I,nº9Fechadepublicación:4deMayo2012
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Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en distintossistemas generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionarían con lamuestra y en virtud de la capacidad antioxidante de esta se inhibiría la generación delos primeros. Así, lo que se determina realmente es el efecto antioxidante ya que laactividad antioxidante no se puede medir de forma directa. Lo ideal seria medir laactividad antioxidante de cada componente de la muestra por separado, sin embargo,y sobre todo en el caso de muestras naturales, es muy difícil determinar el número yconcentración de los compuestos antioxidantes presentes en la muestra.En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidación, no existe unmétodo que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto,es bueno trabajar con varios métodos para facilitar la comparación e interpretación delos resultados. Las características “ideales” que debe reunir un método dedeterminación de capacidad antioxidante son: sencillez, mecanismo químico definido ypunto final fijo, reproducibilidad, adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidrofílicas ylipofílicas y elevado rendimiento de análisis.Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dosestrategias distintas, en función de la información que se desea obtener (Sánchez-Moreno, 2002):● Determinación directa: El radical se emplea como un factor de cuantificación(produce una señal analítica). La adición del antioxidante, antes o después de lageneración del radical, provoca una disminución de la señal. En el ensayo de postadiciónse forma el radical en ausencia de la muestra y así, cuando se añade lasustancia antioxidante se produce un descenso en la señal debido a la disminución dela concentración del radical. En ensayos de inhibición, la muestra se añade a lossustratos de oxidación antes que sea generado el radical, La reacción comienza con laadición del oxidante (ABTS ●+ , DPPH, etc). Determinación indirecta: La presencia de radicales libres produce la pérdida oaparición de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca elaumento o disminución de la señal (métodos, ORAC, FRAP, etc).3. 1. 1.- Método del ABTS ●+ (Ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-sulfónico).El radical ABTS ●+ se genera a partir de su precursor el Ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolín)-6-sulfónico (ABTS), ver figura 11 (Ronald L. Prior, 2005). El radicalcatiónico obtenido es un compuesto de color verde-azulado, estable y con un espectrode absorción en el UV-visible.Es un radical artificial que no mimetiza bien la situación in vivo,termodinámicamente puede ser reducido por compuestos que tengan un potencialredox menor que el del ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchoscompuestos fenólicos con un potencial más bajo. El punto final de la reacción lo marcala sustancia antioxidante empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados quepueden interferir en los resultados finales, lo cual, es un inconveniente.La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolublescomo liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.Existen varios métodos de generación del radical ABTS ●+ :30
Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©- Enzimáticamente (mioglobina, peroxidasa de rábano).- Químicamente (Dióxido de manganeso, persulfato potásico, radicales peroxilo).- Electroquímicamente.En el presente estudio, se ha realizado el método ABTS ●+químicamente utilizando persulfato potásico.generando el radicalLa oxidación con persulfato potásico se lleva a cabo a temperatura ambiente, enausencia de luz, en un tiempo de 12 a 16 h. El persulfato potásico y el ABTSreaccionan estequiométricamente (1:0.5). Una vez generado el radical la medida serealiza mediante un ensayo de post-adición. Este método se aplica en ladeterminación de la actividad antioxidante de frutas, verduras, bebidas estimulantes.Preparación de reactivos:- ABTS 7mM. Para 10 ml Disolver 0,0384 g de sal amónica cristalizada de ABTS en 10 ml deagua destilada.- Solución persulfato potásico 2,45mM. Para 100 ml Disolver 0,0662 g del reactivo en 100ml de agua destilada.-Etanol al 96 % v/v.- Preparación radical ABTS*. Mezclar a partes iguales la solución de ABTS 7mM y la depersulfato pototásico 2,45mM. La mezcla se mantiene en oscuridad a temperatura ambientedurante 16 horas para la formación del radical. Esta solución es estable durante dos días. Lasolución de ABTS* se diluye con etanol para obtener una absorbancia de 0,8 730 nm. Esto seconsigue mezclando 2,5 ml de la solución del radical con aproximadamente 100 ml de etanol. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01gr de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de estasolución se hacen las diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unasconcentraciones de 19, 39, 59, 79, 99, 119, 159 y 199 µM.3.1.2.- Método FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).Benzi y strain,1996; Pulido y col; 2000En este método se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basaen el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe 3+ a Fe 2+ que esmenos antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro esreducido al complejo ferroso coloreado.Se trata de un método espectrofotométrico ya que se mide la absorbancia del Fe 2+ .Así, cuanto más antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reduccióny mayor la concentración de Fe 2+ y más alta la señal de absorbancia. El complejo va apoder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencialredox del Fe 3+ -TPTZ).31
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