สà¹à¸¥à¸à¹à¸à¸£à¸°à¸à¸à¸à¸à¸²à¸£à¸à¸£à¸£à¸¢à¸²à¸¢
สà¹à¸¥à¸à¹à¸à¸£à¸°à¸à¸à¸à¸à¸²à¸£à¸à¸£à¸£à¸¢à¸²à¸¢
สà¹à¸¥à¸à¹à¸à¸£à¸°à¸à¸à¸à¸à¸²à¸£à¸à¸£à¸£à¸¢à¸²à¸¢
- No tags were found...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
บทที่ 3<br />
เทคนิคเบื้องต้นทางจุลชีววิทยา
์<br />
จุลินทรีย์เป็ นสิ่งมีชีวิตขนำดเล็ก<br />
ไม่สำมำรถมองเห็นได้ด้วยตำเปล่ำ<br />
ในธรรมชำติยังเจริญอยู ่ร่วมกับสิ่งมีชีวิตอื่น<br />
กำรศึกษำจุลินทรีย์จึงต้องอำศัยเทคนิคและวิธีกำรหลำย ๆ อย่ำง<br />
กล้องจุลทรรศน์<br />
กำรย้อมสี<br />
กำรแยกจุลินทรีย์ให้บริสุทธิ<br />
กำรเก็บรักษำจุลินทรีย์<br />
เพื่อท ำกำรศึกษำ
ดังนั ้นในกำรศึกษำทำงจุลชีววิทยำ :<br />
ต้องเรียนรู้เทคนิคต่ำง ๆ ให้มีควำมช ำนำญ<br />
เพื่อให้กำรศึกษำจุลินทรีย์เป็ นไปอย่ำงมีประสิทธิภำพ
loop<br />
needle<br />
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Inoculation_loop.JPG
การเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์<br />
• สำมำรถท ำได้ 2 วิธี<br />
แบบใช้แสงธรรมดา<br />
1) กำรศึกษำจุลินทรีย์จำกของเหลว<br />
เพื่อท ำสไลด์สดหรือใช้เทคนิคหยด<br />
แขวน<br />
2) กำรตรึงเซลล์จุลินทรีย์ให้อยู ่กับที่<br />
และย้อมสีเพื่อให้สำมำรถสังเกตเห็น<br />
ควำมแตกต่ำงได้ชัดเจนยิ่งขึ ้น
การเตรียมสไลด์สดและเทคนิคหยดแขวน<br />
การเตรียมสไลด์สด (wet mount)<br />
กำรหยดเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์ลงบนสไลด์<br />
ปิ ดทับด้วยกระจกปิ ดสไลด์<br />
(วำงให้ด้ำนใดด้ำนหนึ ่งของกระจกปิ ดสไลด์สัมผัสกับหยดของเหลว)<br />
เอียงกระจกปิ ดสไลด์ช้ำ ๆ<br />
(ระวังไม่ให้เกิดฟองอำกำศ)<br />
ที ่มา<br />
(Brown, 2005, p.116)
เทคนิคหยดแขวน<br />
(hanging drop technology)<br />
กระจกปิ ดสไลด์<br />
สไลด์หลุม<br />
หยดน ้ำตัวอย่ำง<br />
ที ่มา<br />
(Brown, 2005, p.116)
กำรเสมียร์ (smear) เชื ้อ<br />
เกลี่ยจุลินทรีย์ให้กระจำยบำง ๆ บนสไลด์<br />
ทิ้งให้แห้ง<br />
ให้เชื ้อเรียงตัวกัน<br />
ในปริมำณที่<br />
พอเหมำะ ไม่แน่น<br />
จนเกินไป<br />
ควรเสมียร์ให้อยู ่ตรงกลำงสไลด์<br />
เพรำะจะท ำให้ง่ำยต่อกำรส่อง<br />
ดูภำยใต้กล้องจุลทรรศน์
กำรเสมียร์เชื ้อ (ต่อ)<br />
ต้องสเมียร์ให้เชื ้อกระจำยตัวบำง ๆ<br />
หำกหนำจะยำกต่อกำรสังเกตรูปร่ำง<br />
กำรจัดเรียงตัว และขนำดของเซลล์<br />
ยำกต่อกำรย้อมสีแบบ<br />
มำกกว่ำหนึ ่งสี<br />
กำรตรึงรอยสเมียร์ด้วยเปลวไฟ<br />
หำกให้ควำมร้อนนำนเกินไป จะเป็ นกำรท ำลำยรูปร่ำงของแบคทีเรีย
การตรึงรอยสเมียร์<br />
เพื่อให้เซลล์ของจุลินทรีย์ติดแน่นกับสไลด์<br />
เพื่อป้ องกันจุลินทรีย์หลุดออกจำกสไลด์ ระหว่ำงขั ้นตอนกำรย้อมหรือล้ำงสี<br />
น ำสไลด์ที่รอยสเมียร์แห้งแล้วมำลนผ่ำนเปลวไฟอย่ำงรวดเร็ว 2-3 ครั ้ง<br />
เพื่อดึงน ้ำออกจำกเซลล์ ท ำให้เซลล์ติดแน่นกับสไลด์
การตรึงรอยสเมียร์ (ต่อ)<br />
วำงสไลด์ที่รอยสเมียร์แห้งแล้วบนเครื่องอุ่นสไลด์<br />
ที่อุณหภูมิ 60 องศำเซลเซียส นำน 10 นำที<br />
หรือ<br />
หยดเมธำนอลเข้มข้น 95 เปอร์เซ็นต์<br />
ลงบนรอยสเมียรที่แห้ง นำน 1 นำที<br />
ล้ำงเมธำนอลออกด้วยน ้ำสะอำด
การตรึงรอยสเมียร์ (ต่อ)<br />
กำรสเมียร์เชื ้อจำกตัวอย่ำงทำงสิ่งแวดล้อม<br />
หรือตัวอย่ำงทำงกำรแพทย์ด้วยเทคนิคสวอป<br />
(swab)<br />
ใช้ส ำลีพันปลำยไม้ปลอดเชื ้อจุ่มตัวอย่ำงตรงกลำงสไลด์<br />
ทิ้งรอยสเมียร์ให้แห้งในอำกำศ<br />
ตรึงรอยสเมียร์
กรณีเพำะเลี้ยงเชื้อในอำหำรเหลว<br />
บริเวณสเมียร์เชื ้อ<br />
กรณีเพำะเลี้ยงเชื้อในอำหำรแข็ง<br />
การตรึงรอยสเมียร์<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 92)
การย้อมสีจุลินทรีย์<br />
ศึกษำรูปร่ำง ลักษณะ กำรจัดเรียงตัวของเซลล์<br />
และโครงสร้ำงบำงอย่ำงของจุลินทรีย์<br />
การย้อมสีแบบธรรมดา (simple stain)<br />
การย้อมสีแบบเนกาทีฟ (negative staining)<br />
การย้อมสีมากกว่าหนึ่งสี (differential stain)
การย้อมสีแบบธรรมดา (simple stain)<br />
ย้อมสีจุลินทรีย์ด้วยสีเพียงชนิดเดียว<br />
เซลล์ที่ย้อมจะติดสีเสมอกัน<br />
ช่วยให้ศึกษำรูปร่ำงและขนำดของเซลล์ได้ดียิ่งขึ<br />
้น<br />
ไม่สำมำรถบอกรำยละเอียดของโครงสร้ำงภำยในเซลล์ได้<br />
อำจเติมสำรเคมีลงไปในสีเพื่อให้สีจับวัตถุได้ดีขึ ้น “mordant”<br />
ไอโอดีน<br />
โปแตสเซียมไอโอไดด์<br />
ตัวอย่ำงสีย้อม : methylene blue<br />
crystal violet<br />
carbon fuchsin<br />
S. aureus
การย้อมสีแบบเนกาทีฟ (negative staining)<br />
ศึกษำลักษณะรูปร่ำงของจุลินทรีย์ โดยเซลล์ไม่ถูกย้อม<br />
แต่สีจะไปติดแน่นกับแผ่นสไลด์<br />
เมื่อส่องดูจะมองเห็นเซลล์ได้ชัดเจนขึ ้น<br />
ข้อดี ขนำดและรูปร่ำงของแบคทีเรียไม่เปลี่ยนแปลง<br />
ไม่มีควำมร้อน มำท ำให้รูปร่ำงผิดไปจำกควำมจริง<br />
Negatively Stained Cocci<br />
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Negative%20stain%20results.html
1 2<br />
3 4<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 97)
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/bloodcytology.html
Negatively Stained Bacillus:<br />
(A) Vegetative Cell<br />
(B) Endospore<br />
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Negative%20stain%20results.html
การย้อมสีมากกว่าหนึ่งสี (differential stain)<br />
เป็ นกำรย้อมสีจุลินทรีย์ด้วยสีย้อม >1 ชนิด<br />
สีย้อมต่ำงชนิดกันย้อมติดส่วนต่ำง ๆ ของเซลล์ไม่เท่ำกัน<br />
ท ำให้เห็นควำมแตกต่ำงของเซลล์หรือองค์ประกอบของเซลล์
การย้อมสีแบบแกรม (Grams’ stain)<br />
จ ำแนกแบคทีเรียเป็ น 2 กลุ่ม (ควำมแตกต่ำงของผนังเซลล์แบคทีเรีย)<br />
G+ มีผนังเซลล์เป็ น peptidoglycan<br />
ที่หนำกว่ำ<br />
มีกรดไทโชอิกซึ ่งมีประจุลบอยู ่ใน<br />
ชั ้นผนังเซลล์<br />
ไม่มีลิปิ ดเป็ นองค์ประกอบ<br />
มีชั ้นเพปติโดไกลแคนในผนังเซลล์บำงกว่ำ<br />
ผนังชั ้นนอกที่มีสำรประกอบเป็ นไขมัน<br />
(lipopolysaccharide)<br />
สีครัสตัสไวโอเลตที่ย้อมครั ้งแรกหลุดออก<br />
เมื่อชะสีด้วยสำรชะ<br />
เซลล์ติดสีม่วงของคริสตัลไวโอเลต<br />
เซลล์จึงติดสีแดงของซำฟรำนิน<br />
ล้ำงไม่ออกเมื่อเติมสำรชะสี : อะซิโตน/เอธำนอล
สไลด์ที่ท ำกำรตรึงรอยสเมียร์ของแบคทีเรีย<br />
หยดสีคริสตัลไวโอเลตให้ท่วมเชื ้อที่เกลี่ย<br />
20 วินำที<br />
เทสีทิ้ง แล้วล้ำงด้วยน ้ำกลั่น<br />
หยดสำรละลำยลูกอลไอโอดีนหรือแกรมไอโอดีนบนรอยสเมียร์<br />
1 นำที
ล้ำงสำรละลำยลูกอลไอโอดีนหรือแกรมไอโอดีนออกด้วยน ้ำกลั่น<br />
เอียงสไลด์ 45º ล้ำงสีส่วนเกินออกด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ 95%<br />
ประมำณ 15 วินำที หรือจนกระทั่งไม่มีสีละลำยออกมำ<br />
ล้ำงด้วยน ้ำกลั่นทันที<br />
เพื่อหยุดปฏิริยำกำรล้ำงสี<br />
หยดสีซำฟรำนินบนรอยสเมียร์<br />
1 นำที<br />
ล้ำงสีส่วนเกินออกด้วยน ้ำกลั่น
ซับน ้ำให้แห้ง<br />
ส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์<br />
G + G-
http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%204/gramstain.html
การย้อมสีแบบทนกรด<br />
ผนังเซลล์ของแบคทีเรียบำงชนิดมีไขมัน mycolic acid สูง<br />
ติดสีย้อมยำก<br />
แต่ติดสีแล้วไม่สำมำรถชะออกได้<br />
ด้วยสำรชะสีที่เป็ นกรดแอลกอฮอล์<br />
Mycobacterium tuberculosis<br />
ท ำให้เกิดโรควัณโรค<br />
http://pathmicro.med.sc.edu/infectious%20disease/<br />
mycobacterial%20diseases.htm
mycolic acid ช่วยป้ องกันสำรล้ำงสีซึมเข้ำไป<br />
แบคทีเรียทนกรด<br />
(acid-fast bacteria)<br />
แบคทีเรียไม่ทนกรด<br />
(non acid-fast bacteria)<br />
Mycobacterium sp.: วัณโรค และโรคเรื ้อน<br />
Nocardia sp. : โรค mycetoma<br />
สำมำรถแยกแบคทีเรีย 2 จีนัสนี ้<br />
ออกจำกแบคทีเรียอื่น
1) วิธีของซีล-นีลเซน (Ziehl-Neelsen) :ใช้ควำมร้อน<br />
วำงสไลด์ที่มีรอยสเมียร์บนลวดรองสไลด์ที่พำดอยู ่บนบีกเกอร์ที่มีน ้ำต้มเดือด<br />
หยดสีคำร์บอลฟุคซินให้ท่วมรอยสเมียร์ นำน 3-5 นำที<br />
ผ่ำนน ้ำสะอำดเบำ ๆ หยดแอลกอฮอล์กรดลงบนรอยสเมียร์<br />
เพื่อล้ำงสี นำน 1-2 นำที หรือจนกระทั่งไม่มีสีละลำยออกมำ<br />
ล้ำงด้วยน ้ำสะอำด ซับให้แห้ง
ย้อมทับด้วยสีเมทิลีนบลู 2-5 นำที<br />
ล้ำงสีส่วนเกินออกด้วยน ้ำสะอำด ซับให้แห้ง<br />
ส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ก ำลังขยำย 100 เท่ำ
2) วิธีของคินยูน (Kinyoun) :ไม่ใช้ควำมร้อน<br />
หยดสีคำร์บอลฟุคซินให้ท่วมรอยสเมียร์ นำน 3-5 นำที<br />
ผ่ำนน ้ำสะอำดเบำ ๆ หยดแอลกอฮอล์กรดลงบนรอยสเมียร์<br />
เพื่อล้ำงสี นำน 1-2 นำที หรือจนกระทั่งไม่มีสีละลำยออกมำ<br />
ล้ำงด้วยน ้ำสะอำด ซับให้แห้ง
ย้อมทับด้วยสีเมทิลีนบลู 2-5 นำที<br />
ล้ำงสีส่วนเกินออกด้วยน ้ำสะอำด ซับให้แห้ง<br />
ส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ก ำลังขยำย 100 เท่ำ<br />
PLAY
การย้อมแคปซูล<br />
แคปซูลเป็ นโครงสร้ำงที่ห่อหุ้มอยู ่ด้ำนนอกของเซลล์พบในแบคทีเรียบำงชนิด<br />
แคปซูลของแบคทีเรียส่วนใหญ่เป็ นสำรโพลีแซคคำไรด์<br />
ซึ ่งเป็ นสำรละลำยน ้ำและไม่มีประจุ<br />
ท ำให้ยำกต่อกำรติดสีย้อมโดยตรง<br />
กำรย้อมสีที่ตัวเซลล์และบริเวณสไลด์<br />
ไม่ย้อมสีแคปซูล<br />
แคปซูลในลักษณะใสอยู ่รอบตัวเซลล์<br />
รูปร่ำงของแคปซูลจะขึ ้นอยู ่กับรูปร่ำงของแบคทีเรีย
ย้อมแบคทีเรียตำมวิธีเนกำทีฟ<br />
ทิ้งให้แห้ง<br />
หยดสีซำฟรำนินหรือคริสตัลไวโอเลตให้ทั่ว<br />
1 นำที<br />
ล้ำงสีส่วนเกินออกด้วยน ้ำสะอำด<br />
ซับน ้ำส่วนเกินออกให้แห้ง<br />
ตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ก ำลังขยำย 100 เท่ำ
การย้อมเอนโดสปอร์<br />
โครงสร้ำงพิเศษที่พบในแบคทีเรียแกรมบวกบำงชนิด<br />
ช่วยให้แบคทีเรียสำมำรถมีชีวิตรอดภำยใต้สภำวะที่ไม่เหมำะสมต่อกำรเจริญได้<br />
Thick outer spore coat<br />
protein coat<br />
ช่วยปกป้ องเอนโดสปอร์จำกสำรเคมีที่เป็ นพิษ<br />
Sporangium (mother cell)
เอนโดสปอร์มีผนังหนำ มีน ้ำเป็ นองค์ประกอบน้อยมำกหรือไม่มีเลย<br />
กำรย้อมสี<br />
ต้องใช้ไอน ้ำร้อนช่วยท ำลำยพันธะที่ผนังสปอร์ (spore coat)<br />
ท ำให้ผนังสปอร์บวมและขยำยตัวออก<br />
สีย้อมผ่ำนเข้ำไปได้
วำงสไลด์ที่ตรึงรอยสเมียร์แล้วบนปำกบีกเกอร์<br />
ที่ใส่น ้ำต้มเดือด<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 108)
หยดสีมำลำไคท์-กรีนลงบน<br />
รอยสเมียร์ นำน 5-10 นำที<br />
คีบสไลด์ออก เทสีส่วนเกินทิ้ง<br />
ปล่อยให้เย็น<br />
ผ่ำนน ้ำสะอำดเบำ ๆ จนน ้ำล้ำงไม่<br />
มีสีติดออกมำ ซับให้แห้ง<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 108)
หยดสีซำฟรำนินให้ท่วมรอยสเมียร์<br />
นำน 1 นำที<br />
ล้ำงสีออกด้วยน ้ำสะอำด<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 108)
ซับให้แห้ง<br />
ที่มำ (Brown, 2005, p. 108)
การย้อมแฟลเจลลา<br />
‣แฟลเจลลำเป็ นโครงสร้ำงที่พบในแบคทีเรียที่<br />
เคลื่อนที่ได้<br />
‣มีลักษณะเป็ นเส้นขนำดเล็ก บำงมำก และเปรำะ<br />
ขำดง่ำย<br />
‣มักมีควำมยำวมำกกว่ำตัวเซลล์<br />
ต้องย้อมสีโดยใส่สำร “มอร์แดนท์”<br />
สีย้อมจับบนเส้นแฟลเจลลำ<br />
ขนำดใหญ่ขึ ้น
ซัสเพนชันของแบคทีเรียที่เลี้ยงบน slant agar<br />
อายุ 6-12 ชั่วโมง<br />
ท าความสะอาดสไลด์โดยแช่ใน chromic acid<br />
นาน 24 ชั่วโมง<br />
ค่อย ๆ หยดน ้ากลั่นปลอดเชื้อลงบนเชื้อ<br />
ล้างให้สะอาดด้วยน ้ากลั่น<br />
เอียงหลอดเบาๆ:เชื้อหลุดออกจากผิวหน้า slant<br />
ปิ เปตเชื้อบริเวณผิวหน้าของซัสเพนชัน 0.1 ml
่<br />
เทคนิคการถ่ายเชื้อจุลินทรีย์<br />
กำรศึกษำแบคทีเรียนั ้น จ ำเป็ นจะต้องมีกำรถ่ำยเชื ้ออยู<br />
เป็ นประจ ำ<br />
เริ่มตั ้งแต่กำรแยกเชื ้อให้บริสุทธิ ์ กำรเพำะเลี ้ยง กำร<br />
ทดสอบ และกำรเก็บรักษำ<br />
กำรถ่ำยเชื ้อจึงเป็ นเทคนิคเบื ้องต้นที่ส ำคัญ<br />
ส ำหรับผู้ปฏิบัติงำนทำงจุลชีววิทยำ<br />
ต้องทรำบเป็ นอย่ำงดี พร้อมทั ้งปฏิบัติได้อย่ำงถูกต้อง
การท าให้ห่วงหรือลวดเขี่ยเชื้อปราศจากเชื้อ<br />
ถือห่วงหรือลวดเขี่ยเชื ้อในลักษณะคล้ำยดินสอ<br />
ลนผ่ำนเปลวไฟจนกระทั่งลวดกลำยเป็ นสีแดงตลอดทั ้งเส้น<br />
ทิ้งให้ห่วงเขี่ยเชื ้อเย็น (ห้ำมสัมผัสสิ่งใด)<br />
ที่มำ<br />
(http://www.rlc.dcccd.edu/MATHSCI/reynolds/<br />
MICRO/lab_manual/ transfers.html, 2007)
การถ่ายเชื้อจากอาหารเหลวลงสู ่อาหารเหลว<br />
เขย่ำเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์เบำ ๆ เพื่อให้เชื ้อกระจำยตัว<br />
ใช้ห่วงเขี่ยเชื ้อที่ปรำศจำกเชื ้อถ่ำยเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์<br />
ลงในหลอดอำหำรเหลวที่ปรำศจำกเชื ้อ<br />
ที่มำ<br />
(http://www.rlc.dcccd.edu/MATHSCI/reynolds/<br />
MICRO/lab_manual/ transfers.html, 2007)
การถ่ายเชื้อจากอาหารเหลวลงสู ่อาหารแข็งผิวหน้าเอียง<br />
เขย่ำเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์เบำ ๆ เพื่อให้เชื ้อกระจำยตัว<br />
ใช้ห่วงเขี่ยเชื ้อที่ปรำศจำกเชื ้อถ่ำยเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์<br />
ลงในหลอดอำหำรผิวหน้ำเอียงที่ปรำศจำกเชื ้อในลักษณะ<br />
ซิกแซกจนสุดควำมยำวของผิวหน้ำอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
การถ่ายเชื้อจากอาหารเหลวลงสู ่อาหารแข็งผิวหน้าตรง<br />
เขย่ำเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์เบำ ๆ เพื่อให้เชื ้อกระจำยตัว<br />
ใช้ลวดเขี่ยเชื ้อที่ปรำศจำกเชื ้อถ่ำยเซลล์แขวนลอยของจุลินทรีย์ลง<br />
ในหลอดอำหำรแข็งผิวหน้ำตรงที่ปรำศจำกเชื ้อในลักษณะแทง<br />
ตรง ๆ ลงไปลึกประมำณ ¾ ของควำมยำวของอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ<br />
ที่มำ<br />
(http://www.rlc.dcccd.edu/MATHSCI/reynolds/MICRO/<br />
lab_manual/ transfers.html, 2007)
การถ่ายเชื้อจากจานเพาะเชื้อลงสู ่อาหารแข็งผิวหน้าเอียง<br />
เปิ ดฝำจำนเพำะเชื ้อที่มีแบคทีเรียเจริญอยู ่ขึ ้นเล็กน้อย<br />
ใช้ห่วงเขี่ยเชื ้อที่ปรำศจำกเชื ้อเขี่ยเชื ้อจำกโคโลนีเดี่ยว<br />
ที่เจริญบนผิวหน้ำอำหำรแข็งในจำนเพำะเชื ้อ<br />
ถ่ำยเชื ้อลงบนอำหำรแข็งผิวหน้ำเอียงที่ปรำศจำกเชื ้อ<br />
ในลักษณะซิกแซกจนสุดควำมยำวของอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
้<br />
การแยกเชื้อจุลินทรีย์<br />
กำรแยกเชื ้อจุลินทรีย์เป็ นกำรแยกจุลินทรีย์ที่เจริญอยู ่ร่วมกับ<br />
สิ่งมีชีวิตอื่นออกให้เป็ นเชื ้อบริสุทธิ ์ (pure culture)<br />
เพื่อใช้ในกำรศึกษำลักษณะและคุณสมบัติต่ำง ๆ ของเชื เชื ้อ ้อชนิดเดียวกัน<br />
สำมำรถท ำได้หลำยวิธีดังนี<br />
ทุกเซลล์เหมือนกันทุกประกำร<br />
http://www.dwscientific.co.uk/whitley_workstations.php
การขีดเชื้อในจานเพาะเชื้อ (streak plate)<br />
ลดจ ำนวนจุลินทรีย์โดยกำรใช้ห่วงเขี่ยเชื ้อลำกเซลล์จุลินทรีย์<br />
บนผิวหน้ำของอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ<br />
จนกระทั่งกระจำยเป็ นเซลล์เดี่ยว ๆ<br />
เมื่อเวลำผ่ำนไปเจริญเพิ่มจ ำนวนเป็ นโคโลนีเดี่ยว<br />
สำมำรถย้ำยและถ่ำยต่อเพื่อศึกษำลักษณะของจุลินทรีย์
http://diverge.hunter.cuny.edu/~weigang/Lecture-syllabus.html
การเทเพลทแบบเจือจางด้วยห่วงเขี่ยเชื้อ (pour plate technique)<br />
กำรนับจ ำนวนจุลินทรีย์หรือกำรแยกแบคทีเรียที่อยู ่ปะปนกันหลำยชนิดออกจำกกัน<br />
โดยผสมจุลินทรีย์เข้ำกับอำหำรเลี ้ยงเชื ้อจุลินทรีย์แบบแข็ง<br />
ในระหว่ำงที่อุณหภูมิของอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ อยู ่ที่ประมำณ 45-50ºC<br />
เขย่ำเบำ ๆ เพื่อให้จุลินทรีย์กระจำยตัวอยู ่ในอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ ของเหลว<br />
ปล่อยให้เชื ้อเจริญในสภำวะที่เหมำะสม<br />
โคโลนีของจุลินทรีย์เจริญกระจำยอยู ่ทั่วไปทั ้งบนผิวหน้ำและในอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ<br />
อำจต้องท ำกำรเจือจำงจุลินทรีย์ให้พอเหมำะก่อน<br />
ท ำให้ไม่สำมำรถแยกให้บริสุทธิ ์ ได้
ที่มำ (Cowan and Talaro, 2002, p. 63)
http://www.agro.kmutnb.ac.th/e-learning/521302/1.php
กำรให้เชื ้อกระจำยในจำนเพำะเชื ้อ (spread plate)<br />
เป็ นเทคนิคท ำให้ของเหลวที่มีแบคทีเรียไม่บริสุทธิ ์ ปนอยู ่กระจำยบนผิวหน้ำ<br />
ของอำหำรแข็งในจำนเพำะเชื ้อ และปล่อยให้เจริญเป็ นโคโลนีเดี่ยว<br />
ถ่ำยเชื ้อจำกตัวอย่ำง 0.1ml ลงตรงกลำงผิวหน้ำอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ<br />
ใช้ spreader ปรำศจำกเชื ้อกระจำยเชื ้อแบคทีเรีย<br />
ให้ทั่วผิวหน้ำอำหำรเลี ้ยงเชื ้อในจำนเพำะเชื ้อ<br />
บ่มที่อุณหภูมิที่เหมำะสม นำน 24-48 ชั่วโมง<br />
PLAY
ตัวอย่างจุลินทรีย์<br />
1 มิลลิลิตร 1 มิลลิลิตร 1 มิลลิลิตร 1 มิลลิลิตร<br />
น ้าเกลือ<br />
0.85 เปอร์เซ็นต์<br />
0.1 มิลลิลิตร<br />
0.1 มิลลิลิตร 0.1 มิลลิลิตร 0.1 มิลลิลิตร 0.1 มิลลิลิตร<br />
อาหารเลี ้ยงเชื ้อ<br />
ที่มำ (Bauman, 2003, p. 190)
http://www.thirteen.org/edonline/lessons/sci_bacteria/b.html
ค าถามท้ายบท<br />
• กำรเตรียมสไลด์สดและเทคนิคกำรหยดแขวนต่ำงจำกวิธี<br />
กำรศึกษำด้วยสไลด์ธรรมดำอย่ำงไร<br />
• เพรำะเหตุใดจึงต้องท ำกำรตรึงรอยสเมียร์<br />
• จงบอกข้อดีของกำรศึกษำจุลินทรีย์ด้วยกำรย้อมสีแบบเนกำทีฟ<br />
• ในกำรย้อมสีแบบแกรมสำมำรถแยกจุลินทรีย์ออกเป็ นกี่กลุ่ม<br />
สังเกตได้อย่ำงไร<br />
• เพรำะเหตุใดกำรย้อมเอนโดสปอร์จึงต้องอำศัยควำมร้อน<br />
• จงอธิบำยควำมแตกต่ำงระหว่ำงเทคนิคกำรเทเพลทและกำรท ำ<br />
ให้เชื ้อกระจำยในจำนเพำะเชื ้อ
บทที่ 3<br />
เทคนิคเบื้องต้นทางจุลชีววิทยา