การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์

บทที่ 5
การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์

การเพาะเลี ้ยงจุลินทรีย์
ปรับสภาพแวดล้อมให้เหมาะสมกับการเจริญของจุลินทรีย์ที่ต้องการเลี ้ยง
แหล่งคาร์บอน
แหล่งพลังงาน
ในรูปของสารอาหารที่จุลินทรีย์ใช้ในการเจริญได้
สภาพทางกายภาพเหมาะสม : pH, temp. and O 2

การเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ = การเพิ่มจ านวนของจุลินทรีย์
*ไม่ใช่การเพิ่มขนาดเพียงอย่างเดียวเหมือนสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ
growth

สภาพแวดล้อมที่มีผลต่อการเจริญของจุลินทรีย์
อุณหภูมิ
ออกซิเจน
พีเอช
แรงดันออสโมติก

อุณหภูมิ
• ส าคัญต่อการเจริญของจุลินทรีย์อย่างยิ่ง
• จุลินทรีย์แต่ละชนิดจะมีช่วงของอุณหภูมิในการเจริญแตกต่างกัน
minimum temperature
- อุณหภูมิต ่าสุดที่
จุลินทรีย์เจริญได้
- แต่มีการแบ่งเซลล์น้อย
มาก
optimum temperature
- อุณหภูมิเหมาะสม
ส าหรับการเจริญ
- มีการแบ่งเซลล์ได้อย่าง
รวดเร็วที่สุด
maximum temperature
- อุณหภูมิสูงสุดที่จุลินทรีย์
เจริญได้
- อุณหภูมิสูงกว่านี้จะไม่
เจริญเติบโต
ช่วงของอุณหภูมิทั ้งสาม เรียกว่า cardinal temperature

ช่วงอุณหภูมิที่จุลินทรีย์แต่ละชนิดสามารถเจริญได้
จุลินทรีย์
Bacillus psychrophilus
Micrococcus cryophilus
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Neisseria gonorrhoeae
Thermoplasma acidophilum
Thermus aquaticus
Pyrococcus abyssi
Pyrolobus fumarii
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)
ต ่าสุด เหมาะสม สูงสุด
-10
-4
6.5
0
10
30
45
40
67
90
23-24
10
30-37
37
37
35-36
59
70-72
96
106
28-30
24
46
44
45
38
62
79
102
113
ที่มา (ดัดแปลงจาก Prescott, Harley and Klein, 2005, p. 123)

ถ้าหากจ าแนกจุลินทรีย์ตามอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเจริญ
จะสามารถจ าแนกได้เป็ น 3 กลุ่ม
psychrophile
mesophile
thermopile
จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิ 0 C หรือต ่ากว่า
จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิปานกลาง ~ 25-40 C
จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิสูงระหว่าง 45-60 C

psychrophile จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิ 0 C หรือต ่ากว่า
อุณหภูมิต ่าสุดในการเจริญ 0 C
อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 15-20 C
อุณหภูมิสูงสุดในการเจริญ 30 C
Pseudomonas
Achromobacter
Flavobacterium
Micrococcus

mesophile จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิปานกลาง ~ 25-40 C
อุณหภูมิต ่าสุดในการเจริญ 5-25 C
อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 37 C
อุณหภูมิสูงสุดในการเจริญ 43 C
จุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรคในมนุษย์
Neisseria gonorrhoea
Treponema pallidum
Salmonella typhosa
Shigella dysenteriae
จุลินทรีย์ที่มีถิ่นอาศัยอยู ่ในร่างกายมนุษย์
E. coli
Enterobacter aerogenes

thermopile จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิสูงระหว่าง 45-60 C
อุณหภูมิต ่าสุดในการเจริญ
25-45 C
อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 50-55 C
อุณหภูมิสูงสุดในการเจริญ 60-85 C
Bacillus coagulans
Bacillus stearothermophilus
Lactobacillus delbruckii

ออกซิเจน
มีผลต่อการเจริญของจุลินทรีย์
จ าแนกจุลินทรีย์ออกเป็ น 4 กลุ่ม ตามความต้องการออกซิเจนได้

obligate aerobes
จุลินทรีย์ที่ต้องการออกซิเจนเพื่อใช้สร้างพลังงาน
เนื่องจากไม่สามารถสร้างพลังงานโดยกระบวนการหมัก
Bacillus and Pseudomonas
facultative anaerobe
สามารถสร้างพลังงานได้จากกระบวนการหายใจหรือกระบวนการหมัก
ไม่จ าเป็ นต้องใช้ออกซิเจนในการสังเคราะห์ต่าง ๆ
Escherichia, Proteus and Enterobacter

microaerophile
ต้องการออกซิเจนน้อยกว่า 0.2 บรรยากาศ
ถ้ามีออกซิเจนในปริมาณมากจะเจริญได้อย่างช้า ๆ
Lactobacillus and Nessserria
anaerobe
เป็ นพิษกับเซลล์
ไม่สามารถเจริญได้ในสภาวะที่มีออกซิเจน
เนื่องจากขาด catalase ในการสลาย H 2 O 2 ที่เกิดจากO 2 +H 2 O
Clostridium, Methanobacterium and Bacteroides

OBLIGATE
AEROBE
OBLIGATE
ANAEROBE
FACULTATIVE
ANAEROBE
AEROTOLERANT
ANAEROBE

การเจริญในอาหารเหลวของจุลินทรีย์
สามารถสังเกตปริมาณการเจริญเติบโตว่าอยู ่ในระดับมาก ปานกลาง หรือน้อย
สังเกตการเจริญและกระจายตัวในอาหารเหลวว่าสม ่าเสมอหรือเฉพาะบางต าแหน่ง
การเจริญของจุลินทรีย์ในอาหารเหลวนี ้ บอกความต้องการออกซิเจนในการเจริญ
เจริญที่ผิวหน้าของอาหารเลี ้ยงเชื ้อ : ต้องการออกซิเจนในการเจริญ
เจริญมากที่บริเวณก้นหลอดทดลอง :ไม่ต้องการออกซิเจนในการเจริญ
เจริญกระจายตัวทั่วทั ้งหลอดทดลอง :เจริญได้ทั้งในที่มีและไม่มีออกซิเจน

pH
ส่วนใหญ่ต้องการค่าพีเอชที่เหมาะสมในการเจริญอยู ่ในช่วง 6.5-7.5
แต่อาจมีจุลินทรีย์บางชนิดที่สามารถเจริญได้ที่ช่วงพีเอชอื่น เช่น
Thiobacillus thiooxidans เจริญได้ที่พีเอช 2
Alcaligenes faecalis เจริญได้ที่พีเอช 8.5
เมื่อเลี ้ยงจุลินทรีย์ในอาหารเลี ้ยงเชื ้อได้ระยะหนึ ่ง pH ของอาหารจะเปลี่ยนแปลง
จุลินทรีย์ที่เจริญปล่อยสารบางอย่างออกมา
การย่อยสลายโปรตีนและสารประกอบไนโตรเจน จะปล่อยแอมโมเนีย/อัลคาไลน์อื่นๆออกมา
การย่อยสลายคาร์โบไฮเดรตจะปล่อยสารอินทรีย์ออกมา

ในการเตรียมอาหารเลี ้ยงเชื ้อจึงต้องเติมสารที่ท าหน้าที่เป็ นบัฟเฟอร์
เพื่อช่วยให้พีเอชของอาหารเลี ้ยงเชื ้อเปลี่ยนไปอย่างช้า ๆ
การจัดแบ่งจุลินทรีย์โดยอาศัยคุณสมบัติในการเจริญที่พีเอชต่าง ๆ กัน
แบ่งออกได้เป็ น 2 กลุ่ม
alkaliphilic microorganism
เจริญได้ในอาหาร
เลี ้ยงเชื ้อที่เป็ นเบส :
Vibrio cholerae
acidophilic microorganism
เจริญได้ในอาหาร
เลี ้ยงเชื ้อที่เป็ นกรด :
Lactobacillus
Streptococcus

osmotic pressure
มีผลต่อจุลินทรีย์แตกต่างกันไป
ขึ้นอยู ่กับความเข้มข้นของสารละลายและชนิดของจุลินทรีย์

แรงดันออสโมซิสของเซลล์
จุลินทรีย์>สารละลายภายนอก
ท าให้น ้าไหลเข้าสู ่เซลล์เกิด
การรเต่งบวมของเซลล์
“plasmoptysis”
อาจท าให้เซลล์แตกได้
หากผนังเซลล์จุลินทรีย์ไม่แข็งแรงพอ
จุลินทรีย์ใส่ในสารละลายของน ้าเกลือเข้มข้น 0.01 เปอร์เซ็นต์
นาน 5-20 นาที
น ้าจากภายนอกเซลล์จะไหลออกสู ่ภายในเซลล์
ท าให้เซลล์เต่งบวม

ถ้าสารละลายภายนอกเซลล์มีแรงดัน
ออสโมติกสูงกว่าภายในเซลล์
น ้าจากภายในเซลล์จะไหลออกสู ่j
ภายนอก ท าให้เซลล์เกิดการเหี่ยว
“plasmolysis”
น าจุลินทรีย์ใส่ในสารละลายของซูโครสเข้มข้น 12 เปอร์เซ็นต์
นาน 5-20 นาที
น ้าจากภายในเซลล์จะไหลออกสู ่ภายนอกเซลล์
เซลล์เหี่ยว

http://botit.botany.wisc.edu/images/130/Diffusion_Osmosis/Plasmolysis_and_recovery.html

การเลี ้ยงจุลินทรีย์ในที่มีแรงดันออสโมติกสูง
จะท าให้มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างหรือสมบัติทางสรีรวิทยาของเซลล์
เช่น อาจมีรูปร่างที่ยาวกว่าปกติ หรือรูปร่างไม่แน่นอน

การจ าแนกจุลินทรีย์ตามความสามารถในการปรับตัวให้ทนต่อแรงดันออสโมติกสูง ๆ
osmophile
osmoduric bacteria halophile
จุลินทรีย์ที่ปรับตัวให้เหมาะกับสภาพที่แรงดันออกโมติกสูง ๆ
พร้อมทั ้งมีการเจริญและเพิ่มจ านวนด้วย
จุลินทรีย์ที่สามารถทนต่อแรงดันออสโมติกสูง ๆ ได้
แต่ไม่เพิ่มจ านวน
จุลินทรีย์ที่อาศัยอยู ่ในน ้าทะเล (ความเค็มประมาณ 3.5-
4%)
จุลินทรีย์ที่สามารถเจริญได้ในทะเลที่มีความเค็มถึง 29%

อัตราการเจริญของจุลินทรีย์
น าจุลินทรีย์มาเพาะเลี ้ยงในอาหารเลี ้ยงเชื ้อที่เหมาะสม
บ่มไว้ในสภาพที่เหมาะสมต่อการเจริญ
จุลินทรีย์จะเจริญเพิ่มจ านวนขึ ้นอย่างรวดเร็ว

จุลินทรีย์สร้างเอนไซม์ออกมาย่อยสารอาหารและน าเข้าสู ่เซลล์
ใช้ในการสร้างพลังงานและส่วนประกอบต่าง ๆ ของเซลล์รวมถึงสารพันธุกรรมด้วย
เซลล์ยืดยาว
สร้างเยื่อหุ้มเซลล์และผนังเซลล์มาแบ่งเซลล์ออกเป็ นสองส่วนเท่า ๆ กัน
“binary fission”

การเจริญของจุลินทรีย์ในลักษณะนี ้ถือเป็ นการสืบพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศ
เป็ นการเพิ่มจ านวนแบบอนุกรมเรขาคณิต
1 2 4 8 16 32 64...
หรือ 1 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 ...
ระยะเวลาที่ใช้ในการแบ่งเซลล์แต่ละครั ้ งเพื่อท าให้จ านวนเซลล์เพิ่มขึ ้นเป็ นสองเท่า
“generation time”
จุลินทรีย์แต่ละชนิดจะใช้เวลาในการเพิ่มจ านวนประชากรไม่เท่ากัน

การหาระยะเวลาที่จุลินทรีย์ใช้ในการแบ่งเซลล์เพื่อเพิ่มจ านวนเป็ นสอง
นับจ านวนจุลินทรีย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์
ทราบจ านวนจุลินทรีย์
ทิ้งระยะให้จุลินทรีย์มีการเจริญ
เลี ้ยงในสภาวะใดสภาวะหนึ ่ง
นับจ านวนจุลินทรีย์อีกครั ้ง

ข้อมูลที่ได้
จ านวนจุลินทรีย์เริ่มต้น (B)
จ านวนจุลินทรีย์สุดท้าย (b)
เวลาที่ใช้ในการเพิ่มจ านวนของจุลินทรีย์ (t)
หาความสัมพันธ์ในรูปของสมการ โดยให้
G = เวลาที่ใช้ในการแบ่งเซลล์เป็ นสองเท่าในแต่ละครั ้ ง
N = จ านวนครั ้งของการเพิ่มจ านวนเป็ นสองเท่า (generation)

ถ้าเริ่มต้นจุลินทรีย์ 1 เซลล์
เมื่อผ่านการแบ่งเซลล์ 1 ครั ้ง จะได้จ านวนเซลล์เป็ น 2 เซลล์
2 ครั ้ง เป็ น 4 เซลล์
3 ครั ้ง เป็ น 8 เซลล์
4 ครั ้ง เป็ น 16 เซลล์ ...
* แต่ละครั้งจ านวนจุลินทรีย์จะเพิ่มขึ้นเป็ นสองเท่าเสมอ
หาความสัมพันธ์ในรูปของสมการได้ คือ
b = 1 x 2 n
ถ้าจุลินทรีย์เริ่มต้น เท่ากับ B เซลล์ จะได้
b = B x 2 n

log b = log B x n log 2
n = (log b – log B) / log 2
แทนค่า log 2 = 0.30103
n = 3.3 log b/B
G =
ระยะเวลาที่ใช้ในการเพิ่มจ านวน
จ านวนครั ้งของการเพิ่มจ านวนเป็ นสองเท่า
G = t / 3.3 log b/B = t / n

ลักษณะการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
เมื่อน าจุลินทรีย์ใส่ในอาหารเลี ้ยงเชื ้อแล้วศึกษาการเพิ่มประชากรจุลินทรีย์ที่เวลาต่าง ๆ
น าข้อมูลที่ได้มาหาความสัมพันธ์ระหว่าง
จ านวนล็อก (log) ประชากรของจุลินทรีย์กับระยะเวลาที่ใช้ในการทวีจ านวน
แบ่งการเจริญของจุลินทรีย์ได้เป็ น 4 ระยะ ดังนี ้
Lag phase
Logarithmic phase
Stationary phase
Death phase

Lag phase
จุลินทรีย์ยังไม่มีการเพิ่มจ านวน
อยู ่ระหว่างการปรับตัวให้เข้ากับสิ่งแวดล้อมใหม่
เซลล์จะมีการปรับตัว : สังเคราะห์โพรโทพลาสซึมใหม่ เอนไซม์
โคเอ็นไซม์ ดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ
เพื่อเตรียมพร้อมส าหรับส าหรับการแบ่งเซลล์
ระยะนี ้เป็ นระยะที่เซลล์มีกิจกรรมทางสรีรวิทยาสูง
ขนาดของเซลล์จะเพิ่มขึ ้น โดยเซลล์จะยาวขึ ้น
โปรตีนและน ้าหนักแห้งของเซลล์จะเพิ่มขึ ้น

ระยะแลกเฟสจะยาวนานเพียงใดขึ้นกับ
สภาพแวดล้อมในการเพาะเลี ้ยง
ชนิดของจุลินทรีย์
ระยะเวลาในการเก็บรักษาจุลินทรีย์
ระยะแลกเฟสจะสั ้น
หากน าจุลินทรีย์ไปเพาะเลี ้ยงใน
อาหารชนิดเดิม
ระยะแลกเฟสจะยาว
หรือใส่จุลินทรีย์ที่พร้อมจะแบ่งตัวลงไปในอาหารเลี ้ยงเชื ้อ
หากจุลินทรีย์ที่น ามาเพาะเลี ้ยงมีความ
ผิดปกติหรือ
เชื ้อมีการเก็บรักษาไว้เป็ นเวลานาน
ต้องใช้เวลาในการปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมใหม่

ช่วงปลายของระยะนี ้จุลินทรีย์จะเริ่มมีการแบ่งตัว
แต่เนื่องจากการแบ่งตัวของจุลินทรีย์ไม่ได้เกิดขึ ้นพร้อมกัน
จ านวนประชากรของจุลินทรีย์จึงเพิ่มขึ ้นอย่างช้า ๆ
บางครั ้งถือว่าระยะแลกเฟสเป็ นระยะการปรับตัวของจุลินทรีย์
ให้เข้ากับสภาพแวดล้อมใหม่ก่อนที่จะมีการเพิ่มจ านวนประชากร

Logarithmic phase
บางครั ้งเรียก Exponential phase or Log phase
ระยะที่จุลินทรีย์มีอัตราการแบ่งเซลล์อย่างรวดเร็ว
ถือเป็ นระยะที่มีการแบ่งเซลล์สูงสุด
สารอาหารถูกใช้อย่างรวดเร็ว
เซลล์มีกระบวนการเมแทบอลิซึม
ตลอดจนสรีรวิทยาไม่แตกต่างกัน
จ านวนจุลินทรีย์
เพิ่มขึ ้นอย่างรวดเร็ว
การแบ่งเซลล์แต่ละครั ้งจะใช้เวลาเท่า ๆ กัน
ระยะเวลาการเพิ่มประชากรเป็ นสองเท่าจะเร็วหรือช้าขึ ้นอยู ่กับชนิดของจุลินทรีย์

Stationary phase
ระยะที่จ านวนประชากรของจุลินทรีย์สูงที่สุด และคงที่
จุลินทรีย์ยังคงมีการแบ่งเซลล์ แต่จ านวนประชากรไม่เพิ่มขึ ้น
อัตราการแบ่งเซลล์
=
อัตราการตาย
สภาวะแวดล้อมเปลี่ยนแปลง
จากการสะสมสารพิษจาก
เมแทบอลิซึมของจุลินทรีย์
สารอาหารถูกใช้ไปอย่าง
รวดเร็วใน log phase

ระยะนี ้จะคงอยู ่นานหรือไม่ขึ ้นกับ
ความสามารถในการทนต่อสภาพแวดล้อมที่ไม่เหมาะสมของจุลินทรีย์
ระยะสเทชันนารีเฟสสั ้น
จุลินทรีย์ที่ทนต่อสภาพแวดล้อมที่
ไม่เหมาะสมได้ไม่ดี
ระยะสเทชันนารีเฟสยาว
จุลินทรีย์ที่สามารถสร้างสปอร์
หรือ cyst

Death phase
หรือ Decline phase
เป็ นระยะที่จุลินทรีย์มีอัตราการตายอย่างรวดเร็ว
ท าให้จ านวนประชากรของจุลินทรีย์ลดลงอย่างรวดเร็ว
ขาดสารอาหารส าหรับเซลล์
การสะสมของสารพิษมากเกินกว่า
จะมีชีวิตอยู ่ได้
อาจใช้เวลานาน 2-3 วัน เป็ นสัปดาห์ หรือเป็ นเดือน
ขึ ้นอยู ่กับจุลินทรีย์แต่ละชนิด

การวัดการเจริญของจุลินทรีย์
การวัดการเจริญของจุลินทรีย์สามารถท าได้หลายวิธีด้วยกัน
การนับจ านวนเซลล์
การนับมวลของเซลล์ในรูปของน ้าหนัก
การวัดความขุ ่น
การวัดกิจกรรมทางชีวเคมีของเซลล์
เป็ นต้น

การนับจ านวนเซลล์ของจุลินทรีย์
การนับจ านวนเซลล์จุลินทรีย์โดยตรงจากล้องจุลทรรศน์
Petroff-Hausser chamber : สไลด์พิเศษที่มีความหนา 3-5 mm
ตรงกลางสไลด์เป็ นร่อง
เมื่อปิ ดทับด้วยกระจกปิ ดสไลด์ชนิดพิเศษ จะมีพื ้นที่เท่ากับ 1 mm 2
และมีความลึก 0.02 mm (ปริมาตร 2x10 -5 mm)
ที่มา (http://www.hausserscientific.com/petroffhausser.htm, 2007)

แบ่งเป็ นช่องใหญ่ 25 ช่อง
แต่ละช่องมีพื ้นที่เท่ากับ 0.04 mm 2
(ปริมาตร 8x10 -7 ml)
ภายในช่องใหญ่แบ่งออกเป็ น 16 ช่องเล็ก
แต่ละช่องมีพื ้นที่ 0.0025 mm 2
(ปริมาตร 5x10 -8 ml)
ที่มา (http:// www.emsdiasum.com/microscopy/products/magnifier/counting. aspx, 2007)

หยดตัวอย่างจุลินทรีย์ที่ต้องการทราบจ านวนลงบนสไลด์
นับจ านวนภายใต้กล้องจุลทรรศน์
ทราบจ านวนจุลินทรีย์ต่อปริมาตรของสไลด์
ค านวณหาปริมาณของจุลินทรีย์ต่อcm 3 หรือml

การนับจ านวนเซลล์ ท าได้โดยสมการต่อไปนี ้
เซลล์ต่อมิลลิลิตร = v
xy 1
v
เมื่อ x = จ านวนเซลล์ที่นับได้ต่อ 16 ช่องเล็ก
y = ระดับความเจือจางที่ใช้
1
v = ปริมาตรของตัวอย่างในปริมาตร
(กรณีนับ 16 ช่องเล็ก พื ้นที่ = 8x10 -7 มิลลิลิตร)
= 1.25 x 10 6
* ในทางปฏิบัติจะสุ่มนับจ านวนจุลินทรีย์จาก 5 ช่องใหญ่
แล้วหาค่าเฉลี่ยมาแทนค่าเป็ นค่า x

ที่มา (Bauman, 2003, p. 192)

ค านวนหาปริมาณจุลินทรีย์ต่อมิลลิลิตรได้จากสมการ
เซลล์ต่อมิลลิลิตร v = xy 1
v
= 15 x 1 x 1.25 x 10 6
= 18.75 x 10 6
= 1.88 x 10 7
15 เซลล์
หมายเหตุ กรณีนี ้ไม่ได้ท าการเจือจาง