS scan 或 MS 2 scan)。離子井質譜儀資料收集的順序,常是這三個動作的不斷循環 

重複,亦即包括了一般質譜掃描、放大式質譜掃描、串聯式質譜掃描。而在這樣的實驗裡, 

我們如何經由調整基本電壓與輔助電壓等,使離子井質量分析器收集這些資訊呢?以下,將 

一一說明。 

(一) 一般質譜掃描(MS scan) 

分析物經由離子化後,被導引入離子井內,再排至離子偵測器以紀錄離子的質荷比與數 

量。這個實驗包括三個步驟:離子注入(ion injection)、離子收集(ion trapping)、離子掃描 

(ion scanning)三個動作。以基本電壓與輔助電壓而言,其隨時間的變化如圖四所示。 

圖四、質譜圖掃描過程中,基本電壓與輔助電壓的變化 

1. 離子注入(Ion injection)-由電噴霧(electrospray)或 MALDI 產生的離子以靜電聚焦系 

統傳導至離子井,在離子井的開口,藉由靜電離子門的電壓脈衝瞬間的收放,將離子注入 

離子井內。這個瞬間發生的動作與四極棒的質譜儀的控制截然不同。有個名詞叫離子化時 

間(ionization period),代表離子井開放的時間。其值愈大,進到離子井內的離子愈多,訊 

號也自然愈強。然而不斷的放大開放時間,並不一定會提升質譜圖的品質。因為當離子過 

多時,離子井內的空間電荷效應(space charge effect)也愈強。由於過多離子聚在離子井內 

時,會造成離子井內電場的改變,而影響離子井的性能。這個步驟中,基本電壓的設定是 

固定不變的,以製造一拋物面形的電場,將離子保持在離子井內運動。此時的輔助電壓, 則 

保持關閉的狀態。

155 


2. 離子聚集(Ion trapping)-在穩定的基本電壓作用下,絕大部分的離子都循著自己的軌跡 

在離子井內運動。質荷比小的運動幅度大,而質荷比大的運動幅度小。當有基本電壓存在 

時,在某質荷比範圍以下的離子,會因飛行軌道過大,而越出離子井的範圍。有人稱此質 

荷比值為排除限制值(exclusion limit) (8) 。而質荷比大小不同的離子在離子井內的聚集程度 

也不相同,一般而言,質荷比越大者,便愈不容易被收聚在離子井內 (5) 。而在離子聚集的整 

個過程中,挫弱氣體扮演著極重要的角色。原先離子的運動軌跡是三度空間的規則性運動, 

但經由挫弱氣體的作用後,可以讓它們在離子井內上的動能慢慢減小,最後只是侷限於 Z 

軸上的運動(如圖五)。這個過程又叫作離子冷卻(ion cooling)。 

圖五、挫弱氣體在離子聚集過程中的角色 

3. 離子掃描(Ion scanning)- 如圖四所示,以逐漸拉高基本電壓與輔助電壓的方式,依質 

荷比大小排出聚集的離子。當基本電壓拉高時,離子運動幅度開始變大。輔助電壓也逐漸 

拉高,製造共振驅排(resonance ejection)的效應 (9) 。但單靠 7,000 伏特的基本電壓,是無 

法驅逐所有的離子的,一定要有輔助電壓的協助作用下,所收集的離子才能一一的離開離 

子井。 

(二) 放大式質譜掃描(Zoom scan) 

當離子受電場的影響愈久時,離子井質量測量的解析度就愈大 (10) 。一般可以降低共振驅 

排電壓振幅,以及拉低掃描速度,增加每單位質量所測的數值的筆數。當掃描速度降低時, 

可以掃描的範圍也以同樣的倍數減少。譬如,掃描速度降低 100 倍時,原本可測量 2000 質量 

單位的離子井,測量範圍會變成僅能測量 20 個質量單位。一般來說,要能區分 1 至 3 個電荷 

的放大式質譜掃描,速度常需降低 100 至 300 倍。整個過程的基本電壓與輔助電壓的變化, 

則與一般質譜掃描類似,只是掃描速度較慢罷了。 

究竟放大式質譜掃描與離子電荷數的測量有什麼關係呢?我們利用的是同位素分布圖做 

電荷數的推算。由於每一元素都有質量相差為 1 的同位素,構成的化合物(如胜肽)自然也 

有質量相差為 1 的同位素群。例如,一質量為 2002.9 的胜肽,它的其他同位素帶+1 電荷與+2 

電荷時的質荷比應如下表所列:

單電荷雙電荷 

156 


(2002.9+1)/1=2003.9 (2002.9+2)/2=1002.4 

(2003.9+1)/1=2004.9 (2003.9+2)/2=1002.9 

(2004.9+1)/1=2005.9 (2004.9+2)/2=1003.4 

(2005.9+1)/1=2006.9 (2005.9+2)/2=1003.9 

(2006.9+1)/1=2007.9 (2006.9+2)/2=1004.4 

在放大式質譜掃描下,這兩組離子系列會呈現不同的同位素分布圖(如圖六)。由兩波峰 

間的差值,我們可以算出胜肽帶的電荷數。當帶 N 個電荷時,其波峰質荷比的差值應為 1/N。 

例如說,帶一個電荷時的波峰差值為 1,帶兩個電荷時的波峰差值為 0.5(即 1/2)。藉此,就 

可以算出電荷數了。 

圖六、單電荷與雙電荷胜肽之同位素分佈圖 

(三) 串聯式質譜掃描(MS/MS scan 或 MS 2 scan) 

整個過程包括了幾個動作:離子分離(ion isolation)、離子冷卻(ion cooling)、離子鍵離 

(ion dissociation)、離子驅排(ion ejection)。而基本電壓與輔助電壓的整個變化,在這四個 

過程中,基本電壓與輔助電壓控制各不相同(如圖七)。其中在離子分離的步驟中,在帽型電 

極上使用了特別的波型電壓(Waveform voltage),與一般的規則性交流電壓有所不同,故特 

別增列出來,以區分其不同。 

1. 離子分離(Ion isolation) 

進行串聯式質譜掃描時,將欲分析的離子分離出來是整個實驗的第一步。先是拉高基 

本電壓,以去除比挑選的離子質荷比小的離子。前面曾經提及,在一特定基本電壓下,在 

排除限制值以下的離子,會因 Z 軸的運動過大而流失。而比挑選的離子質荷比高的離子, 

則需在帽型電極上施以特殊的波形電壓,將他們一一去除,最後僅留下特定質荷比的離子 

存留在離子井內。

圖七、基本電壓、輔助電壓、與波形電壓於串聯式質譜掃描的變化 

157 


2. 離子冷卻(Ion cooling) 

基本電壓在前面的步驟中,已拉高至一定程度,其造成的電場會讓離子處於高度的運 

動狀態。為增加測量的解析度,必須慢慢降低基本電壓,藉由挫弱氣體減緩離子運動。 

3. 離子鍵離反應(Ion dissociation) 

輔助電壓這時會提供共振訊號,使得電壓的頻率與離子的現實頻率相等。在此共振激 

發狀態下,離子的速度與動能皆隨時間逐漸提昇 (11) 。撞擊氦氣分子後,蓄積於離子內的能 

量升高,會導致離子結構不穩定,而產生鍵離分應。在離子井內發生的鍵離反應的效率一 

般可以達到 40 至 80%,有時甚至可以到達 100% (12) 。由於有基本電壓存在,因此在排除限 

制值以下的碎片離子,會因運動幅度過大而流失。此時的這個排除限制值,又叫作搔癢質 

量(tickle mass)。而產生的碎片離子在基本電壓與挫弱氣體的作用下,動能會慢慢減低而 

停留在離子井內。 

而胜肽離子經過鍵離反應後,會產生甚麼樣的碎片呢?當一胜肽受到碰撞時,最常斷裂 

在胜肽鍵的位置。斷裂後的在 N 端形成的離子,稱為 b 離子;而 C 端形成的離子稱為 y 離子。 

我們使用下標指定 b 離子與 y 離子的形成位置,當下標為 n,即代表此離子含 n 個胺基酸單 

元。圖八顯示一胜肽在離子井質譜儀的 CID 作用後其產物離子形成的質譜圖。圖中主要的碎 

片離子多為 b 或 y 離子,然而其中也包含某些發生胺(ammonia)的中性脫失(neutral loss) 

的產物離子,其質量比原來的產物離子少了 17Da,而所帶的電荷數保持不變。這類中性脫失 

常見於含有 Gln、Lys 與 Arg 的胜肽。有時質譜中也常會看到水分子的中性脫失,其產物離子 

質量則少了 18Da,這類反應常見於含有 Ser、Thr、Asp 與 Glu 的胜肽。而另一類的中性脫失 

離子為 a 離子,其形成原因,為 b 離子脫失了一氧化碳分子(CO)造成 28Da 的質量損失。

圖八、胜肽在離子井內碰撞挫弱氣體分子後所得的碎片離子質譜圖 

158 


4. 離子驅排(ion ejection) 

對照前述的一般質譜掃描的電壓變化模式(如圖四),應會發現這個過程與之前所敘述 

的一模一樣。簡言之,基本電壓與輔助電壓以等比例慢慢升高,而碎片離子即依照質荷比 

次序,由小而大,一一排出離子井,而在離子偵測器上產生訊號。 

叁、離子井質譜儀與蛋白質身份鑑定 

傳統上,蛋白質的身份鑑定主要仰賴 Edman 降解反應(Edman degradation),以取得一小 

段蛋白質序列,比對蛋白質或核酸的序列資料庫。隨著序列資料庫的逐漸擴充,依靠質譜儀 

所得資訊,即可經由適當的演算方式,自資料庫找到蛋白質的身份資訊。由質譜儀取得數據 

作資料庫搜尋的方式,概分為兩大類:胜肽質量圖(peptide mass map)與串聯式質譜圖(tandem 

mass spectrum)的比對。而離子井質譜儀所得的資料,較適合於後一類的搜尋方法。以下是 

整個分析的步驟與方法的介紹。 

一、樣本處理 

我們必須先將蛋白質切成較小的胜肽片段,以配合離子井質譜儀測量上的準確度與解析 

度,以利資料庫之搜尋。首先,需用還原劑打破雙硫鍵(disulfide bond),再以烴化試劑(alkylating 

agent)將 Cys 修飾成較穩定的結構,而不致使雙硫鍵恢復,妨礙蛋白質酶的作用。最 

後才加入 trypsin 或 Lys-C 一類的蛋白質酶,將蛋白質切成較小的胜肽片段,所得的胜肽產物 

或稱蛋白質消解物(protein digest)。 

二、資料庫搜尋 

串聯式質譜圖之資料庫搜尋是利用串聯式質譜圖作比對。做這類實驗時,我們經常用液 

相層析儀與離子源做串聯使用,以自動化的方式,將胜肽一一分開送入質譜儀內作分析;蒐 

集的質譜圖包括前述的一般質譜掃描、放大式質譜掃描、與串聯式質譜掃描。質譜圖掃描在

159 


對進入的分析物作初步的分析,得到當下離子的質荷比數值;經過電腦程式設定,質譜儀會 

自動選擇一離子作放大式掃描,由同位素分佈圖求得電荷數值;之後再針對此離子做串聯式 

質譜掃描,取得蘊涵序列資訊的離子碎片質譜。而離子井質譜儀收集串聯式質譜圖的效率與 

品質都很高,一次實驗下來往往可以得到數百甚至數千張的串聯式質譜。 

離子的質荷比乘上電荷數即可得到質量的大小,接下來就把資料庫內具有的這個質量的 

胜肽挑選出來。然後再用這些胜肽片段的序列,計算他們的 b 與 y 離子的理論值(如圖九)。 

另一方面,整理樣本胜肽的串聯式質譜圖以得到主要碎片的質量,用來和資料庫挑出的每一 

胜肽的 b 與 y 離子的理論值相比對。當資料庫中的胜肽比對到質譜圖中越多的產物離子時, 

胜肽與串聯式質譜圖的吻合度也愈高(如圖十)。此外,比對時也會考慮這些假設的 b 與 y 離 

子,是否在串聯式質譜圖中為主要的產物離子。如果答案是肯定的,則吻合度更大為提高。 

在每一次的實驗中所收集到數十甚至數百張的串聯式質譜圖,每張都獨立的比對序列資料 

庫,最後再整理交集,便可以得到正確無誤的答案。更重要的是,由於資料比對完全獨立, 

即使原來樣本的成分複雜,我們都可以藉機率的概念,一一確認鑑定。這也是串聯式質譜圖 

比對法最重要的優點之一。 

圖九、資料庫搜尋程式處理並計算 b 與 y 離子質量的實際例子

圖十、理論的 b 與 y 離子質量與實際測得的碎片離子質譜圖的比較 

160 


以下用一實例做說明。這是自鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)純化出的能與其細菌線形 

染色體之終端體(telemere)共價結合的蛋白質,為了瞭解其身分與序列為何。我們對膠體的 

蛋白質作胰蛋白酶分解作用。所得胜肽產物以液相層析—離子井串聯式質譜儀法分析。當時 

實驗使用的機型是 ABI140D 型高壓液相層析儀(Applied Biosystems)串接 LCQ 離子井串聯 

式質譜儀(Finnigan),高壓液相層析儀配有 0.5×150 mm 的 PE Brownlee C18 300Å 管柱 

(Perkin-Elmer)。首先將經過膠體內胰蛋白酶分解作用的蛋白質樣溶解於 0.1% 甲酸,取二 

分之一的量加入 0.1%甲酸補至 20L,14,000 rpm 離心 10 分鐘,取上清液注入機器,以每分 

鐘 5 l 的流速以有機溶液沖提親水性不同的胜肽。接著利用三組掃描模式分析質譜,分別 

為:(1)一般質譜掃描,分別測取質荷比 395-800 與質核比 800-1650 範圍內的離子;(2)放 

大質譜掃描,以求得離子的同位素分布圖;(3)串聯式質譜掃描,針對一般質譜掃描中最多 

的離子,取得串聯式質譜。得到的結果以 Sequest(Finnigan)自動分析,分析時指定胰蛋白 

酶為酵素名稱,比對 Streptomyces coelicolor 的蛋白質序列與基因體序列。我們發現:此細菌 

基因體的 ORF(open reading frame)SC8D11.25 中的胜肽序列,可以與許多的串聯式質譜圖 

有很好的吻合程度;因此判定此 ORF 就是想要研究鑑定的蛋白質 (13) (如圖十一)。 

圖十一、串聯式質譜圖搜尋結果之實例。每一長方格代表實驗中測得的胜肽 (13)

161 


圖十二、假使修飾基之有無,不致響蛋白酶之裁切時,每一帶修飾基的胜肽必 

伴隨著一未修飾的胜肽 

肆、離子井質譜儀與蛋白質後轉譯修飾基分析 

在我們近來開發出以液相層析-質譜儀術為基礎,可有效且靈敏的搜尋帶後轉譯修飾基胜 

肽的方法,這方法叫作特定離子層析圖分析(specific ion tracing analysis) (14) 。我們推想:假 

使修飾基之有無,不致響蛋白酶之裁切時(如圖十二),每一帶修飾基的胜肽必伴隨著一未修 

飾的胜肽。由於小修飾基(如磷酸根)佔胜肽總體積的小部份,理論上對整個胜肽的化學性 

質影響有限。例如說,有無修飾基的胜肽在逆相層析柱內的沖提性質應十分接近。由於許多 

的蛋白質樣本的修飾程度不高(譬如: 10%),難以簡單的方法直接鑑定出來;而利用特定離 

子層析圖分析,則可以參考未修飾胜肽的位置,測試具修飾基胜肽是否存在(如圖十三)。 

圖十三、有修飾基的胜肽與未修飾的胜肽的沖提時間很接近 

液相層析儀與離子井串聯式質譜儀的設定,與用於身分鑑定的實驗相似。以圖十四為例, 

32.9 分鐘的波峰就是未修飾之胜肽(NDSVIVADQTPTPTR),而 30.5 與 32.1 分鐘的波峰則是 

具磷酸化胜肽(phosphorylated peptide)。兩者沖提時間的差異一如預期,僅止於 2 分鐘而已。

圖十四、有修飾基的胜肽與未修飾的胜肽的沖提時間差異小的實例 

162 


找到可能的磷酸化胜肽後,我們通常會藉另一次的獨立分析,以串聯式質譜圖證明這些 

磷酸化胜肽的身分。以這個例子為例,我們不僅證明兩波峰的確是磷酸化的胜肽,更發現每 

個波峰各自代表著不同的位置的磷酸化胜肽。30.5 分鐘的波峰的修飾基在 Thr-69,而 32.1 

分鐘的波峰的修飾基位置在 Thr-71(如圖十五)。這方法已陸續將應用在幾個不同蛋白質的 

研究上,包括病毒蛋白 (15) 、核仁蛋白 (16) 等,都能找到與這些蛋白質功能有關的磷酸化的胺 

基酸位置。此外,我們也成功的將此方法應用於其他小型修飾基的研究上,而初步的結果相 

當不錯。目前我們已成功的鑑識出蛋白質乙醯化(acetylation)的位置 (17) ,預期這些方法將 

能普遍的應用於各類小修飾基的研究上。 

圖十五、兩波峰代表不同的磷酸化胜肽。前波峰的磷酸化位置為 Thr-69,後波峰為 Thr-71 

六、離子井質譜儀與蛋白質體的整體分析 

對蛋白質體研究而言,將上述的蛋白質分析技術,配合上二維電泳的分析,應該可以解 

決此領域內的部分重要課題。然而,處理速度低與樣本處理難,一直是這類研究課題的主要 

障礙。因此,近來新的蛋白質體研究的趨勢,是把液相層析作為主要的蛋白質分離工具,希 

望能於一次的實驗中處理大量的蛋白質或胜肽,同時快速的鑑定其中所含的蛋白質。目前證 

明可獲致實驗結果的,當屬多維性蛋白質鑑定技術(multidimensional protein identification 

technology 或簡稱 MudPit)。而離子井質譜儀,則為率先被使用於這新技術。當然,其速度快 

而品質高的串聯式質譜圖收集,是獲致青睞的主要原因之一。

163 


什麼是多維蛋白質鑑定技術?在原來的設計中,蛋白質混合物於溶液中以蛋白質酶處理 

後,直接與陽離子交換的材質直接混合,讓這些產生的胜肽黏附在材質上。再以人工充填的 

方式,將無分析物的逆相層析材質置入微細管,在後方填入黏有胜肽產物的離子交換層析材 

料。之後,將此毛細管裝在離子井質譜儀的離子源中。作質譜儀分析時,先以低強度的含塩 

溶液,沖提出一部分胜肽來使他們黏附在前端的逆相層析柱,再開始逐漸拉高有機溶液的濃 

度,分離逆相層析柱內的胜肽,使他們進入離子井質譜儀內作串聯式質譜分析。這階段的分 

析完畢後,再以強度稍高於前者的含塩溶液,沖提出下一批的胜肽,重複同樣的逆相層析與 

串聯式質譜儀分析。重複多次之後,便可收集到數以千、萬計的串聯式質譜圖,經資料庫比 

對後,可以確定比對出數以百千計的蛋白質的身份 (18) 。 

圖十六、多維蛋白質鑑定技術的基本架構 

這個技術最近被應用來分析鎌狀性瘧疾原蟲(Plasmodinm falciparum)的生命週期中各 

時間蛋白質體成分。此原蟲在人類體內,會在紅血球內先行成環型胞子體(trophozoite),經 

過不斷的有絲分裂後,會變成裂殖子(merozoite);使紅血球破裂後,便會不斷繁殖。有些 

紅血球會形成原生的生殖體(gametocyte),被吸入瘧蚊後,會在瘧蚊胃內發育成胞子體 

(sporozoite)。這個研究的目的,便在探討在這四個不同時期中,蛋白質表達的差異程度。 

由於瘧原蟲的基因體已定序完成,因此資料庫搜尋上,並無任何困難。其中重要的成果,節 

錄於圖十七之中。他們成功的在環型胞子體、裂殖體、生殖體、胞子體的蛋白質體中各自成 

功鑑定了 1036、839、1147、1049 個蛋白質來,而瘧原蟲共有 2,415 個基因,所以約有三至 

四成的蛋白質表達於各個時期。各類蛋白質在不同時期表現的變化也是研究的重點。大致而 

言,前三時期中與核酸轉錄(transcription)、代謝途徑、蛋白質合成有關的蛋白質,被鑑定 

出的機率要比其他類的蛋白質要高的多。而在胞子體內這些蛋白質的表現,就不如其他時期 

來的明顯。這個結果也簡單證明了蛋白質體在生命週期的多變性 (19) 。

圖十七、鎌狀性瘧疾原蟲生活周期中蛋白質體的變化 (19) 

164 


然而這樣的技術也有它的一些缺陷,譬如說,在整個技術中並未探究量的觀念,雖然他 

們試圖以蛋白質涵蓋率做為指標,但事實上是不充分的。為此,同一群研究者正朝定量分析 

的方向改進此技術,目前似乎已有初步的成果。此外,另一值得注意的技術,當屬同位素黏 

附標記(Isotope-coded affinity tag)的分析方法。然而,至今仍無較重要的應用實例報告,在 

此將不作詳細的討論。 

結語 

自從 1983 年 Finnigan MAT 的 George Stafford 對離子井質譜儀作了重要的改進後,經由 

過去近二十年的發展,其功能實已突飛猛進。其最大的優點,是能進行多次的串聯式質譜實 

驗,對特定分子的結構分析,有非常大的貢獻;而靈敏度高也是重要的優點,少至 10 6 的胜 

肽離子也有可能作其質量的測量。此外,效率高、操作容易、而價格不昂貴等優點,使得離 

子井質譜儀成為未來的蛋白質體研究上不可或缺的重要工具。 

參考文獻 

1. Wilkins, M. R., Sanchez, J. C., Gooley, A. A., Appel, R. D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D. F., and 

Williams, K. L.(1996)Progress with proteome projects. Why all proteins expressed by a genome should 

be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13, 19-50. 

2. Hochstrasser, D. F.(1998)Proteome in perspective. Clin. Chem. Lab. Med. 36, 825-836. 

3. Aebersold, R., Goodlett, D. R.(2001)Mass spectrometry in proteomics. Chem. Rev. 101, 269-295. 

4. Jonscher, K. R., and Yates, J. R. III.(1997)The quadrupole ion trap mass spectrometer-a small solution to 

a big challenge. Anal. Biochem. 244, 1-15. 

5. McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Goeringer, D. E., and Glish,G. L.(1994)Ion-trap mass spectrometry 

of externally generated ions. Anal. Chem. 66, 689A-696A. 

6. Wuerker, R. F., Shelton, H., and Langmuir, R. V. (1959)Electrodynamic containment of charged parti

-cles. J. Appl. Phys. 30, 342–349. 

165 


7. March, R. E., and Hughes, R. J.(1989)in Chemical Analysis, A Series of Monographs on Analytical 

Chemistry and Its Applications(Winefordner, J. D., and Kolthoff, I. M., Eds.), Vol. 102, Wiley, New 

York. 

8. Williams, J. D., Reiser, H.-P., Kaiser, R. E., Jr., and Cooks, R. G. (1991). Ion Proc. Resonance effects 

during ion injection into an ion trap mass spectrometer. Int. J. Mass Spectrom 108, 199-219. 

9. Kaiser, R. E., Jr., Cooks, R. G., Stafford, G. C., Jr., Syka, J. E. P., and Hemberger, P. H. (1991)Operation 

of a quadruple ion trap mass spectrometer to achieve high mass charge ratios Int. J. Mass Spectrom. Ion 

Proc. 106, 79-115. 

10. Fischer, E. Z.(1959)Phys. 156, 1. 

11. Louris, J. N., Cooks, R. G., Syka, J. E. P., Kelley, P. E., Stafford, G. C., Jr., and Todd, J. F. J.(1987) 

Instrumentation, applications, and energy deposition in quadrupole ion-trap tandem mass spectrometry. 

Anal. Chem. 59, 1677-1685. 

12. Cooks, R. G., and Kaiser, R. E., Jr.(1990)Quadrupole ion trap mass spectrometry. Acc. Chem. Res. 23, 

213–219. 

13. Yang, C. C., Huang, C. H., Li, C. Y., Tsay, Y. G., Lee, S. C., and Chen, C. W. (2002)The terminal 

proteins of linear Streptomyces chromosomes and plasmids, a novel class of replication priming 

proteins. Mol. Microbiol. 43, 297-305. 

14. Tsay, Y. G., Wang, Y. H., Chiu, C. M., Shen, B. J., and Lee, S. C.(2000)A strategy for identification and 

quantitation of phosphopeptides by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 

287, 55-64. 

15. Chen, C. W., Tsay, Y. G., Wu, H. L., Lee, C. H., Chen, D. S., and Chen, P. J.(2002)The double-stranded 

RNA-activated kinase, PKR, can phosphorylate hepatitis D virus small delta antigen at functional serine 

and threonine residues. J. Biol. Chem. 277, 33058-67. 

16. Chiu, C. M., Tsay, Y. G., Chang, C. J., and Lee, S. C.(2002)Nopp140 is a mediator of the protein kinase 

A signaling pathway that activates the acute phase response 1-acid glycoprotein gene. J. Biol. Chem. 277, 

39102-11. 

17. Wang, Y. H., Tsay, Y. G., Tan, B. C., Lo, W. Y., and Lee, S. C.(2003)Identification and characterization of 

a novel p300-mediated p53 acetylation site, lysine 305. J. Biol. Chem. 278, 25568-25576. 

18. Washburn, M. P., Wolters, D. and Yates, J. R. III(2001)Large-scale analysis of the yeast proteome by 

multidimensional protein identification technology. Nature Biotechnol. 19, 242-247. 

19. Florens, L., Washburn, M. P., Raine, J. D., Anthony, R. M., Grainger, M., Haynes, J. D., Moch, J. K., 

Muster, N. Sacci, J. B., Tabb, D. L., Witney, A. A., Wolters, D., Wu, Y., Gardner, M.J., Holder, A. A., 

Sinden, R. E., Yates, J. R., and Carucci, D. J. (2002)A proteomic view of the Plasmodium falciparum 

life cycle. Nature 419, 520-526.

166 


20. Gygi, S. P, Rist, B., Gerber, S. A, Turecek, F., Gelb, M. H., and Aebersold, R.(1999)Quantitative 

analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnol. 17, 994-999.

PARTⅣ 

167 

PARTⅣ、蛋白質體學在生物醫學上之應用 

蛋白質體學在生物醫 

學上之應用

前言 

168 

第十四章、蛋白質交互作用之蛋白質體學研究 

第十四章 

蛋白質交互作用之蛋白質體學研究 

Proteomic Based for the Study of Protein-Protein Interactions 

國立陽明大學生化所 

翟建富,廖辰中 

細胞中有許多生理反應是透過蛋白質交互作用所產生,例如訊息傳導、生長週期調控及 

代謝反應等。傳統研究蛋白質交互作用的方法,通常是鎖定某幾個蛋白質分子,再利用生化 

方法研究彼此間的交互作用及生理意義;這類型的研究策略不僅耗時,而且無法全面觀察細 

胞內的變化。 

當越來越多物種的染色體完成定序後,如何應用這些序列資訊,快速且有效率的找出細 

胞中各個基因在細胞中的生理功能,是後基因體時代(post genomic era)的研究重點。本章 

節將介紹如何利用蛋白質體(proteome)的觀念及技術,有效率的研究細胞內各種蛋白質間 

彼此的交互作用。 

內容 

壹、蛋白質體學(Proteomic) 

一、何謂蛋白質體學 

蛋白質體(proteome)是相對於基因體(genome)所產生的名詞,蛋白質體的觀念是全 

面分析細胞內蛋白質的變化情況;傳統蛋白質體的實驗策略是利用二維電泳(two-dimensional 

electrophoresis)分離蛋白質,並利用胺基酸定序的方法鑑定蛋白質的種類,此方法雖然可以 

滿足某些實驗需求,但是卻缺乏大量分析的能力;目前新發展的蛋白質體實驗方法主要是克 

服傳統方法的缺點,達到快速且大量分析的目的。 

二、蛋白質體學在後基因體時代所扮演的角色 

目前有許多物種的染色體已完成定序,為了快速分析細胞內基因的表現變化,發展具有 

大規模分析的方法是必須的。目前有許多方法具有快速且全面的分析的能力,例如 DNA 微 

陣列(microarray)分析及蛋白質體分析等,但是蛋白質體的實驗策略與其他方法比較有以下 

的優點:(1)蛋白質體是以分析細胞內蛋白質的變化為基礎;細胞中執行功能的分子為蛋白 

質,細胞內蛋白質含量的改變可以直接反映其生理的變化。(2)細胞內蛋白質的調節除了量 

的變化外,還有質的變化;二維電泳除了可以觀察蛋白質含量的變化之外,還可以找出蛋白 

質是否有被修飾,例如:蛋白質的磷酸化,即是常見的修飾作用。(3)透過實驗設計,可以 

觀察蛋白質間的交互作用;利用酵母菌雙雜交系統(yeast two hybrid system)或是親合性純 

化,可以直接觀察蛋白質間的交互作用,研究這些交互作用,對於探討蛋白質在細胞內所扮

演的角色有很大的幫助。 

貳、蛋白質體的研究方法 

169 


蛋白質體的研究方法,其特點是這些方法具有大規模分析的能力,以下我們介紹幾種應 

用於蛋白質體的實驗方法:(1)二維電泳(two-dimensional electrophoresis);(2)質譜儀(mass 

spectrometry);(3)酵母菌雙雜交系統(yeast two hybrid system);(4)蛋白質晶片(protein 

chip)。 

一、二維電泳(two-dimensional electrophoresis) 

二維電泳分離蛋白質樣品的原理是依蛋白質分子的等電點及分子量差異。利用二維電泳 

分析蛋白質樣品具有以下幾個優點:(1)二維電泳具有高的解析度,進行一次電泳,可同時 

分析數百至上千個蛋白質。(2)電泳完成後,蛋白質可以在電泳片中保存,待日後分析。(3) 

電泳片中可以直接觀察蛋白質樣品是否有產生修飾反應。(4)二維電泳可以與質譜儀結合加 

速蛋白質鑑定的速率。電泳片中的蛋白質經蛋白酶水解後,可利用質譜儀分析,鑑定蛋白質 

種類。 

二維電泳是結合兩種不同分離原理的電泳系統,其第一維電泳為 IEF 電泳,第二維電泳 

為 SDS-PAGE。IEF(isoelectric focusing: IEF)電泳其分離蛋白質的原理,是利用蛋白質等電 

點(isoelectric points : pI)的差異分離蛋白質。蛋白質是一種兩性物質(amphoteric molecules), 

其可能依所在環境 pH 的不同,產生不同的帶電狀況。蛋白質的淨電荷是由其組成胺基酸側 

鏈(side chain)及 N 端(amino-termini)及 C 端(carboxyl-termini)電荷的總和,而蛋白質 

的等電點(pI)是指蛋白質在特定的 pH 下,其淨電荷為零,此特定的 pH 即為蛋白質的 pI。 

當蛋白質所在環境的 pH 值大於其本身的等電點時,蛋白質分子會帶負電,反之則帶正電(如 

圖一)。 

圖一、蛋白質分子淨電荷與環境 pH 的關係 

蛋白質所在的環境的 pH 值大於其本身的等電點(pI)時,蛋白質分子會帶負電,反之則帶正 

電。 

當我們了解蛋白質分子淨電荷與環境 pH 的關係後,接下來我們來說明 IEF 電泳如何依

170 


照蛋白質等電點的不同,分離蛋白質。IEF 電泳片本身具有 pH 梯度(pH gradient),電泳片 

中的蛋白質其 pI 若小於所在環境的 pH,則蛋白質會帶負電,因此會往正極移動,反之則往 

負極移動,當蛋白質移動至 pH 等於其 pI 時,蛋白質分子的淨電荷為零此時蛋白質分子才不 

移動,所以蛋白質分子會依其等電點,分佈於 IEF 電泳片中(如圖二)。 

圖二、IEF 電泳分離等電點不同蛋白質的原理 

(A)通電前兩種不同 pI 的蛋白質隨機散佈於 IEF 電泳中,圓形中的數字表示蛋白質的 pI。(B) 

通電後蛋白質移動至 pH 等於其 pI 處,蛋白質分子的淨電荷為零,此時蛋白質分子才不移動。 

完成第一維電泳後,在進行第二維電泳,第二維電泳為 SDS-PAGE,因為不同分子量的 

蛋白質分子在 SDS 電泳片中移動速率不同,分子量大移動慢,經電泳後可將分子量不同的蛋 

白質分離,蛋白質樣品經過二次電泳分離後,蛋白質分子會依其等電點及分子量的特性分佈 

於電泳片中(如圖三)。 

二、質譜儀 

質譜儀因為具有準確、靈敏及快速等優點,所以廣泛的應用於不同領域。因為分子游離 

方法的改良,例如雷射脫附(laser desorption, LD)及電灑法(electrospray)等,使得可分析 

的樣品種類及範圍增加。目前已可利用質譜儀分析高分子量、極性大及對熱不穩定的生物性 

分子;此外質譜儀可與氣態層析(GC)、液態層析(LC)等分離儀器結合,使得質譜儀已廣 

泛的應用於生命科學的研究。

171 


圖三、二維電泳結果 

蛋白質樣品經過二次電泳分離後,蛋白質分子會依其等電點及分子量的特性分佈於電泳片中。 

目前主要有三種不同偵測原理的質譜儀可以運用:(1)飛行時間質譜儀(TOF-MS: 

time-of-flight mass spectrometry),是以測量飛行時間為基礎的質譜儀。(2)四極柱式質譜儀 

(quadrupole mass spectrometry) 是利用四極棒電場進行分離。(3)傅立葉轉換離子迴旋共振質 

譜儀(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry)是利用三度空間的離子阱 

(ion trap)以選擇性排除離子的方式達到分離的目的。以下舉例兩種應用於蛋白質體研究的 

質譜儀:MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time of flight mass 

spectrometry) 及四極棒- 飛行時間式質譜儀 Q-TOF ( Quadrupole- Time of flight mass 

spectrometry)。 

MALDI-TOF 是分析蛋白質經蛋白酶水解後,所產生胜鏈片段的組合,得到胜鏈片段的 

組合資料庫後,再與蛋白質胜鏈片段的資料庫中的預測結果比對,找出組合相符的蛋白質, 

藉此達到鑑定蛋白質種類的目的(如圖四)。

蛋白酶水解 

MALDI-TOF分析 

資料庫比對 

172 


未知蛋白質 

胜鏈片段 

質譜儀分析結果 

比對結果 

確定蛋白質種類 

圖四、MALDI-TOF 分析蛋白質流程 

MALDI-TOF 是分析蛋白質經蛋白酶水解後,所產生胜鏈片段的組合,得到胜鏈片段的組合 

資料庫後,再與蛋白質胜鏈片段的資料庫中的預測結果比對,找出組合相符的蛋白質,藉此 

達到鑑定蛋白質種類的目的。

173 


MALDI 為一種提供離子源(ion source)的方式,進行樣品分析時先將待分析之樣品(經 

蛋白酶水解之蛋白質樣品多胜鏈片段)與基質(Matrix)做混合,常用的基質是α-cyano-4hydroxycinnamic 

acid。將樣品的混合液點至金屬盤(target plate),待溶劑揮發後混合物會在 

金屬盤上產生結晶。以 MALDI-TOF 分析時,利用雷射光來激發金屬盤上的結晶,當雷射光 

束打擊到基質時,基質可將能量傳給多胜鏈片段,並造成多胜鏈片段質子化及氣化,氣化之 

多胜鏈片段經由電場加速便進入 TOF 質量分析儀中進行分析(如圖五),所得的結果再與資 

料庫比對,找出胜鏈片段組合相符的蛋白質。因為 MALDI-TOF 具有靈敏度高且分析迅速的 

優點,所以常作為大量分析的工具;使用 MALDI-TOF 的限制是資料庫中必須有分析樣品蛋 

白質的序列資料。 

圖五、MALDI-TOF 離子化原理 

(A)蛋白質樣品與基質混和後加至分析金屬盤的過程。(B)蛋白質樣品經蛋白酶水解所產生之 

多胜鏈片段,與基質(Matrix)做混合,混合物會在金屬盤上產生結晶,分析時以雷射光激 

發金屬盤上的結晶,當雷射光束打擊到基質時,基質可將能量傳給多胜鏈片段,並造成多胜 

鏈片段質子化及氣化,氣化之多胜鏈片段經由電場加速後,進入 TOF 質譜儀(Time-of-flight 

mass spectrum)中進行分析。

174 


Q-TOF 為串聯式質譜儀(tandem mass spectrometry),其結合四極質譜(quadrupole mass 

spectrometry)及飛行時間質譜;Q-TOF 分析主要是要獲得物質的結構資料,如蛋白質序列或 

是胺基酸是否有修飾反應產生。Q-TOF 分析多胜鏈片段的胺基酸序列時,必須先啟動第一個 

質譜儀,將單一的胜鏈片段(母片段)自混合物中分離出來,並且利用通入的氣體,如 argon 

或 nitrogen 將胜鏈片段打斷,再以第二個質譜儀收集這些子片段的訊號;當收集到子片段的 

訊號後,再由子片段的組合推導出胜鏈片段的胺基酸序列(如圖六)。 

圖六、Q-TOF 分析蛋白質原理 

Q-TOF 分析多胜鏈片段的胺基酸序列時,必須先啟動第一個質譜儀將單一的胜鏈片段(母片 

段)自混合物中分離出來,並將胜鏈片段打斷,再以第二個質譜儀收集這些子片段的訊號, 

當我們收集到子片段的訊號後,再由子片段的組合推導出胜鏈片段的胺基酸序列。

175 


三、酵母菌雙雜交系統(yeast two hybrid system) 

酵母菌雙雜交系統是一種偵測一基因對,所表現的蛋白質是否可產生交互作用的方法; 

與其他方法比較,其最大的優點是不需進行蛋白質的純化,只需利用基因選殖的方式,將基 

因選殖至質體,即可進行實驗。其作法是將兩種欲測試的基因分別接在轉錄因子(transcription 

factor)的結合位功能區(binding domain)及活化功能區(activation domain),並且送入酵母 

菌中進行表現。如果兩個測試蛋白質可產生交互作用,則可啟動報導基因(report gene)的系 

統。利用此實驗策略,可以快速的自一系列基因中,篩選出可產生交互作用的蛋白質基因(如 

圖七)。 

圖七、以酵母菌雙雜交系統研究基因庫中基因產物的交互作用 

將基因庫中欲測試的基因分別接在轉錄因子(transcription factor)的結合位功能區(binding 

domain)及活化功能區(activation domain),並且送入酵母菌中進行表現,如果兩個測試蛋 

白質可產生交互作用則可啟動報導基因(report gene)。

176 


四、蛋白質晶片(protein chip) 

蛋白質晶片與 DNA 微陣列(microarray)實驗觀念相同,利用蛋白質晶片可以在同一晶 

片上,觀察樣品中的蛋白質分子與晶片上多種待測蛋白質的結合差異。 

蛋白質晶片是將多種待測的蛋白質固定於玻璃或是其他材質上,再利用此晶片檢測樣品 

與晶片上待測蛋白質的結合反應。蛋白質晶片除了可以分析蛋白質的結合反應外,還可以應 

用於分析蛋白質功能、修飾反應及調節機制的研究 (1, 2, 3) 。 

五、SELDI-TOF MS 質譜儀(surface enhanced laster desorption/ ionization time-of-flight mass 

spectrometry) 

與疾病相關蛋白質分子的研究,常應用於臨床診斷,醫院常面對大量的檢體,所以利用 

疾病相關指標蛋白質(disease biomarker)作為分析診斷依據,是最有效率的方法之一。一般 

尋找指標蛋白質常用的方法,是透過二維電泳比對正常與病人的檢體(如血液、尿液等),並 

比較兩者的蛋白質表現差異,藉此找出與疾病有關的蛋白質。以二維電泳分析病人檢體主要 

的問題是病人檢體的處理與二維電泳呈色靈敏度限制;為了改善上述的問題,建立另一套分 

析快速及靈敏的方法是必須的。有人結合晶片(chip)操作方便及質譜儀高靈敏度的優點, 

設計出 SELDI-TOF 作為蛋白質分析的工具 (4) 。此方法最大的優點是利用同一晶片上不同性 

質的表面(如圖八)(如:陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、抗體等) (5) ,作為選擇性分離的 

工具;與晶片表面結合的分子再以 TOF 質譜儀分析,因質譜儀靈敏度高,有人測試只需 25-50 

個細胞即可進行分析 (6, 7) 。目前已有越來越多 SELDI-TOF 作為尋找指標性蛋白質的研究工具 

(8-10) 

。SELDI-TOF 主要的功能是取代二維電泳作為分析與比對的工具,本身並無法鑑定蛋白 

質的種類,所以其功能與 MALDI-TOF 及 Q-TOF 不同。所以若以 SELDI-TOF 找到檢體中蛋 

白質表現差異後,必須結合其他的分析方法,才能更進一步確定所找到的指標蛋白質種類。 

參、蛋白質交互作用之蛋白質體學研究 

目前有數種蛋白質體實驗策略,應用於研究蛋白質交互作用,下列為幾種常見的方法:(1) 

利用親合性純化結合質譜儀分析蛋白質交互作用;(2)利用酵母菌雙雜交系統分析蛋白質交 

互作用;(3)利用蛋白質晶片分析蛋白質交互作用,以下我們針對不同的方法加以討論並比 

較其優缺點。 

一、利用親合性純化結合質譜儀分析蛋白質交互作用 

此實驗策略是利用含有親合性尾端的蛋白質如含 His-tag 及 GST-tag 的蛋白質與細胞內其 

他蛋白質進行結合測試,並利用質譜儀分析鑑定與其形成複體的蛋白質種類(如圖九)。

(A) 

(B) 

177 


圖八、SELDI-TOF 的分析原理 

(A)各種不同類型的 SELDI-TOF 蛋白質晶片。(B)SELDI-TOF 分析示意圖。當欲分析的 

蛋白質樣品與晶片作用後,以 TOF 質譜儀分析與晶片表面結合蛋白質的分子量分佈。

178 


圖九、利用親合性純化結合質譜儀分析蛋白質交互作用 

利用含有親合性尾端的蛋白質如含 His-tag 及 GST-tag 的蛋白質與細胞內其他蛋白質進行結合 

測試,並利用質譜儀分析鑑定與其形成複體的蛋白質種類。 

目前已有一些利用此研究策略進行大規模分析的例子:Gavin 等 (11) 人利用 1700 種以上 

含有親合性尾端的酵母菌蛋白質,自 Saccharomyces cerevisiae 中分離到 232 個複體蛋白質, 

並鑑定出 1440 種蛋白質。Ho 等人 (12) 利用類似的實驗策略,找出超過 3000 個蛋白質間的交 

互作用;利用上述蛋白質結合反應的資料庫,除了可以作為分析訊息傳遞的路徑外,還可以 

結合生物資訊,歸納出蛋白質胺基酸序列及功能區(domain)在蛋白質結合反應中所扮演的 

角色,所推導出的結果可以應用於電腦預測蛋白質交互作用。

179 


利用親合性結合純化的方式可以快速找出有哪些蛋白質會產生交互作用,但是在應用上 

須注意以下幾個問題:(1)利用親合性純化所得到的蛋白質複體,因為結合反應的條件並不 

是真正的生理環境,所以實驗觀察到的結合反應,並不表示細胞中會有相同的結果。(2)有 

結合反應並不表示其在生理中有其意義,可能是非專一性的結合。(3)細胞中結合不緊密的 

蛋白質,例如一些調節性蛋白質,當其對下游蛋白質完成修飾反應後,即與受質分離,此類 

型的蛋白質可能不易利用此策略觀察到。 

因為上述的原因,所以利用親合性純化所觀察到的結果,必須再利用其他方法進行確 

認,如蛋白質結合動力學及基因層次上的研究,否則極易得到不具生理意義的推論。 

相同的實驗策略可以運用於抗體進行免疫共沈澱的實驗上,但是利用抗體進行實驗時須 

利用單株抗體,而且此抗體必須具有高的專一性,如此才可以得到可信的結果。 

利用親合性純化蛋白質複體,常遭遇到的問題是作為餌的蛋白質,其含量遠超過與其形 

成複體的蛋白質,所以直接將所有的蛋白質進行分析,某些含量較低的蛋白質可能會偵測不 

到,所以建議蛋白質複體先用電泳或是其他的純化方法進行初步的分離,再以質譜儀進行分 

析。 

二、利用酵母菌雙雜交系統分析蛋白質交互作用 

酵母菌雙雜交系統已廣泛的應用於研究酵母菌與 Caenorhabditis elegans 細胞內的蛋白質 

交互作用。利用酵母菌雙雜交系統研究酵母菌內的蛋白質交互作用,約有 4000 個細胞內蛋白 

質間的交互作用被發現 (13, 14) ,此結果對於研究這些蛋白質在細胞內所扮演的角色有很大的幫 

助。以相同的研究策略,Walhout 及 Boulton 等以酵母菌雙雜交系統,分析細胞內 DNA 受到 

損傷後,細胞內蛋白質間的交互作用 (15, 16) 。 

以酵母菌雙雜交系統研究蛋白質間的交互作用有以下幾個優點:(1)所觀察到的交互作 

用是在細胞內發生,比其他 in vitro 的方法更接近生理條件。(2)不需要進行蛋白質純化,只 

需將測試的基因對,選殖至載體即可。(3)可以大量篩選已知及未知的基因產物,甚至基因 

片段所產生的蛋白質是否會發生交互作用。而其缺點為:(1)只能研究一對一的蛋白質交互 

作用。(2)利用融合蛋白技術可能造成蛋白質失活。(3)所觀察到的蛋白質交互作用可能不 

具生理意義(false positive)。(4)無法調整蛋白質交互作用的條件,蛋白質間的結合力如果 

太弱,可能會無法觀察到因而得到錯誤的結果(false negative) (17) 

三、利用蛋白質晶片分析蛋白質交互作用 

蛋白質晶片常見的有兩種類型:抗體型微陣列 (antibody array)與非抗體型微陣列 

(non-antibody array)。 

目前只有少數抗體型微陣列應用的例子。Haab 等人 (18) ,利用 152 種抗體所製成的微陣列, 

將其抗體固定於玻璃表面,觀察不同樣品中,抗原相對量的變化。實驗結果發現抗體與抗原 

產生結合反應時,只有 30%的抗體作用所產生的訊號與抗原的濃度有線性的關係,表示抗體

180 


型微陣列的應用不如預期中理想。 

第二種類型的蛋白質晶片是屬於非抗體型(non-antibody)蛋白質微陣列,已有研究利用 

此類型的蛋白質晶片研究生化路徑的探討。Zhu H.等人利用蛋白質微陣列研究酵母菌中蛋白 

激酶(protein kinase)與其受質的關係 (19) 其將 119 種個別表現的蛋白激酶固定晶片上,並測 

試這些蛋白激酶與十七種不同的受質的結合反應;實驗發現一些新的結合反應發生,結果證 

明利用蛋白質晶片,對於尋找新的蛋白質交互作用是一可行的方法。 

以蛋白質晶片進行實驗具有以下幾個優點:(1)測試時只需少量的樣品,對於研究一些 

得來不易的樣品的分析更顯重要。(2)可以快速的調整反應的條件,減少測試的時間。(3) 

在同一晶片上,可以同時觀察多種蛋白質的結合反應,得到更全面的結果。 

雖然以蛋白質晶片進行實驗有上述的優點,但是應用上還是有其限制,其原因如下:(1) 

將蛋白質固定於玻璃表面時,所進行的化學反應步驟,常造成蛋白質變性而失去原有的活 

性,為了達到最佳的固定條件,必須針對不同的蛋白質測試不同的固定方法,這使得實驗的 

困難度增加。(2)蛋白質間的交互作用有位向的問題,如果固定於表面上的蛋白質其位向不 

對,可能無法得到正確的結果。(3)製備蛋白質晶片需進行蛋白質的純化;進行蛋白質晶片 

實驗的第一步驟是純化欲測試的蛋白質,製備多種純的蛋白質樣品是一個大工程。(4)蛋白 

質晶片進行結合反應是在細胞外進行,細胞內是否會有相同的反應發生,必須更進一步確認。 

結語 

本章節介紹蛋白質體學在蛋白質交互作用的應用,文中介紹幾種實驗方法,並比較其優 

缺點;以蛋白質體學進行蛋白質交互作用的研究,比一般傳統的生化方法快而且廣泛,若結 

合其他分析方法 (如生物資訊學、基因研究等),可以讓我們對細胞內蛋白質間的交互作用有 

更進一步的瞭解。 

參考文獻 

1. Zhu, H., and Snyder, M.(2001)Protein arrays and microarrays. Curr Opin Chem Biol 5, 40-45. 

2. Zhu, H., Bilgin, M., Bangham, R., Hall, D., Casamayor, A., Bertone, P., Lan, N., Jansen, R., Bidlingmaier, 

S., and Houfek, T.(2002)Global analysis of protein activities using proteome chips. Science 293, 

2101-2105. 

3. MacBeath, G., and Schreiber, S. L.(2000)Printing proteins as microarrays for high-throughput function 

determination. Science 289, 1760-1763. 

4. Hutchens, T. W., and Yip, T. T.(1993)New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of 

macromolecules. Rapid.Commun. Mass Spectrom. 7, 576–580. 

5. Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Conrads, T. P., and Felschow, D.(2002)The SELDI-TOF MS approach to 

proteomics: protein profiling and biomarker identification. Biochem. Biophys, Res. Commun. 292, 

587–592.

181 


6. Paweletz, C. P., Liotta, L. A., and Petricoin, E. F.(2001)New technologies for biomarker analysis of 

prostate cancer progression:Laser capture microdissection and tissue proteomics. Urology 57, 160–163. 

7. Paweletz, C. P., Gillispie, J. W., and Ornstein, D. K.,(2000)Rapid protein display profiling of cancer 

progression directly from human tissue using a protein biochip. Drug Dev. Res. 49, 34–42. 

8. Srinivas, P. R., Srivastava, S., Hanash, S., and Wright, G. L.(2001)Proteomics in early detection of cancer. 

Clin. Chem. 47, 1901–1911. 

9. Paweletz, C. P., Liotta, L. A., and Petricoin, E. F.(2001)New technologies for biomarker analysis of 

prostate cancer progression: Laser capture microdissection and tissue proteomics. Urology 57, 160–163. 

10. Eggeling, V. F., Junker, K., Fiedler, W., Wollschied, V., Durst, M., Claussen, U., and Ernst, G.(2001) 

Mass spectrometry meets chip technology: A new proteomic tool in cancer research. Electrophoresis 22, 

2898–2902. 

11. Gavin, A. C., Bosche, M., Krause, R., Grandi, P., Marzioch, M., Bauer, A., Schultz, J., Rick, J. M., 

Michon, A.M., and Cruciat, C. M.(2002)Functional organization of the yeast proteome by systematic 

analysis of protein complexes. Nature 415, 141-147. 

12. Ho, Y., Gruhler, A., Heilbut, A., Bader, G. D., Moore, L., Adams, S. L., Millar, A., Taylor, P., Bennett, 

K., and Boutilier, K.(2002)Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae 

by mass spectrometry. Nature 415, 180-183. 

13. Uetz, P., Giot, L., Cagney, G., Mansfield, T. A., Judson, R. S., Knight, J. R., Lockshon, D., Narayan, V., 

Srinivasan, M., and Pochart, P.(2000)A comprehensive analysis of protein-protein interactions in 

Saccharomyces cerevisiae. Nature 403, 623-627. 

14. Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., Hattori, M., and Sakaki, Y.(2001)A comprehensive 

two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc Natl Acad Sci USA 98, 4569-4574. 

15. Walhout, A. J., Sordella, R., Lu, X., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A., Thierry, M. N., and 

Vidal, M.(2000)Protein interaction mapping in C. elegans using proteins involved in vulval 

development. Science 287, 116-122. 

16. Boulton, S. J., Gartner, A., Reboul, J., Vaglio, P., Dyson, N., Hill, D. E., and Vidal, M.(2002)Combined 

functional genomic maps of the C. elegans DNA damage response. Science 295, 127-131. 

17. Toby, G. G., and Golemis, E. A.(2001)Using the yeast interaction trap and other two-hybrid-based 

approaches to study protein-protein interactions. Methods 24, 201–17. 

18. Haab, B. B., Dunham, M. J., and Brown, P. O.(2001)Protein microarrays for highly parallel detection 

and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol 2, 

RESEARCH0004. 

19. Zhu, H., Klemic, J. F., Chang, S., Bertone, P., Casamayor, A., Klemic, K. G., Smith, D., Gerstein, M., 

Reed, M. A., and Snyder, M. (2000)Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat, Genet, 

26, 283-289.

前言 

182 

第十五章、次細胞層級之蛋白質體學研究 

第十五章 

次細胞層級之蛋白質體學研究 

Subcellular Proteomics 


黃如婷,廖大修 

蛋白質體學(Proteomics)的研究目標主要是在闡明基因體所蘊藏而在蛋白質層次上表 

現的生物複雜度。欲達成蛋白質體學之研究需要各種較先進靈敏的分離方法、質譜儀(mass 

spectrometry)分析並結合生物資訊學(bioinformatics)的應用方能達到在複雜的生物體中鑑 

定(identify)蛋白質的目的。二維膠體電泳(two-dimensional gel electrophoresis)的發展成為 

一個有效分離蛋白質的有力工具,藉此可以地於分子層級之上全面性地檢視生物的多樣性 

(complexity)。胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting) (1-6) 及自動化蛋白質資料庫搜尋 

(automated protein database searching) (7) 用於高生產率(high-throughput)鑑定。目前鑑定對 

象普遍為由二維電泳膠體上所得之蛋白質。近十年來,隨著分析技術的日益進步,許多利用 

不同組織(tissues)、體液(body fluids)或是細胞株(cell lines)做為樣品的二維膠體電泳參 

考圖像(reference map)之資料庫網址業已建立(可參考網址 http://www.expasy.ch/ch2d/2dindex.html) 

(8) 。 

蛋白質體被定義為一個個體之基因體所表達的蛋白質整體或是在多細胞生物中,一個組 

織或一個已分化細胞所表現的蛋白質整體分析資料總和 (9) 。然而,高等真核生物細胞的構造 

相當複雜,欲以單一步驟來達成完整蛋白質體的鑑定實為困難。蛋白質分析複雜並不單單只 

是單一細胞所表達蛋白質的數目眾多,尚包括具有極端等電點(isoelectric points)、疏水性 

(hydrophobicity)、分子量(molecular weight)以及含量少之蛋白質所附帶的分析難度。二維 

電泳的解析力必須至少再提昇二十倍才有可能克服這些困難之處。故現今在分析細胞之蛋白 

質體上已有一趨勢是從次細胞層次蛋白質體(subcellular proteomes)著手,可以減低分析的 

複雜度 (10) 。次細胞層級蛋白質體包括了特定的次細胞區間(subcellular compartmants)以及細 

胞內的巨分子結構(macromolecular structures),如核糖體(ribosomes)、核孔複合體(nuclear 

pore complex)等。此章所提到的胞器(organelle)定義為「存在真核細胞細胞質中,由膜區 

隔出的任何構造」 (11) 。 

內容 

壹、各胞器之蛋白質體 

真核細胞的構造可以分隔成不同的細胞區間,例如胞器。此處將提到的各種胞器包含動 

物細胞的粒線體(mitochondria)、溶酶體(lysosomes)、過氧化氫酶體(peroxisomes)、內質

183 


網(endoplasmic reticulum;ER)、高基氏體(Golgi apparatus)以及液泡(vesicles),當然也 

包括細胞核(nucleus)(如圖一)。 

圖一、真核細胞構造之圖示 (12) 

一般在分離各胞器時多利用離心方式,以不同轉速沈降不同胞器,本章將不著重於討論 

這些分離方法,而將焦點放在各胞器特殊之蛋白質體的介紹,並以核膜(nuclear envelope) 

之蛋白質體 (12) 做較為深入的探討。 

貳、核、核基質(nuclear matrix)與核膜 

細胞核由核膜所包圍,而細胞核之重要性在於其為存放遺傳訊息的場所,且基因表達亦 

在此發生。以纖維母細胞為例,其細胞核約佔細胞體積的百分之五。西元兩千年時,在 

SWISS-PROT 資料庫中便描述了近一千個人類核內蛋白質,這顯示出科學家們對此胞器的高 

度興趣。英國的 MRC Human Genetics Unit 也自西元兩千年起開放了其所建立之蛋白質資料 

庫。(http://www.hgu.mrc.ac.uk/Users/Wendy.Bickmore/npdintro.html) 

在細胞計畫性死亡(programmed cell death;apoptosis)的相關研究中,科學家利用 Burkitt 

淋巴瘤(lymphoma)細胞株(BL60)的核內蛋白質建立一個二維電泳參考圖像 (13) ,接著再 

以 Nanospray ESI-MS/MS 質譜儀技術碎裂已經胰蛋白質水解酶(trypsin)處理後的胜肽片段 

來獲得序列訊息,進一步再與蛋白質資料庫進行掃瞄(screen)比對,結果獲得了 33 個主要 

位於核基質的特定蛋白質 (14) ,此外亦鑑定出參與糖裂解途徑(glycolytic pathway)的蛋白質。

184 


被認為與細胞計畫性死亡有關並可能在 DNA 修復(repair)中扮演重要角色的 60S 酸性核糖 

體蛋白 PO,同樣也在被鑑定的行列中。以人類肝細胞核為材料的 SWISS-2DPAGE 二維電泳 

參考圖像 (15) 可連結至 ExPASy 之伺服器(http://www.expasy.ch/ch2d)取得。 

核基質是位在核內的巨分子結構,可維持核的形狀。截至目前為止已有數個蛋白質體研 

究發現利用不同組織或細胞純化所得的核基質,其蛋白質體似乎具有共同性。存於人類白血 

球(leukocyte)、培養之羊膜細胞(cultured amniotic cells)以及肝臟組織細胞核基質中的蛋白 

質為肌動蛋白(actin)、異質性核內核糖蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleo- proteins)、核 

內 lamins、numatrin 以及 vimentin (16) 。在這些研究中業已證明核基質中有與蛋白質折疊有關 

的分子護送蛋白(molecular chaperone)存在 (17) 。 

核膜由雙層膜所構成,與內質網接連,包圍出核的範圍(如圖二) (12) 。核膜上有核孔複 

合體(nuclear pore complex)貫穿。核孔複和體乃是調節細胞核與細胞質間雙向交通的管道 (18, 

19) (20) 

。在核孔蛋白質體學的分析中,共有 40 個蛋白質被發現與核孔複合體有關 ,每一個被找 

到的蛋白質都經過免疫電子顯微(immunoelectron microscopy)技術來確認其所在位置並加以 

定量。此分析結果不但辨識出 29 個核孔蛋白質和 11 個傳輸因子(transport factor),並且提供 

了一個核孔複合體構造的三維模型建立基礎。 

圖二、核膜構造之圖示。ONM(outer nuclear membrane)即為核外膜,其與核內膜(INM;inner 

nuclear membrane)形成一雙層膜系統,區隔細胞核與細胞質,貫穿核膜之核孔複合體為細胞核、質 

間之溝通橋樑。 (12)

185 


核膜的外層膜(outer membrane)成分與周邊內質網(peripheral ER)相似,但核膜內層 

膜(inner membrane)則包含許多整合性膜蛋白(integral membrane proteins),這些整合性膜 

蛋白質大多會和核薄板(nuclear lamina)含量最豐富的 lamin 或是染色質(chromatin)結合 (21) 。 

近四分之一世紀在生化學、細胞學及遺傳學上已經鑑定出不少內膜蛋白質,包括 lamin-B 

receptor (22) 、nurim (23) 、emerin (24) 與 lamina-associated polypeptides(LAPs)1 和 2 (25) 。這幾個蛋 

白質及一些新發現的蛋白質都可以在以核膜蛋白質為樣品的蛋白質體研究中找到 (26) 。 

科學家們嘗試以許多不同方法來分離核內容物與細胞核膜,但無可避免地所獲得的細胞 

核膜部分總是會摻雜其他細胞質成分。此外,核孔複合體、核薄板、核內膜與染色質間結合 

相當緊密,故極難將這些核構造完全分離。一般的蛋白質體學方法雖可以有效鑑定出存於核 

膜部分的蛋白質,卻不能區別該蛋白質究竟來自核膜或是細胞其他區域。Dreger 等人 (26) 利用 

培養之神經母細胞瘤(neuroblastoma)細胞的不同核膜次分餾部分(subfractions)進行相對 

式蛋白質體(comparative proteomics)研究以鑑定位於核內膜上的整合性蛋白質。先前研究發 

現核薄板不溶於非離子性界面活性劑(nonionic detergent)與鹽類中,但許多內膜整合性蛋白 

質在以非離子性界面活性劑與鹽類萃取後仍與核薄板結合,故 Dreger 等人先萃取出三種不同 

之核膜次分餾部分,再以二維電泳分離,並從膠上切下蛋白質點再以蛋白質水解酶處理,最 

後再利用飛行質譜儀(matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight;MALDI-TOF) 

進行質譜分析(如表一)。 

首先以界面活性劑 Triton X-100 將核外膜及內質網上的可溶蛋白質溶出,不溶的沈澱物 

(即為表一中之抗界面活性劑(Detergent-resistant)部分)便富含核薄板上與核薄板結合的內 

膜蛋白質,接著以鹽類進行第二次萃取,此次之不溶沈澱物(抗鹽類(Salt-resistant)部分) 

雖然亦為核薄板物質,但已移除掉更多的雜質。第三次萃取是利用含尿素(urea)與碳酸鹽 

的溶液,所產生的不溶沈澱物(Chaotrope-resistant)主要就是核內膜整合性蛋白質、核外膜 

及內質網。根據此邏輯,前兩次萃取的不溶沈澱物自然亦可作為找尋新核內膜蛋白質標的之 

材料。 

Dreger 等人的分析結果除鑑定出先前研究者找到的內膜整合性蛋白質外,還發現了四個 

未有報導的整合性蛋白質。其中兩個新蛋白質是之前研究中僅偵測到 mRNA 存在 (27) 的 LAP2 

接合變異型(splice variants)。另一些帶有與先前預測之表現序列(exon)接合交會處(splice 

junction)具部分重疊的獨特肽鏈,確定了先前研究中提到的α、β及γ型,但其餘的δ與ε型則 

未被找到。LAP 2α是缺乏穿膜區域的接合變異型,其不存於以含尿素之碳酸鹽溶液萃取之不 

溶沈澱物中,此證據正好支持了相對式方法的邏輯。第三個新核內膜整合性蛋白質為 Unc84A 

的相似蛋白質(homolog)。Unc84A 為線蟲 Caenorhabditis elegans 之一核膜蛋白質 (28) ,與核的 

移動性有關,且此蛋白質的胺基酸序列從酵母菌至人類都具有保守性。第四個新蛋白質命名 

為 LUMA,完全不具任何已知的特定三級結構,序列也是第一次發表,故尚未有任何功能上 

的預測。

(12, 26) 

表一、Dreger 等人進行核膜分餾所發現到的整合性核膜蛋白質 

186 


Detergent-resistant Salt-resistant Chaotrope-resistant Newly identified 

Emerin + + 

LAP1 

LAP2α + + 

LAP2β + + + 

LAP2β' 

LAP2δ + + + + 

LAP2ε + + + + 

LAP2γ + + + 

LAP2ζ 

LBR + 

LUMA + + + 

MAN-1 + + + 

Nurim + + + 

Unc84 homolog + + + + 

參、粒線體 

一個纖維母細胞約具有一千個粒線體,佔了細胞體積的四分之一,故就數目上而言,粒 

線體是纖維母細胞中最豐富的胞器。粒線體以粒線體外膜(mitochondrial outer membrane)和 

細胞質區隔,以粒線體內膜區隔出兩個粒線體內的特定空間,一為兩層膜間的空腔 

(intermembrane space),另一為粒線體基質(mitochondrial matrix)。粒線體的最重要的細胞 

代謝功能在於提供一個細胞產生能量的位置,以演化角度而言,目前推論由真細菌類 

(eubacteria)被真核細胞的前身攝入,然後進行共同演化,成為現在的真核細胞。其中,真 

細菌便演化成現今所稱之粒線體。時至今日,許多粒線體基因體所蘊含的基因序列已不復見, 

粒線體基因體中只留下絕大部分必須由核提供其基因產物作為輔助方能正確作用的序列。因 

此,大部分的粒線體蛋白質是在細胞質中的核糖體中合成,隨後再轉位(translocate)運輸至 

粒線體中。SWISS-PROT 蛋白質資料庫中已存有數百個人類粒線體蛋白質的資料,另外,專 

門收集粒線體蛋白質資訊的資料庫 MITOP(mitochondrial proteome database) (29) 也已建立。 

此資料庫的目標在廣泛地瞭解及描述各種與粒線體疾病有關的粒線體蛋白質。現已收集超過 

兩百個粒線體蛋白質資料。 

粒線體可由細胞均質物(homogenates)經傳統的次細胞分餾法-蔗糖密度梯度離心方式

187 


(sucrose density gradient centrifugation) (30) 純化而得。Rabilloud 等人 (31) 以人類胎盤(placenta) 

為材料所建立起的粒線體蛋白質之二維電泳參考圖像可由下列網址取得 

(http://www.dsv.cea.fr/thema/MitoPick/Mito2D.html)。此二維參考圖像中的 53 個蛋白質已經 

由胜肽質譜指紋、N 端胺基酸定序或免疫墨點法鑑定出,但此研究並未發現任何新粒線體蛋 

白質,因所有鑑定出的蛋白質均已有相關研究並列入 SWISS-PORT 蛋白質資料庫中。 

肆、溶酶體與過氧化氫酶體 

溶酶體是細胞含量甚豐的胞器,一個纖維母細胞約有 400 個溶酶體。溶酶體的主要生理 

功能是提供蛋白質、寡糖類(oligosaccharides)、糖脂質(glycolipids)及其他大分子分解的場 

所。SWISS-PROT 蛋白質資料庫已有超過五十個溶酶體蛋白質的資料。Chataway 等人 (32) 以人 

類胎盤溶酶體為材料,所建立之二維電泳參考圖像可由網際網路連結獲得。 

(http://www.health.adelaide.edu.au/2Ddatabase/frony2.htm) 

在 Chataway 等人的研究中,利用 N 端定序的方法,作者們鑑定出十四個薄板(luminal)蛋 

白質及五個膜蛋白質,此外並無發現任何新蛋白質被發現,但定出三個原 N 端序列未知蛋白 

質之 N 端序列。在十九個鑑定結果中,僅有六個是先前研究指出確實位在溶酶體中,但其餘 

的十三個蛋白質的細胞位置則尚待確認。 

過氧化氫酶體在一個纖維母細胞中數目約為三百個,其主要是細胞內氧化反應(oxidation 

reaction)發生之場所。SWISS-PROT 蛋白質資料庫收集了超過 35 個過氧化氫酶體蛋白質的 

資料。 

伍、內質網、高基氏體與內吞性液泡(endocytic vesicles) 

蛋白質合成之後的分類整理(sorting)與轉譯後修飾作用是由內質網及高基氏體這兩個 

胞器所主導。SWISS-PROT 資料庫中共描述了超過一百五十個內質網或高基氏體蛋白質。 

Taylor 等人 (33) 以蛋白質體學的方法來鑑定肝細胞(hepatocyte)的高基氏體蛋白質,初步以膠 

體比對的方式獲得一百七十三個蛋白質,其中三個蛋白質點經免疫墨點法進一步鑑定。另一 

與 trans-Golgi network 相關的蛋白質體研究 (34) 則鑑定出由 trans-Golgi network 衍生而得的攜帶 

液泡(carrier vesicles)中的 23 個蛋白質。 

Fialka 等人 (35) 自 Mandin-Darby 犬的腎臟(MDCK)細胞純化出內吞性液泡並對頂點 

(apical)液泡與側向(basolateral)液泡進行蛋白質體學分析。此研究顯示頂點液泡與側向 

液泡所含之蛋白質內容物有所不同,在頂點液泡中發現六個新蛋白質,而在側向液泡中則找 

到另外三個新蛋白質。頂點液泡中的六個新蛋白質中有一個在經過定序後發現是 syntenin,先 

前已有相關研究發現,利用帶有 myc 標幟的 syntenin 為實驗材料,在經過大量表現後,syntenin 

會特定存在於頂端液泡中。

陸、核糖體 

188 


核糖體的主要功能在提供訊息 RNA(mRNA)轉譯成多肽鏈的場所。酵母菌(yeast)的 

80S 核糖體其約含 78 個不同的蛋白質。Link 等人 (36) 在分析酵母菌 80S 核糖體之蛋白質體學 

時,除了用傳統的二維電泳外,還另外使用了蛋白質複合體直接分析(direct analysis of protein 

complexes;DALPC)的方法。其實驗策略為將整個核糖體複合體直接以蛋白質水解酶水解, 

所得的複合體肽鏈混合物再利用陽離子交換層析(cation exchange chromatography)以及反相 

層析(reversed-phase chromatography)分離,之後再注入質譜儀中以 MS/MS 方式進一步斷裂 

肽鏈。肽鏈的碎裂形式便可用於尋找核酸轉譯產物資料庫(translated nucleotide databases)中 

的胺基酸序列。使用 DALPC 策略讓 Link 等人鑑定出 80 個不同的基因產物而其中有 75 個是 

屬於酵母菌 80S 核糖體複合體的蛋白質。剩餘的三個核糖體蛋白質未包含在內的原因極可能 

是分子量太小或是在純化核糖體複合體時便已損失。由鑑定所得之 75 個核糖體蛋白質之肽鏈 

資訊可知 18 個蛋白是由不同的單一基因所表現,而其餘蛋白質則是來自雙倍基因(duplicate 

genes) (37) 。以傳統二維電泳進行分離的蛋白質體研究結果顯示,僅有 60 個核糖體蛋白被找 

到。由這兩個不同實驗方法所進行的蛋白質體學研究均發現一個位在 40S 核糖體次單元體 

(subunit)上的新蛋白質,過去研究未能發現此蛋白質的原因可能是由於此蛋白質的等電點 

相對於一般核糖體蛋白質等電點的偏鹼顯得過酸。此蛋白質缺失的突變研究結果顯示此突變 

株的生長速度明顯減緩,強烈暗示了此蛋白質確實參與了酵母菌的蛋白質合成過程。 

結語 

次細胞分餾及胞器的純化是蛋白質體學中分離蛋白質的一項有效工具。先經過次細胞分餾 

或胞器純化可以降低整個細胞的複雜度。回顧本章所提到的各研究內容,很明顯地,一開始 

所使用的材料越不複雜,最後所得的結果就越詳細。但次細胞層級蛋白質體研究亦有其困難 

所在,其一便是無摻雜其他雜質的單一胞器內容物不易取得,不論什麼樣的分餾、純化方法 

都極難達到百分之百的純度,此外,純度的證明可能更加艱難。基於這個理由,後續必須證 

明目標蛋白質確實位於某個特定胞器,如應用到免疫電子顯微技術 (38, 39) 、免疫螢光染色 

(immunofluorescence)等可定位蛋白質所在位置的相關研究;或是一些將蛋白質加上分子標 

幟(tag)大量表現以利偵測蛋白質在細胞中位置的分子技術 (40) ;甚至是在有明顯表現型差異 

前提下所構築的目標蛋白質突變株 (36) ,這也可以為蛋白質的細胞定位提供間接證據。未來在 

電腦軟體設計越益發達的潮流下,生物資訊學應會成為強大的應用工具,如可預測蛋白質胞 

內位置的軟體之研發,可以高效率地分析預測特定蛋白質在細胞中所在位置。這項工具將非 

常有利於篩選及掃瞄由基因體計畫(genome project)演繹(deduced)所得之新蛋白質序列。 

接下來討論一些關於現今蛋白質體學研究結果的缺點,以 Dreger 等人 (26) 對核膜蛋白質體 

所做的研究作說明。Dreger 等人並未鑑定出 LAP1 這個在許多不同細胞株中均被觀察到的核 

內膜蛋白質 (25) ,可能原因在於(1)在分餾純化步驟便已損失;(2)所使用的神經母細胞瘤並

189 


無 LAP1 的表現;(3)其他技術層面的問題,如僅分析了 75%二維電泳膠體上的蛋白質點;(4) 

蛋白質含量過少,相對於在單一細胞中數目以百萬計的 lamin,先前鑑定所得的核內膜整合性 

蛋白質的量顯得很稀少,儘管質譜技術具有高敏感度,但微量蛋白質仍有可能被忽略而無法 

偵測到。 

另外,分餾純化方法的未能完美可能會影響相對式蛋白質體研究的結果,舉例而言,在 

Dreger 等人的分餾策略中有許多已知位於其他胞器內的蛋白質存在於核膜萃取物,像是粒線 

體蛋白質 F1-ATP-synthase α以及細胞骨架蛋白質,肌動蛋白與 tubulin。反之,會和 lamin 結 

合的核內膜整合性蛋白質 Emerin 卻並未在核膜萃取物中發現。這些蛋白質的胞內所在位置當 

然可以利用後續的實驗來確認,但不可否認的是在難以達到完美分餾的情況下的確會干擾次 

細胞層級蛋白質體學的研究結果。 

在蛋白質分析技術發展至能完整分析整個細胞的蛋白質體之前,唯有結合蛋白質體學及細 

胞生物學,才能令我們更加深入且清楚地一探細胞中各項蛋白質功能運作的奧秘 (41) 。 

參考文獻 

1. Henzel, W. J., Billeci, T. M., Stults, J. T., Wong, S. C., Grimley, C., and Watananbe, C.(1993)Identifying 

proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein 

sequence databases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5011-5015. 

2. James, P., Quadroni, M., Carafoli, E., and Gonnet, G.(1993)Protein identification by mass profile 

fingerprinting. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 58-64. 

3. Mann, M., Hojrup, P., and Roepstorff, P.(1993) Use of mass spectrometric molecular weight information 

to identify proteins in sequence databases. Biol. Mass Spectrom. 22, 338-345. 

4. Pappin, D. J. C., Hojrup, P., and Bleasby, A. J.(1993)Rapid identification of proteins by peptide mass 

fingerprinting. Curr. Biol. 3, 327-332. 

5. Yates III, J. R., Speicher, S., Griffin, P. R., and Hunkapiller, T.(1993)Peptide mass maps: a highly 

informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214, 397-408. 

6. Shevchenko, A., Jensen, O. N., Podtelejnikov, A. V., Sagliocco, F., Wilm, M., Vorm, O., Mortensen, P., 

Shevchenko, A., Boucherie, H., and Mann, M.(1996)Linking genome and proteome by mass 

spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA 93, 14440-14445. 

7. Gras, R., Müller, M., Gasteiger, E., Gay, S., Binz, P. A., Bienvenut, W., Hoogland, C., Sanchez, J.-C., 

Bairoch, A., Hochstrasser, D. F., and Appel, R. D.(1999)Improving protein identification from peptide 

mass fingerprinting through a parameterized multi-level scoring algorithm and an optimized peak 

detection. Electrophoresis 20, 3535-3550. 

8. Hoogland, C., Sanchez, J.-C., Tonella, L., Binz, P. A., Bairoch, A., Hochstrasser, D. F., and Appel, R. D.

190 


(2000)The 1999 SWISS-2DPAGE database update. Nucleic Acids Res. 28, 286-288. 

9. Wilkins, M. R., Sanchez, J. C., Appel, R. D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D. F., and Williams, K. L. 

(1996)Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified 

and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13, 19-50. 

10. Rabilloud, T., Kieffer, S., Pracaccio, V., Louwagie, M., Courchesne, P. L., Patterson, S. D., Martinez, P., 

Garin, J., and Lunardi, J.(1998)Two-dimensional electrophoresis of human placental mitochondria and 

protein identification by mass spectrometry: toward a human mitochondrial proteome. Electrophoresis 

19, 1006-1014. 

11. Lodish, H., Baltimore, D., Berk, A., Zipurski, S. L., Matsudaira, P., and Darnell, J(1995)Molecular Cell 

Biology. pp. G13, Scientific American Books, New York. 

12. Schirmer, E. C., and Gerace, L (2002)Organellar proteomics: the prizes and pitfalls of opening the 

nuclear envelope. Genome Biol. 3, reviews1008.1-1008.4. 

13. Müller, E. C., Schumann, M., Rickers, A., Bommert, K., Wittmann-Liebold, B., and Otto, A.(1999) 

Study of Burkitt lymphoma cell line proteins by high resolution two-dimensional gel electrophoresis and 

nanoelectrospray mass spectrometry. Electrophoresis 20, 320-330. 

14. Gerner, C., and Sauermann, G.(1999)Nuclear matrix proteins specific for subtypes of human 

hematopoietic cells. J. Cell. Biochem. 72, 470-482. 

15. Jung, E., Hoogland, C., Chiappe, D., Sanchez, J. C., and Hochstrasser, D. F. (2000)The establishment of 

a human liver nuclei two-dimensional electrophoresis reference map. Electrophoresis 21, 3483-3487. 

16. Gerner, C., Holzmann, K., Grimm, R., and Sauermann, G.(1998)Similarity between nuclear matrix 

proteins of various cells revealed by an improved isolation method. J. Cell. Biochem. 71, 363-374. 

17. Gerner, C., Holzmann, K., Meissner, M., Gotzmann, J., Grimm, R., and Sauermann, G.(1999) 

Reassembling proteins and chaperones in human nuclear matrix protein fractions. J. Cell. Biochem. 74, 

145-151. 

18. Gorlich, D., and Kutay, U.(1999)Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu. Rev. Cell 

Dev. Biol. 15, 607-660. 

19. Adam, S. A(2001)The nuclear pore complex. Genome Biol. 2, reviews0007.1-0007.6. 

20. Rout, M. P., Aitchison, J. D., Suprapto, A., Hjertaas, K., Zhao, Y., and Chait, B. T.(2000)Analysis of the 

Saccharomyces spindle pole by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. 

J. Cell. Biol. 141, 967-977. 

21. Wilson, K. L.(2000)The nuclear envelope, muscular dystrophy and gene expression. Trends Cell Biol. 

10, 125-129. 

22. Worman, H. J., Yuan, J., Blobel, G., and Georgatos, S. D.(1988)A lamin B receptor in the nuclear 

envelope. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8531-8534.

191 


23. Rolls, M. M., Stein, P. A., Taylor, S. S., Ha, E., McKeon, F., and Rapoport, T. A.(1999)A visual screen 

of a GFP-fusion library identifies a new type of nuclear envelope membrane protein. J. Cell Biol .146, 

29-44. 

24. Manilal, S., Nguyen, T. M., Sewry, C. A., and Morris, G. E.(1996)The Emery-Dreifuss muscular 

dystrophy protein, emerin, is a nuclear membrane protein. Hum. Mol. Genet. 5, 801-808. 

25. Senior, A., and Gerace, L. (1988)Integral membrane proteins specific to the inner nuclear membrane 

and associated with the nuclear lamina. J. Cell Biol. 107, 2029-2036. 

26. Dreger, M., Bengtsson, L., Schoneberg, T., Otto, H., and Hucho, F. (2001)Nuclear envelope proteomics: 

novel integral membrane proteins of the inner nuclear membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 

11943-11948. 

27. Berger, R., Theodor, L., Shoham, J., Gokkel, E., Brok-Simoni, F., Avraham, K. B., Copeland, N. G., 

Jenkins, N. A., Rechavi, G., and Simon, A. J.(1996)The characterization and localization of the mouse 

thymopoietin/lamina-associated polypeptide 2 gene and its alternatively spliced products. Genome Res. 

6, 361-370. 

28. Malone, C. J., Fixsen, W. D., Horvitz, H. R., and Han, M.(1999)UNC-84 localizes to the nuclear 

envelope and is required for nuclear migration and anchoring during C. elegans development. 

Development 126, 3171-3181. 

29. Scharfe, C., Zaccaria, P., Hoernagel, K., Jaksch, M., Klopstock, T., Dembowski, M., Lill, R., Prokisch, H., 

Gerbitz, K. D., Neupert, W., Mewes, H. W., and Meitinger, T.(2000)MITOP, the mitochondrial pro- 

teome database: 2000 update. Nucleic Acid Res. 28, 155-158. 

30. Fleischer, S. and Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. 1974. Methods Enzymol. 31, 6-41. 

31. Wilkins, M. R., Sanchez, J. C., Gooley, A. A., Appel, R. D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D. F., and 

Williams, K. L.(1996)Progress with proteome projects: Why all proteins expressed by a genome sho- 

uld be identified and how to do it. Biotechnol Genet. Eng. Rev. 13, 19-50. 

32. Chataway, T. K., Whittle, A. M., Lewis, M. D., Bindloss, C. A., Davey, R. C., Moritz, R. L., Simpson, R. 

J., Hopwood, J. J., and Meikie, P.(1998)Two-dimensional mapping and microsequencing of lysosomal 

proteins from human placenta. Placenta 19, 643-654. 

33. Taylor, R. S., Fialka, I., Jones, S. M., Huber, L. A., and Howell, K. E.(1997)Two-dimensional maping of 

the endogenous proteins of the rat hepatocyte Golgi complex cleared of proteins in transit. 


34. Fiedler, K., Kellner, R., and Simons, K.(1997)Mapping the protein composition of trans-Golgi network 

(TGN)-derived carrier vesicles from polarized MDCK cells. Electrophoresis 18, 2613-2619. 

35. Fialka, I. Steinlein, P., Ahorn, H., Bock, G., Burbelo, P. D., Haberfellner, M., Lottspeich, F., Paiha, K., 

Pasquali, C., and Huber, L. A. (1999)Identification of syntenin as a protein of the apical early

192 


endocytic compartment in Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem. 274, 26223-26229. 

36. Link, A. J., Eng, J., Schieitz, D. M., Carmack, E., Mize, G. J., Morris, D. R., Garvik, B. M., and Yates Ill, 

J. R.(1999)Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnol. 17, 

676-682. 

37. Mager, W. H., Planta, R. J., Ballesta, J. G., Lee, J. C., Mizuta, K., Suzuki, K., Warner, J. R., and Woolford, 

J.(1997)A new nomenclature for the cytoplasmic ribosomal proteins of Saccharomyces cerevisiae. 

Nucleic Acid Res. 25, 4872-4875. 

38. Wigge, P. A., Jensen, O. N., Holmes, S., Soues, S., Mann, M., and Kilmartin, J. V. (1998)Analysis of the 

Saccharomyces spindle pole by matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry. 

J. Cell Biol. 141, 967-977. 

39. Rout, M. P., Aitchison, J. D., Suprapto, A., Hjertaas, K., Zhao, Y., and Chait, B. T.(2000)The yeast 

nuclear pore complex: composition, architecture, and transport mechanism. J. Cell. Biol. 148, 635-652. 

40. Neubauer, G., King, A., Rappsilber, J., Calvio, C., Watson, M., Ajuh, P., and Sleeman, G.(1998)Mass 

spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome 

complex. Nature Genet. 20, 46-50. 

41. Jung, E., Heller, M., Sanchez, J. C., and Hochstrasser, D. F.(2000)Proteomics meets cell biology: the 

establishment of subcellular proteomes. Electrophoresis 21, 3369-3377.

前言 

第十六章 

微生物生理之蛋白質體研究 

Proteomic Studies of Microbial Physiology 

國立中央大學生命科學系 

黃雪莉 

193 

第十六章、微生物生理之蛋白質體研究 

蛋白質體學為一種大量且快速決定蛋白質功能資訊的創新分析方法,其研究目標為定性 

與定量分析細胞內蛋白質表現,以及其表現如何因特定環境而改變,蛋白質體學和基因體學 

分析研究相輔相成,兩種具有完全相同基因體的細胞,在不同環境中可能表現出不同之基因 

產物結構與機能,因此,蛋白質體學是基因序列解析後,研究基因產物及其表現相當重要之 

方法。 

基本上,將蛋白質體的特性結合遺傳學、分子生物學、蛋白生化學以及生理學,將能夠 

有效率地探討微生物在不同生活環境的蛋白質變化,進而描繪出其蛋白質生理功能。典型的 

微生物生理之蛋白質體學研究,主要為離析微生物可溶性蛋白質,藉由二維電泳(2-D gel 

electrophoresis/ 2DE)法分離蛋白質混合物,使其蛋白質體在二維膠上獨立呈現,再結合介質 

輔助雷射揮離離子化飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS),就分離的蛋白質進行鑑定。由於 

利用蛋白質體學為一相當適合且有效的研究方法,因此,關於蛋白質體學應用於微生物的研 

究,已在生命科學領域蓬勃發展,不僅擴展了分子生物學和感染學的研究,在診斷以及疾病 

治療上,亦能提供許多依據和訊息。 

有鑑於此,本章將分別就微生物之結構蛋白質體學、致病菌的蛋白質體學、微生物受逆 

境下之蛋白質體學及微生物分解環境污染物之蛋白質體學等不同研究現況加以介紹,並進一 

步說明以二維電泳分離微生物蛋白質體之條件的探討。 

內容 

壹、微生物之結構蛋白質體學(Microbial structure proteomics) 

目前生物學家將蛋白質體定義為 “細胞內包含的全部蛋白質”,與具有同源性和普遍性的 

基因組相比,蛋白質體則另具有動態性、時間性、空間性和特徵性。此外,以數量而言,蛋 

白質體内的蛋白質數並不等於基因體內編碼蛋白質的基因數目。Anderson等首先比較多基因 

細胞mRNA與其相對表現的蛋白質量,其研究發現兩者的相關系數為0.48 (1) ,此結果說明了 

兩者數量確實具有差異性。不過,科學家們相信在若干年後將能夠清楚地了解細菌的蛋白質 

功能,主要是由於核酸定序技術的發展進程非常迅速,許多細菌的基因組序列已經陸續完成。 

微生物中第一個基因體序列被解碼的 Haemophilus influenzae (2,3) ( ),隨後其他細菌如Helicobacter pylori 、 Neisseria

194 


gonorrhoeae、N. meningitidis、Mycobacterium tuberculosis、M. leprae、Chlamydia trachomatis、 

Treponema pallidum、Mycoplasma genitalium、Borrelia burgdorferi、Staphylococcus aureus、 

Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Escherichia coli等之基因體序列亦逐一被 

解出 (4) 。值得注意地,在基因體序列被解碼的同時,二維電泳分離蛋白質的方法結合質譜儀 

的發展,使得科學家得以進一步分析在不同生理或環境下,細菌個體之蛋白質體的變化,此 

一發展對於致病菌之新藥開發,如新毒力因子(virulence factor)的鑑定和與疫苗開發有關之 

新抗原蛋白質的探尋,開拓了一個後基因體時代的重要技術 (5,6) 。 

目前已有超過80個細菌及古生菌(Archaea)的基因體序列被解出,且還有更多細菌基因 

組序列的解碼工作正在進行。鑑於如此龐大的解碼資訊需要有效地管理,瑞士生物資訊研究 

所的 Boeckmann等人建立了HAMAP資料庫(),此資料 

庫可自動統計目前被解碼之細菌及古生菌的蛋白質體,至今已進行蛋白質體解碼的細菌計有 

78株,包括16株的古生菌()。此外,在 

SWISS-PROT資料庫中,超過40%的微生物及質體 (plasmid)之蛋白質體資料亦來自HAMAP 

資料庫,其中,已輸入於SWISS-PROT資料庫的5個完整微生物蛋白質體分別為 Escherichia 

coli, Buchnera aphidicola subsp. Acyrtosiphn pisum, Haemophilus influenzae, Mycoplasma 

genitalium 以及 Mycoplasma pneumoniae,另Bacillus subtilis 及 Ethanococcus jannaschii 近期 

將會被發表 (7) 。相關微生物蛋白質體學的資料庫彙整如表一所示。 

貳、蛋白質體學應用於致病菌之研究(Proteomics applied to bacterial pathogens) 

過去五十幾年以來,儘管已研發出許多有效的抗細菌藥劑及疫苗,然而,由細菌、病毒、 

黴菌或是寄生病原體所造成的感染性疾病,仍導致全球人類感染及致死 (8,9) 。根據2000年世界 

人類健康報告指出,感染性疾病為全球前十大死亡之因 (8) ,且對於人類健康所造成的威脅亦 

有增加的趨勢。以美國為例,在1980至1992年的二十年內,感染性疾病的致死率增加了58%, 

其中,原以為已被控制的疾病,如肺結核等,又再度復發,而對於抗生素具有抗藥性的菌株, 

亦有增加的趨勢,致使控制此類疾病的困難度與花費皆相對地增加。目前已知對於殺菌藥物 

具有抗藥性的菌株已有 pneumococci、enterococci、Staphylococci、Plasmodium falciparum及 

Mycobacterium tuberculosis (www.cdc.gov/ncidod/dbmd/antibioticresistance ;; ) (10) 。且至少有20個致病菌的基因體序列,已完成解碼工作,;; ) (10) (如表二),其中,在蛋白體學研究方面,超過50個的蛋白質已被鑑定之 

菌株計有 Mycobacterium tuberculosis、H. pylori、Haemophilia influenza、Mycoplasma 

pneumoniae、Pseudomonas aerugenosa 和 E. coli 等。 

蛋白質體學應用於醫學研究與新藥開發,為一相當有用的方法 (11-14) ,基本上,蛋白質體

195 


學的應用,應是在致病菌的生理與致病性、新藥物研發以及闡明新抗生素作用之機制等方面。 

基本上,為了開發許多有效的抗菌化合物,通常會尋找於細菌內作用的新目標物,但目前遭 

遇的困難在於揭示新化合物的作用目標物及其作用機轉,有時在體外發現新化合物,雖能夠 

使某種蛋白質失活,但體內是否亦具有有這種現象及其是否為抗菌的重要機制,則仍然為未 

知,因此,二維電泳分析提供了一個有效的策略。 

除此之外,藉由蛋白質體學的研究,推測目標微生物的代謝途徑,分析一生物體內蛋白 

質體中所有蛋白質,進而試著拼湊出在細胞內的代謝途徑。例如當發現某病原菌的蛋白質體 

中有 hexokinase(此為糖類代謝中所需的一種酵素),以及其它所有的 glycolysis(糖解作用) 

的酵素,即可推斷此病原菌具有糖解作用,甚至有其下游的糖類代謝作用等。故根據此一方 

式,便可瞭解該病原菌的整體代謝途徑,並藉此試圖找出其弱點而加以攻擊。目前基因體與 

蛋白體技術的發展,希望能應用到幫助尋找致病菌新藥之目標基因和蛋白質,以利藥物和疫 

苗之開發。 

在致病菌株之比較上,利用二維膠體電泳分析其蛋白體,可探討不同感染所得菌株及變 

異株之蛋白體之差異,如毒力因子等 (15) 。過去數年中第一個系統性探討為 Mycobacterium 

tuberculosis 和 M. bovis BCG 之蛋白體的比較研究 (16) 。其中,在263個以 MALDI-TOF MS鑑 

定的蛋白質中發現,有8個在 BCG中為特殊俱有,而13個僅在 Mycobacterium tuberculosis 才 

有,這些差異的蛋白質可作為新疫苗和新藥開發之目標。同一研究團隊在2000年亦比較了三 

株 Helicobacter pylori 之蛋白體,在鑑定出的152個蛋白質中,很有趣地發現三株菌的pattern, 

相同處並不多 (17) ,此表示在蛋白質之胺基酸差異足以在二維膠體上表現出不同的移動輪廓 

(profile)。另一株重要的致病菌,Haemophilus influenzae 的二維電泳分析研究中,Langen 等 

人偵測到502個蛋白質,佔基因體序列的25%全部蛋白質,故未來可以此法對細菌蛋白體進行 

廣泛分析 (18) 。Jungblut 等人於2001年比較 M. tuberculosis strains 與M. bovis strains 毒力因子 

蛋白質的表達差異,約1,800個蛋白質被分離出來,其中,有六個基因產物並非為 M. 

tuberculosis 之基因體所預測出的蛋白質 (19) 。 

此外,若要以二維電泳分析細菌蛋白體,藉以開發致病菌之疫苗,則需要分離菌體之細 

胞膜與細胞質,因為細菌表面之蛋白質與引起免疫反應最為相關。目前進行的研究包含以二 

維電泳分析 Meningococcus M158之細胞膜蛋白質。然而,一般而言,在進行二維電泳分析時, 

膜蛋白總是於二維電泳膠上表現不顯著,主要原因為膜蛋白水溶性低且量少,且常在鹼性pI 

範圍內,因此無法在標準的二維膠體中表現。相關致病菌之蛋白質體研究彙整如表二所示。 

參、微生物逆境中之蛋白質體學(Proteomics applied to bacterial stress 

response) 

藉由蛋白質體學的研究,可獲知同一種細菌在不同環境下,生長環境變化使細菌產生生 

長適應機制,主要為調控與活化蛋白質活性。當微生物受到各種壓力反應時,為取得某些稀

196 


有養分以及利用必要之物質,將有毒物質修飾或排除至菌體外、促進特定的代謝途徑,以保 

護及修復細胞中的必要組成,選擇性地生成新的蛋白質或增加蛋白質表現是必須的 (20) 。因此, 

細菌對於逆境下的壓力反應,主要特徵即為誘發或抑制獨特蛋白質,改變蛋白質表現量。故 

蛋白質體於微生物逆境的研究,即使所有表現蛋白質的分離、染色、定量及定性,藉以分析 

其在不同環境下整體蛋白質表現的差異,以及研究細菌中直接執行生命現象之蛋白質的表現。 

當生物處在各種的逆境時,會表現出不同的逆境蛋白(stress protein)。其中最廣為人知 

且被研究最多的逆境反應,主要是在各種細菌中的熱休克反應(heat shock response),特別是 

在大腸桿菌(Escherichia coli)。在大自然中,絕大多數的微生物是處在於逆境中,例如營養 

源的限制、曝露於紫外光或有毒物質。在這種情形下,微生物通常會藉由改變基因的表現, 

甚至合成對逆境具有專一性的蛋白質來適應環境。因此,微生物在遇到各種不同的逆境時所 

產生的逆境反應,與其活性及生存與否具有相當密切的關係。 

目前關於微生物逆境反應的研究,主要探討溫度、酸鹼值及鹽類等環境壓力下,蛋白質 

表現的情形,相關的研究結果彙整如表三所示。其中,生長在高溫環境下的 E. coli,首先以 

二維電泳膠圖分析其熱休克反應 (21,22) 。此外,近期研究顯示,Bacillus subtilis 在高溫(37℃ 

提升至48℃)及有氧環境下(加入0.0002%的雙氧水),所誘發的蛋白質分別為熱休克蛋白 

GroEL、GroES、DnaK、GrpE 及氧休克蛋白 KatA、MrgA、AhpC、AhpF (23) 。至於低溫的 

逆境研究方面,當 E. coli 生長於4℃的低溫環境壓力時,計有69個蛋白質(佔37℃生長時蛋 

白質的60%)會大量表現 (24) 。 

至於在酸性的逆境研究方面,目前已知的腸道菌,Lactobacillus delbrueckii ,於pH 為4.75 

的酸性環境壓力下,會誘發 GroES、GroEL 及 DanK 等蛋白質 (25) ,而 Rechinger 等人更進 

一步發現,參與 phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system (PTS) 之熱穩定蛋 

白質(heat stable protein, Hpr) 的表現量,亦有增加的情形 (26) 。另外, Lactococcus lactis 的 

最適生長溫度為30℃,但在低溫的逆境下(10℃),則會被誘發出 CspE蛋白質 (27) 。而 

Lactobacillus reuteri 為分佈較廣泛的乳酸菌,分別於pH為 2.0的酸性環境、含0.3%膽鹽濃度 

及兩種條件連續培養之模擬的腸道條件下,則各有11、9與6個蛋白質點會被誘發;其中,酸 

休克蛋白、ornithine carbamoyltransferase、ATPase α與β單位只在酸性環境中被誘發,而在含 

膽鹽環境下,則僅會誘發保護蛋白 GroES 與 ClpB、逆境蛋白 AhpC及 ATP-binding cassette 

(ABC) transporter (28) 。 

關於鹽類之逆境研究方面,Bacillus subtilis 在磷酸鹽飢餓(0.16 mM)的情況下,計有 

PhoA、PhoB、GlpQ、YdhF、PstB1、PstB2、TuaD、YjbC、YfhM、YxiE 等近20種蛋白質會 

被誘發 (29) 。Synechocystia sp.分別在低鹽(2 mM NaCl)及高鹽(324 mM NaCl)環境下,計 

有57個蛋白質會被誘發 (30) 。 Pseudomonas aeruginosa 在磷酸鹽飢餓(8 µM)的環境下,誘發 

PstS 蛋白質 (31) ,若於硫飢餓(500 µM inorganic salfate)之逆境下,則會誘發出 PA1、PA2、 

PA4、PA7、PA9、PA11、PA13、PA14、PA16、PA17 等PA19蛋白質 (32,33) 。

197 


近期研究亦顯示,Staphylococcus aureus 之 methicillic-resistant和methicillic - sensitive 等 

二種品系之菌株 (34) ,於非離子界面活性劑的壓力下,則會被誘發出14個新的毒力因子。 

肆、微生物分解環境污染物之蛋白質體學應用(Proteomics applied to bacterial 

degradation of environmental pollutants) 

由於大量的工業廢水及家庭污水排放至自然環境中,大自然儼然成為各種污染源的最終 

儲存槽,因而使微生物曝露於各式各樣的化學物質壓力(chemical stress)下。早期的研究已 

顯示,當環境微生物曝露於某些毒性化學物質下時,會誘發出特定種類的逆境蛋白與去毒性 

酵素,甚至可將這些毒性化學物質予以利用,作為生長碳源或能量源,不過,目前對於這些 

被誘發的蛋白質之功能及性質,尚未完全瞭解。 

目前關於微生物分解環境污染物的蛋白質體研究,仍非常有限,相關研究結果如表四所 

示。Reardon 等人利用二維膠體電泳的方法,分析 P . putida F1以甲苯及酚為生長碳源時的 

蛋白質表現情形,其結果顯示,雖然 P . putida F1利用相似的代謝途徑分解甲苯及酚,然而, 

在不同碳源誘導下,所產生的蛋白質仍會有所差異,其中,被甲苯所誘發的蛋白質計有10個, 

酚所誘發的蛋白質則有17個,若同時以甲苯及酚為碳源時,則另會誘發1個蛋白質 (35) 。此外, 

亦有研究顯示,將 P . putida SH1分別以0.05%的萘、酚或鄰-甲酚為碳源時,其所誘發的蛋白 

質與利用0.03% succinate 為碳源相較,會有明顯的不同,經 MALDI-TOF 質譜儀的胜肽質量 

指紋做比對,結果分別有10個蛋白質是參與異化萘與5個蛋白質是參與異化酚或鄰-甲酚。由 

二維電泳圖譜與蛋白質鑑定結果推測此菌在異化酚或鄰-甲酚可能利用相同的代謝途徑,而分 

解萘則是循另一代謝途徑。另外,P . putida SH1 在異化苯環化合物時都會誘發烷基過氧化還 

原蛋白(AhpC),這是第一次有關細菌在異化此類碳氫化合物的環境下,有此逆境蛋白質的 

表現 (36) 。 

伍、二維電泳分離微生物蛋白質體之最適化(Optimization of 2-D gel 

electrophoresis of bacterial proteome) 

二維電泳可以藉由蛋白質的等電點與分子量差異將蛋白質分離;二維電泳具有高的解析 

度,一片電泳片可同時觀察數百個點是其優點,所以二維電泳常被應用於分析細胞內蛋白質 

層面的變化,但是有許多問題要克服,如低量的、疏水性的及鹼性的蛋白質,在膠體上無法 

分析出,這些問題是需要克服的,進而使得電泳膠片的再現性及操作便利性改善,所以二維 

電泳目前常被應用於分析細胞內蛋白質變化的工具。近年來,評估30%的蛋白質為膜蛋白 

(37) (38) 

,約1%為鑲嵌蛋白質,這些都很難在二維電泳膠有很好的解析 ,這些蛋白質主要的角色 

為訊號傳遞、細胞附著、代謝與離子的運送以及這些蛋白質常常為主要是藥物反應之攻擊目 

標,所以,要決定膜蛋白在二維電泳解析度的問題,是或不可缺的 (39) 。細菌膜蛋白質之萃取 

常因水溶性低且量少而在二維膠體上無法完全呈現。所以1998年Molloy等人發表了細胞膜蛋

198 


白質的製備方法,採用三種不同溶液對細胞進行連續萃取。在第一步中以8 M urea、4% 

CHAPS、2 mM TBP萃取水溶性最高之蛋白質,其次加上8 M urea、4% CHAPS、100mM DTT 

萃取次水溶性之蛋白質,所得沉澱菌體再以5 M urea、2 M thiourea、2% CHAPS、2mM TBP 

進行萃取之,屬於疏水性之蛋白質群 (40) 。 

Davidsson 與 Nilsson 發表了在 Rotofas cell 中以液相等電點聚焦電泳方法純化細胞粗萃取 

液在以 Mini Gel Elutes 進行電泳溶離(electroelution),所純化之蛋白質則進行水解和介質輔 

助雷射揮離離子化飛行時間質譜儀分析 (41) ,此法可製備毫克量的總蛋白樣品。同一研究團隊 

應用此方法鑑定 H. pylori 之疫苗研發之目標蛋白質 (42) 。 

對於低量的蛋白質樣品,另一分離鑑定的方法是利用 LC-MS/MS(liquid chromatography-tandem 

mass spectrometry)進行分析;一般的蛋白質體學的實驗策略 ,係利用以二維 

電泳分離蛋白質樣品,但是以二維電泳進行蛋白質分離有許多的限制因子,為了克服二維電 

泳分離蛋白質的限制,可以改用液相層析管柱作為蛋白質分離的工具。 

為了增加液相層析管柱分離蛋白質樣品的效果,目前已發展出結合兩種不同分離原理的 

二維液相層析管柱(two-dimensional liquid chromatography) (43) 分離蛋白質樣品的方法;二維 

液相層析管柱通常結合離子交換樹脂管柱(ion-exchange column )與逆相層析管柱 

(reverse-phase column)進行蛋白質樣品的分離;而分離的蛋白質樣品經蛋白酶水解後,可 

直接送入串聯質譜儀(tandem mass spectrometer)鑑定蛋白質胺基酸序列,因為分析的過程可 

以自動化,因此比傳統二維電泳分離蛋白質的實驗策略省時且敏感。 

本研究室在分析細菌蛋白體時,針對革蘭氏陰性菌(Pseudomonas sp. SH4)進行二維電 

泳的分析條件探討。Pseudomonas sp. SH4 是一株可利用 octylphenol polyethoxylate (OPEOn) 

為唯一碳源生長之分解菌,其中,當 n = 9.5 時,為大家所熟知的化合物 Triton X-100;此菌 

可生長在 0.05 ~ 20%不同濃度之 Triton X-100 中。我們擬以二維蛋白質電泳分析此菌中生長在 

OPEOn 所誘發之代謝蛋白質,但殘留在菌體上的界面活性劑又會對二維電泳分離造成負面影 

響,故先探討二維電泳分離此類細菌生長在 Triton X-100 之蛋白質體的影響因子 (44) : 

一、蛋白質樣品製備 

(一) DNA、RNA 的去除 

樣品中如果有太多 DNA 和 RNA 將會造成樣品黏稠度太高,而影響蛋白質分離的效果, 

的本實驗接續先前實驗結果,如圖一 A 和參考之前的文獻 (45) 所述,分別在樣品中加入 

最終濃度為 0.1 mg/ml 的 DNase I 和 25μg/ml 的 RNase A 和 50 mM 的 MgCl2 可發現 

蛋白質點分離和背景模糊現象均可獲得具體改善。同時,去除鹽與界面活性劑亦為一影 

響因子,樣品中如有過量的鹽會造成第一維電泳分離時電流增高使得電壓無法提昇而無 

法達到良好的分離效果。於是在菌體尚未打破之前可用大量的緩衝液沖洗菌體,必要時 

透析樣品以清除殘留的鹽分及污染。亦或是在菌體打破之後,對其蛋白質粗萃液透析 (46) 。 

(二) Tributylphosphine(TBP)的添加

199 


由文獻亦發現在樣品製備時,加入一些強力還原劑如 tributylphosphine,有助於蛋白 

質的溶解 (47) 。另外 TBP 不像是β-mercaptoethanol 或是 dithiothreitol(DTT)其化合物上有氫 

硫鍵,它是一個非離子性還原劑,因此其沒有在電場中會移動的現象。我們發現,加入 2 mM 

TBP 於細菌之蛋白質萃取步驟,比沒加入之萃取後蛋白質濃度增加了 30%。推測其可強力還 

原不易被打開的雙硫鍵(disulfite bond),使得界面活性劑能深入其疏水部份使其充分展開, 

蛋白質溶解度也跟著升高。 

二、等電點焦集條件 

(一) 覆水作用(Rehydration) 

覆水作用主要是使蛋白質樣品藉由吸附作用而進入乾的等電點膠條,整個吸附的過程至 

少必須 12 小時以上,在這麼長的時間必須避免蛋白質之間相互作用而沉澱,也必須防止蛋白 

水解酶的作用。在覆水溶液加入最後濃度為 3 mM 的 TBP 可防止已還原的硫氫鍵再度形成雙 

硫鍵,和破壞蛋白水解酶的結構。 

在覆水作用分別加入 3 mM 的 TBP 與 18 mM 的 DTT 作比較,所得的二維電泳圖如圖一 

B,發現加入 TBP 的膠跑出來的蛋白質點比較清晰,而且比加 DTT 的膠多出了 90 個蛋白質 

點。 

覆水作用可分為兩種:主動式覆水作用和被動式覆水作用,其差異在於覆水作用時有和 

沒有施與一微小電壓,在覆水作用實施與一個微小的電壓(50V),有助於大分子蛋白質的進 

入。此外,覆水作用完成時用濾紙把等電點膠條表面多餘的樣品和水分沾除是必須的。因為 

表面多餘的水分會蛋白質會在影響一維電泳的分離。 

(二) 一維電泳電壓 

各種細胞組織所組成的蛋白質特性不一,因此所需要的分離條件也不同,其一維電泳電 

量的設定依組織不同從 30 到 200 kVh 不等,本實驗從 150 kVh 到 120 kVh 到 30 kVh 左右, 

結果發現此菌在 pI 4~7 的最適化電量為 35kVh。 

詳細的電壓設定也是一個關鍵,以此菌在 35kVh 的條件下,Multiphor II 系統進行 IEF 為 

例:通常以 500 V 一分鐘,目的在排除附著於表面的鹽類,續以線性 1~3500V 共一小時,慢 

慢提升電壓使樣品不會一下受到強大電場拉扯而交互作用進而沉澱堆積,最後維持高電壓 

3500V 進行高解析度的分離,一直到 35kVh (約 9.4 小時)。 

三、第二維 SDS-PAGE 條件 

在以往的膠片底部常有一些沉澱現象為 glycine 沉澱,而實驗顯示在進行 SDS-PAGE 時上 

層緩衝液溶液的 pH 值下降的很快,懷疑是緩衝液溶液緩衝能力不足,因此改進成使用二倍 

的 SDS-TG buffer 其獲得的緩衝效果也會較好(如圖一 C)。 

四、SDS-PAGE 染色方法

200 


一般實驗室都用 coomassie blue R-250 來染色,然而 CBB R-250 的靈敏度 100 ng 卻不及 

CBB G-250 10~20 ng。且在使用 CBB R-250 時需接觸到一些有毒的化學溶劑如甲醇或是醋 

酸。因此改用靈敏度較高的 CBB G-250 來染色是較安全的做法,而本實驗室發現此兩種染色 

劑的靈敏度並無明顯差異。 

不同的染色劑所呈現蛋白質的量也不同,在針對此兩種染色劑對於樣品量的最適化實驗 

中發現:CBB R-250 約需 1 mg 的樣品量,而 CBB G-250 約需 0.8 mg 的樣品量才能達到最多 

的點。而最適化的結果發現在 pI 4~7 的範圍內可得約 500~600 個蛋白質點。 

結語 

在嶄新的世界中,我們會看到生命科學的巨大變化,即從以DNA, mRNA測定為主的基因 

體學轉移到蛋白質體學。雖然蛋白質體學的發展目前還受到許多因素的限制,如蛋白質的某 

些不易控制的特性,然而,相信蛋白質體學不但會促進基因體學的進一步發展,而且最終會 

超越基因體學,而蛋白質體學與生物醫學的交集將更有助於揭示生命科學的推展。

201 


表一微生物蛋白質體學及其資料庫 

Microorganism Important findings Reference 

Saccharomyces cerevisiae 279 different gene products from 401 different spots Perrot et al., 1999 

on a 2D gel. 

(48) 

Yeast Protein Map server(YPM): 

htpp://www.ibgc.u-bordeaux2.fr/YPM 

Saccharomyces cerevisiae YPD contains more than 50 000 annotations lines 

derived from the review of 8500 research 

publications. The information concerning each of 

the approximately 6100 yeast proteins is structured 

around a convenient one-page format 

Synechocystis sp. 227 protein spots on two dimensional gels was 

linked with the genes that encoded them. 

Caenorhabditis elegans 

Total number of known and predicted proteins are 

18,545. Proteins characterized by genetics or 

biochemistry are 1,541 (8% of total). proteins 

known by similarity to characterized proteins are 

10,227 (55% of total). Proteins of unknown 

function are 7,118 (38% of total) 

Payne et al., 1997 (49) ; Hodges et al., 1999 (50) 

Yeast Protein Database (YPD): 

http://www.proteome.com/YPDhome.html 

Sazuka et al.,1999 (51) 

Cyano2Dbase: 

http://www.kazusa.or.jp/tech/sazuka/cyano/pr-oteome.html 

Costanzo et al., 2000 (52) ; Costanzo et al., 2001 (53) 

Caenorhabditis elegans proteome database (WormPD): 

http://www. proteome.com/databases/index.html

202 


表一微生物蛋白質體學及其資料庫 (續) 


Mycobacterium tuberculosis 3,924 genes has been sequenced. There are two Jungblut et al., 1999 

virulent strains of M. tuberculosis (H37Rv and 

Erdman). 16 proteins are different between them in 

intensity or position 

(16) ; Mollenkopf et al., 1999 (54) 

Dynamic 2-D PAGE database: 

http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE 

Mycobacterium bovis BCG Two non-virulent vaccine strains of M. bovis BCG 

(Chicago and Copenhagen). 25 proteins differing 

in intensity or position between them 

Escherichia coli 231 polypeptides are identified on the E. coli 

SWISS-2DPAGE map: 64 have been identified by 

N-terminal microsequencing, 39 by amino acid 

composition, and 82 by sequence tag. Of 153 

proteins putatively identified by gel comparison, 

65 have been confirmed 

Jungblut et al., 1999 (16) ; Mollenkopf et al., 1999 (54) 

Dnamic 2-DE database 


Tonella et al., 1998 (55) 

SWISS-2DPAGE database: 

http://www.expasy.ch/ch2d/ch2d-top.html

203 


表一微生物蛋白質體學及其資料庫 (續) 


Methanococcus jannaschii Identification of 170 of the most abundant proteins Giometti et al., 2002 

found in total lysates of M .jannaschii grown 

under optimal fermentation conditions. 

(56) 

M. jannaschii proteome databases: 

http://proteomes.pex.anl.gov/ 

H. pylori 

Pseudomonas putida 

KT2440 

Recognized by H. pylori positive sera: the 

predicted coding region HP0231, serine protease 

HtrA (HP1019) and Cag3 (HP0522). Other 

antigens were recognized differently by sera from 

gastritis and ulcer patients 

The P. putida genome sequence will reveal the 

organism’s potential in various biotechnological 

areas, including the production of natural 

compounds and remediation of polluted habitas. 

Haas et al., 2002 (57) 

H. pylori 2-DE database: 


Nelson et al., 2002 (58) 

TIGR database: 

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html

204 


表二以蛋白質體學研究致病菌之抗生素抗藥性、毒力因子、診斷或新藥物目標 

Pathogens Key findings Reference 

Candida aelbicans 

Overexpression of Cd1p or CaMdr1p of plasma membrane 

fractions isolated from azole-resistant stains 

Niimi et al., 1999 (59) 

Candida aelbicans 

Immunogenic proteins Pitarch et al., 1999 (60) 

Chlamydia trachomatis 

Edwardsiella tarda 

Streptococcus pneumonia 

Streptococcus pyogenes 

Mycobacterium tuberculosis 

Haemophilus influenzae 

Helicobacter pylori 

Immunoreative proteins with patient sera Sanchez-Campillo et al., 1999 (61) 

Virulence factors in bacterial pathogens: flagellin and SsB Tan et al., 2002 (62) 

Erythromycin resistance Cash et al., 1999 (15) 

42 proteins were identified by peptide fingerprinting with MS Chaussee et al., 2001 (63) 

Different proteins in M. bovis BCG. Jungblut et al., 1999 (16) 

Identity 502 proteins by comprehensive 2D gel/proteomic 

approach 

Protein vaccine candidates : adhesives, and other 

membrane-associated proteins. 

Langen et al., 2000 (18) 

Nilsson et al., 2000 (42)

205 


表三微生物壓力反應之蛋白質體學研究 

Microorganism Stress Stress responsive proteins Reference 

Bacillus subtilis Heat GroEL、GroES、DnaK、GrpE Bernhardt et al., 1997 (23) 

Oxidative stress KatA、MrgA、AhpC、AhpF 

Phosphate starvation PhoA、PhoB、GlpQ、YdhF、PstB1、 Haike et al., 2000 

PstB2、TuaD、YjbC、YfhM、YxiE 

(29) 

Antelmann et al., 2000 (64) 

Glucose starvation 150 proteins synthesizes de novo and 

cessation of the synthesis of almost 400 

proteins 

Bernhardt et al., 2003 (65) 

Pseudomonas aeruginosa PA01 Sulfur starvation 

Phosphate starvation 

PA1、PA2、PA4、PA7、PA9、PA11、 

PA13、PA14、PA16、PA17、PA19 

A major protein identified as PstS, a 

phosphate binding protein of the pts 

operon 

Quadroni et al., 1999 (32) ; Kertesz 

et al., 1993 (33) 

Madhusudhan et al., 2003 (31) 

Bradyrhizobium japonicum Aerobic/ anaerobic NifA and FixK2 Dainese-Hatt et al., 1999 (66) 

Heat A set of 19 heat shock proteins (Hsp) 

was observed (HspB, C, D, E and H、 

GroES1 and GroES2、GroEL2, GroEL4, 

and GroEL5 and DnaK etc.) 

Münchbach et al., 1999 (67)

206 


表三利用蛋白質體學研究微生物之壓力反應 (續) 


Pseudomonas fragi Osmotic shock Five Na2SO4(8%) stress proteins (not 

identified) 

Vasseur et al., 1999 (68) 

pH one acid (pH 5.4) shock protein, seven 

alkaline (pH 10.5) shock proteins 

(not identified) 

Escherichia coli Cold Protein synthesis in E. coli decreased 

strongly after a temperature downshift 

from 37 to 4℃. The number of 

synthesized proteins represented 60% of 

the overall observed at 37℃. There are 

overexpression of 69 proteins by 

shocked bacteria. 

Perrot et al., 2000 (24) 

Lactobacillus delbrueckii Acid GroEs、GroEL、DnaK Lim et al., 2000 (25) ; Renchinger et 

al.,2000 (26)

207 


表三利用蛋白質體學研究微生物之壓力反應 (續) 


Synechocystis sp. Low and high salts The precursors of all 57 periplasmic 

proteins identified have a signal peptide 

Fulda et al., 2000 (30) 

Lactococcus lactis Cold CspE Wouters et al., 2001 (27) 

Lactobacillus reuteri pH2.0, bile salts, 

pH2.0→bile salts 

The acid shock protein, ornithine 

carbamoyltransferase, ATPase α and β 

subunit are acid response proteins 

induced by acid only. And GroES, ClpB, 

alkyl hydroperoxide reductase (AHPC) 

and ATP-binding cassette (ABC) 

transporter are induced when treated 

with bile salts. 

黃郁芳與黃雪莉,2002 (28) 

表四以蛋白質體學研究細菌分解環境毒性污染物之相關研究 

Microorganism Hazardous compound Reference 

Pseudomonas putida KT2442 

2-chlorophenol 

Lupi et al., 1995 (69) 

Acinetobacter radioresistens 

Pseudomonas putida F1 

phenol, benzoate 

Toluene, phenol, toluene + phenol 

Pseudomonas putida SH1 Naphthalene, phenol, o-cresol 

Giuffrida et al.,2001 (70) 

Reardon and Kim, 2001 (35) 

Huang and Lian, 2002 (36) 

Pseudomonas sp. SH4 Octylphenol polyethoxylate 徐秉正與黃雪莉,2002 (44)

第十六章、微生物生理之蛋白質體學研究 

A. 1.樣品未處理 DNase I 和RNase A 

2.加入100µg/ml DNase I+25µg/ml RNase A 

B. 

1.覆水緩衝液加入 3 mM TBP 2.覆水緩衝液加入 18 mM DTT 

C. 1.一倍的SDS-TG buffer 

2.兩倍的SDS-TG buffer 

pI 4 7 

200 

116 

97.4 

66.2 

43 

31 

21.5 

14.4 

6.5 

圖一、二維電泳圖譜之最適化:左邊為未處理,右邊為處理部份: (A)在樣品中加入100 µg/ml 

DNase I + 25µg/ml RNase A。 (B)在覆水緩衝液加入 3 mM TBP和加入18 mM DTT之差 

異。 (C)第二維電泳使用兩倍的SDS-TG buffer 

200 

116 

97.4 

66.2 

43 

31 

21.5 

14.4 

6.5 

208 

pI 4 7

參考文獻 

209 


1. Anderson, N. L., and Seichamer, J.(1997)A comparison of selected mRNA and protein abundances in 

human liver. Electrophoresis 18, 553. 

2. Fleischmann, R. D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage, A. R., Bult, C. J., 

Tomb, J. F., Dougherty, B. A., and Merrick, J. M.(1995)Whole-genome random sequencing and assembly 

of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496-512. 

3. Cordwell, S. J., Nouwens, A. S., Verrills, N. M., Basseal, D. J., and Walsh, B. J.(2000)Subproteomics 

based upon protein cellular location and relative solubilities in conjunction with composite 

two-dimensional electrophoresis gels. Electrophoresis 21, 1094-1103. 

4. Clayton, R. A., White, O., and Fraser, C. M.(1998)Findings emerging from complete microbial genome 

sequences. Curr. Opin. Microbiol. 1, 562-566. 

5. Grandi, G.(2001)Antibacterial vaccine design using genomics and proteomics. Trends Biotechnol. 19, 

181-188. 

6. Chakravarti, D. N., Fiske, M. J., Fletcher, L. D., and Zagursky, R. J.(2001)Application of genomics and 

proteomics for identification of bacterial gene products as potential vaccine candidates. Vaccine 19, 

601-612. 

7. Boeckmann, B., Bairoch, A., Apweiler, R., Blatter, M.C., Estreicher, A., Gasteiger, E., Martin, M. J., 

Michoud, K., O’Donovan, C., Phan, I., Pilbout, S., and Schneider, M.(2003)The SWISS-PROT protein 

knowledgebase and is supplement TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Research 31, 365-370. 

8. Fauci, A. S.(2001)Infectious diseases: considerations for the 21 st century. Clin. Infect. Dis. 32, 675–685. 

9. Huang, S. H., and Jong, A.(2001)Cellular mechanisms of microbial proteins contributing to invasion of 

the blood-brain barrier. Cell Microbiol. 3, 277-287. 

10. Huang, S. H., Triche, T., and Jong, A. Y.(2002)Infectomics: genomics and proteomics of microbial 

infections. Funct. Integr. Genomics 1, 331-344. 

11. Hanash, S. M., Madoz-Gurpide, J., and Misek, D. E.(2002)Identification of novel targets for cancer 

therapy using expression proteomics. Leukemia 16, 478-485. 

12. Tang, H., Peng, T., and Wong-Staal, F.(2002)Novel technologies for studying virus-host interaction and 

discovering new drug targets for HCV and HIV. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 541. 

13. Nagl, S. B.(2002)Computational function assignment for potential drug targets: from single gene to 

cellular systems. Curr. Drug Targets. 3, 387-399. 

14. Petricoin, E. F., Zoon, K. C., Kohn, E.C., Barrett, J. C., and Liotta, L. A.(2002)Clinical proteomics: 

translating benchside promise into bedside reality. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 683-695. 

15. Cash, P., Argo, E., Ford, L., Lawrie, L., and McKenzie, H.(1999)A proteomic analysis of erythromycin 

resistance in Streptococcus pneumoniae. Electrophoresis 20, 2259-3368. 

16. Jungblut, P., Schaible, U., Mollenkopf, H-J., Zimny-Arndt, U., Raupach, B., Mattow, J., Halada, P.,

210 


Lamer, S., Hagens, K., and Kaufmann, S.(1999)Comparative proteome analysis of Mycobacterium 

tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: towards functional genomics of microbial pathogens. 

Mol. Microbiol. 33, 1103-1117. 

17. Jungblut, P. R., Bumann, D., Haas, G., Zimny-Arndt, U., Holland, P., Lamer, S., Siejak, F., Aebischer, A., 

and Meyer, T. F.(2000)Comparative proteome analysis of Helicobacter pylori. Mol. Microbiol. 38, 

710-725. 

18. Langen, H., Takacs, B., Evers, S., Berndt, P., Lahm, H., Wipf, B., Gray, C., and Fountoulakis, M.(2000) 

Two-dimensional map of the proteome of Haemophilus influenzae. Electrophoresis 21, 411-429. 

19. Jungblut, P. R.(2001)Proteome analysis of bacterial pathogens. Microbes and Infection 10, 831-840. 

20. Craig, E. A.(1985)The heat-shock response. CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 239-280. 

21. Neidhardt, F. C., Phillips, T. A., VanBogelen, R. A., Smith, M. W., Georgalis, Y., and Subramanian, A. R. 

(1981)Identity of the B56.5 protein, the A-protein, and the groE gene product of Escherichia coli. J. 

Bacteriol. 145, 513-522. 

22. VanBogelen, R. A., Kelley, P. M., and Neidhardt, F. C.(1987)Differential induction of heat-shock, SOS, 

and oxidation stress regulons and accumulation of nucleotides in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169, 

26-32. 

23. Bernhardt, J., Volker, U., Volker, A., Antelmann, H., Schmid, R., Mach, H., and Hecker, M.(1997) 

Specific and general stress proteins in Bacillus subtilis-a two-dimensional protein electrophoresis study. 

Microbiology 143, 999-1017. 

24. Perrot, F., Hebraud, M., Junter, G. A., and Jouenne, T.(2000)Protein synthesis in Escherichia coli at 4 ℃ . 


25. Lim, E. M., Ehrlich, S. D., and Maguin, E.(2000)Identification of stress-inducible proteins in 

Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus. Electrophoresis 21, 2557-2561. 

26. Rechinger, K. B., Siegumfeldt, H., Svendsen, I., and Jakobsen, M.(2000)“Early” Protein synthesis of 

Lactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus in milk revealed by [ 35 S]-methionine labeling and 

two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 21, 2660-2669. 

27. Wouters, J. A., Frenkiel, H., de Vos, W. M., Kuipers, O. P., and Abee, T.(2001)Cold shock proteins of 

Lactococcus lactis MG1363 are involved in cryoprotection and in the production of cold-induced 

proteins. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5171-5178. 

28. 黃郁芳,黃雪莉 (2002)Lactobacillus reuteri 於酸性與環膽鹽環境中蛋白質體研究。中華民國微 

生物學會年會。 

29. Haike, A., Scharf, C., and Hecker, M.(2000)Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus subtilis: 

proteomics and transcriptional analysis. J. Bacteriol. 182, 4478-4490. 

30. Fulda, S., Huang, F., and Nilsson, F.(2000)Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803 

identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations. Eur. J. Biochem.

267, 5900-5907. 

211 


31. Madhusudhan, K. T., Robert, M., Naoak, K. and Hiryuki, M.(2003)Identification of a major protein 

upon phosphate starvation of Pseudomonas aeruginosa PAO1. J. Basic Microb. 43, 36-46. 

32. Quadroni, M., James, P., Dainese-Hatt, P., and Kertesz, M. A.(1999)Proteome mapping, mass 

spectrometric sequencing and reverse transcription-PCR for characterization of the sulfate 

starvation-induced response in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Eur. J. Biochem. 266, 986-996. 

33. Kertesz, M. A., Leisinger, T., and Cook, A. M.(1993)Proteins induced by sulfate limitation in 

Escherichia coli, Pseudomonas putida, or Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 175, 1187-1190. 

34. Cordwell, S. J., Larsen, M. R., Cole, R. T., and Walsh, B. J.(2002)Comparative proteomics of 

staphylococcus aureus and response of methicillin-resistant and methicillin-sensitive strains to Triton 

X-100. Microbiology 148, 2765-2781. 

35. Reardon, K. F., and Kim, K. H.(2002) Two-dimensional electrophoresis analysis of protein production 

during growth of Pseudomonas putida F1 on toluene, phenol, and their mixture. Electrophoresis 23, 

2233-2241. 

36. Huang, S. L., and Lian, F. J.(2002)A proteomic study on bacterial degradation of aromatic compounds. 

102nd Annual meeting of American Society for Microbiology. 

37. Paulsen, I. T., Sliwinski, M. K., Nelissen, B., Goffeau, A., and Saier, M. H.(1998)Unified inventory of 

established and putative transporters encoded within the complete genome of Saccharomyces cerevisiae. 

FEBS Lett. 430, 116-125. 

38. Garrels, J. I., McLaughlin, C. S., Warner, J. R., Futcher, B., Latter, G. I., Kobayashi, R., Schwender, B., 

Volpe, T., Andersen, D. S., Mesquita-Fuentes, R., and Payne, W. E.(1997)Proteome studies of 

Saccharomyces cerevisiae: identification and characterization of abundant proteins. Electrophoresis 18, 

1347-1360. 

39. Santoni, V., Molloy, M., and Rabilloud, T. (2000)Membrane proteins and proteomics: un amour 

impossible? Electrophoresis 21, 1054-1070. 

40. Molloy, M. P., Herbert, B. R., Walsh, B. J., Tyler, M. I., Traini, M., Sanchez, J. C., Hochstrasser, D. F., 

Williams, K. L., and Gooley, A. A.(1998)Extraction of membrane proteins by differential solubilization 

for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 19, 837-844. 

41. Davidsson, P., and Nilsson, C. L.(1999)Peptide mapping of proteins in cerebrospinal fluid utilizing a 

rapid preparative two-dimensional electrophoretic procedure and matrix-assisted laser desorption 

/ionization mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1473, 391-399. 

42. Nilsson, C., Larsson, L., T., Gustafsson, E., Karlsson, K. A., and Davidsson, P.(2000)Identification of 

protein vaccine candidates from Helicobacter pylori using a preparative two-dimensional electrophoretic 

procedure and mass spectrometry. Anal. Chem. 72, 2148-2153. 

43. 43 Mawuenyega, K. G., Kaji, H., Yamuchi, Y., Shinkawa, T., Saito, H., Taoka, M., Takahashi, N., and

212 


Isobe, T.(2003)Large-scale identification of Caenorhabditis elegans proteins by multidimensional liquid 

chromatography-tandem mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 23-35. 

44. 徐秉正,黃雪莉 (2002)Pseudomonas sp.SH4 蛋白質體研究:二維電泳條件之最適化。中華民國 

微生物學會年會。 

45. Blomberg, A., and Blomberg, L.(1995)Interlaboratory reproducibility of yeast protein patterns analyzed 

by immobilized pH gradient two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 16, 1935-1945. 

46. Stasyk, T., Hellman, U., and Souchelnytskyi.(2001)News. Optimizing sample preparation for 2-D 

electrophoresis. Life science news 9, 8-13. 

47. Herbert, B. R., and Molly, M. P.(2001)Reduction and alkylation of proteins in preparation of 

two-dimensional map analysis: why, when, and how. Electrophoresis 19, 845-851. 

48. Perrot, M., Segliocco, F., Mini, T., Monribot, C., Schneider, U., Shevchenko, A., Mann, M., Jenö, P., and 

Boucherie, H.(1999)Two-dimensional gel protein database of Saccharomyces cerevisiae. Electro- 

phoresis 20, 2280-2298. 

49. Payne, W. E., and Garrels, J. I.(1997)Yeast Protein database(YPD): a database for the complete 

proteome of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 1, 57-62. 

50. Hodges, P. E., McKee, A. H., Davis, B. P., and Payne, W. E.(1999)The Yeast Proteome Database 

(YPD): a model for the organization and presentation of genome-wide functional data. Nucleic Acids 

Res. 1, 69-73. 

51. Sazuka, T., Yamaguchi, M., and Ohara, O.(1999)Cyano2Dbase updated: linkage of 234 protein spots to 

corresponding genes through N-terminal microsequencing. Electrophoresis 20, 2160-2171. 

52. Costanzo, M., Hogan, J., Cusick, M., Davis, B., Fancher, A., Hodges, P., Kondu, P., Lengieza, C., 

Lew-Smith, J., and Linger, C.(2000)The Yeast Proteome Database (YPD) and Caenorhabditis elegans 

Proteome Database (WormPD): comprehensive resources for the organization and comparison of model 

organism protein information. Nucleic Acids Res. 28, 73-76. 

53. Costanzo, M. C., Crawford, M. E., Hirschman, J. E., Kranz, J. E., Olsen, P., Robertson, L. S., Skrzypek, 

M. S., Braun, B. R., Hopkins, K. L., Kondu, P., Lengieza, C., Lew-Smith, J. E., Tillberg, M., and Garrels, 

J. I. (2001)YPD, PombePD and WormPD: model organism volumes of the BioKnowledge library, an 

integrated resource for protein information. Nucleic Acids Res. 1, 75-79. 

54. Mollenkopf, H., Jungblut, P., Raupach, B., Mattow, J., Lamer, S., Zimny-Arndt, U., Schaible, U., and 

Kaufmann, S.(1999)A dynamic two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis database: the 

mycobacterial proteome via Internet. Electrophoresis 20, 2172-2180. 

55. Tonella, L., Walsh, B. J., Sanchez, J. C., Ou, K., Wilkins, M. R., Tyler, M., Frutiger, S., Gooley, A. A., 

Pescaru, I., Appel, R. D., Yan, J. X., Bairoch, A., Hoogland, C., Morch, F. S., Hughes, G. J., Williams, K. 

L., and Hochstrasser, D. F.(1998)'98 Escherichia coli SWISS-2DPAGE database update. Electrophoresis 

19, 1960-1971.

213 


56. Giometti, C. S., Reich, C., Tollaksen, S., Babnigg, G., Lim, H., Zhu, W., Yates, III J., and Olsen, 

G. (2002) Global analysis of a "simple" proteome: Methanococcus jannaschii. J. Chromatogr. B 782, 

227-243. 

57. Haas, G., Karaali, G., Ebermayer, K., Metzger, W. G., Lamer, S., Zimny-Arndt, U., Diescher, S., Goebel, 

U. B., Vogt, K., Roznowski, A. B., Wiedenmann, B. J., Meye,r T. F., Aebischer, T., and Jungblut, P. R. 

(2002) Immunoproteomics of Helicobacter pylori infection and relation to gastric disease. Proteomics 

2, 313-324. 

58. Nelson, K.E., Weinel, C., Paulsen, I. T., Dodson, R. J., Hilbert, H., Martins dos Santos, V. A., Fouts, D. 

E., Gill, S. R., Pop, M., Holmes, M., Brinkac, L., Beanan, M., DeBoy, R. T., Daugherty, S., Kolonay, J., 

Madupu, R., Nelson, W., White, O., Peterson, J., Khouri, H., Hance, I., Chris Lee, P., Holtzapple, E., 

Scanlan, D., Tran, K., Moazzez, A., Utterback, T., Rizzo, M., Lee, K., Kosack, D., Moestl, D., Wedler, 

H., Lauber, J., Stjepandic, D., Hoheisel, J., Straetz, M., Heim, S., Kiewitz, C., Eisen, J., Timmis, K. N., 

Dusterhoft, A., Tummler, B., and Fraser, C. M.(2002)Complete genome sequence and comparative 

analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ. Microbiol. 4, 799-808. 

59. Niimi, M., Cannon, R., and Monk, B. (1999)Canduda albicans paththogenicity: a proteomic 

perspective. Electrophoresis 20, 2299-2308. 

60. Pitarch, A., Pardo, M., Jiménez, A., Pia, J., Gil, C., Sánchez, M., and Nombela, C.(1999)Two- 

dimensional gel electrophoresis as analysis tool for identifying Canduda albicans immunogenic proteins. 


61. Sanchez-Campillo, M., Bin, L., Comanducci, M., Raggiaschi, R., Marzocchi, B., Pallini, V., and Ratti, G. 

(1999)Identification of immunoreactive proteins of Clamydia trachomatis by Western blot analysis of a 

two-dimensional electrophoresis map with patient sera. Electrophoresis 20, 2269-2279. 

62. Tan, Y. P., Lin, Q., Wang, X. H., Joshi, S., Hew, C. L., and Leung, K. Y.(2002)Comparative proteomic 

analysis of extracellular proteins of Edwardsiella tarda. Infect. Immun. 70, 6475-6480. 

63. Chaussee, M. S., Watson, R. O., Smoot, J. C., and Musser, J. M.(2001)Identification of Rgg-regulated 

exoproteins of Streptococcus pyogenes. Infect. Immun. 69, 822-831. 

64. Antelmann, H., Scharf, C., and Hecker, M.(2000)Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus 

subtilis: proteomics and transcriptional analysis. J. Bacteriol. 182, 4478-4490. 

65. Bernhardt, J., Weibezahn, J., Scharf, C., and Hecker, M.(2003)Bacillus subtilisduring feast and famine: 

visualization of the overall regulation of protein synthesis during glucose starvation by proteome analysis. 

Genome Res. 13, 224-237. 

66. Dainese-Hatt, P., Fischer, H-M., Henecke, H., and James P.(1999)Classifying symbiotic proteins from 

Bradyrhizobium japonicum into functional groups by proteome analysis of altered gene expression levels. 


67. Münchbach, M., Dainese, O., Staudenmann, W., Narberhaus, F., and James, P.(1999)Proteome analysis

of heat shock expression in Bradyrhizobium japonicum. Eur. J. Biochem. 263, 39-48. 

214 


68. Vasseur, C., Labadie, J., and Hébraud, M.(1999)Differential protein expression by Pseudomonas fragi 

submitted to various stresses. Electrophoresis 20, 2204-2213. 

69. Lupi, C. G., Colangelo, T., and Mason, C. A.(1995)Two-dimensional gel electrophoresis analysis of the 

response of Pseudomonas putida KT2442 to 2-Chlorophenol. Appl. Environ. Microbiol. 61, 2863-2872. 

70. Giuffrida, M. G., Pessione, E., Mazzoli, R., Dellavalle, G., Barello, C., Conti, A., and Giunta, C.(2001) 

Media containing aromatic compounds induce peculiar proteins in Acinetobacter radioresistens, as 

revealed by proteome analysis. Electrophoresis 22, 1705-1711.

前言 

第十七章 

NMR 在蛋白質體學之研究 

中央研究院生物醫學科學研究所 

羅元超,陳金榜 

215 

第十七章、NMR 在蛋白質體學之研究 

2001 年二月,由美國政府主導的”人類基因體計畫”(Human genome project)團隊和由 

Dr. J.C. Venter 所領導的 Celera Genomic 公司分別在自然(Nature)和科學(Science)兩大國 

際知名期刊報導他們所完成的人類基因體 30 億鹼基對定序解碼的研究成果。誠如美國時代雜 

誌所論述,人類基因圖譜計畫的完成僅是一個新世代的開始,而非結束,這主要原因是至今大 

家對這些基因所產生的蛋白質在人體內對生理作用及疾病的影響所知仍有限。因此,在進入 

後基因時代之後,蛋白質體學研究已成為全球生命科學領域的重點之一。其中結構蛋白質體 

學(Structure proteomics)和結構基因體(Structure genomics)是目前蛋白質體學中最重要的 

研究課題之一。其主要目標即是利用 X-ray 和 NMR 技術及電腦模擬計算快速且大量地定出蛋 

白質結構,進而探討結構與功能之關聯性。目前世界主要先進國家,諸如美國、日本、法國 

及德國等,皆投入大筆研究經費,設立結構基因體中心 (1-3) ,期望能建立起一套系統來增進蛋 

白質表現能力及純化步驟,並能快速且大量地定出蛋白質三維結構。 

一般而言,當提到超高磁場 NMR 技術主要功能時,大家便想到它可用來解出蛋白質之 

立體結構。然而除了這項功能之外,NMR 的用途可說是十分廣泛的。NMR 也可應用於研究 

蛋白質骨架(backbone)或側鏈(side-chain)原子之動態(dynamics) (4) 。當蛋白質形成多樣 

的構形時也可藉由 NMR 區別出來 (5) 。NMR 亦能決定出含有解離基胺基酸之 pKa 值 (6) 。再者, 

藉著在不同條件下,NMR 光譜分析也可能偵測出蛋白質是否形成集合體或纖維物 (7) 。NMR 

還能夠決定蛋白質與結合物之解離常數(Kd) (8) 。當蛋白質溶解在 D2O,利用 NMR 可以提供 

H 與 D 的交換速率,進而得知哪些氫原子可能形成氫鍵 (9) 。在藥物開發方面,即使目標蛋白 

質與結合物之作用很弱,NMR 仍然可以快速地偵測出來 (10,11) ,所以在藥物篩選與開發方面, 

NMR 技術之應用是越來越重要。另外當蛋白質無法結晶時,利用 NMR 或許可定出這些蛋白質 

在水溶液之結構。因此,毫無疑問地,NMR 之應用在結構蛋白質體學的研究是極其重要的。由 

於篇幅有限,本文無法詳細討論各項 NMR 的應用,僅能就傳統 NMR 在決定蛋白質結構的瓶 

頸,及近年來 NMR 領域之發展加以討論,讓讀者能更加了解 NMR 技術在後基因體時代的重 

要性。 

內容 

壹、蛋白質樣品的篩選 

對許多結構基因體計畫而言,篩選出“行為良好” 的蛋白質標的可供核磁共振光譜學家 

及 X-ray 繞射光譜學家進行結構探討,是影響整個計畫完成的一大課題,這裡所謂的“行為

216 


良好“是指其整體結構穩定,而且不會有互相聚集(aggregation)的現象產生,尤其蛋白質 

的聚集對結構學家來說是非常頭痛的事;對核磁共振而言,一個不良的蛋白質會嚴重影響光 

譜的品質,進而延長分析光譜的時間;對 X-ray 光譜學家而言,容易互相聚集或是結構過於 

鬆散(disorder 的比例大於 10%)都是不利於結晶的因素 (12) ;以美國的 Northeast Structural 

Genetics Consortium(NESGC)為例,截至西元 2002 年底為止,NESGC 在 1295 個可表現的 

蛋白質標的中,決定了 50 個蛋白質結構,其中 22 個是以 X-ray 結晶繞射所決定,剩餘 28 個 

是以 NMR 的方式所決定 (13) ,因此如何在眾多的蛋白質標的中挑選適合進行 NMR 及 X-ray 研 

究的對象,是整個結構基因體計畫中最重要的第一步。 

利用 NMR 來初步篩選合適的蛋白質標的是目前各大結構基因體中心所普遍採用的方 

式,它可以快速的獲得整個蛋白質結構穩定或鬆散的資訊,並進一步測試不同的緩衝溶液、 

pH、溫度和輔因子(cofactor)的效果,以便找到該蛋白質最穩定的狀態;通常對一個濃度約 

1mM 的蛋白質樣品而言,只需要數分鐘的時間便可收集完成一個簡單的一維 NMR 光譜,圖 

一 A 是一個摺疊不完全的蛋白質樣品所得到的一維氫光譜,我們可以看到這個光譜在化學位 

移 8.0 ppm 的部分有非常強的吸收峰(典型無結構蛋白質的訊號),而這個訊號便可作為我們 

判定蛋白質樣品是否具有結構的依據,當一個蛋白質樣品的構形為無規則盤繞(random-coil) 

時,其醯胺基氫原子(amide proton)的化學位移會落在 8.0 ppm 附近,而當其有穩定的二級 

及三維結構時,其醯胺基氫原子的化學位移會受到周圍不同化學環境(例如:苯環的遮蔽效 

應)的影響而散布在較大的範圍中: 7.0~10 ppm,(如圖一 B);除了骨架上的醯胺基氫原子外, 

脂肪族的氫原子也有類似的分布情形,圖一 A 在 0.8 ppm 上有很強且集中的吸收峰,相反的, 

圖一 B 的吸收峰則散佈在 1~-0.5 ppm 之間。除了利用化學位移來判斷蛋白質分子結構的穩 

定性外,我們還可利用其吸收峰的半高寬(linewidth)來判斷蛋白質分子的聚集效應,對結 

構穩定且分子量相似的兩個蛋白質分子而言,在同樣溫度下,其一維光譜的吸收峰應該呈現 

出相似的半高寬,分子量越小、半高寬越小,相反的,分子量越大、半高寬也越大。 

相較於一維氫光譜,擁有較高解析度的二維 NMR 光譜也常被用於蛋白質分子穩定性的 

篩選或是與其它分子形成複合物(complex)的研究,其中最有效率也最常被使用的便是所謂 

的 Heteronuclear Single Quantum Correlation(HSQC)光譜,HSQC 光譜可將氮原子的化學位 

移和其直接鍵結的氫原子化學位移產生連結,在此光譜上,除了脯胺酸(proline)之外,每 

個殘基(residue)都有一個交叉峰(cross peak),這些交叉峰的分布情形也遵守之前一維光譜 

的原則,一個摺疊不完全的蛋白質分子,其 HSQC 光譜上的點會聚集在 8.0 ppm 附近 (對 1 H 

象限而言,如圖一 C );相反的,一個完全摺疊的蛋白質分子其光譜則會有較平均的分布 (如 

圖一 D )。

(A) (B) 

(C) (D) 

217 


圖一、(A)一個摺疊不完全的蛋白質樣品所得到的一維氫光譜;(B)結構穩定的蛋白質樣品 

所得到的一維氫光譜;(C)與 A 相同樣品的 2D 1 H- 15 N HSQC 光譜;(D)與 B 相同樣 

品的 2D 1 H- 15 N HSQC 光譜。 

而隨著整個光譜的交叉峰被完全確認出其在蛋白質序列上的相對位置,其後續在藥物設 

計上的應用更是廣泛;例如所謂的 SAR by NMR(結構活性關連,structure activity relationship 

by NMR) (11) 主要就是根據蛋白質分子化學位移的改變為基礎(如圖二),藉以設計高親合性 

的配體;例如一個蛋白質有兩個結合位置,當加入配體 A(Ligand A)時,A 結合區的殘基 

在 HSQC 光譜上會有較大的化學位移改變,而加入配體 B 時,B 結合區的殘基則表現出較大 

的化學位移改變,綜合這些資訊所設計的配體 C,即配體 A 加配體 B,中間以一條 linker 連 

接,便可擁有配體 A 和配體 B 的親合性,以此繼續推演測試下去便可設計出一個具有藥物潛 

力的高親合性前導化合物(lead compound)。

218 


圖二、以 2D 1 H- 15 N HSQC 光譜觀測牛蛙卵核醣核酸水解酵素和其配體鍵結時的化學位移變 

化,箭頭指示無配體(灰色)和加入配體(黑色)時交叉峰的變化。 

貳、核磁共振光譜在決定蛋白質結構之應用 

傳統利用核磁共振光譜來決定蛋白質三維結構的過程,主要可分為以下四個步驟:(1). 

光譜的取得;(2)循序鑑定的完成;(3)磁歐效應(nuclear Overhauser effect , NOE)等限制 

條件的收集;(4)結構粗算及精算。以上各個步驟在國內期刊中多有著墨 (14,15) ,在此僅作簡 

單討論。 

一、光譜的取得 

以目前較普遍的 600MHz 核磁共振儀來說,收集一個濃度約 1mM 的蛋白質樣品的三維 

光譜,約需 2~3 天的時間,而要完成整個循序鑑定的流程及收集足夠的限制條件,約需要 10 

個三維的光譜,因此在樣品濃度高及蛋白質樣品穩定性佳的兩個前提下,起碼仍需要一個月 

的時間才能收集完所需要的資訊,不過由於硬體的進步這部份將可大大的改善,我們在下文 

將有詳細的論述。 

二、循序鑑定的完成 

三維光譜的循序鑑定會因為光譜的品質而需要不同的時間,光譜上重疊的交叉峰越少, 

循序鑑定所花費的時間也會越少,一般來說,一個有經驗的核磁共振光譜學家完成一個 10KDa 

大小的蛋白質分子的循序鑑定大約需要幾週或幾個月的時間,不過由於軟體的進步,此步驟 

所花費的時間預計也會逐漸的減少。

219 


三、NOE 等限制條件的收集 

傳統以核磁共振決定蛋白質三維結構所採用的限制條件主要有 NOE、J-偶合常數及氫鍵 

這三種限制條件,核子自旋經由化學鍵所產生的偶合現象會使氫原子的吸收峰一分為二,兩 

個吸收峰在化學位移上的差值便是 J-偶合常數,一般較常量測的 J-偶合常數是 3 JHNα(由醯胺 

基上的質子和鄰接的 C α 質子偶合所產生),其偶合常數的大小會因雙面角的不同而有差異, 

而不同的二級結構會有不同的雙面角,因此經由 J-偶合常數這個限制條件,我們便可很清楚 

地知道蛋白質骨架的二級結構。氫鍵的確認可由量測醯胺基氫原子和水溶液中質子的交換速 

率而來,參與形成氫鍵的氫原子其交換速率會比一般醯胺基氫原子來得慢,透過氫鍵限制條 

件的獲得,也可幫助我們了解蛋白質骨架的二級結構。以上兩種限制條件雖然都很容易取得, 

不過它們主要用來幫助光譜學家了解一個蛋白質的二級結構,而要得到一個高解析度的三維 

結構主要依賴 NOE 限制條件的取得;NOE 的效應是由於原子核自旋的磁偶矩交互作用所造 

成,其大小和兩原子核間的距離六次方成反比,也就是兩個氫原子間的距離越短,NOE 光譜 

上所量測到交叉峰的強度就越強,不過 NOE 效應有距離的上限,通常我們只能量測到小於 

5Å 的距離所造成的 NOE 效應,而對結構計算來說,一個殘基要有 10 個以上的 NOE 限制條 

件方能得到一個高解析度的三維結構,所以核磁共振光譜學家在決定蛋白質的三維結構時, 

會花上數個月甚至一年以上的時間在鑑定氫原子間的 NOE 限制條件,而如何正確無誤又快速 

的完成 NOE 的鑑定,是核磁共振光譜學家在結構基因體計畫中所面臨的最大難題。 

四、結構計算及精算 

由於半導體材料科學的長足進步,目前電腦及工作站的運算速度和以往不可同日而語, 

因此在結構計算及精算步驟所需要的時間主要還是取決於限制條件的取得,使用越多的限制 

條件,所計算出的三維結構其解析度也越好。 

參、核磁共振領域近年之進展 

結構基因體主要研究是要”快速且大量”解出蛋白質三維結構、目前傳統核磁共振光譜在 

此方面有兩大瓶頸,一是收集所需三維光譜的時間太長,二是分析光譜,鑑定限制條件費時 

過久。若要解決這些問題,除了必須增加核磁共振的解析度及靈敏度外也要加速限制條件的 

鑑定,所幸隨著核磁共振領域的發展,現今已有不少的方法可以克服上述兩大瓶頸,首先是 

磁場強度的提昇,世界上兩大核磁共振儀製造商 Bruker 及 Varian 皆已推出 800MHz 的核磁共 

振儀,且世界數個頂尖的實驗室,諸如美國的 Scripts Research Institute 也成功裝置了 900MHz 

核磁共振儀。在結構基因體計畫中研究之蛋白質標的往往擁有較高之分子量,經由核磁共振 

儀所測得之光譜也就相對較為複雜,許多交叉峰通常彼此相鄰甚至重疊,所以實驗中使用的 

磁場強度愈大其收集的光譜解析度也愈好,越能分辨鄰近的交叉峰,進而分析更大的蛋白質 

分子。此外,核磁共振儀的靈敏度也與磁場強度的平方成正比,故在實驗中所使用的磁場強 

度增加兩倍時,其靈敏度就可以增加為原先的四倍,如此一來只要花費十六分之一的時間,

220 


或是花同樣的實驗時間,其樣品中蛋白質濃度為原先的四分之一,即可測得所需的光譜。一 

般來說,分子量較大的蛋白質,往往不易表現和純化,尤其濃縮至高濃度時,常有相互聚集 

或是沈澱現象的發生,若能以較低的樣品濃度進行實驗,也可以減少許多樣品製備的時間及 

材料費用,所以高磁場的核磁共振儀對大分子量的蛋白質來說是非常的重要,此外,更高的 

磁場強度,也有利於近年來發展之核磁共振光譜的進行,此部分將在下文中一一介紹;總之, 

追求更高磁場強度的核磁共振儀是所有核磁共振光譜學家的共同願望。 

核磁共振光譜儀的靈敏度與收集訊號的探頭也有相當大的關連,探頭是進行核磁共振實 

驗和收集實驗訊號最重要的裝備,而探頭中的核心部分,是由能進行放射與收集無線電波的 

線圈所組成,這些線圈在收集訊號時的靈敏度會受到本身雜訊的影響,而雜訊的大小和溫度 

有關,若線圈自身的溫度愈低,雜訊愈小,其收集訊號之靈敏度也就愈高;一直以來,核磁 

共振儀探頭的線圈並無法有效的控溫,使其溫度下降,不過近幾年新發展的超低溫探頭 

(cryogenic probe),可以將線圈冷卻至絕對溫度 25K,並且不會影響到樣品的控溫(一般是 

室溫),而隨著線圈的低溫(25K)效應,超低溫探頭的靈敏度可以達到一般探頭的四倍,光 

譜訊號收集時間縮短為原來的十六分之一,若是用相同的訊號收集時間,樣品蛋白質濃度只 

需原先濃度的四分之一,可預期的,超低溫探頭的發展將對結構基因體計畫有極大的幫助, 

由其雖然價格不菲,卻仍受世界各核磁共振中心的青睞,可看出其重要性。 

除了儀器硬體的進步發展,在樣品的製備上也能增加光譜的解析度和靈敏度,現今最常 

採用的便是部分氘原子標定(fractional deuteration) (16) ,此方法是將養菌的培養液中的水換 

成重水,如果氘原子標定比例要達到 90%以上,則需將培養液中的養分來源葡萄糖換成氘原 

子標定之葡萄糖。如此一來表現出的蛋白質分子上的氫原子便會被置換成氘原子,由於氘原 

子的迴旋磁性比(gyromagnetic ratio)比氫原子要小很多,將氫原子置換成氘原子可減少氫氫 

偶極弛緩( 1 H- 1 H dipolar relaxation)及氫氫偶合( 1 H- 1 H scalar couplings)所造成的自旋-自旋 

弛緩(spin-spin relaxation)速率的加快,而自旋-自旋弛緩速率愈慢,光譜靈敏度愈好,訊號 

的解析度也會加強,因此氘原子標定對改善大分子量蛋白質的光譜訊號相當有幫助,如圖三 

所示,百分之 90%的氘原子標定使得交叉峰的半高寬度縮小,讓核磁共振光譜學家更容易鑑 

定光譜擁擠區之殘基,也使原本訊號薄弱的交叉峰變得更明顯。另外新的核磁共振光譜實驗: 

橫向弛緩最佳化光譜 TROSY(transverse relaxation-optimized spectroscopy) (17) 亦能增加光譜 

解析度, TROSY 實驗是由 2002 年諾貝爾化學獎得主 K. Wüthrich 於 1997 年所提出,此實驗 

能選擇弛緩較慢的訊號,因此其光譜的解析度也能大幅的增加(如圖四);TROSY 實驗在高 

磁場下的效果較好,常應用在觀測兩個大分子量蛋白質結合時的化學位移改變。利用樣品中 

蛋白質自身部分氘原子標定加上使用 TROSY 型式之核磁共振光譜實驗,使核磁共振光譜學 

家能夠進行大分子量蛋白質的結構分析,而此一分子量限制已由原先 30KDa 推進至 30~ 

50kDa。 

縮短分析光譜與收集限制條件的時間是加快決定蛋白質三維結構的速度的另一要件;針 

對光譜分析方面,大致粗分為兩部分,一為循序鑑定,另一為 NOE 光譜的鑑定。目前有不少

221 


分析軟體針對這些鑑定流程嘗試進行全自動或是半自動的鑑定。循序鑑定主要依賴 13 C 和 15 N 

標定蛋白質樣品所進行之三維結構實驗,其標定方法是在培養液中加入 13 C 標定之葡萄糖與 

15 

N 標定之氯化銨(NH4Cl),並利用此培養液表現出目標蛋白質,雙重標定之後的蛋白質分 

子其 13 C 和 15 N 之間會產生偶合的現象,利用這些偶合現象我們可將第 i 個殘基的共振訊號傳 

送至第 i+1 個殘基的醯胺基氫原子上,如此兩兩相互組合再加上不同的氨基酸會有不同的化 

學位移交叉峰的分佈,以此對照蛋白質分子的氨基酸序列,便能依照順序從 N 端至 C 端完成 

所有殘基骨架及側鏈上的化學位移鑑定,上述方法就是所謂的循序鑑定 (18) ,也是一般核磁共 

振光譜學家所採用的鑑定策略,目前有不少分析軟體嘗試將此鑑定流程自動化,其中最成功 

的當屬 Rutgers 實驗室所推出的軟體‥AUTOASSIGN (19) ,在他們的文獻中,測試了 11 個 6KDa 

~18KDa 不同分子量之蛋白質分子的三維光譜,發現 AUTOASSIGN 幾乎完成了所有的循序 

鑑定(~96%),且幾乎沒有錯誤(0.5%),不過值得注意的一點是所有自動鑑定軟體都極度 

依賴解析度良好的三維光譜,當重疊的訊號增加時,鑑定的失敗率與錯誤率也會跟著上升。 

(A) (B) 

圖三、(A)一個 30KDa 蛋白質分子的 2D 1 H- 15 N HSQC 光譜;(B)加上氘原子標定樣品的 

2D 1 H- 15 N HSQC 光譜,由此圖可看出氘原子標定後光譜的解析度和靈敏度的提升。(此 

圖摘自 Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. 27: 357–406)

(A (B 

222 


圖四、(A)一個 45KDa 蛋白質一般的 2D 1 H- 15 N HSQC 光譜;(B)TROSY 形式的 2D 1 H- 15 N 

HSQC 光譜。兩個光譜都是在 750MHz 的核磁共振儀上所收集。(此圖摘自 Curr. Opin. in Struct. 

Biol. 1999, 9: 594–601) 

NOE 光譜的鑑定是所有光譜的分析中最耗費時間的步驟,主要的原因有二,一是光譜交 

叉峰常有嚴重的重疊,二是鑑定不明確交叉峰的難度較高,藉由蛋白質樣品以 13 C 和 15 N 加 

以標定,可提高光譜的解析度,而解析度雖然提高了,磁歐效應光譜(nuclear Overhauser effect, 

NOESY)的鑑定仍須花上不少時間,舉例來說,殘基 i 的醯胺基氫原子在光譜上有一交叉峰, 

其在 1 H 象限的化學位移為 3.0ppm,根據之前循序鑑定完成時所鑑定出的所有殘基側鏈氫原 

子的化學位移,假設只有一個殘基 j 側鏈氫原子的化學位移在 3.0ppm,我們便可得知此為殘 

基 i 的醯胺基氫原子和殘基 j 側鏈氫原子所產生的 NOE 交叉峰,而這也代表這兩個氫原子在 

立體結構上的距離小於 5 Å,根據 NOE 交叉峰的強度和距離的關係,我們常區分 NOE 為強、 

中、弱三種,其相對應之距離限制為 1.8-2.4 Å、1.8-3.6 Å 及 1.8-5 Å 三種,這樣的距離限制 

頗為寬鬆,因而需要大樣的限制條件才能獲得高解析度的結構。不過上述的例子是少數,一 

般的情況是常有數個氫原子的化學位移都在 3.0ppm 附近,而增加了鑑定上的難度,我們稱此 

種不明確的交叉峰為模擬兩可(ambiguity),因為 NOESY 光譜常有為數眾多的不明確的交叉 

峰,故一般 NOE 的鑑定策略是先鑑定出所有明確只有一種可能性的交叉峰,將其轉換成距離 

的限制條件,輔以經由 J-偶合常數得到之雙面角限制條件和氫鍵的限制條件進行結構的粗 

算,再以粗算得到的初步結構來鑑定不明確交叉峰,分析出最符合初步結構的鑑定結果,以 

此不斷重覆進行結構計算和不明確交叉峰的鑑定,最後當每個殘基平均都有十個以上和別的 

殘基之距離限制條件時,一個高解析度的結構便可精算得出。圖五是利用核磁共振光譜所決 

定的具抗癌活性牛蛙卵核醣核酸水解酵素的高解析度三維結構。

(A) (B) 

223 


圖五、利用核磁共振光譜所決定的具抗癌活性牛蛙卵核醣核酸水解酵素的高解析度三維結 

構。(A)15 個最低能量 NMR 結構的疊合圖;(B)結構解析度的示意圖,呈現的柱狀區域越 

細,解析度越好。 

NOSEY 光譜在鑑定上的複雜性較高,大部分的分析軟體在自動鑑定 NOSEY 光譜的功 

效上都不甚理想,其中較為成功的計算軟體應屬 ARIA(Ambiguous Restraints for Iterative 

Assignment) (20) ,ARIA 是一個半自動的 NOE 鑑定分析軟體,其主要功能為鑑定不明確的 NOE 

交叉峰,運作的方法則模擬上文所提的鑑定策略,因此光譜學家必須提供一個初步且明確的 

NOE 鑑定,ARIA 運用這些初步鑑定的限制條件計算出一組初步的結構群,再根據結構群的 

平均結構進行不明確 NOE 交叉峰的鑑定,每重複分析一次,便將新確認出的與仍不明確的 

NOE 交叉峰輸出成表供光譜學家鑑定,雖然 ARIA 的鑑定並不是完全自動化,不過此分析軟 

體仍然提供了一個加快鑑定不明確 NOE 的方法。截自目前為止,自動化鑑定軟體已成功的應 

用在某些蛋白質分子上,不過它們仍有很大的發展空間,特別是側鏈上氫原子共振訊號的自 

動鑑定及完全自動的 NOESY 光譜鑑定,目前都不完備,不過可預期的是這些軟體對鑑定光 

譜的幫助將與日俱增。 

肆、殘存磁偶矩偶合常數 

近幾年來,核磁共振實驗不斷有新的進展,讓它的應用範圍更加的寬廣,其中殘存磁偶矩偶 

合常數(Residual dipole coupling,簡稱 RDC) (21) 實驗可說是最重要的里程碑。傳統核磁共振 

決定三維結構所採用的 NOE,J-偶合常數及氫鍵等,都是小範圍的限制條件,對大分子蛋白質來 

說,其結構往往是由幾個區塊(domain)彼此以迴圈(loop)相連結所成,而迴圈部分由於動 

性較大所以 NOE 的數量較少,計算出的結構其區塊和區塊的相對位置便容易失真,而 RDC 

可以測量兩核子自旋之間的磁偶矩和磁場的夾角,這是一種整體方位上的限制條件,剛好可以 

彌補 NOE 條件的不足。一對核子自旋之間的磁偶矩偶合常數和兩核子間的距離及連接兩核子 

的向量與磁場方向的夾角角度有關,其關係式可以簡化如下:=C (3cos 2 θ-1 )/2r 3 ,是磁偶矩偶合常數,C 是一個簡化後的常數,θ是連接兩核子的向量與磁場方向的夾角角 

度,r 是兩核子的距離;當蛋白質溶解在一般的緩衝溶液時,其分子運動是散亂的,此時夾角 

角度會因為時間的平均而趨於零,磁偶矩偶合常數也就等於零;不過在 1997 年時,光譜學家

224 


A. Bax 在這方面了有驚人的突破,他在緩衝溶液中加入少量的"雙層磷脂"(phosopholipid 

bilayer ),這些脂肪類會在溶液中形成所謂的"bicells",並將整個溶液轉變成液晶(liquid 

crystal)的型態,而在這種液晶型態的溶液中,蛋白質分子的運動便出現了少許的非均勻性, 

這小於千分之一的非均勻性會造成一明顯的偶合常數,因此稱之為殘存磁偶矩偶合常數 

RDC。除了加入磷脂類外,後續的研究也發現某些病毒或噬菌體在高磁場下也會形成規律的 

排列 (22) ,而引發 RDC 效應。RDC 的值可用各種光譜來量測,其中較容易進行的是異核一鍵 

的 RDC 實驗,例如 1 H- 15 N 或是 1 H- 13 C 這兩對,量測的方法是進行 1 H 去偶極化的 HSQC 光 

譜,在光譜中每個交叉峰都會被分裂成兩個,這兩個交叉峰化學位移的差值就就等於 RDC 加 

上 1 H 和 15 N 或 1 H 和 13 C 的偶合常數,而 1 H 和 15 N 或 1 H 和 13 C 的偶合常數只要用溶在一般 

緩衝溶液的樣品進行相同的實驗便可量得,兩組實驗一比較我們便可輕易得到各個鍵結的 

RDC 數值;RDC 的數值經由公式轉換可以得到量測的兩個核子間的向量和磁場方向的夾角角 

度,這種全面性的限制條件對於結構的計算有相當大的幫助,一般的流程是在結構精算時加 

入這種限制條件,所以光譜學家只需要完成明確 NOE 的鑑定進行粗算,再加入 RDC 的限制 

條件進行精算,便可以得到一個高解析度的三維結構,這樣可以省略鑑定不明確的 NOE 所耗 

的大量時間,此外,對氨基酸序列相近的蛋白質家族而言,其三維結構只需要以相似蛋白質 

分子的三維結構為起始,加上本身的 RDC 限制條件進行結構精算便可得到;不過 RDC 的量 

測雖然很有威力,目前卻有一個較大的缺點,就是為了形成液晶所加入的介質容易和蛋白質 

發生聚集作用而沉澱,因此介質的選擇很重要,而這方面的研究仍在進行,假以時日,相信 

RDC 限制條件對加速結構基因體計畫將有很大的助益。表一列出利用核磁共振光譜定出蛋白 

質立體結構的簡易流程過程。 

從結構到功能 

結構基因體計畫以基因的序列為起點,表現蛋白質,決定其三維結構,而最後的挑戰便 

是從這些結構的訊息中找到和生物活性相關聯的線索,進而確認其在細胞內的功能。然而, 

從蛋白質的結構我們能得到哪些訊息呢?一個高解析度的三維結構不僅能讓我們了解蛋白質 

骨架摺疊的形狀(fold),還能確認有哪些殘基是包埋在結構中心,而哪些是在結構的表面, 

暴露於溶液之中;根據研究,超過 70%以上的酵素其活性中心(active site)位於蛋白質表面 

最大的裂口中 (23) ,因此蛋白質的立體結構對活性的確定有很大的幫助;目前一般的作法是將 

蛋白質的立體結構輸入到結構資料庫中作比對,從相似的結構中我們便能得到生物活性的一 

些線索,因而去設計實驗,確認其功能;目前較著名的資料庫有 CATH (http:// www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath 

) 以及 DALI (http://www2.ebi.ac.uk/adli )。雖然從三維結構預測活性的作 

法至今仍有許多挑戰,預料在幾年內會有許多新的方法及進展,不過可展望的是一旦從結構 

確定便能得知其功能,我們便能利用此方法選擇最重要的蛋白質標的進行藥物的設計以調控 

蛋白質的作用,而這也是結構基因體計畫最後的目標。


225 

表一、利用核磁共振光譜定出蛋白質立體結構的簡易流程過程。 

基因體解碼所得之訊息 

選擇目標蛋白質 

將對應的DNA序列載入表現系統中 

大量表現目標蛋白質 

純化 

以一維及二維核磁共振光譜進行篩選 

多維光譜的收集 

進行光譜的循序鑑定 

是否有結構? 

光譜品質良好? 

是否有相似蛋白質結構 

收集殘存磁偶矩 

進行結構的精算並 

定出最後的NMR結構 

進行結構的粗算 

可 

否 

是 

是 

是 

否 

否 

否 

收集NOE, J-偶合常數 

及氫鍵等限制條件 

其他表現系統 

溶解度高? 

是 

可 

擱置 

否 

擱置 

擱置 

進行氘原子標定 

基因體解碼所得之訊息 

選擇目標蛋白質 

將對應的DNA序列載入表現系統中 

大量表現目標蛋白質 

純化 

以一維及二維核磁共振光譜進行篩選 

多維光譜的收集 

進行光譜的循序鑑定 

是否有結構? 

光譜品質良好? 

是否有相似蛋白質結構 

收集殘存磁偶矩 

進行結構的精算並 

定出最後的NMR結構 

進行結構的粗算 

可 

否 

是 

是 

是 

否 

否 

否 

收集NOE, J-偶合常數 

及氫鍵等限制條件 

其他表現系統 

溶解度高? 

是 

可 

擱置 

否 

擱置 

擱置 

進行氘原子標定

結語 

226 


生物科技產業為目前世界先進國家努力推動之高科技產業,而結合人類基因圖譜進行以 

蛋白質為標地之藥物研究及發展是當今生技製藥業的重點發展方向,其中利用蛋白質結構為 

基礎的藥物設計及篩選找到可進一步研發之藥物先導化合物是重點研究之一。本文介紹了如 

何應用 NMR 技術來決定出蛋白質結構,也詳述了近年來 NMR 軟硬體之突破及發展,以便快 

速且大量地定出蛋白質結構,而找出它們的功能。由於 NMR 硬體儀器,數據分析,及結構計 

算皆有很大的擴充空間,我們相信 NMR 應用在生物科技或生物醫學上之研究在未來是更加 

重要及需要的。然而在此我們也要特別強調,整個結構蛋白質體學研究是需要”群體”來共同 

努力完成的,譬如在蛋白質標的的選擇或蛋白質表現系統的改善皆有賴其他的研究專家來提 

供資訊。最後,我們要感謝國科會對結構蛋白質體學的重視,特別在國家基因體醫學計畫項 

下,設立 NMR 核心設施(core facility),投入大筆經費購買 600MHz 和 800MHz NMR 儀器 

並裝備低溫超導探頭.相信在這些儀器陸續安裝運轉後,我國在 NMR 結構蛋白質體學之研究 

在不久的將來可見到豐碩的成果。 

參考文獻 

1. Norvell, J. C., and Machalek, A. Z.(2000)Structural genomics programs at the US National Institute of 

General Medical Sciences. Nat. Struct. Biol. 7, 931. 

2. Yokoyama, S., Matsuo, Y., Hirota, H., Kigawa, T., Shirouzu, M., Kuroda, Y., Kurumizaka, H., 

Kawaguchi, S., Ito, Y., Shibata, T., Kainosho, M., Nishimura, Y., Inoue, Y., and Kuramitsu, S.(2000) 

Structural genomics projects in Japan. Prog. Biophys. Mol. Biol. 73, 363-376. 

3. Heinemann, U.(2000)Structural genomics in Europe: slow start, strong finish? Nat. Struct. Biol. 7, 

940-942. 

4. Renner, C., and Holak, T. A. (2001)NMR 15N relaxation of the insulin-like growth factor(IGF) 

-binding domain of IGF binding protein-5(IGFBP-5)determined free in solution and in complex with 

IGF-II. Eur. J. Biochem. 268, 1058-1065. 

5. Muhlhahn, P., Zweckstetter, M., Georgescu, J., Ciosto, C., Renner, C., Lanzendorfer, M., Lang, K., 

Ambrousius, D., Baier, M., Kurthe, R., and Holak, T. A.(1998)Structure of interleukin 16 resembles a 

PDZ domain with an occluded peptide binding site. Nat. Struct. Biol. 5, 682-686. 

6. Fielding, L.(2000)Determination of Association Constants(Ka)from Solution NMR Data. Tetrahedron 

56, 6151-6170. 

7. Zurdo, J., Guijarro, J. I., Jimenez, J. L., Saibil, H. R., and Dobson, C. M.(2001)Dependence on solution 

conditions of aggregation and amyloid formation by an SH3 domain. J. Mol. Biol. 311: 325-340. 

8. Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., and Fesik, S. W.(1996)Discovering high-affinity ligands 

for proteins: SAR by NMR. Science 274, 1531-1534. 

9. Canet, D., Last, A. M., Tito, P., Sunde, M., Spencer, A., Archer, D. B., Redfield, C., Robinson, C. V., and

227 


Dobson, C. M.(2002)Local cooperativity in the unfolding of an amyloidogenic variant of human 

lysozyme. Nat. Struct. Biol. 9: 308-315.10. Diercks, T., Coles, M., and Kessler, H.(2001)Curr. Opin. 

Chem. Biol. 5, 285-291. 

10. Diercks, T., Coles, M., and Kessler, H.(2001)Applications of NMR in drug discovery. Curr. Opin. Chem. 

Biol. 5, 285-291. 

11. Pellecchia, M., Sem, D. S., and Wuthrich, K.(2002)NMR in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 

211-219. 

12. Kwong, P. D., Wyatt, R., Desjardins, E., Robinson, J., Culp, J. S., Hellmig, B. D., Sweet, R. W., Sodroski, 

J., and Hendrickson, W. A.(1999)Probability analysis of variational crystallization and its application to 

gp120, the exterior envelope glycoprotein of type 1 human immunodeficiency virus(HIV-1). J. Biol. 

Chem. 274, 4115-2413. 

13. Service, R. F.(2002)Structural genomics. Tapping DNA for structures produces a trickle. Science 298, 

948-950. 

14. 陳金榜,(1994)蛋白質在水溶液中之結構─多維異核核磁共振之應用. 科儀新知, 第十五卷, 第六 

期, 40- 46. 

15. Huang, T. H., Chen, C., and Lin, T. H.(1997)核磁共振光譜學與蛋白質分子水溶液中的結構. 

Chemistry 55, 77-86. 

16. Gardner, K. H., and Kay, L. E.(1998)The use of 2 H, 13 C, 15 N multidimensional NMR to study the 

structure and dynamics of proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27, 357-406. 

17. Riek, R., Pervushin, K., and Wuthrich, K.(2000)TROSY and CRINEPT: NMR with large molecular and 

supramolecular structures in solution. Trends Biochem. Sci. 25, 462-468. 

18. Wuthrich, K.(1986)NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley Interscience, New York. 

19. Zimmerman, D. E., Kulikowski, C. A., Huang, Y., Feng, W., Tashiro, M., Shimotakahara, S., Chien, C., 

Powers, R., and Montelione, G. T.(1997)Automated analysis of protein NMR assignments using 

methods from artificial intelligence. J. Mol. Biol. 269, 592-610. 

20. Nilges, M., Macias, M. J., O'Donoghue, S. I., and Oschkinat, H.( 1997)Automated NOESY 

interpretation with ambiguous distance restraints: the refined NMR solution structure of the pleckstrin 

homology domain from beta-spectrin. J. Mol. Biol. 269, 408-422. 

21. Tjandra, N., and Bax, A.(1997)Direct measurement of distances and angles in biomolecules by NMR in 

a dilute liquid crystalline medium. Science 278, 1111-1114. 

22. Hansen, M. R., Mueller, L., and Pardi, A.(1998)Tunable alignment of macromolecules by filamentous 

phage yields dipolar coupling interactions. Nat. Struct. Biol. 5, 1065-1074. 

23. Thornton, J. M., Todd, A. E., Milburn, D., Borkakoti, N., and Orengo, C. A.(2000)From structure to 

function: approaches and limitations. Nat. Struct. Biol. 7, 991-994.

前言 

第十八章 

蛋白質體學與單株抗體之應用 

Proteomics and Monoclonal Antibody Tool 

國立台灣大學生化科技系微生物與生化學研究所 

莊榮輝,吳裕仁 

228 

第十八章、蛋白質體學與單株抗體之應用 

蛋白質體學的應用,是目前世界上熱門的概念與技術之一,這有其道理 (1) 。因為掌握蛋 

白質體工具,等於多了一項超強的研究武器,可以看到傳統研究方法所無法觀察到的現象。 

這個工具對於生命科學之研究者而言,有如人類之發明輪子,或者發現電力一般重要。另外, 

蛋白質體學不只是一項工具的發明而已,也是整體研究觀念的改變,強迫科學家以整個細胞 

或生物的角度,去重新思考以往的研究問題;觀察角度不一樣,研究結果也會有很大的突破。 

高產能(high-throughput)的概念,是在人類基因體計畫(Human genome project)完成 

後,科學家開始要面對某一生物的全體基因開始的;因為每一個可表現的基因,都會產生其 

所對應的蛋白質,因此也由基因體學(Genomics)衍生了蛋白質體學(Proteomics)這個字, 

開始了蛋白質體學的應用。不論是基因體或蛋白質體,科學家必須處理數量龐大的基因或蛋 

白質,要以高產能的觀念來進行分離或檢定,有別於傳統的單一基因或蛋白質。而在處理數 

量龐大的蛋白質體時,如何快速而正確地檢定一個蛋白質的身分,是一個極關鍵的步驟。到 

目前為止,單株抗體仍是最方便而有效的方法,可以人工的製備流程,產生對目標蛋白質具 

有很高專一性的探針。 

本章首先說明幾個主題觀念:(1)蛋白質體學與二次元電泳;(2)單株抗體的專一性及 

其應用;(3)二次元電泳與免疫轉印的結合。然後提出一種想法,目的是把單株抗體的生產 

流程高產能化,並且配合蛋白質體學的發展與需要,嘗試製備整個蛋白質體中,大部分蛋白 

質的專一性抗體(4),以便應用在蛋白體的快速檢定,以及將來可能的抗體晶片製作(5)。 

若你對製備抗體庫的問題不是很有興趣,可以跳過第(4)部份,直接閱讀抗體庫的可能應用。 

內容 

壹、蛋白質體學與二次元電泳 

要探索一個細胞的全體蛋白質,很難找到完美的方法,因為蛋白質的性質不若核酸均一, 

每種蛋白質都有其自身的特別個性;比較方便而快速的工具就是二次元電泳(two-dimensional 

electrophoresis, 2DE):2DE 把所抽取出來的蛋白質,先後以等電焦集法(IEF)及 SDS-PAGE 

進行分離,所有蛋白質在大約 20 cm 見方的膠片上分散開來,每一色點至少含有一種蛋白質, 

但同一種蛋白質可能會產生數個色點,這是因為蛋白質由基因轉錄後,還要經過各種修飾, 

因此會有許多變貌。 2DE 有許多先天上的缺點,最嚴重的是所看到的色點多寡,可能取決於

229 


抽取或分離方法的不同而有差異,一些微量蛋白質或脂溶性蛋白質不易抽出,因而很容易忽 

略重要蛋白質。雖然如此,2DE 還是比較方便的折衷辦法,但在應用時要謹記其缺陷。 

在收集了不同處理(或突變株)的生物樣本,分別以 2DE 比較其蛋白質體圖譜後,可以 

找出該變化所造成的蛋白質色點消長;這些有差異的色點可以直接挖出,並以蛋白質定序儀 

或質譜儀得知其部份胺基酸序列,配合已知蛋白質資料庫之搜尋與比對,就可得知該蛋白質 

色點的身分(如圖一)。 

Sample 

GCG 

Database 

searching 

蛋白質體可以綜觀蛋白質的消長與身分 

2D electrophoresis 

N- 

Mass spectrum 

Pure protein 

MALDI-TOF 

Amino 

acid 

sequencing 

Proteolytic 

digestion 

Proteolytic fragments 

Capillary 

Electrophoresis 

HPLC 

Juang et al (2002) Enzyme Biochemistry Laboratory 

圖一、蛋白質體工具的圖示流程,說明如何快速檢定出蛋白質的消長與身分。 

若該種生物的基因體已經被解碼,則有另一個檢定方法,就是把這個未知蛋白質 X 挖出 

來之後,先經過專一性的蛋白酶水解成各種長短的胜肽片段,再由間質連結雷射脫附-飛行時 

間質譜儀(MALDI-TOF)得知這些片段的精確分子量;另一方面,在其基因體資料庫中搜尋, 

若某一蛋白質 Y 以同一蛋白酶進行模擬水解,可得到相同的胜肽片段,則可以推斷未知蛋白 

質 X 的可能身分就是 Y (如圖二)。這樣所推得的結果相當可靠,但若你所研究生物的基 

因體還沒有解碼,就無法利用這個方法。 

鑑定得到一系列具有明顯變化的蛋白質,就可串連出可能的代謝或反應途徑,進而解釋 

在生理方面的變化原因。另外,細胞內的任何一個蛋白質,一定與一種以上的蛋白質或其他 

分子,有著交互的作用關係;這種蛋白質與蛋白質間的交互關係,環環相扣成一個巨大的網 

狀關係,並深刻地影響該蛋白質的功能,以及整個細胞生理作用的調節。 

以上所述基因體與蛋白質體的發展,啟動了系統生物學(systems biology)的觀念,科學

230 


家對整體基因或蛋白質體的觀察,可用來探索以前所無法觸及的生理或生化問題。 

Unknown protein 

Protease digestion 

P1 P2 P3 P4 

MALDI-TOF 

MW4 MW2 MW3 MW1 

● 比對各片段分子量可確定該蛋白質身分 

貳、單株抗體的專一性及其應用 

m/z 

Search Database 

Candidate protein 

Digestion Simulation 

Calculate Mol wt 

MW4 MW2 MW3 MW1 

圖二、未知蛋白質先以專一性蛋白酶水解成胜肽片段,再經 MALDI-TOF 質譜儀可 

得知這些片段的精確分子量,與資料庫模擬水解片段比較後可判定其身分。 

自然界有許多專一性的配對分子,例如:兩股 DNA 分子間的鹼基配對、酵素與其基質 

間的結合與催化、各種荷爾蒙與其受體、抗原與其抗體的結合等。其中,抗原與抗體的專一 

性配對,可用人為的設計與免疫操作,在實驗室中取得專一性的抗體;這是目前極少數可用 

人工產生專一性分子探針的方法之一。 

抗體與抗原之間的高度專一性,一直吸引著研究學者的注意力;對於抗原抗體間的專一 

結合關係,免疫學家自百年前已從免疫沈澱法清楚觀察,後來又發展出雙向免疫擴散(double 

diffusion),以及酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),成為免疫 

化學的標準工具。這些免疫工具與方法,到現在都還應用在基礎研究,或產業界的各種檢驗 

及醫療用途上。 

脊椎動物對外來的異物會產生抗體來清除之,這些外來異物稱為抗原,包括細菌或者各 

種巨大分子;尤其蛋白質是相當強的抗原,很容易誘生出專一性抗體。但一個抗體分子只與 

蛋白質分子上的一小段胺基酸鏈結合,大約在六到十來個胺基酸長度,這一小段蛋白稱抗原 

決定基(antigenic determinant 或 epitope)。因此,一個分子量較大的蛋白質,可能有數個抗 

原決定基,可以誘生數種不同的抗體分子,稱為多價抗原(multivalent antigen)。

231 


而在生物體內,是由一種稱為 B 細胞的白血球負責抗體的合成;但是每一個 B 細胞只能 

產生一種抗體,對抗一種抗原決定基。若有一個多價抗原分子,可被宿主生物辨認出四個抗 

原決定基,則此宿主至少會產生四種 B 細胞,產生四種不同的抗體,分別對抗這四個抗原決 

定基(如圖三)。傳統免疫方法所得到的抗血清中,就是含有所有抗體的混合物,因此可以 

有效地與抗原結合,並且很快清除抗原,以維護生物體的健康。 

● 一個 B 細胞只能生產一種抗体,對付某一抗原決定基。 

B 

● 若有許多抗原決定基,則需許多株 B 細胞分別生產許多抗体。 

B 

B 

B 

親和力成熟 

Y 

Y 

Y 

2 

3 

4 

B 

Y 

Y 

Y Y 

抗原 

Y 

圖三、一個 B 細胞只能產生一種抗體,對抗一個特定的抗原決定基。通常蛋白質 

分子上都有很多抗原決定基 (多價抗原),因此會誘生出許多 B 細胞,分別產生專 

一性的抗體。若把其中某一 B 細胞株單離出來,以細胞融合方法產生融合瘤 

(Hybridoma),就可以在培養基中生長,並且產生均一的抗體,稱為單株抗體。 

這種傳統抗血清雖然對抵抗疾病很有效用,但是有一個缺點:若是兩個不同的蛋白質有 

部份相同的胺基酸片段,並且都可以誘生抗體,則此抗血清會同時辨認這兩個蛋白質;由其 

中之一個蛋白質所誘生的抗血清,會與另外一個蛋白質有免疫反應,稱之為交叉反應 

(cross-reactivity)。 

若想像把抗血清中的每一種抗體都分離開來,以單一種抗體對抗原分子上的抗原決定基 

進行偵測,就可避開交叉反應的問題。同時,已知每一種 B 細胞都只能生產一種抗體,因此 

若能夠挑出所要的 B 細胞,大量培養後令其產生均質的抗體,就能達成上述目的。而這種 

抗體因為是由單一株 B 細胞所生產,也只含有一種抗體,稱之為單株抗體(monoclonal 

antibody, mAb) (2) 。此關鍵技術是一九八○年代,由 Kohler 與 Milstein 兩位科學家在英國劍 

橋大學所研發,往後數十年無論在基礎研究或醫學應用上都有很大貢獻,也一起獲得諾貝爾 

獎(1984 年)。 

3 

1 

2 

4 

1

232 


他們最重大的突破,就是發展出 B 細胞與骨髓癌細胞融合的方法。因為一般的 B 細胞無 

法在培養皿中活太久,因此不能如上述大量培養 B 細胞;而骨髓癌是一種淋巴癌細胞,與 B 

細胞的背景相似,並且可以在培養皿中永久繼代下去,具有長生不死的特性。若將這兩種細 

胞混合,並以化學試劑聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)誘導其相互融合,兩組染色體混 

合之後可能產生重組,當細胞分裂數次之後,染色體數目回復正常,將可能有子代細胞同時 

兼具分泌抗體及長生不死兩種特性,稱為融合瘤(hybridoma)。 

單株抗體與傳統抗血清在應用上,有些不一樣的地方:(1)單株抗體是由已經建立的融 

合瘤細胞所生產,因此只要細胞株存在,就可以一直生產該抗體,可以視為一種固定的試劑, 

不像靠動物生產的傳統抗血清,隨著動物個體不同會有變化;(2)單株抗體因為只含有一種 

抗體,無法像傳統血清一樣,與抗原產生免疫沈澱,因此雙向免疫擴散也無法產生沈澱線; 

(3)基於同樣的理由,加上單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處,因此整體的結合力量 

可能不如傳統抗血清;(4)但單株抗體的專一性較好,且可控制所要對抗的抗原決定基位置。 

當許多蛋白質的基因解碼後,其胺基酸序列得以順利推知,並且預測其分子上的抗原決 

定基;近年來也因此流行一種方法,先選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段,大約 

有十到二十個胺基酸的長度,再以人工方法合成出這條胜肽後,接到無關的巨分子蛋白質 

carrier,然後免疫動物產生傳統的抗血清。這種抗血清因為只會對抗一段很短的蛋白質片段, 

有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性,特稱之為單專一性抗體(monospecific Ab)。 

另外,當基因操作技術發達之後,發展出噬菌體表現(phage display)的方法,期以取代 

傳統的細胞融合方法,以便得到類似單株抗體的專一性探針。這是利用噬菌體的外殼蛋白基 

因為架構,插入抗體基因上與抗原結合區的部份(variable regions 或 domains),然後利用基 

因洗牌方式任意修改這段基因,建立一個噬菌體基因庫並由其中篩選,找出可以表現對抗原 

具有高專一性結合的噬菌體。這種方法相當吸引人,因為可用人為的方法達成在細胞內所進 

行的免疫確認反應,同時若篩得此一噬菌體,可馬上取出這段具有高專一性結合的基因,經 

修飾之後應用為人體的免疫治療試劑。 

參、二次元電泳與免疫轉印的結合 

雖然蛋白質體『幾乎』可以讓研究者看到了全體蛋白質,但是其中最重要、也最困難的 

工作,就是如何去檢定每一個獨立蛋白質,乃目前蛋白質體研究的主要挑戰。每一個挑出來 

的蛋白質色點,可以用蛋白質定序儀去定序,或者用質譜儀去檢定蛋白質片段,再以電腦資 

料庫比對該色點的身分;這個程序是目前蛋白質體學的標準流程,雖然很麻煩,但也是不得 

已。 

如上一段所言,單株抗體是目前少數可以用人工操作,製備得專一性探針的方法。假如, 

蛋白質體中的每一個蛋白質,都有其專一性的抗體,則利用蛋白質轉印與免疫染色技術,就 

可以很快得知目標色點的身分,可說是極為方便且快速。

A 

Starch 

phosphorylase 

(enzyme activity) 

B 

C 

Starch 

phosphorylase 

(mAb detection) 

未出土竹筍 → 出土竹筍 

未出土竹筍出土 60 cm 竹筍 

233 


圖四、抗體把複雜的二次元電泳圖譜簡化,清楚顯現所要追蹤的目標蛋白質色點。 

(A)竹筍生長過程中,starch phosphorylase 活性顯著下降;(B)用二次元電泳追 

蹤這個過程的蛋白質體變化,色點很多而複雜;(C)若以 starch phosphorylase 的 

抗體進行專一性染色,則可以清楚分辨其消長情形。 

圖四舉出一個明顯的例子,以二次元電泳觀察竹筍快速生長過程中,其蛋白質體的變化。 

雖然二次元電泳圖譜顯示,竹筍在出土前後的蛋白質體的確有相當大的變化 (如圖四 B),但 

這些色點的身分與確實的消長情形,實在難以清楚辨認。若以一個已知的蛋白質澱粉磷解酶 

(starch phosphorylase)為探索目標,發現在竹筍快速生長過程中,其活性也跟著下降 (如圖 

四 A)。若有此酵素的抗體,並對上述二次元電泳進行免疫染色,先把跑好的膠片轉印到尼 

龍紙上,再用抗體為探針去抓出其目標抗原,由圖四 C 發現未出土竹筍的確有 starch 

phosphorylase 存在,而成長後的竹筍則完全看不到,與圖四 A 的觀察完全符合。 

因此,在進行蛋白質體學研究的同時,若能夠生產對抗全部或大部分蛋白質的抗體,則 

對於檢定目標蛋白質的消長,將有極為關鍵性的效果。然而專一性抗體的製作,到目前為止, 

是相當困難而麻煩的工作,尤其是單株抗體的製作流程更可能長達一年,且通常每次只能處 

理一個均質蛋白質,而純化均質蛋白質則可能是一件更艱鉅的事。 

硝 

酸 

銀 

染 

色 

免 

疫 

染 

色

肆、建立蛋白質體的抗體庫 

234 


因應蛋白質體的發展與需要,漸漸形成了以高產能方式,生產抗體的想法,希望能夠以 

整個蛋白質體為對象,製備每一蛋白質色點的抗體,組成一個抗體庫(antibody bank)。而 

這種蛋白質體抗體(proteomic Ab)的產生方式,剛好可以應用單株抗體的製備特點,儘可能 

挑出所有可生產抗體的細胞株,同時也不用去純化每一個蛋白質。 

基本上是利用免疫學『一個 B 細胞只產生一種抗體』的基礎原理,把整個蛋白質體一次 

免疫,然後挑出所有可以對抗此蛋白質體中,任何一個抗原的 B 細胞,確認單株化建立穩定 

的細胞株後,可生產對應的專一性抗體。理論上,此一想法應該可行,但事實上可能有許多 

操作上的困難度。預計在學理上主要的問題可能有以下三端: 

一、整個蛋白質體中的每個蛋白質,其含量多寡不一,若要同時免疫,勢必有些抗原免疫量 

較大;而那些含量少者,免疫量也較少。 

二、整個蛋白質體中的每個蛋白質,其抗原性強弱不一,抗原性強的比較容易誘生抗體,反 

之則不易。對胺基酸序列同質性高的蛋白質,則可能根本無法誘生抗體。 

三、目標蛋白質體中所含的各蛋白質成員,是否確實代表整個蛋白質體? 或只是其中的一部 

份? 

第三個問題是所有蛋白質體研究的共同問題,目前暫時不去考量,儘量跟隨學術界認可 

的條件進行。至於前面兩個問題,其實都與細胞免疫反應有關,倒是可以一起處理。這兩個 

問題的相同困擾,就是單單一次免疫以及接下來的細胞融合,可能無法拿到所有蛋白質的抗 

體;因為含量少或者抗原性差的蛋白質,預料無法順利誘生抗體。 

為了解決此問題,設計了一個方案(如圖五),把蛋白質依照抗原性的強弱分成三類, 

希望能夠經過三次連續的免疫與細胞融合流程,就能夠收到大部分蛋白質的專一性單株抗體 

(期望達八成以上)。在得到第一階段抗體庫後,做成親和吸著劑,把原來的蛋白質體通過 

此吸著劑,收集未吸附的蛋白質後,以 2DE 及免疫染色法檢查其蛋白質圖譜,再進行第二次 

免疫及細胞融合流程,製備第二階段抗體庫;再如法吸附中等抗原性蛋白質後,進行第三次 

免疫及融合。預定如此應可製備得 80%以上蛋白質的抗體,若尚有重要蛋白質沒有得到抗 

體,可在 2DE 上挖出色點,單一或混合幾個蛋白質,再進行一次免疫及融合。 

至於另一個問題,就是蛋白質含量的多寡不同,預期上面的方案可以同時解決。也就是 

在第二或第三次融合時,樣本已經吸收掉較高抗原性蛋白質,便可提高整體抗原的量,以便 

呈現低含量的蛋白質。

篩選抗體的問題 

蛋白質體 

免疫 

第一次 

細胞融合 

細胞篩選 

單株抗體庫 

I 

親和管柱 

I 

未吸附部份 

第二次 

免疫及融合 


II 

235 


親和管柱 

II 

未吸附部份 

第三次 

免疫及融合 


III 

圖五、以蛋白質體製備全部抗體的流程,依抗原性的強弱可分成三個階段,得到第 

一階段抗體庫後,製成親和吸著劑去除對應抗原,未吸附部份再進行下一波融合。 

篩選生產專一性抗體的細胞株時,通常都使用 ELISA,先在 ELISA plate 上吸附抗原分 

子,再利用此抗原為釣餌。若融合細胞產生了專一性抗體,就會結合到 ELISA plate 上所吸附 

的抗原,然後再以二次抗體來檢測(如圖六);二次抗體是可以辨認小白鼠抗體的抗體,通 

常都由另一種動物獲得(例如山羊對抗小白鼠抗體的抗體),二次抗體上面並連接有追蹤的 

酵素或螢光,以方便偵測。吸附在 ELISA plate 上的抗原要使用均質蛋白質,才能產生有效率 

的專一性辨認;但是因為我們免疫的抗原是整個蛋白質體,因此也要以整個混合的蛋白質進 

行吸附,如此將使得 ELISA 的篩選產生嚴重的缺陷,只能篩選到含量較大的抗原,一些含量 

較少者將不易被挑選出來,將會加劇上面所提出來的問題(蛋白質含量少、抗原性弱)。 

可能的解決方法之一,就是在第一次篩選時,就使用一次元蛋白質電泳轉印及免疫染色, 

而不用較簡便的 ELISA。這將使篩選工作變成極為繁重,也必須設計高產能的篩選方式或自 

動化流程。然而也有其好處,就是可以很快在一次元電泳圖譜上,大致辨認出抗體所結合的 

色帶位置,有助於篩選出較為多樣的抗體,不會只挑出一些對抗相同抗原的抗體。 

若某一蛋白質體在 2DE 電泳片上有 1,000 個色點,因為一種蛋白質可能不只產生一個色 

點,預估可能有 300 種蛋白質,則至少產生 300 株抗體。但因為上述之抗原性強弱不同,或 

者含量多寡的關係,並非所有抗體都會一起誘生,預估三分之一的話,大約應可篩到 100 株

236 


抗體,但又因為同一蛋白質可能會選到數個不同的細胞株,因此全數可能高達 200 至 300 株 

細胞,全都要在 2DE 電泳片上驗明其專一性,這是更為繁重的工作。有一個可能的方便做法 

是重複使用 2DE 轉印紙,在以第一種抗體染色後,先畫下色點的位置,再繼續進行第二種抗 

體的染色,如此進行下去,應該有個使用極限。最好使用化學螢光呈色方法,避免對抗原蛋 

白質的破壞。 

酵素呈色加入基質 

不相關抗體 

另外,為了降低整體工作量,有一個策略是省去『單株化 subcloning』步驟。單株化是在 

挑出所要的細胞株之後,再以『限數稀釋法 limiting dilution』把細胞分散,使得每一個培養 

槽只有一個細胞,則由此單一細胞繁殖出來的細胞,就只含有均一化的純系細胞;否則,可 

能夾雜著不同的細胞株,也就不是單株抗體了。為了可以減少單株化的必要性,在剛融合完 

成後的細胞,必須分布在更多的培養盤中,希望以後所挑出來的細胞儘可能都已經是單株的 

狀況。對於重要的抗體,或者懷疑並非單株,可以個別再進行單株化的步驟。 

免疫(Immunization)反應先導實驗 

連結酵素 

二次抗體 

抗原 

ELISA Plate 固相擔體 

一個有用的先導實驗,可能成為抗體庫製備的必要程序。就是在以目標蛋白質體對小白 

鼠進行免疫時,先收集各時期的抗血清,分別對 2DE 圖譜進行免疫染色,觀察所能產生抗體 

的強度與種類。圖七說明此一過程,在免疫一個月後,各蛋白質漸漸開始產生抗體,並且隨 

著免疫期間的長短,會有不太相同的免疫反應。也許可以混合兩種不同免疫期間的小白鼠 B 

E 

2 

專一性抗體 

圖六、以酵素免疫分析法(ELISA)來檢定細胞株是否生產有專一性的抗體。若樣 

本中含有專一性抗體,就會與固相擔體上的抗原結合,否則會被洗掉(不相關抗體); 

再用二次抗體去結合此專一性抗體,觀察所連結的酵素活性呈色即可偵測。

237 


細胞,同時進行細胞融合,以節省篩選工作與時間。另外,圖七顯示ㄧ次免疫流程無法得到 

所有色點的抗體,因此圖五的階段式免疫及融合流程確屬必要。 

Silver staining 

Pre-immune serum One-month serum 

Six-week serum Two-month serum 

圖七、以竹筍的整體蛋白質為抗原免疫小白鼠,在一個月後漸漸產生抗體;在不同 

的免疫期間,可能會有不同的抗體產生。 

伍、蛋白質體抗體庫的可能應用(Antibody bank application) 

得到某一蛋白質體的抗體庫之後,將可試著應用在種種生理現象的探討,這也是最令人 

期待的時刻。以竹筍抗體庫為例,其中最具學術價值的,是將此抗體庫配合蛋白質體學的整 

體性檢定,觀察綠竹開花前後的變化情形,或可推出竹子開花的分子機制。由於竹子開花不 

定期,且一旦開花則整片竹林全部一起開花,開完花後很快就凋謝死亡,因此誘導竹子開花 

的機制,一直是科學界未解的謎團。 

當然,使用竹筍的抗體庫可能不很適當,因為竹筍的生長與竹子開花,可能是經由完全 

不同的機制。但是,相信有很多的代謝途徑是共用的,可以觀察得某些消長情形。另一方面, 

我們也可以找出在竹子開花前後,含量具有顯著增加,但無法被本抗體庫所辨認的蛋白質(扣 

除法),再以胺基酸定序或質譜儀判定此一未知蛋白質,則可突顯出與開花相關的關鍵性蛋 

白質。這些研究方式都還是要配合著蛋白質體學的觀念與工具進行。 

蛋白質體的抗體庫一旦建立,很快就可以應用到抗體晶片(anitbody chip)的製造 (3) 。把 

全數抗體一個一個點在固相玻片上,並確定抗體可與其抗原專一性地結合;待測的樣本中若 

含有抗原蛋白質,就會被吸附到晶片的對應抗體上,再以各種方法檢測這些抗體色點。最方

238 


便的方法,是能直接測到抗原與抗體的結合,而不須利用標誌或者呈色反應,例如台大醫工 

所林啟萬教授利用表面電漿子共振(surface plasmon resonance, SPR)就可直接感應到抗體是 

否已經與抗原分子結合。 

另外,若樣本中的全體蛋白質可以用螢光分子標幟上去,且不影響其抗原性,則可用為 

上述抗體晶片的直接檢測。更可使用兩種不同顏色的螢光標幟物,分別標示兩個待比較的蛋 

白質體樣本,分別進入抗體晶片進行結合,再比較兩個晶片上螢光色點的差異,即可清楚辨 

認出蛋白質體的消長情形。 

所有這些應用,都還籠罩著一個隱憂,就是所得到的抗體庫是否完整。但這是取決於生 

物細胞的基因表現程度、蛋白質體的抽取方式,以及 2DE 圖譜的顯像能力,是目前所無法避 

免的根本性弱點。雖然如此,我們只要得到大多數蛋白質的抗體,就已經足夠以現有的方法 

與技術,由蛋白質體中觀察到很多有趣的生命現象。 

結語 

二次元電泳是研究蛋白質體的重要工具之一,可以方便解析細胞中的各種蛋白質,但所 

染出來的複雜蛋白質圖譜,通常都不太容易解讀。單株抗體是由人工製備所得到的專一性探 

針,可在複雜的二次元蛋白質圖譜,清楚地染出其所對抗的抗原蛋白質。這些能力使得二次 

元電泳加上免疫轉印法,成為解析蛋白質體極為有用的利器。 

參考文獻 

1. Proteomics, Nature Insight(2003)Nature 422, 191-237. 

2. Monocloanl Antibody(2003)http://ccms.ntu.edu.tw/~juang/ECX/monoclonal.htm. 

3. Huang, R. P.(2001)Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system. J 

Immunol Methods 255, 1-13.

內容 

壹、蛋白質體學(Proteomics)的定義 

第十九章 

蛋白質體學與基因醫學 

Proteomics and Genomics 

國立陽明大學免疫學研究中心主任 

謝世良 

239 

第十九章、蛋白質體學與基因醫學 

”基因醫學”(Genomic medicine),或稱為”功能性基因體學”(Functional Genomics),包 

含的範圍甚廣,然而蛋白質體學(Proteomics)無疑是近年來發展最快速的領域之一。蛋白質 

體學(Proteomics)一詞始自 1970 年代,意味著以二維的膠體(two-dimensional poly-acrylamide 

gel or 2D-PAGE)來展現某一特定的細胞或組織內為數眾多的蛋白質,並將這些資料整理,貯 

存於資料庫以供比對。雖然不同的實驗室可以同樣的 2D-PAGE 來展現細胞內的蛋白質並與資 

料庫的其它 2D-PAGE 比對,但當時缺乏靈敏及快速的分析方法來確認 2D-PAGE 上的蛋白質。 

相反的當時基因體學研究已可利用鏈聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)來增 

殖微量的 DNA,並以 DNA 自動定序儀來確定 DNA 的序列,因此在 1980 年代蛋白質體學的 

研究方式受到很大的限制。到了 1990 年代,供生物學研究用的質譜儀(mass spectrometry) 

逐漸浮現,並成為一個強而有力的分析工具,掃除過去因蛋白質量少而無法分析的限制。此 

項發展,再加上公用資料庫(public domain database)已有的基因序列,使蛋白質體學進展到 

一個全新的年代。今日蛋白質體學的定義,幾乎包含了”功能性基因體學”的大部分領域,如 

大規模的蛋白質確認,蛋白質在細胞內分布的定位,及以 yeast two-hybrid 系統為基礎的蛋白 

質與蛋白質間的交互作用(interaction)(如表一)。 

貳、為什麼需要蛋白質體學(Proteomics)研究 

基因體學研究累積了無數的基因的序列於資料庫中,研究者也逐漸發現光靠 DNA 的序 

列並無法闡明複雜的生物現象,因為細胞的功能決定於蛋白質的表現及轉譯後的修飾 

(post-translational modification)(如表二),而非僅於 mRNA 的表現。蛋白質體學研究恰可 

彌補基因體學研究的不足,可幫助我們研究及瞭解複雜的生物反應。 

基因庫中的 open reading frame(ORF)並不表示一定存在一個對等功能的基因,因為多 

數的 ORFs 是藉由電腦預測的,尚未經實驗證實。因此以蛋白質體學來驗證基因的 ORF 是否 

確實可製造出蛋白質,是瞭解資料庫中無數基因功能的第一步。此外無數的 post-translational 

修飾(如表二),也只能由蛋白質體學研究才能知悉。此外 cDNA 表現的量與蛋白質表現量 

常不一致,因此蛋白質體學的發展是功能性基因體學最重要且不可或缺的一環。

240 


參、基因體學(Genomics)與蛋白質體學(Proteomics)研究的聯結 

探究細胞的功能,基因體學及蛋白質體學研究是彼此互補的,因此有必要將二者聯結(如 

圖一),下列是目前功能性基因體學學研究的幾個步驟: 

一、生產 cDNA expression library 以供 DNA 晶片製作 

估計的人類基因的數目大約為 30000 至 40000 左右(2001 年 2 月 15 日公布)。多數的 cDNA 

片段序列也已貯存在 EST 的資料庫(dbEST),但只有少數的 EST 其基因所轉釋的蛋白功能 

已被確定。在 2002 年 11 月 8 日公布的資料顯示人類基因體學的 EST 總數為 4,875,855 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)相當於 UniGene 上 121,062 clusters(2002 年 9 

月 28 日公布),其中只有 13,407 的 EST 之相對的基因功能被確認。最直接了當的方法來解決 

此問題,是找出某一組織的功能狀態與基因表現的相關性。研究基因表現情形的方法可利用: 

(1)serial analysis of gene expression(SAGE);(2)將 oligonucleotide 或 cDNA 定在尼龍膜 

及玻片上製成微陣列晶片(microarray chip)。此 2 種方式可快速比較正常人與病人或處於不 

同狀況下的細胞,其 mRNA 表現上的差異。 

圖一 

Genomics 

Gene Engineering; 

Site-specific, Homologous 

Recombination; 

Transposition 

Cis & trans splicing; 

Co-, post-Transcriptional 

RNA Editing; 

Ribosomal Frameshifting 

Post-translational 

Modification; 

Protein Splicing 

DNA 

Genomes 

mRNA 

Transcriptomes 

Protein 

Proteomes 

Full Length Genes 

Bioinfomatics 

Data Analysis 

Array Scanner 

Probe Hybridization 

Target Preparation 

Mass Analysis 

Peptide Sequencing 

2D Electrophoresis 

Proteomics

241 


二、將 cDNA expression library 以 E. coli 表現其蛋白以供蛋白質晶片製作 

蛋白質是 DNA 密碼轉譯的產物,以執行特定的功能。由於為數眾多的蛋白質參與細胞 

的 homeostasis,因此需要一套快速分析的方法以篩選出表現量具有差異的蛋白質。蛋白質晶 

片上每一點的含量介於 150uM 至 450uM,每一玻片約可點上 4800 點檢體,因此以微量的試 

劑即可篩選出表現有差異的蛋白質;每一個點的偵測敏感度約為 250 attomol 或 10pg。蛋白質 

微陣列不但可以研究基因表現的情形,亦可從整個基因體學層面來篩選與其互相作用 

(interaction)的蛋白質,因此可將 cDNA library 中的 cDNA 序列與其潛在的生物功能相聯結, 

例如藉由研究 ligand-receptor 之交互作用以探究蛋白質的潛在功能。此外,微陣列上的蛋白, 

可用 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry(MALDI-MS)分析以製作 

MPI(minimal protein identifier)目錄(如圖二),如此即可將高密度的蛋白微陣列與 2D-PAGE 

的分析結果加以連結。 

Gene Expression Analysis Protein Analysis 

Microarray / total mRNA 2D Electrophoresis / total protein 

PCR MALDI-MS 

Unigene 

Uniprotein 

Set 

MALDI-MS 

圖二、以 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry(MALDI-MS)分析製 

作 MPI(minimal protein identifier)目錄的流程

242 


三、以高解析度 2D-PAGE 分析某一細胞株或組織的蛋白表現情形 

每一個細胞內所含的 DNA 含量是相同的,但不同的細胞內所表現的蛋白質差異極大, 

若將基因體學比喻成靜置的貯存所,蛋白質體學的變化卻是非常活躍,依生理狀態及發育狀 

態的不同其表現也相異。這對以系統化的分析來探究細胞的蛋白質表現情形的科學家是一項 

巨大的對戰,因為同一細胞可因外在因素的微細變化,而導致蛋白質表現量及分布上的巨大 

改變,或因不同的時間點內收集之檢體而產生差異。 

一片高析度的 2D-PAGE 可顯示出 10,000 點,若想研究含量稀少的蛋白,則必需先將其 

所在的胞器(organelle)純化(enrichment)再以 2D-PAGE 分析。在 2D-PAGE 上的蛋白質可 

以切割下來,並以酵素分解成為小的胜肽(peptide)後,以質譜儀(mass spectrometry)分析, 

每一個點經 MALDI-MS 分析的結果會產生一個對應的 MPI 資料,並將它貯存於資料庫中。 

由 expression library 得到的 MPI 資料,可與 mRNA 互相對照,找出彼此的相關性,將來就可 

以 MPI 的資訊推斷在 2D-PAGE 上的點(spot)究竟是那一個蛋白質。從過去的研究顯示利用 

基因體學(genomics)及蛋白質體學所得到的結果相關性並不高,故 MPI 可當成二者之間的 

橋樑,使我們能更正確的分析經由 high throughput 研究方式所得的大量資訊,對細胞的反應 

做出更精準的闡示。 

四、以質譜儀來聯絡目前的蛋白質體學及基因體學學 

將基因體學學與蛋白質體學二者聯絡的策略,可摘要如下:建立一個 Unigene set,將一 

個 gene 所有表現的 mRNA 及 EST 蒐集起來,並以基因工程表現成蛋白質,再以質譜儀決定 

其 MPIs。由 2D-PAGE 所得到的 MPIs,將可以電腦比對由其它 expression library 所得到的 

MPIs。如此,數以千計具有活性的蛋白質即可與其相對應的基因聯結。此方法最大的好處是 

蛋白質的確認(identification)變得更加可信,因為是以 Unigene set 的 MPI 與 2D-PAGE 上蛋 

白質的 MPI 來比對,而不是與經由蛋白質序列所預測的 mass fingerprint 來比較。 

結語 

基因體學學研究在過去十年前已有長足的進度,相關的技術發展也日益成熟,將來的發 

展方向則是朝向 lab on chip 的方向發展。蛋白質體學則是繼起的研究領域,雖然質譜儀、 

2D-PAGE 及染色技術已有長足進度,但因無法展現分子量大的蛋白,仍是一個很大的瓶頸, 

利用 isotope 標示蛋白的 isotope-coded affinity tagging(ICAT)技術,或許可突破 2D-PAGE 的 

限制,提供一個更快速靈敏的方法來研究蛋白質表現的差異性。 

參考文獻 

1. PROTEOMICS: from protein sequence to function, edited by S R PENNINGTON & M J DUNN, BIOS 

Scientific Publishers Limited 2001, ISBN 0-387-91589-3 Springer-Verlag, New York Berlin Heidelberg 

2. Proteome Research: Mass Spectrometry, edited by P James, SBN 3-540-67256-7 Springer-Verlag, Berlin

Heidelberg New York 

243 


3. Pandey, A., and Mann, M.(2000)Protomics to study genes an genomes. Nature. 405, 837. 

表一、蛋白質體學(Proteomics)的定義 

Proteomics-the classical definition 

Two-dimensional gels of cell lysates and annotation 

Two-dimensional gels to visualize differential protein expression 

Proteomics-in the post-genomics era 

Protein identification: 

One-dimensional gels (for example, analysis after affinity 

Purification) 

Two-dimensional gels (for example, analysis after affinity 

Purification, body fluids, etc.) 

Protein chips (chips coated with, for example, proteins or 

antibodies) 

Proteins/protein complexes in solution (identification without 

Electrophoresis) 

Post-translational modifications 

Phosphorylation 

Glycosylation 

Determining Function 

Assays for enzymatic activity or determining substrates 75 

Bioassays for cytokines, receptor/ligand-binding assays 

Localization within the cells (GFP fusions) 

Proteomic analysis using large-scale mouse knockouts 76 

or RNA ingerference 77 

Phenotypics analysis using deletion strains 78 

Molecular Medicine (no longer just pharmaceuticals) 

Finding molecular (protein) drug targets 

Disrupting protein-protein interactions using drugs 

Large-scale animal assays for recombinant proteins, 

Antibodies and inhibitors 

Differential display by two-dimensional gels (superseded by 

DNA-based array in many situations) 

Limited applications in: 

Body fluids (for example, serum and urine) 

Variants resulting from post-translational modifications 

Protein-protein interaction 

Direct DNA readout 

Yeast two hybrid 

Phage display 

Ribosome display 79 

RNA-peptide fusions 80 

Protein identification 

Affinity purification and mass spectrometry

表二、常見的轉釋後的蛋白修飾 

Carbohydrates 

N-linked oligosaccharides 

O-linked oligosaccharides 

Glycophosphoinositol-lipid anchors 

C-Mannosylation 

Lipids 

Acylation 

Palmitylation 

Myristylation 

Farnesylation 

Prenylation 

Geranylgeranylation 

Amino acid modification 

Amidation-deamidation 

Cysteinylation 

Formylation 

Citrullination 

Isoaspartylation 

Detyrosination 

Thioether addition 

Gamma-carboxylation 

Deimidation 

Cross-linking 

Disulfide formation 

Thiolester formation 

Transglutamylation 

Small adducts 

Phosphorylation 

Sulfation 

Nitration 

Acetylation 

Formylation 

Methylation 

Oxidation 

Hydroxylation 

Iodination 

Biotinylation 

244 


Miscellaneous 

Complex formation (noncovalent or covalent) 

Polymerization, Conformational changes, Folding into different forms, Proteolytic cleavages, 

Ubiquitinylation

附錄: Web addresses for a selection of sequence databases and analyses tools 

Website 

ensembl.ebi.ac.uk 

genome.wustl.edu/gsc/ 

www.hgmp.mrc.ac.uk/ 

www.hgsc.bcm.tmc.edu/ 

wit.integratedgenomics.com/ 

GOLD 

www.jgi.doe.gov/ 

star.sci.genome.ad.jp/kepp 

www.ornl.gov/hdmis/ 

www.ncbi.nim.nih.gov/genome/ 

seq/ 

www.sanger.ac.uk/ 

www.tigr.org/tdb/ 

snp.cshl.org 

www-genome.wi.mit.edu/ 

註 1:EST:expressed sequence tag 

註 2:SNP:single nucleotide polymorphism 

Organization 

European Molecular Biology 

Laboratory, Heidelberg,Germany/ 

Sanger Centre,Cambridge,UK 

Genome Sequencing Center, 

Washington University School of 

Medicine, St. Louis, USA 

Human Genome Mapping Project 

Resource Centre, Wellcome Trust 

Genome Campus, Cambridge,UK 

Human Genome Sequencing 

Center, Baylor College of Medicine, 

Houston, Texas, USA 

Integrated Genomics Inc.,Chicago, 

lllinois, USA 

Joint Genome Institute, Walnut 

Creek, California, USA 

Kyoto Encyclopaedia of Genes and 

Genomes, Institute for Chemical 

Research, Kyoto University, Japan 

Life Sciences Division, Department 

of Energy, Oak Ridge National 

Laboratory, Tennessee, USA 

National Center for Biotechnoloogy 

Information, National Institutes of 

Health, Bethesda, Maryland, USA 

Sanger Centre, Wellcome Trust 

Genome Campus, Cambridge, UK 

The Institute for Genome Research, 

Rockville, MD,USA 

The SNP Consortium Ltd., Cold 

Spring Harbour Laboratory, Cold 

Spring Harbour, New York, USA 

Whitehead Institute Center for 

Genome Reasearch, Cambridge, 

Massachusetts, USA 

245 


Information available 

人類、老鼠和蚯蚓之基因 

注解 

人類和典型有機生物體序 

列說明,EST(注 1)說明、 

步驟和技術支援 

序列資料庫和搜尋引擎, 

系統發育的連結分析,相 

關連結 

人類、老鼠和果蠅的序列 

說明,人類基因轉錄資料 

庫 

包括已完成和正在進行之 

基因體計畫,以及相關連 

結和發表 

人類和微生物序列及基因 

圖譜,功能性基因體計劃 

序列資料庫以及目前分子 

間相互作用資訊 

進度報告、目前發表、會 

議記錄等連結,特別是人 

類基因體計劃 

序列、SNP(注 2)和文獻資 

料庫,資料採集工具,人 

類和老鼠基因性及物理性 

圖譜 

人類基因體及其他原核和真 

核生物的基因體解序計劃之 

進度 

微生物、植物和人類之序列、 

功能及分類學資料庫 

人類基因體之 SNP 圖譜 

人類、小鼠和大鼠的基因性 

及物理性基因圖譜,以及人 

類 SNP 資料庫

前言 

第二十章 

蛋白質體學於癌症研究之應用 

Proteomic Approaches in Cancer Research 

長庚大學中醫系 

潘台龍 

246 

第二十章、蛋白質體學於癌症研究之應用 

癌症是人類健康的大敵,長期以來不論中外相關研究皆非常蓬勃。雖然癌症分子生物學 

及癌症發生基因變化這兩大領域已有極大的進展;但對於癌症診斷及治療仍存在很多瓶頸。 

本章將以蛋白質體學(proteomics)觀點並透過腫瘤血清或組織的研究來探討未知的生物標記 

及其應用於早期癌症的診斷、治療與生物醫學上的方向,同時比較與其他研究方式之差異點。 

希望從蛋白質的角度切入且發展出癌症治療的標的;除了提供一個癌症診治的平台外,也能 

開創一個全新的蛋白質生物技術領域 (1) (如圖一)。 

研究基礎細胞功能與分子組成 

診斷及偵測疾病之分子標記研發 

新藥與生物活性分子研發 

探索藥理作用及毒性機制 

圖一、蛋白體學於臨床醫學之應用(Amersham Bioscience) 

病理生理之研究 

個體表現型預測治療反應 

發現新藥標的物 

分子解剖遺傳或藥理的混亂

內容 

壹、癌症研究與基因醫學 

247 


一、簡介 

藉由病理檢驗雖不難判定出腫瘤屬性;然而,癌症在臨床診斷上的錯誤仍時有所聞且造 

成相當嚴重的後果。此外,各種癌症的癒後、癌細胞是否轉移(metastasis)至其他器官甚或 

療程的設計等相關重要議題需要有效率及更準確地偵測方式 (2) 。 

針對不同癌細胞種類及病患的抗癌治療各別差異性極大,評估癌細胞轉移可能性或用藥 

效果等不易僅由簡單的染色病理切片解讀;因此,為了成功治癒癌症勢必需要更多詳細的資 

訊例如:控制細胞生長的基因表現、控制生長的基因突變,或是轉移及抗藥性的程度等。蛋 

白質體分析即提供一種為定義腫瘤診斷標誌有效的方式。另外,蛋白質體學同時具有解開基 

本腫瘤生物學疑問之相關癌症病理機制的潛力。本單元主要探討腫瘤之蛋白質體學分析特別 

是人類腫瘤蛋白質的表現情形,希望對所有讀者有些許助益。 

(一) 腫瘤發生(Tumourgenesis) 

約有 90%人類癌症為源自表皮細胞的惡性腫瘤,而大部分表皮細胞腫瘤不論是在生物性 

或臨床表現上皆呈現很高的異質性。若能了解癌細胞的發展及演進將有助於診斷與治療。一 

般而言; 癌細胞的形成是因控制細胞分裂的正常調控機制失去作用所導致。腫瘤發生屬於「多 

步驟」程序且與突變及其他造成「增加顯性前致癌基因活動」或「失去腫瘤抑制基因功能」 

之基因事件有關。在腫瘤細胞癌化的過程中,達爾文天擇論確實發生;因基因突變累積導致 

細胞週期的調節失去控制,且細胞自體凋亡(apoptosis)的能力降低,此外,細胞浸潤入侵 

周圍組織的能力則大幅增加並造成遠端部位的轉移。控制細胞週期、凋亡及轉移特性的機制 

十分繁雜,也有很多的分子參與這些過程,從腫瘤診斷的觀點而言;這種複雜性使得鎖定某 

些分子作為探討癌症相關議題目標變得相當困難,無法保有其完整性。致癌基因的前身為「前 

致癌基因」(proto-oncogene),可歸類為一種正常基因的型態,此種基因往往控制正常細胞的 

生長和分化。在大多數情況下,這些前致癌基因的蛋白質產物與細胞訊息傳遞(signal 

transduction)過程有密切關連。在這些前致癌基因蛋白質產物中;有些屬於生長因子(growth 

factor)或其受器(如 c-sis, c-erbB, c-Met)、小型 G 蛋白(如 c-Ras)、蛋白質磷酸脢(如 c-Raf), 

或是核內轉錄因子(如 c-Fos, c-Jun)等。當前致癌基因因突變、轉位、刪除或因放大作用而 

改變導致功能增加時將使細胞訊息形成無法控制的狀態。反之,腫瘤抑制基因蛋白質產物通 

常與抑制細胞增生(cell proliferation)相關。 

目前最常被研究的腫瘤抑制基因為 p53,位於人類第十七對染色體的短臂上; 人類癌症 

中最常被提及的基因改變即為 p53 基因的變異。細胞內的去氧核醣核酸一旦受到破壞,接下 

來 p53 基因會被磷酸根修飾而更穩定其蛋白質產量大量上升;p21Cip1 基因被 p53 活化製造 

週期激脢抑制蛋白(cyclin kinase inhibitor)阻斷了細胞週期增生過程。如此複雜機制如果用 

傳統分析方法可能落於瞎子摸象的窘境,為全面顧及致病機轉及訊號傳遞之路徑,微陣列晶 

(microarray)片及二維電泳(two-dimensional electrophoresis)正可提供解開此複雜機轉;然

248 


而訊號傳遞需要蛋白質磷酸化(phospharylation)之改變,此磷酸化多寡進而影響癌症誘發, 

所以二維電泳較能提供更多資訊分析癌症病症與早晚期。 

(二) 腫瘤標記(Tumor markers) 

由於癌細胞的發生原因複雜且多樣;因此對治療的反應與效果有很大的差異,若能結合 

各種腫瘤特有的腫瘤標記;將可有效預測其生物特性;尤其是若能清楚分辨腫瘤診斷、篩檢 

或預期的標記更能大為提升防癌和治療效果。診斷標記(diagnostic marker)可用於幫助組織 

病理學的分類,這將有助於決定最有利的治療手段。篩檢標記包含各種生化指數例如:荷爾 

蒙受體、細胞增生標記、蛋白脢及血管新生指數標記等等;這些項目常被視為一般癌症診斷 

的指標,因為上述標記與腫瘤惡性化有關;因此可用於癌症細胞的檢測及臨床醫師選擇治療 

方式的參考依據 (3) 。最佳的癌症治療效果並非來自於強烈的細胞毒殺藥;因為這些藥常導致 

極端的副作用,而是使用癌症病患可以接受的處方為佳。至於預期標記則提供選擇不同治療 

模式的數據,例如:雌激素受體呈陽性的乳癌病患以抗雌激素(tamoxifen)治療;反之,雌 

激素受體呈陰性的患者則以化療為主。總言之,只要有足夠的診斷和篩檢標記數據就可從其 

中一窺治療的可能結果,達到治療癌症的最佳效果。 

(三) 表現基因學(Expression genetics) 

以比較篩選癌細胞基因表現方式鑑定癌症相關基因的學門被統稱為「表現基因學」。在腫 

瘤發生的過程中可鑑別出基因表現的變化;即可界定治療癌症的基因目標或指標。在哺乳動 

物中正確的蛋白質產物數目尚未完全得知,目前已有超過一百萬個人類表現序列標籤(EST) 

序列發表並刊登於公共資料庫中,由於基因重複(redundancy)原則可知真正的蛋白質產物 

數目遠小於這個數字;但約有超過十萬個人類表現基因是不爭的事實。由於後轉譯修飾作用 

(post-translational modification)使得一個訊息核醣核酸轉錄體(mRNA transcript)得以製造 

一個以上的蛋白質產物,因此,也許有超過一百萬或更多不同的蛋白質在人體內製造出來。 

然而,一個完全分化的細胞只有一部分的基因會表現且很難預測表現的基因比例。現有學說 

假設一個細胞內約有兩萬個基因表現且每個蛋白質產物有至少五種不同的形式,即可產生十 

萬種不同的蛋白質。二維技術的演進;特別是在等電點焦點(isoelectric focusing)時蛋白質 

解析度大增使得分離及分析近一萬個蛋白質變成可能;雖然如此,仍有絕大部分的細胞內蛋 

白質也許因為太微量而無法清楚解析。在癌化過程中,量多的蛋白質所扮演的角色不一定較 

微量蛋白質更為關鍵,因此二維電泳於癌症研究的限制仍是存在的。 

比較蛋白質體系統與訊息核醣核酸表現分析法可知:分析訊息核醣核酸的表現可透過兩 

種方式,其與蛋白質二維電泳技術就可得到的訊息輸出而言極為類似。一種稱為「互補去氧 

核醣核酸基因庫隨機定序法」(random sequencing of cDNA libraries),另一種技術稱為「微陣 

列」(microarrays)。前者可利用自動定序儀快速分析出任意從互補去氧核醣核酸基因庫挑出 

的轉植體(clone)序列並可比較不同基因庫間被定序的轉植體序列光譜;現今有很多公開的 

資料庫可供查詢及比對。截至目前已有來自 156 個互補去氧核醣核酸基因庫的珍貴資料被公 

諸於世。訊息核醣核酸與蛋白質產物在量的比例上出現落差,其原因可能是不同蛋白質的半

249 


衰期(half-life)差異所致,根據學者的研究結果:兩者之間存在某種相關係數。故蛋白質資 

訊仍需透過二維電泳才較為完整;無法直接由訊息核醣核酸的實驗結果得知蛋白質全貌。 

另外,互補去氧核醣核酸微陣列也是一種分析基因表現的有力工具,其做法是將數千個個別 

互補去氧核醣核酸或寡核甘酸(oligonucleotide)點在固定的支撐物(immobilized support)上, 

以被螢光物質標定的細胞互補去氧核醣核酸作探針(probe);這個技術用來研究表現的基因 

群並可確認表現圖譜。最近的文獻提到:微陣列技術可用於探討某些癌症發生時的基因表現, 

這些資訊對癌症生物學而言極為重要。由於對基因資訊與轉錄體(transcript)深入研究使得 

癌症細胞分子改變已能被清楚了解;然而真正控制細胞功能運作的是蛋白質而非去氧核醣核 

酸或核醣核酸。且兩者間因修飾作用無法等量齊觀,例如:基因序列不能闡述蛋白質間的交 

互作用情形,若佐以蛋白質體的資訊更能表現出癌化細胞內真實的情形 (4) 。 

貳、蛋白質體學技術與資料分析 

一、蛋白質體技術(Proteome technology) 

(一) 樣本備製(Sample preparation) 

步驟如下:準備並純化細胞(preparation/purification)、細胞溶解(cell lysis)及溶液均質 

化(solubilization)。為能正確表現腫瘤的蛋白質體分析,所得到的樣本最好只有癌細胞不含 

其他周圍組織如基質細胞、血球或血清。目前已有先進的儀器可幫助擷取純粹的癌細胞排除 

其他非癌細胞或組織。即利用所謂的「雷射擷取微解剖儀」(Laser capture microdissection, 

LCM);此技術使得單一細胞群的蛋白質體研究成為可能,並可直接從冷凍的腫瘤切片取得 

細胞。透過顯微鏡並以紅外線雷射取出目標癌細胞或組織,接下來這些細胞從原附著的薄膜 

上溶解出來直接進行蛋白質分析。此技術不會破壞組織原本的結構還能保持細胞內微小分子 

呈現 in situ 狀態(如圖二)。 

a

250 


圖二、雷射捕捉細胞顯微鏡(Emmert-Buck et al.(1996)Science, 274(5289): 998-1001) 

(二) 進行電泳的前置準備 

市面上已有很多相關書籍詳述二維電泳組織、細胞及體液樣本的前處理。不同的處理方 

式即使是很細微的修正或電泳時的條件往往對解析度有很大的影響,甚至對二維電泳膠上可 

清楚分析的蛋白質點數也因上述差異而有所不同。例如:在溶解液中加入某種化學藥劑 

(thiourea)可增進樣本的解析度,特別是針對斥水性蛋白質效果最好。此外,不同的界面活 

性劑(detergent)對斥水性蛋白質於等電焦點(isoelectric focusing)電泳時的解析能力也有影 

響。當放置樣本時可將其溶於水合(rehydration)溶液中再置入電泳膠條,可大幅增加置入蛋 

白質樣本的量。最後,若能於正式電泳前先行將水合中的電泳膠條導入低電流,可改善非常 

高分子量蛋白質的解析度。 

(三) 二維電泳之蛋白質鑑別 

固定酸鹼值梯度電泳(IPG strip)的發展提高實驗的再現性(reproduciblity)及增加樣本 

置入的容量,幾乎從最酸性到最鹼性的蛋白質皆可藉由 IPG strip 完全解析。全蛋白質(total 

protein)樣本置入量愈大才足以進行接下來蛋白質定序的步驟。利用 IPG strip 進行的實驗較 

其他方式更具優勢的地方在於分離的蛋白質圖譜再現性極高,使得不同實驗室的資料可互相 

比對節省大量時間。改善樣本的溶解度導致二維電泳膠上之可解析的蛋白質點數明顯增加, 

雖使得一片電泳膠稍嫌擁擠但這個問題因更大片的膠體問世迎仞而解(目前已有 30×40cm 的 

膠體)。然而,太大的膠體在處理上較為困難;因此,可先在一維電泳時以不同的酸鹼質梯度 

分離蛋白質再以不同的膠體成分(percentages of total acrylamide)作二維電泳以增加可分析的 

蛋白質點。另外,為解決鹼性蛋白質解析度的問題,可同時利用酸鹼值梯度非常大(pH 4-12) 

及較小(pH10-12)的 IPG 膠條來解析極度鹼性的蛋白質且具有絕佳的效果。在發展蛋白質 

體學的過程中結合先進的質譜(mass spectormetry)技術與公共資料庫(EST database)發展 

實現了蛋白質鑑定比對的夢想,也加速蛋白質體學具長足進步的空間。至今只要有 10 attomole 

的蛋白質即足夠以質譜作正確性極高的分析及鑑定 (5) 。未來蛋白質體分析過程將朝向機械化 

前進,屆時實驗結果和分析的高效率無庸置疑。 

二、蛋白質資料分析(Protein analysis) 

(一) 資訊科技與資料庫(Information technology and databases) 

電腦輔助影像分析系統(computer-assisted image analysis systems)的發展使得有效率地 

分析二維電泳圖譜上數以千計的蛋白質點成為可能。透過網際網路的發達,各種蛋白質、基

251 


因或二維電泳相關資料庫甚至更複雜的資訊查詢皆信手可得;這些資料庫可由位於日內瓦 

ExPASy 伺服器的網站獲得(http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index. html)。快速地鑑定蛋白質雖 

然因質譜儀技術大幅演進不再是主要困難;然而大部分的資料庫目前仍無法提供現成的即時 

圖像,這個問題可由自動化工作站的觀念來解決。做法如下:將蛋白質從二維電泳膠切下, 

以酵素(trypsin)切割後再利用 MALDI-TOF 分析蛋白質片段後即可輕鬆比對不同膠片上的 

蛋白質群。然而,隨著膠片數目增加上述方式在執行上顯得較為困難,目前自動化的蛋白質 

點探測、計數、量化及比對技術仍有其限制;特別是針對異質性高的樣本或來自不同批次、 

酸鹼值範圍的二維電泳結果而言。因此未來執行相關工作時,人為的檢驗及再評估是絕對必 

要的。 

參、蛋白質體學之新興分析設備 

一、輻射包覆親和性標籤(isotope-coded affinity tag) 

質譜儀的應用得以快速大量比較蛋白質混合物的質與量,其技術原理類似於分析兩個細 

胞狀態間不同基因表現時所用的微陣列方法,其標記方式有兩種:化學基或兩種輻射物質: 

輕型或重型,這些標記與蛋白質 cysteine 結合可稱為輻射包覆親和性標籤。重試劑加在其中 

一種樣本(cancer cell)而輕試劑則加在另一種樣本(normal cell),接下來樣本混合以蛋白質 

脢切成小片段再用質譜儀分析。加在蛋白質的標籤不影響其原來特性故兩種不同樣本的小片 

段會同時進入質譜儀。質譜儀可檢測出每個樣本中含重型及輕型標籤的相對量,即可了解細 

胞或組織內蛋白質的分布情形(如圖三)。這種研究方式可隨時監測細胞癌化病理發展過程中 

蛋白質的改變,對癌症的蛋白質體研究非常有幫助。

252 


圖三、同位素標記定量(Gygi S. P. et al. (1999) Nat Biotechnol. 17, 994-999.) 

二、SELDI-TOF 

蛋白質體技術發展至今已能快速大量地研究蛋白質,且繼續朝著三個大領域前進:一、 

生物晶片(biochip)以質譜儀作基礎來偵測蛋白質,如 SELDI-TOF 系統,二、蛋白質陣列(protein 

array),及最近的反相蛋白質(reverse phase protein)陣列(如圖四)。由於以上生物技術的進 

步使得分析大群的資料成為可能。其中,SELDI-TOF MS 系統可製造大量低分子量的蛋白質 

表現資料並可勾勒出腫瘤的蛋白質圖譜,是現在分析蛋白質不可或缺的一項新技術。 

SELDI-TOF 的核心配備是由直徑約 1 到 2 公厘釣餌(bait)形成的表面,其材質多為鋁或不 

鏽鋼所形成的支持物,釣餌表面可以是斥水性、帶正電或負電,基本原理為親和性作用故結 

合的生化分子可以是抗體(antibody)、純化後的蛋白質受器(recepter)或去氧核醣核酸寡核 

甘酸(DNA oligonucleotide)。少量(約 0.6L)的液化組織或體液通過釣餌表面實與之產生相 

互作用再洗去未反應的分子後以 MS-TOF 分析。結果經輸出後可看到小分子量的蛋白質依各 

自質量大小分開並透過電腦軟體的記錄以標準質量色層(standard mass chromatograph)或似 

膠密度圖(gel-like density graph)呈現。此技術在數分鐘內就能取得蛋白質的成分概要且只 

需要非常少量的細胞即可同時分析數以百計的蛋白質。目前已應用在癌症的研究上,將不同 

人類腫瘤的惡性、轉移、癌化前及正常細胞群以 SELDI-TOF 分析可在最短的時間內確認蛋白 

質標記,並可觀察到細胞由正常到癌症產生一連串蛋白質變化。這些資料對癌症的預防、診 

斷治療及抗癌新藥的開發有實質的助益。 

(一)作用原理 

(二)不同溫度所呈現蛋白質差異

圖四、蛋白晶片(Ciphergen, ProteinChip manuscripts) 

253 


三、實驗室資訊處理系統(Laboratory information processing system, LIPS) 

由於實驗儀器的進步,研究蛋白質可結合各種先進設備以截長補短互通有無。廣義的蛋 

白質體學也包含基因及轉錄體的研究;除了對所得到的蛋白質資訊更為確定外也能了解蛋白 

質的後轉譯修飾作用;癌症的蛋白質體學也不能完全排除這些資料。在累積大量資料的同時 

必須具備一套有效率的資訊處理系統才能歸納出有用的資訊,也才能從多如牛毛的實驗結果 

得到結論。所謂實驗室資訊處理系統是由多個系統及處理程序組合而成;各種資料以不同的 

格式(format)儲存並以個別程式(program)閱讀資料。標準使用程序為:樣本 inventory、 

影像數位化(digitize image)、偵測並量化質點、透過影像比對並將質點標準化、選定質點作 

質譜分析、進入網站搜尋並建立圖譜,最後將資料以統計軟體分析。利用這組資料分析系統 

可節省大量的資料處理時間且資訊可隨時加入更改,不論資料呈變動狀態或非常複雜皆可將 

之制度化及系統化(如圖五)。 

圖五、生物資訊流程圖

肆、蛋白質體學於各種癌症研究的應用 

254 


一、膀胱癌(Bladder cancer) 

根據國外文獻報導 150 個膀胱癌樣本的二維電泳結果分析顯示;低分化程度的腫瘤有某 

些蛋白質如:細胞角質素(cytokeratins)、psoriasin、galectin 7 及 stratifin 的表現量皆降低, 

這些蛋白質在膀胱癌化時具某種意義,甚至可作為一種膀胱癌蛋白質標記(如圖六)。目前已 

可自網路下載或查詢到膀胱癌二維電泳蛋白質圖譜 (6) 。 

二、腎臟癌(Kidney cancer) 

已有科學家發表正常及腎細胞惡性腫瘤(RCC)間蛋白質的差異比較,在比對的四種蛋 

白質中有兩種酵素蛋白:ubiquinol cytochrome reductase(UQCR)及 mitochondrial NADHubiquinone 

oxidoreductase complex I 在正常腎臟組織有表現而在腎細胞惡性腫瘤的圖譜中卻 

沒有這兩種蛋白質。此重大發現導致以下的結論:在腎細胞惡性腫瘤發展及惡化的過程中, 

粒線體的調控路徑十分重要。此外,缺乏表現的蛋白質可能源自於某種尚未發現的缺失、基 

因表現的抑制或後轉譯修飾 (7) 。 

三、肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC) 

肝細胞癌的形成非常複雜,與肝硬化時的基因表現多重改變有關。將正常肝細胞、肝硬 

化及腫瘤三種組織分別取出並進行蛋白質體與 MALDI-TOF 分析;再相互比較蛋白質表現後 

發現有多達 21 種蛋白質的差異。這些蛋白質包括:sarcosine dehydrogenase 、 liver 

carboxylesterase、peptidyl-prolyl isomerase A 及 lamin B1 等蛋白直皆可作為可能的肝細胞癌腫 

瘤標記。特別是 lamin B1 在肝硬化的組織中表現大增,可作為肝硬化的篩檢標記(如圖七)。 

上述蛋白質可作為未來研究肝炎發生時的標的或肝癌診斷、治療的指標 (8,9) 。 

結語 

蛋白質體研究結果可應用於一個學習模式的建構,例如將二維電泳的資料以多變數分析 

方式來分類某些癌症的期別或腫瘤的屬性(良性/不確定/惡性)。此種分類方式正確度極高且 

簡易無侵害性,可發展成癌症在臨床診斷及治療的重要參考依據。由以上的例子發現;蛋白 

質體學再癌症研究的應用不只侷限於實驗室的實驗更有臨床價值,未來發展成更先進的癌症 

診療工具指日可待。自從人類基因序列解密後,全球科學家致力於發現不同系統的基因表現。 

蛋白質體學提供了以去氧核醣核酸為基礎之所有生物技術的另一種選擇,如前所述;在癌化 

過程中發生很多蛋白質轉錄後修飾作用(如蛋白質磷酸化或去磷酸化、蛋白質的分解等),使 

得蛋白質體學在癌症研究及探索癌症標記的角色較其他研究工具更為重要、有效率與直接。 

此外,相關自動化的先進儀器與各種應用軟體持續問世及在網際網路的推波助瀾下,蛋白質 

體學技術以臻成熟,蛋白質體學的時代已然來臨。

255 


Bladder cancer grade I Bladder cancer grade VI 

圖六、初期與末期膀胱癌蛋白表現差異圖譜 

Normal Hepatoma 

圖七、比對正常與肝癌蛋白表現差異

參考文獻 

256 


1. Srinivas, P. R., Verma M., Zhao Y., and Srivastava, S.(2002)Proteomics for cancer biomarker discovery. 

Clin. Chem. 48, 1160-1169. 

2. Hanash, S. M., Madoz-Gurpide, J., and Misek, D. E.(2002)Identification of novel targets for cancer 

therapy using expression proteomics. Leukemia 16, 475-485. 

3. Alaiya, A., Franzen, B., Auer, G.., and Linder, S.(2000)Cancer proteomics: from identification of novel 

markers to creation of artificial learning models for tumor classification. Electrophoresis 21, 1210-1217. 

4. Hanash, S. M.(2001)Global profiling of gene expression in cancer using genomics and proteomics. Curr. 

Opin. Mol. Ther. 3, 538-545. 

5. Ong, S. E., and Pandey A.(2001)An evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in 

proteomics. Biomol. Eng. 18, 195-205. 

6. Adam, B. L., Vlahou, A., Semmes, O. J., and Wright, G. L Jr.(2001)Proteomics approaches to biomarker 

discovery in prostate and bladder cancers. Proteomics 1, 1264-1270. 

7. Herrmann, P. C., Liotta, L. A., and Petricoin, E. F. 3rd.(2001)Cancer proteomics: the state of the art. Dis 

Markers 17, 49-57. 

8. Shalhoub, P., Kern, S., Girard, S., and Beretta, L.(2001)Proteomic-based approach for the idntification of 

tumor markers associated with Hepatocellular carcinoma. Dis. Markers 17, 217-223. 

9. Qin, L. X., and Tang Z. Y. (2002)The prognostic molecular markers in Hepatocellular carcinoma. World 

J. Gastroenterol. 8, 385-392.

前言 

257 

第二十一章、蛋白質體學於中草藥研發的應用 

第二十一章 

蛋白質體學於中草藥研發的應用 

Proteomic Applications in Research of Chinese Medicine 

長庚大學中醫系暨長庚醫院心臟內科 

潘台龍,李英雄 

由於生物技術的進步與發展,現今已有相當多的世界人口由正統西方藥物治療轉而依賴 

傳統草藥療法;而中草藥成分中同時包含許多有害及有益之生物活性混合物,如何明確地分 

離中草藥具藥性成分與草藥的準備、品質控制和用藥安全同樣重要。目前中草藥應用領域已 

開發出更多科學研究方法;且近幾年間在蛋白質技術方面已呈跳躍式進步。在這兩大前提下, 

中草藥的相關研究與發展勢必更為篷勃並令中草藥的價值大為提升。本章將以蛋白體學的角 

度探討中草藥研發並為中草藥科學化、標準化及藥理機制與毒性分析作深入的詮釋。 

內容 

壹、以蛋白質體學探討中草藥研究 

一、簡介 

傳統醫藥生長區域廣闊,外觀形態也許並無差異,但內含成分卻相差極多,目前並無一 

定客觀標準但憑中醫藥商多年累積的經驗作判斷,如此不但阻滯中藥科學化的發展也無法提 

升中醫藥之使用價值;蛋白體學(proteomics)以最直接的研究方法並加入生物資訊的應用; 

為更進一步的中草藥研究提供了非常重要的基礎。其中,以蛋白質體學分析中草藥具藥性成 

分之蛋白質並比較不同產地之基源與藥效使其標準化;則傳統醫學一直以來為人所垢病無法 

科學化的問題將得以解決,中草藥將更廣為世人所用;嘉惠所有病患,提升醫療水準。中草 

藥的臨床療效可分為以下幾種:抗腫瘤、免疫調節、活血化瘀、延緩老化及調理神經系統與 

內分泌系統,其作用機制包括細胞激素(cytokine)或細胞本身的改變及誘導基因表現與影響 

酵素活動等等。這些體內環境在使用中草藥後有極大的改變,而這些改變必定伴隨著大量蛋 

白質的變化;若利用蛋白體學直接由表現蛋白質層次著手即可鑑定出可能與疾病或療效有直 

接相關性的蛋白質,並不需要事先探究疾病的詳細分子機制;較傳統實驗方法更為快速且更 

接近問題核心。蛋白質體學的功能在生物醫學相關研究上扮演了無庸置疑的角色;中草藥治 

療的目標並非基因本身而是由基因轉譯的蛋白質,且因後轉譯的蛋白質修飾作用,有時在基 

因層次中無法展現蛋白質在量或活性方面的改變。故如何利用現代科技表現蛋白質的質量變 

化將成為醫學研究的關鍵;蛋白質體學在這種情形下再次受到矚目。最新的技術能夠迅速和 

正確地分析蛋白質,即便蛋白質非常微量仍能清楚偵測到他們的活化。蛋白質體分析如同大 

部份新興術語,並沒有清楚的定義但是可概括表示所有蛋白質的描述。實際發現人類的基因 

數目約 35000 個與之前預測 50000 到 130000 個基因相差極大充分說明生物學的複雜性。其中

258 


蛋白質功能和彼此間的交互作用必定十分複雜且奧妙,而基因所表達的資料不能夠獨自地闡 

明這種高度的複雜性。故蛋白質體學在中草藥研發、中草藥機源確認、中草藥有效成分分析、 

療效及作用機制研究方面的確具有極大功能 (1) 。 

二、蛋白質體分析技術之演進 

蛋白質體分析技術大致可以兩項技術概述之:蛋白質分離和定量及蛋白質確認與比對; 

以二維電泳技術將蛋白質分離後再進行比對,被視為標的之蛋白質繼續接著確認處理的步 

驟。傳統上這個確認步驟是藉由轉移蛋白質點到薄膜(PVDF membrane)上再執行 N-序列蛋 

白質定序(N-terminal sequence)。但其蛋白質的 N-端應化學修飾而鎖著,所以無法順利且大 

量執行。然而,現在已被質譜(MS)技術取代;1980 年代後期和 1990 年代早期科學家發 

現質譜技術對生物學樣品分析有卓著的貢獻因而加速了質譜在質量上大為改進;特別在儀器 

設施中主要對離子化技術的發明:基質輔助雷射解吸附質譜(MALDI)和電噴霧質譜技術 

(ESI),這些方法使蛋白質離子化並且藉此發現大量的生物學分子和更精準的蛋白質篩選。 

1990 年代中後期,在質譜儀的敏感度、自動化和產量上的推進,提升了蛋白質確認精準度。 

這些進步部份是由於微米裝置的發展應蘊而生。自動化搜索蛋白質資料庫軟體的發展也促使 

蛋白質研究突飛猛進;將這些新興技術實際應用在中草藥分析研究上,才能真正顯示現代科 

學的精髓 (2) 。 

三、蛋白質晶片與中草藥研發 

另外,蛋白質晶片也大量應用於中草藥研究;蛋白質晶片主要探討的是已知的蛋白質;而上 

述的二維電泳則可分析未知的蛋白質,若能互相參照或用作更進一步的確認皆對實驗結果很 

有助益。蛋白質晶片在用作大量樣本篩選時相當快速且可省下人力及物力。蛋白質體晶片一 

開始的步驟是過濾眾多目標分子(蛋白質),這些分子可能和某種疾病有絕對相關性或和其他 

藥物互相影響調控。達成目標確認的方式非常明確及簡易;只需將患者的組織與正常人的組 

織相互比對找出兩者間的差異分子;不論是多出或缺少的分子即可標定為目標分子,完成目 

標確認的步驟。比較患者和常人表現的蛋白質之差異只是一種達成目標確認的方式,然而過 

分信賴此種方式可能造成誤導;因為組織是由多個細胞組成的,較大量的細胞類型可能遮蔽 

某個重要細胞蛋白質過度或過少的表現;因此,疾病的細胞模型也普遍作為目標鑑定方式之 

一。同時,晶片也提供中草藥研發時蛋白質標的尋找;如培養人類肝癌細胞並加入生物活性 

檢測以證明中草藥萃取成分之療效,於不同作用時間抽取細胞之蛋白質,再以生物晶片 

(Biochip)進行雜交實驗,所得到不同表現質或量蛋白質即為標的蛋白質(如圖一)。 

四、蛋白質體學輔助工具-生物資訊學(Bioinformatics) 

管理巨量的蛋白質資料需快速及簡捷之技術,因此生物資訊體學的領域成為非常重要的 

一環。總體而言,生物資訊體學是一種橫跨電腦科學、工程學和生物科學的訓練方式並且扮

259 


演蛋白質資料庫中心主要的資料管理方式。在得到人類或動物實驗的大量資料時,從生物資 

訊體學發展出來的工具可提供合乎邏輯的分析和整合。任何單一的人類目標蛋白質有可能沒 

有任何已知的功能,但生物資訊體學連結於果蠅或酵母基因的資料庫能提供十分關鍵的資料。 

圖一、治療前後蛋白質表現差異圖譜 

Spleen treated(Blue)、Spleen control(Red);Number of Spots:297,Number of Matched Spots:182 

(61.28%) 

藉由生物資訊體學中強大資料庫(Data base)的建立與連結;很多重要的資訊在最短時 

間內即可獲得且由彙整的資料中可得到大量具有意義的訊息,對目標確認而言非常重要。目 

標確認實驗通常在短期內即可完成,某個蛋白質標的與中草藥基源或中草藥療效關係明確。 

然而在作目標確認時,不同的實驗方法可能產生數以百計的潛在目標蛋白質,因此需要比較 

長的程序以完全分辨此目標蛋白質是確實扮演中心角色抑或僅是扮演次要的角色。在這步驟 

可嘗試使用傳統工具;然而,也應考慮實際進行的可行性。舉例來說,如果確認產生了具體 

目標蛋白質,應以最易取得的模型及最經濟的方式來進行。有時某些步驟甚至會導致負作用, 

不但無法解決原本的問題;反而製造另一個干擾因子,故在實驗時須特別注意相關的每個細 

節,才不致糢糊了原來的目的。由於時代進步;高產量快速篩選利用各式各樣的化學物圖書 

館來識別可能與目標蛋白質互相作用的化合物且琳瑯滿目的現代輔助儀器;如:機器手臂技 

術(robotic)、微量流體(microfluid)、和微量化驗與自動化化合物儲藏和取回作整合,因此, 

篩選技術的高產量正在很快地進化,使得篩選目標蛋白質的速度大幅推進。這些篩選步驟通 

常以化學 ligand 和受體間的相互關係作為基礎,兩者間的親和力決定了引導結果,而抑制物 

的加入使得結果可經由反向證明,使結論更為肯定與正確。

五、中草藥蛋白質體學之特異性 

260 


中草藥的蛋白質體學研究有些步驟與實驗條件與動物不盡相同,如有些中草藥是植物具 

細胞壁與葉綠體故特別在作樣本備置時必須特別注意這些差異點。以下範例概述中草藥植物 

根部樣本在抽取其蛋白質時進行之步驟:樣本至於液態氮中磨碎並以加入含 10%TCA 及 

0.07%DTT 的-20℃丙酮中,於-20℃靜置一小時後以 35,000×g,4℃離心十五分鐘。接下來沉 

澱物用含 0.07%DTT 之-20℃丙酮清洗兩次,每次皆需靜置三十分鐘再於 4℃以 12,000×g 離心 

十五分鐘。將沉澱物冷凍乾燥五分鐘後立即用 2 毫升的溶解液(lysis buffer)使之均勻懸浮其 

中。最後在室溫下以 19,000×g 離心十五分鐘去掉不溶物後即可測其蛋白質濃度。有些中草藥 

的本體具不同部分與組織;在研究上也要特別注意這方面的差異 (3) 。 

貳、兩種蛋白質體學應用在中草藥研發的例子 

一、高麗與西洋人蔘二級代謝物蛋白質體學分析-蛋白質體學於中草藥藥理成分之比較分析 

高麗蔘與西洋蔘皆是廣為世人所用的傳統中草藥,兩者具免疫調節及抗癌作用;前者屬 

熱性而後者較寒。根據神農本草經記載,人蔘不同種類、部位的功效不盡相同甚至不同來源 

的人蔘也有成分差異,故以科學方法分辨這些差異在人蔘的相關研究與應用十分重要。之前 

人蔘的藥性成分主要是利用 HPLC 分離人蔘素(ginsenosides)或增幅之 DNA。然而,這種方 

式無法分辨人蔘不同部分混合物或量化其中的純物質;而蛋白質體學可克服這方面的問題。 

將高麗人蔘與西洋蔘主要根部、側根、表皮與地下莖之頭部的蛋白質作二維電泳分離並以 

Edman N 端定序法鑑定目標蛋白質;最後以電腦軟體比對這些部分蛋白質之二維電泳圖譜即 

可分辨出高麗蔘與西洋蔘以下幾大差異點:(1)高麗蔘與西洋蔘間的不同(2)高麗蔘各個部 

位的差別(3)野生高麗蔘主根部與培養之高麗蔘細胞的成分差異。另外,兩種人蔘的主根部 

特異性蛋白質標誌(specific protein marker)也完成確認。在這個實驗中樣品不應超過一個月 

並儲存於 4℃以保持蛋白質成分完整,且取樣時應注意確實分別各部位以防實驗誤差;如人 

蔘頭部兩端 0.5 公分處應去除而表皮樣本不應超過 0.2 公分厚。不同部位之人蔘植物體或培養 

細胞在均質化前應先測重並以 1:1(w/v)比例之萃取液(含 8M 尿素、2%CHAPS 及 0.28%DTT) 

將樣本均質化,此混合液冷凍、溶解三次後於 4℃以 10000 轉離心 15 分鐘,收集上清液後測 

蛋白質濃度。接下來取 300 L 內含 100 g 的樣本進行一維電泳;之後將其膠條以平衡緩衝 

液平衡其 pH 值約兩分鐘,利用 SDS-PAGE 進行二維電泳後再銀染(如圖二);銀染後之膠體 

影像掃描至電腦後以軟體分析比對各部位之蛋白質點差異。電泳膠上的蛋白質轉至 PVDF 薄 

膜後以蛋白質定序儀定出蛋白質序列並以 BLAST 之 SWISS-PORT 分析目標蛋白質即完成人 

蔘具藥性成分蛋白質研究 (4) 。根據這個實驗結果可得知;以蛋白質體技術為工具研究中草藥 

藥理成分可加速中草藥質量判定過程並對中草藥材標準化及相關研究開發皆有極大助益。相 

對哺乳類基因定序的完成,中藥材蛋白體學研究急需材料本身基因庫之建立,否則蛋白質水 

解後之指紋質譜分析則無相關資料可供搜尋 (5) 。

圖二、人參根部二維電泳圖 

261 


二、冬蟲夏草對免疫機制調節與抗癌活性研究-蛋白質體學於中草藥療效之探討 

在傳統中醫藥學裡將冬蟲夏草視為抗癌良藥且其具免疫調節功能,中外文獻也多有證 

實。冬蟲夏草具有一種糖蛋白可刺激脾臟細胞增生與細胞激素表現;將餵食此種糖蛋白的小 

鼠脾臟取出進行蛋白質體分析,結果顯示有約一半的蛋白質圖譜產生改變並影響 IL-1、IL-2 

或 INF- 等細胞激素表現大幅增加的狀態。結合動物模式與蛋白質體學將可快速篩選中草藥 

體內實驗甚或人體試驗療效、有效成分及機制探究;雖然冬蟲夏草用於抗癌已有數千年歷史, 

但真正的分子基礎仍混沌不明,經由前人證實冬蟲夏草水溶液萃取之多醣體確有其療效。將 

服用冬蟲夏草萃取物之小鼠脾臟取出後以溶解液(lysis buffer)均勻溶解並加入染劑 

(bromophenol blue),於 13,000 轉離心 10 分鐘取上清液依標準程序測定樣本之所有蛋白質 

(Total protein)濃度。以 500 g 蛋白質樣本進行前述之二維電泳後利用螢光染劑-Sypro 

RubyTM 染色。染色後的電泳膠以螢光雷射掃描器掃描並以軟體分析比對蛋白質點,所有蛋白 

質點自動偵測與量化再以肉眼逐一確認即可得到變化達到統計學顯著差異意義的蛋白質。將 

這些蛋白質點切下以鹼性緩衝液洗滌並脫水乾燥及真空快速離心再將膠體泡在消化緩衝液 

(digestion buffer)中,取 1 L消化後的蛋白質碎片置於 

MALDI 分析儀的 96 個孔洞中並加 

入基質溶液(matrix solution),可測出蛋白質質量並鑑定出該變化蛋白質為何(如表一) (6,7) 。 

以上兩個例子說明:蛋白質體學在現今中草藥領域不論是中草藥藥性成分、基源分析、 

中草藥科學標準化抑或是中草藥動物體內實驗療效研究與各種醫療機制都是不可或缺的技 

術;而蛋白質的表現較基因層次的變化更為直接且正確;故蛋白質體學在中草藥研發應用而 

言佔有極重要的地位。

表一、差異蛋白質經飛行質譜分析所得結果 

結語 

262 


由於電腦網際網路的興起,所有中草藥的相關研究與研發之標的地平線似乎都向前推移 

了一大步。生物科技也是如此,人們必須花時間學習該如何使用新技術並且最佳地應用他們 

將其變成可靠的資訊 (8) 。蛋白質體學分析對中草藥的療效、藥用價值或其基源將仰賴資料的 

數量大量增加及其他生物學知識的補充而蛋白質體學和生物資訊學整合將對中草藥研發有相 

當大的助益 (9,10) 。 

參考文獻 

Protein name 

Fructose-bisphosphate aldolase A 

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 

Pyruvate kinase 

Thioredoxin peroxidase 

Rab11 GTP-binding protein 

Enolase-α 

Rim 

Cyclophilin 

Calreticulin 

HSP60 

HSP27 

Vimentin 

Triosephosphate isomerase 

Protein disulfide isomerase 

α-antitrypsin 

Proteasome 

Aldose A 

1. Watson, B. S., Asirvatham, V. S., Wang, L., and Sumner, L. W.(2003)Mapping the proteome of barrel 

medic(Medicago truncatula). Plant. Physiol. 131, 1104-1123. 

2. Kvasnicka, F.(2003)Proteomics: general strategies and application to nutritionally relevant proteins. J. 

Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 787, 77-89. 

3. Man, W. J., White, I. R., Bryant, D., Bugelski, P., Camilleri, P., Cutler, P., Heald, G., Lord, P. G., Wood, J., 

and Kramer, K.(2002)Protein expression analysis of drug-mediated hepatotoxicity in the Sprague-Dawley 

rat. Proteomics 2, 1577-1585. 

4. Lum, J. H., Fung, K. L., Cheung, P. Y., Wong, M. S., Lee, C. H., Kwok, F. S., Leung, M. C., Hui, P. K., 

and Lo, S.C.(2002)Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C. A. Meyer and the potential to use it as 

an Identification tool. Proteomics 2, 1123-1130. 

Swiss-Prot 

Accession number 

Identified by 

5. Samson, D., Legeai, F., Karsenty, E., Reboux, S., Veyrieras, J. B., Just, J., and Barillot, E.(2003) 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M 

M

263 


GenoPlante-Info(GPI): a collection of databases and bioinformatics resources for plant genomics. 

Nucleic Acids Res. 31, 179-182. 

6. Wang, Y. Y., Khoo, K. H., Chen, S. T., Lin, C. C., Wong, C. H., and Lin, C. H.(2002)Studies on the 

immuno-modulating and antitumor activities of Ganoderma lucidum(Reishi)polysaccharides: functional 

and proteomic analyses of a fucose-containing glycoprotein fraction responsible for the activities. Bioorg. 

Med. Chem. 10, 1057-1062. 

7. Schleiff, E., Eichacker, L. A., Eckart, K., Becker, T., Mirus, O., Stahl, T., and Soll, J.(2003)Prediction of 

the plant beta-barrel proteome: A case study of the chloroplast outer envelope. Protein. Sci. 12, 748-759. 

8. Thiellement, H., Zivy, M., and Plomion, C.(2002)Combining proteomic and genetic studies in plants. J. 

Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.782, 137-149. 

9. Witzmann, F. A., and Grant, R. A.(2003)Pharmacoproteomics in drug development. Pharmacogenomics 

J. 3, 69-76. 

10. Wilkins, M. R.(2002)What do we want from proteomics in the detection and avoidance of adverse drug 

reactions. Toxicol. Lett. 127, 245-249.

PARTⅤ 

264 

PARTⅤ、蛋白質體學之新技術發展 

蛋白質體學之新技術 

發展

前言 

第二十二章 

蛋白質體學研究新技術之介紹 

New Technologies in Proteomics 

美商應用生命系統公司(Applied Biosystems) 

劉俊昇 

265 

第二十二章、蛋白質體學研究新技術之介紹 

隨著蛋白質體學日益蓬勃發展,各式新技術亦不斷推陳出新,除較具代表性的新技術, 

如新型設計之質譜儀、蛋白晶片、及微流體技術(本書均另有專門章節介紹,請參閱)等等 

之外,本章節將列舉數項亦具代表性技術以供參考,其中有些已經可在市面上看到商業化產 

品,有些則仍在概念或研發階段,期待在可見的將來可為蛋白質體學研究帶來新的技術革命。 

內容 

壹、多維液相層析(Multiple Dimensional Liquid Chromatography MDLC) 

當蛋白質體學(Proteomics)興起之後,研究重點不再侷限於純化特定蛋白質,爾是在於 

如何有效快速地在成千上萬的總蛋白質(total protein)中找到與實驗相關的目標蛋白質(target 

protein)。二維電泳(2D Electrophoresis)是目前最被廣泛應用的蛋白展開分離分析技術(另 

有章節詳述,請參閱),它擁有相當多的優點,包括: 

一、它是非常成熟且易於設立的技術。 

二、經染色或成像後為目視可判讀資料,一目了然。 

三、分辨率不錯的技術。 

四、如從簡易手動式設備入門,則所需經費不高。 

然而二維電泳技術本身也有一些瓶頸有待突破,包括: 

一、再現性歧異度較高。 

二、每次進樣量(Capacity)有限。 

三、酸鹼度或分子量差異較大的蛋白質群組較難分析。 

四、回收率較低,不利作進一步分析。 

五、耗時較長,且不易全程自動化處理。 

因此,如何發展與二維電泳具有互補性的技術,使研究者能更快速有效的找到目標蛋白 

質,且純化出夠多的量以利進一步分析,也成為一門重要的課題,多維液相層析(Multiple 

Dimensional Liquid Chromatography 以下簡稱 MDLC)即是目前被廣泛討論及應用的一項互 

補性技術。

266 


MDLC 的概念其實在早期仍在使用開放式層析管柱(open column)純化蛋白質時即已普 

遍被應用。例如先以親和性層析管柱(affinity column)取得特定種類蛋白質後,再以反相層 

析管柱(reverse phase column)進一步純化目標蛋白質,即是一種 MDLC 的概念。 

MDLC 在蛋白質體學(Proteomics)興起之後也重新被賦予定義及使命,它可以單獨作為 

一項分離分析技術,也可以結合一維或二維電泳達到很好的蛋白質展開分離分析效果,先以 

MDLC 去除掉 Abundant Protein 後,原先在電泳上無法染色判讀的一些微量蛋白質,不論是 

低分子量或高分子量群組,均可輕易判讀(如圖一-A, 一-B 及一-C )。 

圖一-A、MDLC and PAGE for Proteome(由美商應用生命系統公司提供) 

圖一-B、Abundant Protein Removal by MDLC(由美商應用生命系統公司提供)

267 


圖一-C、SDS-PAGE Showing HAS Removal from Sample by MDLC(由美商應用生命系統公司 

提供) 

貳、ICAT 技術(Isotope Coded Affinity Tags Technology) 

ICAT 技術首先由美國西雅圖的華盛頓大學(University of Washington)的 Reudi Aebersold 

博士所發表並取得專利 (1) ,隨後並將技術授權給 Applied Biosystems 公司商業量產。ICAT 技 

術的最大訴求重點在於能將一組實驗,在成千上萬的總蛋白質中(totaprotein),將目標蛋白 

質(target protein)快速有效地篩選出來,並同時完成目標蛋白質鑑定,及相對定量,以了解 

其 Down 或 Up regulation 之關係,且整個實驗流程可以搭配相關的 MDLC、質譜儀及軟體等, 

使全程達到最高的自動化效果,ICAT 技術由於是以質譜儀當作偵測工具,其靈敏度較電泳染 

色更佳,有助於篩選出微量蛋白質,特別是某些重要的微量調控蛋白質(low copies of regulatedproteins)。 

ICAT 技術主軸主要是利用兩種具質量相差的 Tag (如圖二-A),兩種 Tag 分別稱為 Light 

Tag 及 Heavy Tag,而兩者質量相差剛好 8 daltons,經過分別標定實驗組及對照組的總蛋白質, 

再以 MDLC 分離純化,並導入質譜儀分析。由於同一蛋白質在實驗組及對照組經標定後其質 

量相差為 8 daltons,透過軟體分析可將表現有明顯差異的目標蛋白質篩選出來(down regulated 

or up regulated protein)(詳細流程圖請參考圖二-B 及二-C) 

ICAT 技術目前已在 Yeast 建立一定程度的 Model,並已在某些癌症研究,如肝癌及前列 

腺癌等獲得初步成果。

圖二-A、ICAT TM Reagent(由美商應用生命系統公司提供) 

268 


圖二-B、The Isotope-Coded Affinity Tag Method ICAT TM (由美商應用生命系統公司提供)

圖二-C、ICAT reagent Workflows(由美商應用生命系統公司提供) 

269 


參、LC/ MALDI 質譜儀串聯介面(LC/ MALDI Interface for Mass Spectrometry) 

質譜儀無疑是現今公認非常有效率的蛋白質分析鑑定儀器(本書另有數章節介紹,請參 

閱),一般常用的質譜儀進樣系統有液相層析(LC)及固態基質輔助雷射脫附游離(MALDI) 

等兩種,兩種方式各有其優缺點,因此,如何能結合且同時發揮兩種進樣優點,也是技術發 

展的一大重點,LC/ MALD 質譜儀串聯介面也因此應運而生。 

目前已有點盤式(如圖三-A)及蛇型連續塗抹式(如圖三-B)LC/MALDI Interface。 

圖三-A、點盤式 LC/ MALDI Interface(由美商應用生命系統公司提供)

270 


圖三-B、蛇行連續塗抹式 LC/ MALDI Interface(由美商應用生命系統公司提供) 

肆、凝膠/質譜儀成像系統(Molecular Scanner ) 

凝膠/質譜儀成像系統最先由日內瓦大學提出 (2) ,其方法為將未經任何染色處理的電泳凝 

膠經過一片含 Trypsin 的薄膜轉印至 PVDF,並將 PVDF 直接以質譜掃描,再經電腦影像分析 

後可還原成數位影像(如圖四-A),本方法可節省傳統電泳法的很多步驟,如染色、影像掃描、 

In Gel Digest 等等耗時耗工的過程,而且點區中每一個數位影像點皆可獲得其質譜圖(如圖四 

-B)。此系統因分析每片凝膠所需的硬碟及記憶體空間甚為龐大,是目前急需克服的問題。 

圖四-A、The Principle of the Molecular Scanner(由美商應用生命系統公司提供)

圖四-B、Example:Data Presentation(由美商應用生命系統公司提供) 

伍、組織/細胞/質譜儀成像系統(Tissue/Cell Imaging ) 

271 


如同凝膠/質譜儀成像系統(Molecular Scanner )概念一般,目前也有人發展以組織切片 

直接進質譜儀掃描成像(如圖五),此技術目前尚屬於初步研發階段,然若一旦有商業量產機 

種推出,勢必又是一項研究利器。 

圖五、Tissue analysis by MALDI-MS(由美商應用生命系統公司提供)

參考文獻 

272 


1. Gygi, S. P. et al.(1999)Quantitative Analysis of Complex Protein Mixtures Using Isotope-Coded Affinity 

Tags, Nat Biotechnol. Oct 17, 994. 

2. Binz, P. A. et al.(1999)A Molecular Scanner To Automate Proteomic Research and to Display Proteome 

Images, Anal. Chem. 71, 4981-4988.

第二十三章 

生物晶片與蛋白質體學 

光電生醫中心 

林世明 

273 

第二十三章、生物晶片與蛋白質體學 

前言 

基因組定序(genome sequencing)、生物資訊學(Bioinfomatics)、與分析設備的快速發展 

促使了蛋白質體學(proteomics)領域的產生。其中利用二維電泳(Two-dimension electrophoresis)為主幹的分析技術,可以將一群複雜的蛋白質複合物,使之個別分離並尋找出特定 

的目標蛋白質。而分離出來的目標蛋白質,進一步利用質譜(Mass Spectrometry)加以即時 

分析。由於其具有快速分析的特性,隨之而衍生的是大量有待分析的資料。例如:蛋白質的 

結構特徵與功能。其主要的挑戰在於我們必須能發展有效率且具有專一性、特異性的方法; 

以應用於解決一些重要課題,例如:生物辨識(bio-recognition)、生物分子相關網路、定性 

定量設備、與操作技術的建立…..等等。 

內容 

壹、蛋白質體學之偵測與未來發展 

在許多關於生物、電腦及分析科學的發展事件中,改善傳統偵測蛋白質特性之方法,成 

為蛋白質體學相關新領域之基礎。選擇數種物種,將其基因完全定序,大規模定序已有初步 

結果或即將完成。未來只要資料庫完成建檔,其所包括在內的物種,這些基因庫資料可以轉 

譯成所有具潛能的蛋白質庫(protein library)。於基因庫真實世界及真實特性蛋白質庫之間, 

透過網際網路形成一結合,電腦科技生物資訊及所接觸資料可常常改進。在資料庫中,憑藉 

經驗產生資料使用,例如,可以利用相關對應基因研究下之蛋白質,做二維電泳及質譜儀分 

析,因此加速蛋白質/基因發現,在細胞層次上拓展對生物分子途徑及交互作用了解。具特性 

的蛋白質庫之重要性,可提供高敏感性及真實性資訊的適用分析設備已快速推進中。 

過去十年來於蛋白質特性有兩種分析方法使用率增加:表面電漿共振生物分子交互作用 

分析(SPR-BIA)及基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜技術。 SPR-BIA 

是一光學(非破壞性)晶片基台技術,可偵測介於固定的受體(substrate)及水溶性載體所發 

生之生物分子交互作用(如圖一)。對具功能性特點之蛋白質,此技術已變成有價值之工具, 

並且廣泛用於確認參予生物分子交互作用之動力學(kinetics)及親和性參數(affinity constant) 

(1-4) 

。另外,MALDI-TOF 使用於蛋白質結構特性分析,透過胜肽圖譜(peptide mapping)結 

合資料庫之研究,範圍從序列鑑定到準確定出蛋白質質量 (5-8) 。當思考相容性(晶片基台 SPR 

偵測格式適於質量分析)及互補性(蛋白質功能及結構分析)時,可推測由 SPR-BIA 及 

MALDI-TOF 共同創造出多維分析方法,可形成一協同分析。根據 Randll W. Nelson (9) 致力於 

很多努力將 SPR-BIA 及 MALDI-TOF 結合再一起形成一分析器,叫做”生物分子交互作用分

蛋白質體學 - 國立陽明大學

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?